FACULTADES DE QUETZALTENANGO UNIVERSIDAD RAFAEL LANDIVAR FACULTAD DE NUTRICION

Nutricin bacteriana Y medios de cultivo

CURSO: Microbiologa y parasitologa Lic.: Alberto Rafael Garca SECCION: A Fecha: 6 de Septiembre del 2012 NOMBRES: Eder Vsquez de Len 1645608

Introduccin.

La fisiologa bacteriana comprende el estudio de a bacteriana comprende el estudio de las funciones realizadas por estos las funciones realizadas por estos microorganismos. Microorganismos. Las bacterias son muy eficientes fisiolgico Las bacterias son muy eficientes fisiolgicamente, sintetizan en forma muy r sintetizan en forma muy rpida sus componentes pida sus componentes celulares, siendo la mayor celulares, siendo la mayora autosuficientes auto suficientes a pesar de su simpleza estructural. pesar de su simpleza estructural. En la bacteria se desencadenan una serie de En la bacteria se desencadenan una serie de procesos qumicos que en conjunto constituyen el micos que en conjunto constituyen el metabolismo bacteriano El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgnicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones fsico-qumicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estar formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las clulas, las condiciones fsicoqumicas y fisiolgicas del medio, la naturaleza y composicin de la fase gaseosa y las condiciones de incubacin, especialmente la humedad y la temperatura.

ndice: Caratula .. 1 Introduccin..2 ndice .. 3 Nutricin y crecimiento bacteriano..........4 Tabla 1.........4 Fuentes de carbono y energa para el crecimiento bacteriano5 Tabla 2...6 SOLUCIONES:.7 El medio de cultivo..8 Condiciones generales para el cultivo de microorganismos.14 1- disponibilidad de nutrientes adecuados.14 2- consistencia adecuada del medio15 3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases16 4- condiciones adecuadas de humedad..16 5- Luz ambiental..16 6- pH..16 7- Temperatura.16 8- Esterilidad del medio..17 La evolucin de los medios de cultivo..18 Tipos bsicos de medios de cultivo atendiendo a su estado fsico:..19 Atendiendo a su utilidad prctica:..19 Medios para aislamientos primarios:.19 Medios para identificacin:.19 Conclusiones:20 Comentario:..21 Bibliografa22 Anexos..23

Nutricin y crecimiento de las bacterias Cada organismo debe encontrar en su ambiente todas las sustancias requeridas para la generacin de energa y la biosntesis celular. Los elementos o sustancias qumicas de este ambiente que son utilizados para el crecimiento de las bacterias son denominados nutrientes o requerimientos nutricionales. En el laboratorio, las bacterias crecen en medios de cultivo que son diseados para proveer todos lo nutrientes esenciales en solucin para el crecimiento bacteriano. En un nivel elemental, los requerimientos nutricionales de bacterias como E. coli son revelados por la composicin elemental de la clula, que consiste en C, H, O, N, S. P, K, Mg, Fe, Ca, Mn, y trazas de Zn, Co, Cu, y Mo. Los elementos se encuentran en forma de agua, iones inorgnicos, pequeas molculas, y macromolculas que sirven tanto al rol estructural como funcional en las clulas. Las funciones fisiolgicas generales de los elementos son resumidas en la siguiente Tabla.

Tabla 1. Principales elementos, sus fuentes y funciones en clulas bacterianas.

Elemento Carbono

% de peso seco 50

Fuente Componentes orgnicos o CO2

Oxgeno

20

H2O, componentes orgnicos, CO2, y O2

Nitrgeno

14

NH3, NO3, componentes orgnicos, N2

Hidrgeno

H2O, componentes orgnicos, H2

Fsforo

Fosfatos inorgnicos (PO4)

Azufre

SO4, H2S, So, componentes de azufre orgnico

Funcin Principal constituyente de material celular constituyente de material celular y agua celular; O2 es aceptor de electrones en la respiracin aerbica Constituyente de aminocidos, nucletidos de cidos nucleicos, y coenzimas Principal constituyente de componentes orgnicos y agua celular Constituyente de cidos nucleicos, nucletidos, fosfolpidos, LPS, cidos teichoic Constituyente de cystena, metionina, glutathione, varias coenzimas 4

Potasio

Sales de potasio

Magnesio

0.5

Sales de magnesio

Calcio

0.5

Sales de calcio

Hierro

0.2

Sales de hierro

Catin inorgnico celular principal y cofactor para ciertas enzimas Catin inorgnico celular, cofactor para ciertas reacciones enzimticas Catin inorgnico celular, cofactor para ciertas enzimas y un componente de endosporos Componente de citocromos y ciertas protenas del hierro y un cofactor para algunas reacciones enzimticas

La tabla anterior ignora la presencia de elementos en trazas en la nutricin bacteriana. Los elementos en trazas son iones metlicos requeridos por ciertas clulas en cantidades tan pequeas que es difcil detectarlos (medirlos), y no es necesario agregarlos al medio de cultivo como nutrientes. Los elementos en trazas son requeridos en cantidades tan pequeas que estn presentes como contaminantes del agua u otros componentes del medio. Como iones metlicos, los elementos en trazas habitualmente actan como cofactores para reacciones enzimticas esenciales en la clula. Un elemento en traza de un organismo puede ser un elemento requerido por otro y viceversa, pero los cationes habituales calificados como elementos en trazas en la nutricin bacteriana son Mn, Co, Zn, Cu, y Mo.

Para crecer en la naturaleza o en el laboratorio, una bacteria debe tener una fuente de energa, una fuente de carbono y otros nutrientes requeridos, y un rango permisivo de condiciones fsicas como concentracin de O2, temperatura, y pH. A veces las bacterias son referidas individualmente o en grupos basados en sus patrones de crecimiento bajo varias condiciones qumicas (nutricionales) o fsicas. Por ejemplo, los fottrofos son organismos que utilizan la luz como fuente de energa; los anaerobios son organismos que crecen sin oxgeno; los termofnicos son organismos que crecen a altas temperaturas.

Fuentes de carbono y energa para el crecimiento bacteriano Todos los organismos vivos requieren una fuente de energa.

Los organismos que utilizan energa radiante (luz) son llamados fottrofos. Los organismos que utilizan (oxidan) una forma orgnica de carbono son llamados heterotrficos o quimio (hetero) trficos. Los organismos que oxidan componentes inorgnicos son llamados littrofos. Los requerimientos de carbono de los organismos deben ser abastecidos con carbono orgnico (un componente qumico con una unin de carbono-hidrgeno) o con CO2. Los organismos que utilizan carbono orgnico son heterotrficos y los organismos que utilizan CO2 como nica fuente de carbono para el crecimiento son llamados autotrficos.

As, sobre la base de las fuentes de energa y carbono para el crecimiento se pueden definir los cuatro principales tipos nutricionales de procariotas (Tabla 2).

Tabla 2. Principales tipos nutricionales de procariotas.

Tipo nutricional Fotoautotrficos Fotoheterotrficos

Fuente de energa Luz Luz

Fuente de carbono CO2 Componentes orgnicos

Ejemplos Cianobacteria, algunas bacterias Verde y Prpura Algunas bacterias Verde y Prpura Pocas bacterias y muchas Archaea La mayora de las bacterias, algunas Archaea

Componentes Quimioautotrficos o inorgnicos, por Litotrficos CO2 ejemplo H2, NH3, (Litoautotrficos) NO2, H2S Quimioheterotrficos Componentes o Heterotrficos orgnicos Componentes orgnicos

Casi todos los eucariotas son tanto fotoautotrficos (por ejemplo, algas y plantas) o heterotrficos (por ejemplo, animales, protozoos, hongos). La litotrofa es nica para procariotas y la fotoheterotrofa, comn en las bacterias verde y prpura, sucede nicamente en muy pocas algas eucariticas. La fotografa no ha sido encontrada en la Archaea.

Este esquema simple de la utilizacin del carbono, tanto carbono orgnico como CO 2, ignora la posibilidad de que un organismo, si es autotrfico o heterotrfico, pueda requerir pequeas cantidades de ciertos componentes orgnicos para el crecimiento

porque son sustancias esenciales que el organismo es incapaz de sintetizar de los nutrientes disponibles. Tales componentes son llamados factores de crecimiento. La nutricin de todos los organismos implica el aprovisionamiento de energa para llevar a cabo las reacciones metablicas, y el suministro de materiales para la sntesis celular. En la nutricin hetertrofa, las reacciones catablicas representan la forma de aprovisionamiento de energa, para lo cual es necesario que exista alguna molcula donadora de electrones para los procesos de produccin energtica, ya sea la fermentacin o la respiracin, esta ltima aerobia o anaerobia. Pero adems, estos mismos nutrientes son los utilizados para los procesos de biosntesis. En la nutricin auttrofa existe un paso previo, la fotosntesis (quimiosntesis), durante el cual el organismo fabrica sus propias molculas orgnicas a partir de sustancias inorgnicas sencillas. Adems, la energa necesaria para llevar a cabo esta sntesis se obtiene de dos fuentes diferentes: la energa solar o las reacciones qumicas. El metabolismo bacteriano representa uno de los mayores puzzles para el estudiante de bioqumica, ya que presenta todos los tipos de nutricin posible, y todas las rutas metablicas posibles. El anlisis detallado de dichos metabolismos representa una prueba de fuego que mide el grado de comprensin alcanzado con respecto a los diferentes procesos metablicos estudiados. Veamos, a continuacin, diferentes clasificaciones de las bacterias. Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energa, las bacterias se pueden dividir en: Si la energa procede de radiaciones: bacterias fototrofas, que a su vez pueden ser: Fotolitotrofas: captan energa lumnica en presencia de sustancias inorgnicas. Fotoorganotrofas: captan energa lumnica con requerimiento de sustancias orgnicas. q Si la energa se desprende a partir de molculas qumicas en reacciones biolgicas de xido-reduccin: bacterias quimiotrofas, que a su vez pueden ser: Quimiolitotrofas: captacin de energa qumica a partir de sustancias inorgnicas. Quimioorganotrofas: captacin de energa qumica a partir de sustancias orgnicas. Desde el punto de vista biosinttico (o sea, para sus necesidades plsticas o de crecimiento), las bacterias se pueden dividir en: q Litotrofas: son aquellas que slo requieren sustancias inorgnicas sencillas (SH2S0, NH3, NO2-, Fe, etc.). q Organotrofas: requieren compuestos hidrocarburos, lpidos, protenas, alcoholes...). orgnicos (hidratos de carbono,

SOLUCIONES: 1. Los procesos asimilativos se refieren a la utilizacin de los compuestos para producir la energa para la asimilacin reductora del carbono. En los procesos 7

asimilativos, los productos finales, en este caso los nitratos, son productos de desecho (residuos) que se acumularn en el suelo para alimentar a las plantas. En los procesos disimilativos, los compuestos que antes se utilizaban como fuente de electrones ahora son utilizados como receptores de electrones al final de la cadena transportadora de electrones. En este caso, los nitratos son los receptores de electrones, que de esta manera se reducen, produciendo como residuo sustancias como el nitrgeno gaseoso. 2. Las bacterias nitrificantes son quimiolitrotrofas. 3. Fotolitotrofas, fotoorganotrofas y quimiolitotrofas son bacterias auttrofas. Las bacterias quimioorganotrofas son bacterias hetertrofas. 4. Las bacterias quimiorganotrofas tienen un metabolismo semejante al de los animales. Se caracteriza por utilizar molculas orgnicas complejas para su nutricin, de manera que la energa necesaria para los procesos anablicos la obtienen de la oxidacin de dichas molculas orgnicas. La diferencia fundamental con respecto a los organismos auttrofos es que carecen de procesos de fotosntesis (o quimiosntesis), ya que no es necesaria una transformacin energtica, puesto que las molculas orgnicas utilizadas ya contienen energa qumica lista para ser liberada. 5. Un grupo de bacterias oxida el amoniaco a nitritos con el fin de obtener la energa necesaria para llevar a cabo el Ciclo de Calvin, dejando los nitritos como residuos. Otro grupo de bacterias utilizan estos nitritos como receptores de electrones en el final de la cadena de transporte electrnico de la respiracin. Son grupos de bacterias diferentes, y en ambos casos, los compuestos utilizados participan en dos procesos metablicos diferentes. Las secuencias de las reacciones tienen lugar en sentido contrario, ya que en un caso la secuencia es oxidativa y en otro caso la secuencia es reductora. 6. La nitrificacin y la desnitrificacin son dos procesos independientes en la naturaleza, llevados a cabo por grupos diferentes de bacterias. 7. Las bacterias desnitrificantes tienen respiracin anaerobia, ya que el aceptor final de electrones no es el oxgeno, sino los nitratos. Sin embargo, del esquema de la nitrificacin no podemos decir qu tipo de respiracin tienen las bacterias nitrificantes, ya que las reacciones nos proporcionan la oxidacin de los donadores en los procesos de reduccin del carbono, no la reduccin de los aceptores al final de la respiracin. El medio de cultivo El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgnicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones fsico-qumicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estar formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las clulas, las condiciones fsicoqumicas y fisiolgicas del medio, la naturaleza y composicin de la fase gaseosa y las condiciones de incubacin, especialmente la humedad y la temperatura. 8

 El sustrato de cultivo. La mayor parte de las lneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte ms o menos slido. El crecimiento en suspensin est usualmente restringido a algunas lneas celulares especialmente de clulas hematopoyticas y tumores ascticos. Segn si la lnea celular precise o no unirse al sustrato para proliferar se dice que es dependiente (adhesin) o independiente (suspensin) de anclaje: La mayor parte de las clulas que se mantienen en cultivo proceden de disgregacin tisular o de tumores formados por clulas adheridas y mantienen esa caracterstica: necesitan adherirse al sustrato para mantenerse. Los cultivos en suspensin suelen coincidir con los de aquellas clulas que in vivo son circulantes, en general clulas sanguneas. El gran inters que tiene el cultivo de clulas sanguneas (linfocitos) ha extendido notablemente la caracterizacin de los cultivos en suspensin. El cultivo de clulas en suspensin tiene algunas ventajas: mayor facilidad de manipulacin y pase de un cultivo al siguiente (replaqueo) pues no requieren separacin del sustrato mediante por ej. Tripsinizacin, posibilidad de cultivo en mayor escala pues slo dependen de la accesibilidad del medio y de los gases pero no de la superficie del recipiente, etc... y algunas desventajas: son cultivos homogneos en los que se pierden las interacciones (espaciales, de adhesin, etc...). Los tipos de sustrato ms empleados en la actualidad son los siguientes: Vidrio. Empleado usualmente como sustrato de cultivo tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y esterilizacin. Asimismo es especialmente til para su posterior observacin al microscopio por su calidad ptica. Plstico desechable. Muy empleado en la actualidad como material desechable estril por irradiacin. El plstico ms empleado es el polietileno, de buena calidad ptica. Debido a que este plstico es hidrofbico requiere un tratamiento mediante irradiacingamma, qumico, o mediante descargas elctricas que produzca una superficie hidroflica. El tratamiento es caracterstico de los diferentes suministradores, y por ello los productos varan en calidad de uno a otro. Aunque para la mayor parte de los usos rutinarios no es necesario, es recomendable probar muestras de distintos orgenes y medir la eficacia de plaqueo y las tasas de crecimiento para maximizarlas especialmente en aquellas lneas celulares de crecimiento difcil. Otros plsticos que se emplean son polivinil-cloruro, policarbonato (PVC), politetrafluoretileno (tefln, PTFE), thermanox (TPX). Actualmente es de gran inters, especialmente para el cultivo de clulas epiteliales polarizadas, el uso de membranas plsticas porosas. Un ejemplo de este tipo de cmara se representa en la figura. Microsoportes ("microcarriers"). Se trata de soportes plsticos (polietileno), de sephadex o poliacrilamida en forma de pequeas bolas ("beads") a las que se unen las clulas dependientes de anclaje. Estas bolas con las clulas adheridas se mantienen en suspensin. 9

Otros sustratos artificiales. Se han desarrollado tcnicas para crecer clulas de glia en sustratos metlicos, de paladio (Westermark, 1978) o en discos de acero (Birnie y Simmons, 1967). Superficies tratadas. La adherencia y crecimiento de las clulas en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido a la presencia de colgeno o fibronectina liberada por las clulas, o bien sobre superficies recubiertas de protenas de matriz extracelular (fibronectina, colgeno, vitronectina, Matrigel, etc...). As, se pueden tratar los recipientes de cultivo con fibronectina (1 ng/mL) aadido al medio, o con colgeno. El tratamiento con colgeno desnaturalizado aumenta la adhesin de muchos tipos celulares, y especialmente de las clulas epiteliales. Muchos resultados parecen indicar que el tratamiento de las superficies con compuestos biolgicamente activos pueden inducir alteraciones especficas de la adhesin o el comportamiento celular. Se han descrito mtodos para la reconstitucin de membranas basales con la finalidad de optimizar las condiciones de diferenciacin celular (Reid y Rojkind, 1979). Estos resultados refuerzan la nocin cada vez ms extendida de que las interacciones clula-matriz extracelular son determinantes en la regulacin de la proliferacin y la diferenciacin. Otros tratamientos que se han usado han sido: gelatina (msculo), poli-D-lisina (algunos teratomas de ratn). "Feeder layers". Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus caractersticas diferenciadas precisan de suplementos especficos. Una manera de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares. Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente por irradiacin X o gamma). Este efecto podra ser debido a dos posibilidades: suplementacin del medio, o modificacin del sustrato. Una de las monocapas ms empleadas son los fibroblastos de ratn 3T3 irradiados. Matrices tridimensionales. Son sustratos en los que las clulas penetran, estableciendo una distribucin tridimensional: geles de colgeno (Douglas y col., 1980), esponja de celulosa sola (Leighton y col., 1951), o recubierta de colgeno (Leighton y col., 1968), o "gelfoam". En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una manera anloga a como lo hacen en el tejido de origen: clulas epiteliales de mama se organizan en disposicin tubular, mientras que las clulas del carcinoma de mama lo hacen de una forma mucho ms desordenada (Yang y col., 1981). Sustratos no adherentes. Son sustratos que no permiten la adhesin celular, por ejemplo agar, agarosa, o methocel (metilcelulosa de alta viscosidad). Son de utilidad en situaciones en las que no conviene que exista dispersin de las clulas derivadas de una originaria, por ejemplo en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus.

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Interfases lquido-gel o lquido-lquido. Se han observado en algunas situaciones proliferacin celular y adhesin a las interfases lquido- lquido o lquido-gel, a pesar de que se desconocen exactamente los mecanismos (Rosenberg, 1965). Haces microcapilares permeables (hollow fiber). Son cmaras de crecimiento de clulas formadas por un recipiente cilndrico en el que se siembra, y en el interior del cual hay un haz de capilares plsticos permeables adecuados para que las clulas se adhieran. Los capilares se encuentran conectados a un circuito de recambio del medio. Este dispositivo ofrece una gran superficie de crecimiento apta para el crecimiento celular, y un eficaz sistema de recambio del medio. Tal como se ha descrito previamente, el material ms utilizado como sustrato es el plstico desechable, en forma de diferentes tipos de recipientes. Los ms comunes son: placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaos: 3,5, 6,0 y 10 cm de dimetro son las ms empleadas cuando se trata de crecer las clulas para usar directamente en experimentos. No es recomendable, por su escasa estanqueidad, emplearlas para el mantenimiento de lneas. Multiplicas. Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96 pocillos. Ascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaos, son recomendables para el mantenimiento de las lneas y la reduccin de clulas, o bien para el crecimiento de clulas en suspensin. oller bottles". Se trata de tubos, con una cara plana sobre la que se fija el cultivo, y que se incuban en los incubadoras dotados de oller". Existen variantes con una gran superficie de adhesin (espirales de plstico...) y que se destinan a la produccin de gran nmero e clulas. Incubador tipo roller Roller bottles fase gaseosa. Los componentes ms significativos de la fase gaseosa son el oxgeno y el dixido de carbono: oxgeno. Las necesidades de oxgeno para la mayor parte de los cultivos celulares son cubiertas con la tensin atmosfrica, aunque existen cultivos, especialmente los cultivos de rganos que requieren una tensin de oxgeno superior (del 95%) posiblemente debido a la geometra del rgano y a las dificultades de difusin del gas en su interior. Se ha propuesto (McKeehan y col., 1976) que los requerimientos e selenio en el medio podran ser debidos a su papel en la detoxificacin de radicales de oxgeno, especialmente en los medios sin protenas sricas. dixido de carbono. El dixido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO2 disuelto, el pH y la cantidad de iones HCO3 De modo que para establecer un pH determinado se debe tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato sdico y la tensin CO2. Cada medio tiene una concentracin recomendada de bicarbonato y tensin de CO2 para alcanzar el pH correcto. Sin embargo, emplean otras sustancias taponadoras en la formulacin de muchos medios en la actualidad, lo que permite una estabilidad superior de pH en el medio, as como una mayor capacidad taponadora (los denominados Good's buffers: HEPES, Tricina,.. (Good et al., 1966 Aunque aparentemente podra ser posible prescindir del bicarbonato en la formulacin del medio, esto se ha revelado falso, debid probablemente a que la ausencia de bicarbonato sdico desplazara la ecuacin [1] hacia la derecha, de modo que tendera 11

a desaparece el CO2 disuelto y eventualmente el in bicarbonato, ambos aparentemente necesarios para el crecimiento celular (Itagaki y Kimura, 1974). Una alternativa es la suplementacin del medio con piruvato. Esto permite a muchos tipos celulares incrementar su produccin de CO endgeno, hacindolas independientes de la aportacin de CO2 exgeno. En resumen, los cultivos crecidos a baja densidad en un recipiente abierto precisan una atmsfera de CO2, cuya concentracin est equilibrio con el bicarbonato sdico en el medio. A concentraciones celulares muy reducidas (por ej. durante el clonaje) es necesario aadir CO2 en la fase gaseosa de los frascos cerrados. Cuando la concentracin celular es ms elevada puede no ser necesario aadir CO2frascos cerrados, pero si en frascos abiertos. En los casos en los que la densidad celular sea elevada, con mucha produccin de cido recomendable, por la elevada produccin de CO2 endgeno, mantener abierto el recipiente de modo que se pueda eliminar el exceso. Estos casos es especialmente recomendable suplementar el medio con HEPES para asegurar un correcto control del pH del medio. Propiedades fsicas. Las caractersticas del medio son: pH, osmolaridad, temperatura, viscosidad y tensin superficial. PH y capacidad taponadora. El pH ptimo de crecimiento para la mayora de tipos celulares es de 7,4 aunque existen pequea variaciones: algunas lneas normales de fibroblasto crecen mejor entre pH 7,4 y 7,7 y clulas transformadas lo hacen en el margen de 7,0 a 7,4 (Eagle, 1973), clulas epidrmicas pueden ser mantenidas a pH 5,5 (Esfinge y col., 1979). El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a pH 7,4, naranja a pH 7,0, amarillo a pH 6,5, azul-rojo a p 7,6 y prpura a pH 7,8. El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios bruscos de pH. La solucin taponadora empleada sigue siendo el tampn bicarbonato, que equilibra el CO2 atmosfrico, a pesar de su escasa capacidad taponadora, debido a: bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el cultivo. HEPES es la solucin taponadora de eleccin por su elevada capacidad taponadora en el rango 7,2 a 7,6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mM. Cuando se usa conjuntamente con Cexterno, debe estar a concentracin doble del bicarbonato para un tamponamiento adecuado (ver figura 3.3). Osmolaridad. Muchas clulas en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo bien en el rango de 260 320 mOsm/kg, con pequeas variaciones dependiendo de la especie considerada. Es recomendable emplear medios ligeramente hipotnicos para compensar la evaporacin durante el periodo de incubacin, especialmente en incubadores sin control de la hmeda ambiente. La osmolaridad se controla mediante la determinacin del punto de congelacin o la elevacin de la presin de vapor. Hay que tener ecuenta que la adicin de HEPES, de drogas disueltas en cidos fuertes y la neutralizacin posterior pueden afectar fuertemente a osmolaridad del medio. Temperatura. La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las clulas, de ah la importancia de un buen control d est en la incubacin. Influye 12

asimismo en el pH del medio, por lo que se recomienda o bien ajustar el pH de las medias 0,2 unidades debajo del ptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar en la estufa y despuajustar el pH, antes de aadirlo al cultivo. Viscosidad. La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre crecimiento. S es importante para evitar el dao celular en la agitacin del cultivo (menor dao a ms viscosidad) y en la tripsinizacin. Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero, aadiendo al medio carboximetil-celulosa o polivinil pirrolidon (Birch y Pitch, 1971). Tensin superficial. La tensin superficial se ha de mantener baja, y en general slo se ve alterada por la aparicin de espumas en el cultivo en suspensin donde se burbujea CO2. En estos casos es recomendable emplear un agente antiespumante de silicona pues estos casos se producen un aumento de la desnaturalizacin de protenas y se incrementa el riesgo de contaminacin si la espuma alcanza cuello del recipiente de cultivo. Condiciones fisiolgicas. Hacen referencia a la composicin del medio. Ya se indic que la principal dificultad para el establecimiento das lneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio "natural" como extracto Brionarios, hidrolizados de protena o sueros. Un primer grupo de medios tales como el medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, 1955, 1959) l ms complejo 199 de Morgan y col. (Morgan y col., 1950) o CMRL 1066 de Parker y col. (1950) eran medios definidos pero que precisable un suplemento de suero entre el 5 y el 20%. A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios ms complejos como NCTC 109 (Evans y co A aproximacin recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12, suplementado con elevada concentracin de suero (20%) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir Despus de aos de investigacin en la composicin de los medios la eleccin de stos sigue siendo emprica. Los principales medios empleados y sus aplicaciones son: Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con slo los aminocidos esenciales. Se necesita siempre la suplementacin con suero bovinfetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratn y clulas HeLa. Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio

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de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificarte muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificarte pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas). Condiciones generales para el cultivo de microorganismos El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

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1- disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medias sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2- consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificarte y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.

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3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. 5- Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.

6- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. 7- Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los termfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios. 16

8- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante) La evolucin de los medios de cultivo Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificarte, marcan dos importantes puntos de inflexin en su evolucin. La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido. Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificarte. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus procesos 17

metablicos, eran los nicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos. Tipos bsicos de medios de cultivo atendiendo a su estado fsico: Lquidos Semislidos Slidos Atendiendo a su utilidad prctica: Medios para aislamientos primarios: Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.) selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancias aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, KanamicinaVancomicina) enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein). Medios para identificacin: Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las

peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (Oxidacin-Fermentacin)

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Conclusiones: Los medios de cultivo son soluciones acuosas donde se desarrollan los microorganismos. El desarrollo de los microorganismos solo ocurre en presencia de los nutrientes requeridos (que dependen del microorganismo particular). Los componentes de un medio de cultivo dependen del microorganismo que se pretende cultivar y de la finalidad del cultivo. A continuacin se describe que es general la necesidad de utilizar: agua, sustancias orgnicas y sustancias inorgnicas. Los medios de cultivo slidos llevan adems un agente solidificaste Se pueden utilizar sustancias puras o mezclas de sustancias orgnicas Como sustancias puras ms comunes se encuentran los azcares: Frecuentemente son utilizados como fuente de carbono y energa por los microorganismos. Entre ellos, es comn el empleo de monosacridos como la glucosa, disacridos como la lactosa y polisacridos como el almidn. Ciertas bacterias no pueden utilizar los carbohidratos como nutrientes y se emplean otras sustancias puras (aminocidos, cidos grasos) o mezclas de sustancias orgnicas. La nutricin de todos los organismos implica el aprovisionamiento de energa para llevar a cabo las reacciones metablicas, y el suministro de materiales para la sntesis celular. En un nivel elemental, los requerimientos nutricionales de bacterias como E. coli son revelados por la composicin elemental de la clula, que consiste en C, H, O, N, S. P, K, Mg, Fe, Ca, Mn, y trazas de Zn, Co, Cu, y Mo. Los elementos se encuentran en forma de agua, iones inorgnicos, pequeas molculas, y macromolculas que sirven tanto al rol estructural como funcional en las clulas. Las funciones fisiolgicas generales de los elementos son resumidas en la siguiente Tabla.

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Comentario: Un organismo para que pueda subsistir necesita encontrarse en un ambiente necesario y las sustancias necesarias para el requerimiento de evolucin. En un nivel elemental, los requerimientos nutricionales de las bacterias cualesquiera que sean son revelados por la composicin elemental de la clula, que consiste en diferentes compuestos C, H, O, N, S, P, K, y otros. Estos compuestos pueden estar en forma de agua, iones inorgnicos, molculas y macromolculas que funcionan para el rol estructural de estas bacterias o virus. El cultivo se realiza en medio artificial, mediante la mescla de componentes purificados o de soluciones complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones adecuadas sobre soportes del medio exterior. Debe de cumplir varios aspectos para la proliferacin disponibilidad de nutrientes adecuados, consistencia adecuada del medio, presencias de oxigeno y otros gases, condiciones adecuadas de humedad, luz ambiental, pH, temperatura y esterilidad del medio, y los tipos bsicos de cultivo es su estado fsico: lquido, semislidos, slidos. Entre algunas bacterias tenemos las nitrificantes que son quimiolitrofas, fotolitotrofas, fotoorganotrofas y quimiolitrofas son bacterias auttrofas, hay bacterias quimioorganotrofas que son bacterias hetertrofas. En general la necesidad de utilizar: agua, sustancias orgnicas y sustancias inorgnicas. Los medios de cultivo slidos llevan adems un agente solidificaste

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Bibliografa ESTUDIO DE LA FISIOLOGA DE LOS MICROORGANISMOS PROFESORA: ELCI VILLEGAS Soluciones Cultivos Celulares Protocolos y tcnicas Cultek www.biologia.edu.ar/bacterias/nutric~2.htm Bioqumica de los seres vivos

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Anexos: Medio de cultivo

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Nutricin bacteriana

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