Bruce LL A 201102

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Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Gnero Brucella spp

Prof. Marcos JP Gomes
DOENA DE BANG, ABORTO CONTAGIOSO, ABORTO INFECCIOSO, ABORTO ENZOTICO E "SLINKING OF THE CALF".
Homem: FEBRE ONDULANTE, FEBRE DE MALTA OU DO MEDITERRNEO, FEBRE

MALTESA, FEBRE DE GIBRALTAR
ATUALIDADES Atualmente (2011), na List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature do pesquisador J.P. Euzby e o site www.bacterio.cict.fr/b/brucella. H citao de 10 espcies e nenhuma subespcie neste genro, entretanto existem espcies no gnero Brucella. So elas: Brucella abortus (Schmidt 1901) (Meyer and Shaw 1920). Brucella canis (Carmichael and Bruner 1968) Brucella ceti (Foster et al. 2007) Brucella inopinata (Scholz et al. 2010) Brucella melitensis (Hughes 1893) (Espcie tpica do gnero). Brucella microti (Microtus arvalis Scholz et al. 2008) Brucella neotomae (Neotoma lepida Stoenner and Lackman 1957) Brucella ovis (Buddle 1953). Brucella pinnipedialis (Foster et al. 2007) Brucella suis (Huddleson 1929,) HISTRICO A primeira espcie do gnero Brucella foi isolada, em 1887, pelo Dr. David Bruce, em amostras (bao) colhidas em necropsia de militares que morreram vtimas dessa enfermidade nas costas do Mediterrneo, chamada de Febre de Malta. O organismo foi mais denominado Micrococcus melitensis e mais tarde denominado de Brucella melitensis. Em 1897, um veterinrio dinamarqus chamado Bernard Bang, isolou e denominou de Bacillus abortus e, mais tarde foi conhecida como Brucella abortus de um feto bovino abortado. A B. suis foi isolada, em 1914, por Jacob Traum, de um leito abortado. Na Nova Zelndia, uma doena genital de ovinos foi associada ao organismo do gnero Brucella spp por M.B. Buddle e Boyes, em 1956. Um organismo, provavelmente idntico ao isolado na Nova Zelndia foi isolado na Austrlia de carneiros infectados por Simmons e Hall, em 1953. A B. neotomae foi isolada, pela primeira vez, em roedores do deserto de Utah em 1957, por Stoenner e Lachaman, nos Estados Unidos. A B. canis foi isolada em 1966, nos EUA e, posteriormente descrita por Carmichael, em 1969. As espcies B. ovis e a B. canis so mais adaptadas aos seus hospedeiros do que a B. abortus, B. melitensis ou a B. suis. Em 1994, novas espcies do gnero Brucella foram isoladas e identificadas de pinpedes (focas), nas costas da Esccia, por Ross e colaboradores. Em 2007, os novos isolados foram includos no gnero Brucella como o nome de B. pinnipedialis (Foster et al. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS 2007). Nos Estados Unidos de um cetceo (golfinho) capturado, por Ewalt e colaboradores, em 1994. Mais tarde, esses isolados foram incluidos no gnero Brucella com o nome de B. ceti (Foster et al. 2007). As amostras isoladas desses mamferos marinhos e os testes sorolgicos neles realizados demonstraram que a infeco bruclica ocorre em um grande numero de espcies marinhas. Em 2008, nos Estados Unidos (Oregon), Barun Kumar De e colaboradores descreveram as caractersticas microbiolgicas, bioqumicas e moleculares de uma linhagem de Brucella incomum (BO1) isolada de uma prtese de seio (silicone) de uma senhora com 71 anos de idade com sinais clnicos compatveis com brucelose. A anlise inicial, incluindo teste de susceptibilidade bioqumica, TSA, anlise de cidos graxos e anlise molecular baseadas na reassociao do ADN-ADN e presena de mltiplas cpias de IS711 sugeriram que o isolado era uma brucella like organism, mas a determinao da espcie, atravs de dados moleculares baseados no sequencionamento do 16S rARN e na anlise sequencial multilocus, demonstraram que a linhagem BO1 era uma cepa incomum, atpica e nova de Brucella, pois no est relacionada as atuais espcies descritas. Em 2010 ela foi includa na List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature com a denominao de B. inopinata (brucela no esperada). Em 2009, Nos Estados Unidos (Texas), Natalia E. Schlabritz-Loutsevitch e colaboradores descreveram e relataram, pela primeira vez, um novo isolado de Brucella associado a dois casos de morte neonatal em primatas (babunos). As amostras do tero isoladas foram caracterizadas, utilizando os testes bioqumicos tradicionais, PCR e sequenciamento de multilocus. Os isolados se assemelham morfologicamente a Brucella embora suas caracteristicas no fossem consistentes com qualquer espcie descrita. No Brasil, a brucelose foi detectada, pela primeira vez, por Gonalves Carneiro, em 1913, que relatou um caso de brucelose humana. Desde l, vrios inquritos epidemiolgicos revelaram a presena da enfermidade nos animais domsticos em todo o pas. A brucelose bovina causada pela B. abortus a mais prevalente das infeces bruclicas no Brasil, seguida da B. suis em sunos. A B. melitensis e a B. neotomae no foram isoladas/identificadas no pas (Poester et al., 2002). Em 1977, um levantamento nacional estimou a prevalncia para cada regio do pas. Neste estudo a regio Norte obteve uma prevalncia de 4,1%; a regio Nordeste com 2,5%; a regio Centro-Oeste com 6,8%; Sudeste com 7,5% e regio Sul com 4%. (Brasil, 1977). Em 2001, o Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA) instituiu o Programa Nacional de Controle e Erradicao de Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) que definiu estratgias no controle da brucelose bovina no Brasil (Instruo Normativa 2004). Os inquritos sorolgicos realizados no perodo compreeendido entre 2001 e 2004, nos 13 estados (BA, ES, GO, MG, MT, PR, SC, RJ, RS, SP, SE, TO e DF) constataram que a infeco est disseminada em todas as reas estudadas e que a situao desigual entre os estados e mesmo entre regies de um mesmo estado. Detectou-se uma tendncia de crescimento da brucelose bovina no pas (Centro-Oeste / Norte) com elevao nos estados com muita tradio na pecuria de corte. Mato Grosso apresentou aumento da prevalncia quando comparado ao ltimo levantamento da situao nacional realizado em 1975 (Anselmo e Pavez, 1977). Outros estados diminuram sua prevalncia, especialmente os Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS estados de Minas Gerais e Santa Catarina que apresentou os menores ndices do Brasil (Lage et al. 2008). CARACTERSTICAS GERAIS DO GNERO Cocos, cocobastonetes ou bastonetes curtos com 0,5-0,7 de dimetro e 0,6-1,5m de comprimento; arranjos individuais, aos pares, cadeias curtas ou mesmo em pequenos grupos; acapsulados; no possuem colorao bipolar verdadeira; no possuem esporos; Gram negativas; imveis; no flagelados; aerbias, possuindo metabolismo do tipo respiratrio; possuem sistema citocromo, e como aceptor final de eltrons, oxignio ou nitrato e, sendo assim nitrato redutase produzida. Muitas amostras requerem CO2 suplementar para seu crescimento, especialmente no cultivo primrio. As colnias, em agar dextrose ou outro meio sem sangue so transparentes, elevadas, convexas com bordos inteiros, lisos e com superfcie brilhante. Possuem cor de mel quando iluminadas com luz transmitida. Variantes rugosas de espcies lisas existem. Existem tambm espcies rugosas estveis com uma preferncia por determinados hospedeiros (caninos e ovinos). A temperatura tima de crescimento de 37C. O crescimento ocorre entre 20C a 40C e o pH timo entre 6,6 a 7,4; catalase positiva; geralmente oxidase positiva; quimiorganotrficas. A maioria das cepas requer meios de cultivo seletivo e complexo, contendo aminocidos, tiamina, nicotinamida e ons de magnsio. Algumas cepas podem ser induzidas ao crescimento em meio mnimo, contendo sais de amnio como nica fonte de nitrognio. O crescimento promovido pela adio de soro ou sangue, entretanto hemina (Fator X) e nicotinamida adenina dinucleotdio (NAD Fator V) no so essenciais. Produz cido, mas no de carboidratos em meios convencionais, exceto para a B. neotomae. No produzem indol; no liquefaz a gelatina ou soro coagulado; no lisam hemcias; no produzem metil carbinol (Teste de Voges-Proskauer); vermelho de metila negativo; possuem antgenos intracelulares especficos para o gnero; so parasitos intracelulares facultativos. So agentes infecciosos transmissveis para muitas espcies animais, e o homem. TAXONOMIA Classicamente, o gnero Brucella continha seis espcies, mas continua evoluindo. Atualmente, novas espcies foram includas. Cada uma das espcies possui seus hospedeiros preferenciais: B. abortus (bovinos); B. melitensis (caprinos e ovinos); B. suis (sunos); B. canis (caninos); B. ovis (ovinos); B. neotomae (rato do deserto, Neotomae lepida); B. microti (camundongo do campo, Microtus arvalis); B. ceti (cetceos); B. pinnipedialis (penpedes) e a B. inopinata (homem). Todas so importantes patgenos para os animais (domsticos e silvestres) e o homem, causando uma doena que denominada genericamente de brucelose. Exceto a B. neotomae e a B. ovis, todas as demais so capazes de infectar o homem. Novas espcies como B. pennipedialis dos penpedes; a B. ceti dos cetceos e a B. microti do roedor Microtus arvalis, e a B. innopinata isolada do homem foram includas recentemente no gnero. As alteraes causadas pela brucelose so encontradas nos rgos reprodutores e sistema microctico fagocitrio (retculo-endotelial). As leses no trato reprodutor incluem Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS placentites e/ou abortamentos (bovinos, ovinos, sunos e caprinos) que levam infertilidade, associadas s perdas econmicas importantes. A facilidade com que algumas espcies do gnero Brucella podem ser transmitidas (direta ou indiretamente) aos animais e ao homem mostra a importncia do controle desta enfermidade. As caractersticas morfotintoriais e culturais no so suficientes para diferenciar as espcies novas e clssicas, assim como os seus vrios biovares. Pode no ser correto associar o isolamento de uma espcie ou biotipo a um hospedeiro, muito embora, cada espcie tenha certa predileo por certos hospedeiros, conforme o quadro I. Quadro I. As principais espcies de Brucella spp e seus hospedeiros preferenciais
Espcies Hospedeiro Preferencial Outras espcies _______________________________________________________________________________ Bovinos B. abortus B. melitensis** B. suis Ovinos B. melitensis** B. ovis (Epididimite) B. melitensis** B abortus B. suis B. abortus
Caprinos Eqinos Sunos
B. abortus B. suis B. melitensis** B. abortus B. abortus B. melitensis** B. suis B. canis
Caninos
B. canis
Homem
B. abortus B. melitensis** B. suis B. inopinata** B. ceti** B.pinnipedialis** B. neotomae**
? ? ?
Roedores (Neotoma lepida) Camundongo campo (Microtus arvalis) Cetceos Penpedes
B. microti**
B. ceti** B. pinnipedialis**
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** No h registro dessas espcies do gnero Brucella no Brasil, at o presente momento.
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS DIAGNSTICO LABORATORIAL O diagnstico laboratorial complexo, pois exige equipamento, meio e pessoal qualificado. As caractersticas diferenciais entre diferentes espcies clssicas e seus biovares do gnero Brucella mostrado no Quadro II abaixo
Quadro II. Caractersticas diferenciais entre espcies/biovares clssicas do gnero Brucella
__________________________________________________________________________________ C r e s c i m e n t o em c o r a n t e s A g l u t i n a o do s o r o Espcies Biovar CO2 H2S Tionina Fucsina bsica A M R _________________________________________________________________________________ B. melitensis 1 n n + + n + n 2 n n + + + n n 3 n n + + + + n B. abortus 1 2 3 4 5 6 7 9 1 2 3 4 5 (+) (+) (+) (+) n n +/n n n n n n n + n + + + + n n + + + n n n n n n + n n + n + + + + + + + + + + + (n) + n + (+) + + + + n n + (-) n (n) n n + + + n n + + n + + + + n n n + n n n + + n + + n n n + + n n n n n n n n n n n n n n n n + + n
B. suis
B. canis B. ovis B. neotomae
Obs. * n = negativo-
+ = positivo
Brucella abortus
Prof. Marcos JP. Gomes
BRUCELOSE BOVINA
INTRODUO O isolamento de Brucella abortus foi obtido nas diversas populaes bovinas distribudas pelo mundo, embora sejam raros em pases onde programas de controle e erradicao foram bem sucedidos. MORFOLOGIA E COLORAO A B. abortus um bastonete curto ou cocobacilo, medindo 0,5 a 0,7 por 0,6 a 1,5m. Os bastonetes so to curtos que podem ser confundidos com cocos. Eles esto presentes em arranjos individuais ou cadeias curtas. A B. abortus por ser um parasito intracelular facultativa e frequentemente encontrada em aglomerados ou em esfregaos de exsudatos. A B. abortus Gram negativa, corando-se, com alguma dificuldade, pelos corantes comuns. Ela no lcool cido resistente, mas pode resistir descolorao com alguns cidos fracos; esta propriedade confere a base para algumas coloraes especiais tais como a colorao de Kster em que o organismo cora-se de vermelho vivo. B. abortus no mvel, no forma esporos e no possui cpsula bem desenvolvida. Entretanto, a presena desta cpsula pode ser demonstrada em cepas isoladas, utilizando-se corantes especiais. RESISTNCIA E SOBREVIVNCIA As espcies so inativadas pela pasteurizao entre 10 e 15 segundos; so destrudas rapidamente pelos desinfetantes comuns como o cresol 3%; hidrxido de sdio a 2%; compostos de ortofenis 3-5%; mercuriais e lcool 70%. O crescimento de B. abortus fora da clula dos mamferos hospedeiros no tem importncia na epidemiologia da doena, pois ela no se multiplica fora dos animais e somente persiste no ambiente. A viabilidade dela fora do hospedeiro influenciada pelas condies ambientais. A sua viabilidade aumentada em temperatura mais amena e umidade, sendo diminuda quando h alta temperatura, luz solar direta e dessecamento, como demonstrado no Quadro II. A resistncia fora do corpo do hospedeiro de aproximadamente: 5 dias temperatura ambiente; 30-37 dias quando secas lentamente no solo; 75 dias no feto abortado em clima temperado. O tempo de sobrevivncia nas fezes parece ter importncia, especialmente em muitos sistemas produtivos. O tempo de sobrevivncia das fezes lquidas varia, sendo dependente da temperatura de estocagem. Na temperatura de 4550 C a sobrevivncia da B. abortus de 4 horas, enquanto que na temperatura de 15C de aproximadamente 8 meses.
Quadro II. Sobrevivncia da B. abortus, segundo o ambiente e o tempo

Ambiente Luz direta Solo Seco mido Frio Fezes Fluidas Altas Temperaturas Urina gua Tratada Poluda Feto sombra 5 114 dias 30 150 dias 180 dias 8 240 dias 2 dias 5 dias 4 dias 66 dias 151 185 dias Tempo 4,5 h
OUTRAS FONTES DE INFECO O papel dos touros na transmisso da B. abortus tem sido objeto de investigaes. A B. abortus pode causar orquite, epididimite e vesiculite seminal e a localizao nesses lugares resulta na eliminao do agente pelo smen. Seu potencial de transmisso est associado ao mtodo de reproduo (monta natural, I.A.) e, freqentemente touros infectados permanecem frteis. Equdeos domsticos so susceptveis infeco com B. abortus havendo pouca evidncia que eles possuam um papel significante na epidemiologia da doena. A B. abortus geralmente localiza-se na bursa, tendes, msculos e articulaes assim como tecidos e trato reprodutivo. O achado clnico clssico o abscesso fistulado denominado Mal das cernelhas ou Mal das Cruzes. CARACTERISTICAS CULTURAIS E BIOQUMICAS O crescimento pode ser aerbio, mas muitas cepas necessitam tenso de CO2 para o seu crescimento, especialmente no isolamento primrio (B. abortus e B. ovis). A B. abortus catalase e oxidase positivas, produzindo H2S de protenas ou peptdeos ricos em aminocidos e enxofre. Geralmente produz urease. Os biovares foram classificados segundo os testes: 1)suscetibilidade aos corantes; 2)necessidade de CO2; 3)produo de H2S e 4)presena do antgeno de superfcie A ou M. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS A B. abortus no hemoltica, no liquefaz a gelatina e no produz cido a partir da glicose ou outro carboidrato, possuindo um padro de oxidao de substrato. O crescimento de B. abortus incrementado pela adio de sangue ou soro. Meios com composio complexa como soro dextrose agar ou Albimi Brucella agar ou caldo devem ser utilizados no isolamento primrio e/ou na manuteno de cepas. Antimicrobianos podem ser adicionados ao meio bsico (polimixina B 5.000 UI/L; bacitracina 25.000 UI/L; ciclohexamida 100 mg/L; cido nalidxico 5 mg/L; nistatina 100.000UI/L e vancomicina 20 mg/L), inibindo o crescimento de contaminantes em amostras de placenta, secrees vaginais, leite ou fluido do abomaso de fetos abortados. As colnias da B. abortus no isolamento primrio so de crescimento lento e raramente visvel antes das 48 horas. Elas atingem o crescimento mximo aps 5 a 7 dias a 37C. A colnia isolada pode ser lisa, caracterizado por serem convexas; redondas com o bordo inteiro; podem estar dissociadas ou rugosas, caracterizadas por serem colnias chatas, grandes com aparncia granular e opacas. O crescimento esparso no meio fluido. A quantidade de C+G do ADN de 57%. A B. abortus mostra 100% de homologia com as outras brucelas, exceto a B. ovis. FAGOTIPAGEM A fagotipagem utilizada para identificar diferentes espcies de Brucella spp, incluindo as amostras de B. abortus. Os fagos utilizados na rotina so Tb, Wb, Fi, Bk2 e R. A diluio do fago conhecida como RTD (Routine Test Dilution) que corresponde a 104-105 unidades formadoras de placas por mililitro (UFP/mL). O RTD o nmero mnimo de fagos responsvel pela lise confluente numa cepa propagante. Os procedimentos para fagotipagem foram descritos em detalhes por Corbel e Hendy (1985). A fagotipagem uma ferramenta rpida e segura na identificao de espcies do gnero Brucella. ANTGENOS A parede celular da B. abortus consiste de uma camada externa de lipopolissacardio na qual a cadeia de polissacardeos fica exposta. A cadeia de polissacardeo possui os antgenos de superfcie principais (A ou M), os quais esto envolvidos na aglutinao. Estes antgenos da B. abortus nas cepas lisas esto relacionados com antgenos de superfcie encontrados na Yersinia enterocolitica 09, sendo fonte de confuso na interpretao de testes sorolgicos para a brucelose. As protenas da parede celular esto agrupadas em 3 categorias de acordo com o peso molecular (SDS-PAGE). As protenas possuem: a) 8.000 a 94.000D; b) 35.000 a 40.000D (porinas) e c) 25.000 a 30.000D. O antgeno protico provavelmente estimule a reao de hipersensibilidade retardada, provavelmente uma porina. Os antgenos envolvidos na resposta celular no esto totalmente identificados. EPIZOOTIOLOGIA A B. abortus um agente intracelular facultativo de bovinos e outras espcies, sendo transmitida pela ingesto do alimento ou secrees contaminadas. A transmisso venrea possvel, mas pouco comum. A transmisso congnita ou intramamria pode ocorrer. Equinos, ovinos e ces podem infectar-se, mas a transmisso, nestas espcies, para Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS o hospedeiro primrio pouco provvel. A doena encontrada em todas as regies criatrias de bovino no mundo, exceto nas reas onde os programas de erradicao tiveram sucesso. A B. abortus no resistente luz solar e dissecao, sobrevivendo mais no inverno do que no vero. Sobrevive no leite, mas destruda pela pasteurizao. A brucelose bovina endmica no Brasil, estando presente e diagnosticada em todos os estados, entretanto h grandes variaes entre as estimativas dos estados. O Ministrio da Agricultura (MA), em 1975, num levantamento soroepidemiolgico estimou a prevalncia da infeco bruclica em bovinos em 4,0% na regio Sul; 7,5% na regio Sudeste; 6,8% na regio Centro-Oeste; 2,0% na regio Nordeste e 4,1% na regio Norte (Anselmo e Pavez, 1977; Poester et al., 2002). Outros estudos, realizados principalmente na dcada de 80 no detectaram mudanas significativas comparadas estimativa da dcada anterior. No comeo da dcada de 1990, Minas Gerais iniciou uma campanha de vacinao compulsria de terneiras com a B19 em todo o estado. Alm de Minas Gerais, o Rio Grande do Sul era o nico estado que possua um programa de vacinao ativo, mas com menores ndices de cobertura vacinal (Paulin e Ferreira Neto, 2003). No Rio Grande do Sul, os levantamentos regionais revelaram que a situao pouco mudou nos ltimos anos. O programa bem sucedido de vacinao contra a brucelose bovina fez baixar a prevalncia de 2% para 0,6% em 1986. O ltimo levantamento, realizado em 2006, revelou uma prevalncia ao redor de 1% com variaes, segundo a regio do Estado. Segundo os dados oficiais, a prevalncia da brucelose bovina no Brasil variou entre 4 e 5%, no perodo de 1989-1998 (Brasil, 2001). Os estudos brasileiros mostraram que foram isoladas e identificadas a B. abortus biovares 1, 2, 3 e 6 e a B. suis (Garcia-Garrillo, 1987; Langenegger et al., 1975). Giorgi et al. (1972), em So Paulo, isolaram 23 amostras de B. abortus e B. suis de bovinos, sunos e equinos. No Rio Grande do Sul, Poester (1974; 1977) isolou B.abortus biotipo 1 e B. suis de bovinos, equinos e sunos. No Rio de Janeiro, Langenegger et al. (1975), isolaram e identificaram 10 amostras B. abortus, sendo 4 cepas de B. abortus biotipo 1 e 6 do biotipo 3 de bovinos em matadouro. A maioria dos casos de brucelose humana est ligada a atividade profissional do trabalhador e essencialmente relacionada com o magarefe. A prevalncia da infeco humana ou animal muito provavelmente esteja subestimado, pois so reduzidos os trabalhos disponveis. Em Minas Gerais, Godoy et al. (1977) estimaram prevalncia de 0,28% de reagentes dentre 9.360 amostras de doadores de sangue. Barufa (1978), no Rio Grande do Sul, evidenciaram que a enfermidade era mais frequente em pessoas da zona rural; mais frequente no homem do que na mulher e que o consumo de queijo no pasteurizado seria a fonte de infeco para o homem. Nos Estados Unidos, 85% das infeces em bovinos so causadas pelo bitipo 1; as remanescentes pelos bitipos 2 e 4. As propriedades de maior tamanho provavelmente possuem maiores infeces maiores pela manuteno de animais, latentemente infectados. O uso de reas de pastejo comunitrias pode ser um fator na transmisso de B. abortus entre as propriedades. H casos de infeco por B. abortus em vrias espcies silvestres como bises, cervdeos e alces. O convvio destas espcies com bovinos aumenta a possibilidade de infeces cruzadas, representando uma via pouco frequente. Na frica, a Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS situao bem diferente, ocorrendo casos de brucelose bovina devido transmisso, atravs dos animais silvestres. Os animais pr-pberes so geralmente resistentes infeco, mas h um aumento da suscetibilidade infeco com o amadurecimento sexual e prenhez. A infeco da bezerra (terneira) pode ocorrer no tero da me ou pela ingesto de leite contaminado. Animais expostos podem desenvolver infeces latentes que no so detectveis, atravs de testes sorolgicos. A freqncia de tais infeces est estimada em 2 a 3 % dos animais expostos. Os animais com infeco latente podem permitir a transmisso da infeco ao produto e disseminar a brucelose em uma propriedade (tida como) indene. Nos machos, os casos de epididimites e orquites so relativamente comuns, podendo assim, transmitir a brucelose, atravs do smen contaminado. A principal porta de entrada da B. abortus a mucosa oral de terneiros ou terneiras que ingerem leite contaminado; nasofaringe e a mucosa conjuntival e, mais raramente, o trato genital de machos e de fmeas. Sob condies experimentais, o organismo penetra na pele ntegra de cobaias, sunos e bovinos. Aps a penetrao a B. abortus dirige-se ao linfonodo regional e, posteriormente corrente sangunea. A fase de bacteremia resulta na disseminao do organismo ao bere, tero e linfonodos associados. A B. abortus um microrganismo intracelular facultativo, podendo sobreviver e multiplicar-se em macrfagos e clulas epiteliais. A sobrevivncia nas clulas fagocticas do hospedeiro, em parte, est relacionada falha do organismo em estimular um nvel efetivo de desgranulao aps a entrada do agente. Este efeito mais aparente em B. abortus com variantes lisas do que nas rugosas. A B. abortus possui uma resistncia natural morte intraleucocitria. O agente prolifera maciamente em clulas com altos nveis de eritritol, como aquelas encontradas no trato genital de fmeas prenhe e macho. As bactrias penetram nas clulas epiteliais do crion e proliferam, produzindo placentite e endometrite com ulcerao da camada de revestimento do tero. As leses no feto incluem: edema, congesto pulmonar, hemorragias do epicrdio e da cpsula esplnica. A morte fetal segue, mas no certo que seja devido endotoxinas da B. abortus ou interferncia da funo placentria. A presena dos organismos induz inflamao das membranas, interferindo com a circulao do feto e pode explicar o porqu do aborto. O feto morre por falta de aporte nutricional. O organismo encontrado no estmago e pulmes do feto abortado. O aborto, geralmente ocorre no tero final da prenhez. Aps o parto ou aborto a B. abortus est presente nas descargas uterinas por poucos dias, sendo gradualmente eliminada do trato reprodutivo. A infeco pode ser mantida no sistema microctico fagocitrio e bere. Grande nmero de bactrias eliminado no leite e fonte de infeco para bezerros (terneiros) e para o homem. A maioria dos infectados permanece portador pela vida, eliminando o organismo no exsudato e no leite, aps cada parto. A B. abortus pode ser detectada nos linfonodos do trato digestivo e bao de animais infectados, podendo ser isolada do sangue e de higromas do joelho. O higroma da articulao do joelho possui alta correlao com abortos causados por B. abortus em animais no continente africano, onde um grande nmero de organismos virulentos est presente no fluido. B. abortus pode infectar equinos em menor frequncia do que em bovinos. Nos equinos, as localizaes preferenciais so: bursas, articulaes ou bainhas tendneas, e tem Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS sido encontrada em bursites supra-atlantal, bursites supra-espinosa e em cernelhas fistulosas (Mal das cernelhas). Esta bactria pode tambm infectar ovinos, caprinos e sunos, mas numa frequncia menor. IMUNIDADE A B. abortus parasito intracelular facultativo, podendo escapar do efeito bactericida do anticorpo ou complemento presente no plasma. A imunidade protetora depende principalmente da resposta celular em que a atividade ltica dos macrfagos iniciada, aps a ativao das linfocinas pelos linfcitos T. A opsonizao pelos anticorpos facilita a entrada da bactria nos macrfagos, aumentando a possibilidade da morte bacteriana intracelular. As bactrias multiplicam-se mais lentamente nos macrfagos de animais vacinados do que em animais controle no vacinados. O anticorpo humoral pouco correlacionado com a imunidade protetora. Fmeas vacinadas com B19, quando (bezerras) terneiras, mostram-se resistentes ao desafio, aps os ttulos carem a nveis abaixo dos detectveis. Entretanto, grandes doses de soro hiperimune podem interromper a difuso de Brucella spp nos animais infectados. Aps a infeco, aglutininas da classe IgM so as primeiras imunoglobulinas a aparecerem no plasma, atingindo o seu pique em 2 semanas. Os anticorpos IgG aparecem um pouco mais tarde, superando os ttulos de IgM em 4 a 6 semanas e, permanecendo como anticorpos dominantes. Bovinos infectados possuem altos ttulos de IgG. Estes anticorpos aglutinantes no possuem atividade opsonizante e nenhum efeito sobre a eliminao do organismo. Em bezerras vacinadas com a B 19, a produo de IgM aumenta rapidamente. O anticorpo IgG1 eleva-se mais lentamente, no atingindo altos nveis, nem persistem por muito tempo. Os anticorpos de IgG1 so muito mais baixos nos animais vacinados do que dos animais naturalmente infectados. DIAGNSTICO A infeco causada pela B. abortus pode ser detectada, atravs do: a) diagnstico bacteriolgico; b) diagnstico sorolgico e c) diagnstico molecular. Diagnstico bacteriolgico O isolamento da B. abortus obtido pelo cultivo no meio base (agar Triptose ou agar Albimi) com a adio de soro e ATMs. O cultivo incubado 37C em uma atmosfera de 10 % de CO2, durante, pelo menos, 4 dias. As amostras podem ser obtidas de feto abortado; placenta; exsudato uterino; leite e abscessos. A prova biolgica consiste na inoculao de tecidos ou fluidos macerados em cobaias, devendo ser sacrificados 3 a 6 semanas, mais tarde. O soro testado para a presena de anticorpos e os rgos como o bao, fgado, linfonodos regionais e testculos devem ser cultivados para o re-isolamento de B. abortus. O exame direto de tecidos pode ser realizado pela IF (Imunofluorescncia) ou pela imunoistoqumica. Estas tcnicas podem ser importantes, especialmente em amostras contaminadas (membranas fetais, cotildones, secrees vaginais ou fetais), apesar de ser pouco utilizada na prtica. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS Diagnstico sorolgico Os testes sorolgicos para diagnstico da brucelose tiveram inicio, em 1897, com o desenvolvimento do teste de aglutinao de Wright (Wright e Smith, 1897). Problemas de reaes sorolgicas positivas resultantes de exposio a outras bactrias ou reaes cruzadas foram detectados. Desde ento, melhores testes tm sido desenvolvidos e muitos destes so utilizados mundialmente. Raras enfermidades infecciosas apresentam tanta variedade diagnstica como a brucelose. Estes mtodos incluem testes aplicados no soro, no sangue total, no muco vaginal, no plasma seminal, no leite dessorado ou no leite total. O diagnstico da brucelose, de um modo geral, enfrenta situaes especficas e prprias que podem interferir com o desempenho dos testes aplicados (sensibilidade e especificidade). Reaes inespecficas so atribudas a anticorpos naturais ou a produtos catablitos de organismos que compartilham antgenos de estruturas semelhantes s da Brucella. Reaes cruzadas com outros microrganismos como: Salmonella urbana, Escherichia coli O:116 ou O:157, Stenotrophomonas maltophilia e Yersinia enterocolitica O:9 so alguns desses exemplos. A membrana externa da brucela lisa composta de fosfolipdios, protenas e LPS-S. A maioria dos testes sorolgicos, particularmente aqueles que utilizam suspenso de bactrias ntegras como o teste de soro-aglutinao lento (SAL) em tubo; o teste do Antgeno Acidificado Tamponado (AAT) e o teste de Fixao do Complemento (FC); a maioria dos testes de ELISA e o Teste do Anel em Leite (TAL) foram desenvolvidos para detectar anticorpos contra a cadeia O do LPS-S. Estes testes so teis em levantamentos, campanhas em larga escala e em programas sanitrios de controle e erradicao com fins comerciais, muito embora outros testes como ELISA no sejam oficialmente reconhecidos no Brasil, no contexto do Programa Nacional de Controle e Erradicao da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT). Alguns destes testes so aplicados como teste de triagem por serem baratos, simples, com alta sensibilidade, seguidos de testes confirmatrios mais especficos. Teste do Antgeno Acidificado Tamponado (AAT) O teste do AAT uma modificao do teste de aglutinao em placa. O antgeno corado pelo Rosa de Bengala e tamponado a um pH de 3,65. Neste pH as aglutininas no especficas so inativadas o a IgG dos animais infectados, aglutinam fortemente. Iguais volumes de soro e antgeno (30l) so misturados; agitados por 4 minutos e observados em caixa com iluminao indireta. O teste barato e simples de realizar. Apesar de melhorar a especificidade num pH cido, resultados falso-positivos podem ocorrer, geralmente devido a presena de IgM devido a vacinao pela B19.
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS 1) B. abortus ; 2) B. canis ; 3) B. ceti ; 4) B. melitensis ; 5) B. microti* ; 6) B. neotomae ; 7) B. ovis ; 8) B. pinnipedialis ; 9) B. suis biovar 1 ; 10) B. suis biovar 2 ; 11) B. suis biovar 3 ; 12) B. suis biovar 4 ; 13) B. suis biovar 5 1 Urease VP Fago Tb** (Tbilisi) Fago Wb** (Weybridge) Fago Iz** (Izatnagar) Fago** R/C L-Alanina*** LArabinose*** L-Arginina*** LAsparagina*** MesoEritritol*** DGalactose*** L-Acido glutmico*** L-Lysina*** DLOrnitina*** D-Ribose*** D-xilose*** Hospedeiro preferencial +**** + + + + + + + + + + Bov 1 2 + + + d + d + + 3 + + + + d + + + + 4 + + + + + + 5 + + + 6 + d + + + + + + + d 7 + d + + 8 + ***** + + + + + Pin 8 9 + + + d + + + + d + + + + Sui 9 10 + + + + + d + + + d + + d 11 + + + d + + + d + + d 12 + + + + + + d + + d 13 + + + + d + + d + + d
Can Cet Cap Mar Nle Ov 2 3 4 5 6 7
Sui, Sui Ren Ren Leb 10 11 12 13
1) B. abortus ; 2) B. canis ; 3) B. ceti ; 4) B. melitensis ; 5) B. microti* ; 6) B. neotomae ; 7) B. ovis ; 8) B. pinnipedialis ; 9) B. suis biovar 1 ; 10) B. suis biovar 2 ; 11) B. suis biovar 3 ; 12) B. suis biovar 4 ; 13) B. suis biovar 5
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS Fixao do Complemento Este teste considerado como o teste confirmatrio na deteco sorolgica de anticorpos de animais infectados. Ele foi modificado, padronizado e adaptado ao sistema de microplacas (Alton et al. 1988; Anon, 2000). Ao contrrio do teste SAL, os ttulos no diminuem quando a doena torna-se crnica. Os resultados so expressos em unidades internacionais (UI) e, apesar de no estar padronizado no Brasil, o ponto de corte definido por alguns pases em 20 UI que aplicado rigorosamente onde a B19 no tiver sido utilizada por muitos anos. A sua aplicao restrita em pases que aplicam a B19 como a frica do Sul que frequentemente tem problemas com um nmero inaceitvel de falsopositivos, pois a vacinao induz a ttulos significantes. necessrio treinamento e experincia para certificar como livres de brucelose, quando rebanhos ou animais individualmente so positivos ao teste. Os ttulos vacinais tendem a declinar mais rpido do que aqueles devido infeco com cepas de campo. O declnio de ttulos tambm dependente da idade de vacinao dos animais. Existe uma dificuldade na diferenciao das reaes vacinais das causadas por cepas selvagens, no existindo nenhuma prova sorolgica capaz de diferenciar ttulos vacinais de infecciosos. A vacinao de novilhas e animais adultos pode resultar em muita confuso na interpretao de testes laboratoriais, sendo essencial o registro de vacinaes e de datas de nascimento para permitir a correta interpretao dos resultados do testes de FC. Este teste preconizado em bovinos para comrcio internacional. Teste de Soroaglutinao lenta (SAL) O teste de soro-aglutinao em tubo (SAL) foi, no passado, utilizado nos programas de erradicao da brucelose em muitos pases. O antgeno e as condies do teste foram padronizados internacionalmente. O teste realizado em pequenos tubos e com diluies seriadas do soro. A aglutinao completa na diluio 1:100 ou maior considerada positiva. Mais tarde, este teste foi adaptado como teste de SAR (soro aglutinao rpida) e hoje no mais utilizado. Em alguns pases, o teste de SAL foi, e ainda utilizado, associado ao teste do 2mercaptoetanol (2ME), como teste confirmatrio nos programas de erradicao e controle da brucelose. Ele considerado como de alta especificidade quando associado ao 2ME e alguns autores desencorajam o seu uso isoladamente, especialmente para propsitos comerciais. Aglutininas no especficas no soro so diminudas pela adio de EDTA, sem a reduo nos ttulos de B. abortus de animais infectados. O teste de SAL-EDTA um teste muito mais especfico e particularmente til na deteco de infeces novas, particularmente naquelas com duas semanas de curso como demonstradas em condies experimentais, mas sua utilidade em rebanhos que esto cronicamente infectados mais limitada, pois alguns animais infectados poderiam ser classificados como negativos pelo teste, pois a infeco est na fase crnica. O teste de SAL ainda muito til como teste suplementar para indicar os nveis de anticorpos IgM, a imunoglobulina aps a vacinao com a B19, mas no serve como indicador de infeco ou vacinao.
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS O teste do 2-Mercaptoetanol (2ME) um teste utilizado em paralelo com a prova lenta que por sua seletividade apenas para IgG empregado como teste complementar aos testes de triagem. Os anticorpos da classe IgM degradam-se em presena de substncias, contendo radicais tiol como o 2ME. Desse modo, as amostras de soro com predomnio de IgM apresentam-se negativas ao 2ME e positivos prova lenta. Este mesmo resultado pode ser interpretados como resultados inconclusivo. Se os 2 testes forem positivos com predomnio de IgG, eles podem indicar infeco. O teste de ELISA indireto (ELISAi) O teste de ELISA indireto (ELISAi) possui uma sensibilidade semelhante do AAT, porm menor que a FC. O teste ELISA foi o teste substituto do AAT por estar padronizado e sua leitura feita por espectrofotmetro ao invs de visual. Deve-se ter cuidado ao empregar-se esta tcnica em rebanhos vacinados com B19, pois muitos resultados falso-positivos podem ocorrer. O teste tem sido indicado para o comrcio internacional de bovinos pela OIE (Anon, 2000). O teste de ELISA competitivo (ELISAc) A base deste teste foi o uso de anticorpo monoclonal seletivo (Mab) que compete com o anticorpo a ser testado. O ELISAc utiliza um Mab especfico para um dos epitopos da B. abortus (cadeia O) e que por isso possui maior especificidade do que o ELISA indireto. O ELISAc foi capaz de eliminar em parte, os problemas de reaes ps-vacinais (B19) ou com outras bactrias. Infelizmente, o ELISAc resolve apenas parcialmente este problema. Ainda persistem os anticorpos aps a infeco com Yersinia enterocolitica O:9 e pela vacinao com B19. Entretanto, a atividade do anticorpo residual devido vacinao ou reao cruzada foi menos persistente neste teste do que com os outros testes. recomendado como teste alternativo no comrcio internacional de bovinos pela OIE (Anon, 2000) Ensaio da Polarizao Fluorescente (EPF) O ensaio de polarizao fluorescente uma tcnica rpida e simples para mensurar a interao antgeno-anticorpo, sendo til tanto no laboratrio quanto em trabalhos de campo. O mecanismo do teste baseado na velocidade de rotao aleatria das molculas em soluo. Molculas menores apresentam maior velocidade e vice-versa. O antgeno, conjugado com fluorcromo de baixo peso molecular (um fragmento do polissacardeo O da B abortus) adicionado ao soro ou outro fluido a ser testado. Se o anticorpo estiver presente, h a ligao com o antgeno marcado, causando uma diminuio de taxa de rotao que pode ser medida por um equipamento de luz polarizada. O EPF tem apresentado bons resultados em trabalhos experimentais. Este teste recomendado como uma alternativa para o mercado internacional de bovinos, pela OIE. Teste do Anel em Leite (TAL) O teste do anel em leite (TAL) foi utilizado na deteco de anticorpos no leite. O desenvolvimento de reao positiva depende de duas reaes: Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS a) Glbulos de gordura no leite so aglutinados pelos anticorpos no leite (aglutininas/glbulos de gordura) b) Brucelas coradas pela hematoxilina (antgeno) que so adicionadas ao leite e que formam um complexo antgeno/anticorpo e glbulos de gordura que ascendem superfcie, formando uma camada colorida no topo do tubo de teste. O teste foi utilizado com teste de detriagem pela sensibilidade e versatilidade, pois pode detectar a infeco bruclica nas amostras de leite (tarro ou de tanques) de rebanhos com animais infectados, nos indivduos infectados de um rebanho ou no monitoramento de rebanhos livres. A sensibilidade reduzida quando aplicada em rebanhos grandes com poucos reagentes. Entretanto, a perda na sensibilidade em rebanhos grandes com 150 ou mais animais pode ser contrabalanada pelo aumento na proporo do leite em relao ao antgeno adicionado amostra. Apesar de sua reduzida sensibilidade em grandes rebanhos, o TAL tem tido sucesso no monitoramento de rebanhos leiteiros livres de brucelose. Aps um teste positivo no tarro, as vacas que contriburam com esse leite devem ser individualmente testadas pela sorologia, na identificao das fmeas infectadas. O TAL tem desvantagens como resultados falso-positivos incluindo 1-Prevalncia alta de mastites; 2-Proporo alta de vacas no incio e fim de lactao; 3-Vacinao recente com B19 (3-4 meses); 4-Leite congelado. As amostras de leite podem ser preservadas para o TAL pela adio de 0,5 mL de soluo de formalina (7,5 mL de 37% de formaldedo em 1 litro de gua destilada) para 10 ml de leite se o teste for realizado muito longe. No TAL o antgeno uma suspenso morta de B. abortus, coradas pela hematoxilina. Leite fresco misturado ao antgeno na proporo de 1 mL do leite para cada gota de antgeno. A mistura incubada a 37C, durante 1 hora. Caso seja positiva, a reao apresentar agrupamentos de organismos na poro superficial, levados pelos glbulos de gordura. Assim, um teste positivo evidenciado pela formao de um anel de colorao violeta azulada na poro superior do tubo. A durao e temperatura na qual as amostras so estocadas podem causar reaes falso-positivas (em particular temperaturas maiores de 45 C por 5 min). As amostras pasteurizadas no devem ser testadas pelo TAL. Vrios pases tm substitudo o TAL pelo ELISAi para o leite. Embora essa tcnica no esteja padronizada, ela recomendada no comrcio de bovinos pela OIE. Diagnstico molecular (PCR) Numerosos ensaios, utilizando o PCR j foram desenvolvidos na identificao de espcies do gnero Brucella spp, especialmente nos estudos epidemiolgicos. Vrias estratgias tm sido exploradas na diferenciao de espcies de Brucella, incluindo locus specific multiplexing como o baseado no IS711 (sequncia de insero); PCR-RFLP no locus omp2. Infelizmente, no h tcnica robusta o suficiente que permita a diferenciao entre os diferentes bitipos. Inicialmente, esses ensaios foram dirigidos ao ADN purificado de isolados cultivados, mas to logo novas linhagens foram identificadas (no leite e queijo), novos avanos permitiram a melhoria dessa tcnica diagnstica em laboratrios como a remoo de inibidores da PCR. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS A B. abortus sensvel s gentamicinas, canamicinas, tetraciclinas e rifampicinas. A tetraciclina associada estreptomicina no tratamento de brucelose humana. A combinao de cotrimoxazol rifampicina ou tetraciclina e estreptomicina rifampicina tambm utilizada. A localizao intracelular do organismo requer uma terapia prolongada. Bovinos no devem ser tratados com ATMs. VACINAS H dois imungenos importantes no controle da infeco por B. abortus: a vacina elaborada com a amostra B19 e a vacina elaborada com a amostra RB51. As 2 vacinas so vivas. A cepa 19 consiste de uma linhagem vivel, caracterizada pela baixa virulncia (cobaias e bovinos) e excelente propriedade imunizante. Esta cepa possui grande estabilidade. A sua virulncia no foi alterada desde 1930, ano em que foi isolada pela primeira vez. A cepa B19 uma amostra lisa de B. abortus, levemente patognica para cobaias. Vacas prenhes podem abortar pela inoculao da vacina B19 e, nesse caso, o organismo vacinal pode ser demonstrado com facilidade nas membranas fetais e feto. A linhagem vacinal, raramente eliminada pelo leite. Ela pode causar infeco no homem, geralmente de forma leve, com perodo de recuperao mais curto do que infeces por cepas virulentas. Esta vacina deve por isso ser manipulada com cuidado. As terneiras (bezerras) devem ser vacinadas entre 4 e 8 meses de idade. A vacinao nessa idade recomendada para evitar a persistncia de aglutininas e problemas no diagnstico mais tarde. A cepa B19 protege da infeco por B. abortus cerca de 70% das vacas ou por 4 a 5 gestaes, sendo mais efetiva na proteo de animais jovens de cria quando aplicada sob bases populacionais. Animais adultos vacinados com a B19 so protegidos, mas desenvolvem aglutininas, persistentemente. H evidncias de que se reduzirmos a dose vacinal haveria uma menor persistncia de aglutininas, mas esta prtica no recomendada no Brasil. A vacinao de vacas no perodo de prenhez inicial com grandes doses (60 bilhes) de B19 produz uma alta probabilidade de infeco uterina. O risco menor quando a dose reduzida (300 milhes). A vacina elaborada com a cepa rugosa 45/20 de MacEwen no mais empregada em nosso meio, mas foi usada no Brasil e amplamente utilizada na Irlanda e outros pases europeus no controle da brucelose bovina, no passado. uma vacina produzida com a bactria morta e com adjuvante oleoso. CONTROLE E PREVENO As perdas econmicas advindas da brucelose, juntamente com o perigo de infeco humana, impuseram o programa de controle e erradicao da doena. No Brasil, a perda econmica com a brucelose bovina foi estimada, em 1971, como algo em torno de 32 milhes de dlares anuais (Poester et al., 2002). muito provvel que esses prejuzos estejam subestimados e urge que faamos um levantamento da prevalncia da brucelose em todos os estados do Brasil. Assim poderamos inferir nos prejuzos diretos e indiretos da brucelose nos bovinos e em outros animais de produo. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS Os princpios incorporados no PNCEBT foram dependentes das condies locais, manejo e do nmero de animais envolvidos. 1) Animais infectados devem ser detectados, marcados e eliminados da propriedade. A deteco realizada pela sorologia ou ainda utilizando o Teste do Anel no Leite como teste de triagem, seguido pelo teste de aglutinao de cada amostra animal com sacrifcio dos reagentes. 2) A vacinao obrigatria com B19 de terneiras (bezerras) entre 4-8 meses deve aumentar a resistncia dos animais. importante esclarecer que no RS aconselhado fazer a vacinao de animais um pouco mais cedo, pois algumas raas europias ciclam com 5-6 meses de idade. 3) Princpios gerais de higiene so impostos na preveno da infeco ou reintroduo da infeco. A doena desaparece dentro de 2 anos e, ao final de 5 anos, dos animais com infeco crnica, se forem tomadas essas medidas,. VACINA RB51 A amostra RB51 uma amostra rugosa, estvel e que no contm cadeia O no LPS da parede celular e comporta-se bioquimicamente como a linhagem lisa 2308 em sua utilizao do eritritol, da qual foi originada. A RB51 induz a formao de anticorpos s protenas da membrana externa, mas no contra a cadeia O. Por esta razo pode ser aplicada em animais com qualquer idade, pois no interfere com os testes sorolgicos. Ela possui reduzida virulncia para camundongos por ter um perodo curto de "clearence" no bao, conferindo por isso imunidade ao camundongo imunizado e desafiado com B. abortus 2308. Esta vacina est sendo utilizada em vrios pases, inclusive no Brasil, pois no interfere nos testes sorolgicos tradicionais para deteco de anticorpos contra o LPS (lipopolissacardio) da cadeia O. A vigilncia de uma propriedade deve ser mantida por meio de testes sorolgicos peridicos; pelos testes nos animais comprados; pela ocorrncia de sinais clnicos compatveis com a enfermidade e pelo exame sorolgico de animais enviados ao matadouro.
Quadro IV. Resultado dos testes, segundo a tcnica AAT, 2ME de brucelose LABACVETUFRGS, entre 2001 e 2011
Ano 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Amostras 1.745 1.433 535 61 212 6 86 12 65 10 AAT 222 208 126 0 27 2 16 0 14 3 2ME 148 143 70 13 1 % AAT 2ME 12,7 66,6 14,5 68,7 23,5 55,5 0 12,7 48,1 33,3 18,6 6,25 0 21,5 30 % 2ME 8,4 9,9 13,0 0 6,1 ? 1,1 0 21,5 30
Quadro V. Amostras de soro trabalhadas no LABACVET-UFRGS entre 2001-2011

Ano 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Bovino 1745 1433 535 61 259 41 88 12 65 10 Eqino 11 2 2 5 9 50 32 25 13 Suno 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Caprino 15 31 1 63 1 56 1 49 12 Ovino 70 120 26 220 97 53 138 141 8 Canino 16 25 141 79 184 424 70 31 3
Brucella ovis
BRUCELOSE OVINA ou EPIDIDIMITE OVINA
INTRODUO A Brucella ovis causa uma enfermidade crnica nos ovinos e, caracterizada principalmente por alteraes testiculares com conseqncias sobre a fertilidade dos carneiros, abortos ocasionais nas ovelhas e aumento da mortalidade de perinatal em cordeiros. HISTRICO A B. ovis foi isolada, pela primeira vez, em 1952, por McFarlane e colaboradores, na Nova Zelndia. Simmons e Hall, em 1953, na Austrlia isolaram e descreveram o organismo como semelhante a brucella like organism. Buddle e Boyes (1953) consideraram-na como uma mutante da Brucella melitensis. Buddle props os nomes de Brucella ovis, tendo como base os antgenos de superfcie comuns entre a amostra e as amostras rugosas de B. abortus e B. melitensis. Props tambm o nome da doena como epididimite infecciosas dos carneiros. A homologia do DNA recentemente props a existncia de uma nica espcie, a B. melitensis, no gnero Brucella e as demais espcies (de hoje) seriam biovares. Assim teramos B. melitensis biovar Ovis. Esta proposta, no entanto, no se concretizou na prtica. DISTRIBUIO A infeco cosmopolita, especialmente nos pases onde h criao de ovinos. A infeco maior quando detectada pela primeira vez, podendo variar entre 20 a 60% dos carneiros e em 45 a 75% dos rebanhos testados. A prevalncia baixa, nos pases onde h programas de controle, entretanto a erradicao difcil de ser alcanada. A B. ovis produz doena clnica ou subclinica em ovinos que caracterizada por leses genitais em carneiros e placentite nas ovelhas. A principal consequncia da doena a reduo na fertilidade dos machos, abortos espordicos na fmea e aumento da mortalidade perinatal. A doena tem sido relatada na Argentina, Austrlia, Brasil, Canad Chile, Frana, Alemanha, Hungria, Mxico, Nova Zelndia, Peru, Romenia, Russia, Repblica Eslovaca, frica do Sul, Espanha, Uruguai, EUA, mas provavelmente ela ocorra na maioria dos paises produtores de ovinos. IMPACTO ECONMICO O impacto econmico difcil de ser quantificado. No Brasil, sabemos que a enfermidade causa prejuzo direto e indireto sobre a produtividade dos rebanhos infectados, especialmente sobre a fertilidade de reprodutores ovinos (machos e fmeas). Recentemente, as autoridades governamentais brasileuras elaboraram um programa nacional de controle da brucelose ovina para o Brasil, mas ainda no foi efetivamente implantado.
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS CARACTERSTICAS MORFOLGICAS ECULTURAIS A B. ovis um cocobastonete ou bastonete Gram negativo; no encapsulado; no forma esporos; possui tamanho de 0,5 a 0,7 de dimetro e 0,7 a 1,2 m de comprimento; corados pela tcnica de Stamp ou de Kster; cresce bem em meios base (Trypticase Soya Agar, Blood Agar Base, Columbia Agar) enriquecidos com 5 a 10% de sangue ou soro ou seletivamente isolada no meio de Thayer-Martin modificado. O crescimento necessita 10 a 20% de CO2 no cultivo primrio, embora existam cepas CO2 independentes. As colnias tornam-se visveis aps 3 a 5 dias de incubao a temperatura de 34 37C. As amostras podem crescer a temperatura de 26C, mas as colnias aparecem em 610 dias. Colnias no so hemolticas, so circulares, convexas, com bordos inteiros. So positivas ao teste da acriflavina para colnias rugosas. CARACTERSTICAS BIOQUIMICAS Perderam a atividade da urease e no reduzem nitrato a nitrito. So catalase positivas e oxidases negativas. H2S negativas. Crescem nas concentraes de fucsina bsica e tionina. Oxidam: L-alanina, D-alanina, L-asparagina, D-asparagina, cido d-glutmico, DL-serina, e adonitol. No oxidam: L-arabinose, D-galactose, D-glicose, D-ribose, mesoeritritol, D-xilose, L-arginina, DL-citrulina, DL-ornitina e L-lisina. FAGOTIPAGEM A B. ovis no lisada pelos fagos: Tibilisi, Weybridge, M51-S708, Firenze, BK, MC/75, D ou grupo R. No entanto lisada pelo fago R/O, tanto na RTD (dose rotina de teste) como 104 RTD. No h biotipos reconhecidos. TRANSMISSO A principal forma de transmisso por via venrea. A transmisso macho para macho possvel em que machos infectados e animais susceptveis compartilham o mesmo espao. Sodomia outro meio de transmisso. A maioria dos casos ocorre aps a estao de monta ou acasalamento. Indubitavelmente existem mecanismos complexos que no esto totalmente conhecidos, mas a transmisso venrea passiva de macho infectado para macho suscetvel via fmea infectada parece ser a mais importante forma de transmisso para manter e difundir a doena. A probabilidade de infeco depende principalmente da via, da dose e das caractersticas intrnsecas do animal, tais como idade e raa. A infeco experimental no carneiro pode ser obtida de muitas formas: oral, intravenosa, intratesticular, conjuntival, intraprepucial subcutnea, atravs de escarificaes da pele, intraretal, e intranasal. Embora no haja estudos comparativos, os melhores resultados foram obtidos, atravs da inoculao intraconjuntival, intraprepucial ou por ambas simultaneamente. Doses de 5 X 108 1010 UFC de B. ovis so suficientes para obter as taxas de infeco prximas a 100%. Se a idade afeta a susceptibilidade infeco, isto alvo de controvrsia. A infeco tem sido demonstrada em carneiros com 4 meses de idade, sugerindo que animais na puberdade ou logo aps a ela so susceptveis a B. ovis. Embora a transmisso venrea parea ser a principal forma de difuso, os animais adultos so mais susceptveis infeco natural. Alem disso, a incidncia de alteraes testiculares e a Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS brucelose aumentam com a idade, estando relacionadas experincia sexual dos animais. No h informaes publicadas sobre o efeito da idade sobre a suscetibilidade infeco sobre condies experimentais. SUSCEPTIBILIDADE AOS HOSPEDEIROS As ovelhas, ao contrrio dos carneiros, parecem ser resistentes infeco. Poucas fmeas adquirem a infeco ativa com aborto e morte perinatal mesmo quando cobertas por machos infectados. O mesmo acontece com a infeco experimental de fmeas prenhes. A infeco que ocorreu na primeira prenhez, dificilmente acompanha a seguinte. Cordeiros nascidos de mes infectadas, dificilmente tornam-se infectados, mesmo ingerindo leite infectado. Estas evidncias demonstram que o papel das fmeas na transmisso ativa da infeco menos importante. H muitas referncias sugerindo que a susceptibilidade pode variar entre as raas de carneiros. A raa Merina australiana parece ser menos infectada pela B. ovis do que as raas britnicas no mesmo ambiente. A mesma observao tem sido feita, comparando raas importadas com raas nativas. As raas nativas da Espanha e a raas derivadas da raa Merina so mais resistentes brucelose ovina do que as raas europias importadas. Embora a resistncia gentica doena possa ser importante, a suscetibilidade pode estar relacionada taxa de crescimento, precocidade e atividade sexual. INFECO EM OUTRAS ESPCIES A B. ovis parece infectar exclusivamente ovinos, acomentendo essencialmente carneiros. No h relatos do isolamento da B. ovis no homem. H referncias da infeco experimental de outras espcies animais. A inoculao experimental da B. ovis no macho caprino leva colonizao genital e extragenital e posteriormente ao desenvolvimento de leses semelhantes quelas observadas nos carneiros. O manejo extensivo em que caprinos e ovinos coabitam pode facilitar a transmisso de ovinos para caprinos e vice-versa. Entretanto, o isolamento de B. ovis de casos naturais, em caprinos ainda no foi relatado. A infeco tem sido tambm reproduzida nos cervos silvestres. Animais de laboratrio tm sido infectados por inmeras vias com doses variando entre 104 a 1011 UFC, mas com sucesso varivel. No h um modelo animal experimental na pesquisa com B. ovis, embora coelhos, ratos, gerbil, hamster, camundongo e cobaias tenham sido utilizados. PATOGENIA H um longo perodo de latncia antes de surgirem os sinais clnicos evidentes, assim como a infeco causada por outras espcies de brucelas. Sob condies experimentais, o agente permanece confinado aos linfonodos prximos ao local de entrada por 2 a 3 semanas e ento ocorre bacteremia. Nos carneiros experimentalmente infectados, a bactria tem sido isolada do fgado, rins, bao, testculo, epiddimo, vescula seminal, glndula bulbouretral, ampolas e linfonodos ilaco, pr-escapulares, pr-crural, submaxilar, parotdio e retrofarngeo. Os rgos-alvo so epiddimo e glndulas sexuais acessrias com eliminao do agente, Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS atravs do smen, na maioria dos carneiros. Nos animais reagentes, geralmente o cultivo negativo, mas a bacteria pode estar localizada em outros rgos. Essa hiptese consistente com o isolamento da B. ovis no bao e linfonodo ilaco de animais experimentalmente infectados e que no foram isoladas dos rgos genitais e glndulas sexuais acessrias. A localizao no epiddimo acompanhada por edema perivascular e infiltrao dos linfcitos, moncitos e neutrfilos. Logo aps a inflamao do epitlio tubular segue-se uma hiperplasia papilar e degenerao hidrpica local com formao de cistos intraepiteliais. A destruio epitelial, tanto pela bactria quanto pela reao inflamatria leva a um extravasamento de espermatozides. A resposta do hospedeiro aos espermatozides extravasados leva a formao de um granuloma espermrico que pode bloquear o epiddimo com posterior degenerao e fibrose. Na fmea, a patogenia da B. ovis no bem conhecida. Fmeas ovinas experimentalmente expostas a B. ovis tanto antes da monta quanto no final da gestao no abortam. Somente femeas expostas no incio ou na metade da prenhez desenvolvem infeco, podendo eventualmente abortar. A bactria localiza-se na placenta e alcana o feto, atravs dos vasos do crion, com a progresso da infeco. Embora o aborto no seja frequente, as fmeas infectadas desenvolvem placentite, interferindo na nutrio fetal e nascimento de cordeiros fracos. A reao inflamatria e imunolgica da B. ovis ao feto similar quelas observadas no feto bovino causado pela B. abortus. PATOLOGIA NO MACHO Carneiros infectados no desenvolvem epididimite palpvel, mesmo quando a B. ovis est associada epididimite ovina, Em levantamento conduzido com 267 carneiros soropositivos, somente 125 (46,8%) mostraram alteraes testiculares palpveis. Uma proporo importante de carneiros infectados no evidencia leses escrotais. Na maioria dos casos, a localizao testicular unilateral e a cauda do epiddimo o local mais comum. Alteraes na cabea e no corpo do epiddimo so frequentes. A atrofia testicular e aumento da cauda do epiddimo so caractersticas da fase crnica da doena. A aparncia macroscpica dos testculos geralmente normal, mas pode-se perceber granulomas e calcificao. O epiddimo afetado parece firme, mostrando superfcie esbranquiada ao corte em consequncia da proliferao de tecido conectivo. Frequentemente so encontradas no tecido conectivo, abscessos, contendo substncia cremosa ou caseosa. Hemorragia e inflamao exsudativa na tnica vaginal so achados frequentes como resultado da ruptura da leso bsica (espermatocele) do epiddimo. A organizao deste exsudato leva a formao de adeses entre estas duas camadas da tunica vaginal. As vesculas seminais esto aumentadas com ductos dilatados com contedo fluido ao corte. Nenhuma alterao macroscpica pode ser observada na glndula bulbo-uretral, prstata e ampolas. LESES NO MACHO O exame microscpico dos epiddimos infectados mostra edema intersticial, fibrose e infiltrado perivascular de linfcitos e plasmcitos. Os ductos epididimrios mostram hiperplasia epitelial com cistos intraepiteliais, contendo neutrfilos e restos celulares. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS Granuloma espermtico circundado por linfcitos, clulas gigantes e epiteliides so achados frequentes. A atrofia testicular deriva do processo regressivo do epitlio testicular e suspeno da espermatognese. Pode tambm ocorrer proliferao do tecido conectivo intertubular, granuloma espermtico extratubular, necrose e calcificao dos ductos seminferos. As principais alteraes das vesculas seminais incluem a infiltrao de linfcitos e plasmcitos; fibrose e hiperplasia epitelial difusa com cistos intraepiteliais, contendo neutrfilos. A inflamao das ampolas est associada com a epididimite. reas focais de hiperplasia com cistos intraepiteliais vazios e acmulo de neutrfilos no lmen das dilataes do epitlio so geralmente observadas. Alem disso, acmulo de clulas redondas e fibrose podem ser visualizados na lmina prpria. O exame microscpico da prstata e da glndula bulbouretral revela uma discreta infiltrao de clulas redondas e hipertrofia glandular focal. Formaes papiliformes e concrees (corpora amilacea) so frequentes nessas duas glndulas acessrias. Nas ovelhas infectadas observa-se um exsudato purulento, variando de uma pequena quantidade sobre a superfcie da membrana corioalantide intacta at uma grande quantidade na rea interplacentoma. O exsudato contm bactrias, macrfagos, neutrfilos e clulas epiteliais de descamao. Fibrose, espessamento e edema da membrana corioalantide so observadas nos casos mais graves. Os cotildones podem evidenciar vrios graus de necrose. Clulas do epitlio corinico podem estar aumentadas e conter bactrias. Necrose focal epitlio intercotiledonrio e corinico so frequentemente observados. Leses nas artrias so comuns com trombos fibrinosos no interior de vasos; aumento de clulas endoteliais e proliferativas, na tnica intima. No h leses patognomnicas na infeco bruclica. ISOLAMENTO DE AMOSTRAS As amostras para o isolamento de B. ovis de animais vivos inclui: smen, suabe vaginal e leite. O smen pode ser colhido facilmente em subios tomados da cavidade prepucial, apos a eletroejaculao. Se o eletroejaculador no disponvel, podemos coletar da vagina de fmeas livre da infeco, imediatamente aps a monta natural. A melhor tcnica de diagnstico direto o isolamento bacteriano em meio de cultivo adequado. Amostras de smen, subio vaginal, ou leite, devem ser semeados diretamente em placas, contendo meios adequados; incubadas a 37C numa atmosfera de 5-10% de CO2. Os tecidos devem ser macerados e triturados com pequena quantidade de salina estril ou PBS antes de serem semeado. A amostra de smen menos contaminada pode ser obtida pela exposio e limpeza do pnis e o ejaculado colhido em frasco estril. Nos animais mortos, a colheita de amostras para isolamento da B. ovis inclui nos machos, o epididimo, vesculas seminais, ampolas seminais, linfonodos inguinais e nas fmeas, o tero, linfonodos ilacos e supramamrio. Entretanto para obter melhores resultados deveremos incluir outros rgos e linfonodos como: bao, linfonodos cranial, pr-escapular, prefemural e testiculares. Cordeiros mortos e placenta devem ser examinados. As amostras preferenciais devem colhidas como o fluido do abomaso e pulmo. As amostras para cultivo devem ser refrigeradas e transportadas para o laboratrio Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS o mais rpido possvel aps a coleta. A bactria permanece vivel por at 72 horas a temperatura ambiente e a sobrevivncia pode ser aumentada a 4C ou preferencialmente pelo congelamento das amostras teciduais. Esfregaos vaginais e de smen podem ser corados pela tcnica de Stamp onde cocobastonetes caractersticos podem ser evidenciados na maioria dos infectados. O exame de amostras coradas pelo Stamp (trato genital do carneiro, linfonodo inguinal, placenta, contedo do abomaso e pulmo de feto) pode permitir o diagnstico presuntivo rpido. Entretanto outras bactrias com morfologia similar ou caractersticas tintoriais semelhantes (B. melitensis, Coxiella burnetii e Chlamydophila spp) podem estar presentes nas amostras, tornando o diagnstico difcil para profissionais menos experientes. A microscopia deve ser confirmada pelo cultivo do agente. IDENTIFICAO DO AGENTE A existncia de leso macroscpica (epididimite uni ou bilateral) no carneiro pode ser indicativa de infeco, mas exames laboratoriais so necessrios para confirmar a doena, atravs de mtodos diretos e indiretos. Esfregaos diretos podem ser examinados, atravs da colorao de Gram ou Stamp e a presena de cocobastonetes demonstrada em muitos animais infectados. Entretanto, outras bactrias com caractersticas morfotintoriais semelhantes (B. melitensis, Chlamydophila abortus) podem estar presentes. Exame Direto O diagnstico direto realizado, atravs do isolamento da B. ovis no smen, nos tecidos do carneiro ou ainda nas secrees ou leite de fmeas em meio de cultivo seletivo. As tcnicas de biologia molecular como PCR e eletroforese de campo pulsante tm sido aplicadas, entretanto as tcnicas indiretas baseadas nos testes sorolgicos so as preferidas no diagnstico de rotina. O smen do carneiro pode ser obtido facilmente por meio do eletroejaculador. O smen pode ser colhido para bacteriolgico em sacos plsticos ou por meio de subio tomado da cavidade prepucial aps a eletroejaculao. Cultivo No isolamento da B. ovis, as amostras de smen so semeadas diretamente em plascas de AS apropriadas (Thayer-Martin); incubadas a 10% de CO2. A colheita e transporte de amostras uma tarefa trabalhosa, pois alguns animais infectados no excretam ou a eliminam intermitentemente e, por isso, o bacteriolgico de smen no prtico e nem til no diagnstico da infeco, especialmente em programas de controle e erradicao de grande escala. Isolamento e identificao As colnias da B. ovis no so hemolticas; so circulares, convexas; possuem bordos inteiros; so do tipo rugoso quando examinadas pela luz oblqua; positivas ao teste de acriflavina. A B. ovis perdeu a atividade de urease; falha na reduo de nitrato para nitrito; catalase positiva; oxidade negativa; no produz H2S; no crese na presena de Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS violeta de metila, mas geralmente cresce na presena de concentraes de fucsina bsica e tionina. A maioria dos laboratrios de diagnstico veterinrio no est equipada na identificao completa da B. ovis, sendo necessria a adoo de um protocolo prtico e presuntivo na identificao. A maioria das B. ovis pode ser identicada, tendo como base as caracteristicas de crescimento, observao direta, utilizando a luz refletida oblqua, colorao de Stamp, Gram, catalase, oxidase, urease e teste de acriflavina. Entretanto, a identificao definitiva deve ser realizada no laboratrio de referncia com experincia na identificao e tipificao de Brucella spp. Recentemente, um mtodo de eletroforese de campo pulsante foi desenvolvido para o gnero Brucella spp e com essa tcnica possvel diferenciar B. ovis das outras espcies. Fagotipagem Os cultivos no so lisadas pelos bacterifagos do grupo Tbilisi, Weybridge e Iz, no teste de diluio rotineiro (RTD) ou 104 RTD, enquanto so lisados pelo bacterifago R/C. Diagnstico sorolgico Teste de Imunodifuso em gelose de agar (IDGA), Teste de Fixao do Complemento (FC) e, ensaio imunoenzimtico (ELISA), utilizando antgenos de superfcie solveis da B. ovis, podem ser utilizados. Alguns testes de ELISA, que utilizam protenas recombinantes e monoclonais, esto sendo testadas em pesquisas de campo. As sensibilidades dos testes IDGA e ELISA so semelhantes e o teste de ELISA apresenta maior sensibilidade do que o teste de FC. A combinao da IDGA e ELISA apresenta os melhores resultados em termos de sensibilidade, embora o teste de IDGA seja mais prtico e barato. O teste recomendado para o comrcio internacional permanece sendo o teste de FC. O LPS da parede celular o principal antgeno de superfcie na maioria das bactrias Gram negativas, sendo verdade para as brucelas lisas. Entretanto a B. ovis rugosa e, portanto sua superficie celular difere das demais brucelas lisas. A principal diferena na estrutura da parede celular entre as brucelas lisas e rugosas a ausncia de cadeia O no LPS das amostras rugosas. O LPS da B. ovis assim como o LPS das mutantes rugosas de B. abortus e B. melitensis podem ser extradas com o uso de solventes orgnicos. A tcnica de ter-de-petrleo-cloforfrmio-fenol (PCP), originalmente desenvolvida para mutantes rugosas de enterobactrias a tcnica de escolha para obter LPS de B. ovis, uma vez que ela produz antgeno essencialmente livre de protenas e cidos nuclicos. Entretanto a grande hidrofobicidade do LPS purificado representa um problema para o seu uso em muitos testes sorolgicos. A estrutura do LPS da B. ovis no tem sido estudada e conhecida. Embora ela contenha acar presente na estrutura ncleo-lipdio A do LPS de outras brucelas, o LPS purificado da B. ovis revela somente uma reao de identidade parcial com o LPS dos mutantes rugosos de B. abortus e B. melitensis ou com o LPS rugoso presente no antgeno extrado pelo calor da B. canis, sugerindo a presena de determinantes antignicos espcie-especficos no LPS da B. ovis. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS Antgenos O tratamento das brucelas rugosas pela tcnica da salina aquecida (mtodo da salina quente), produz extratos antignicos solveis cujo componente principal precipita com o soro das brucelas rugosas. Por essa razo, o antgeno termorresistente tem sido referido como o antgeno rugoso especfico ou quando obtido da B. ovis ele chamado antgeno especfico da B. ovis. Entretanto, a caracterizao qumica do antgeno termorresistente da B. ovis mostrou que so enriquecidos com LPS rugoso, protenas da membrana externa e outros componentes externos da membrana. Assim, o antgeno termorresistentes contm determinantes do LPS especficos para a B. ovis, mas outros componentes antignicos adicionais. O antgeno termorresistente, devido a sua solubilidade em gua e alta concentrao em eptopos na superfcie celular o melhor antgeno para o diagnstico e tm sido amplamente utilizados para o diagnstico sorolgico da infeco causada pela B. ovis. A B. ovis cepa REO 198 CO2 independente e por isso, recomendada como fonte de antgeno termorresistente para os testes sorolgicos. Esta cepa foi obtida no Institute National de la Recherche Agronomique (INRA) Laboratoire de Pathologie Infectieuse et Immunologie, Nouzilly, Frana. Meios slidos so satisfatrios para o crescimento da B. ovis REO 198. O ideal seria inclurem-se vrias cepas ou linhagens na elaborao do antgeno. O antigeno deve ser preparado como segue: 1) Crescimento exponencial de uma cepa de preferncia aerbia (B. ovis REO 198) em frascos de Tripticase soja em incubador orbital a 37C e a 150 rpm; ou em garrafas Roux de Tripticase Soja Agar ou outro meio adequado, com 5% de soro ou em fermentador descrito para B. abortus, mas com a adio de 5% de soro ao meio. 2) As clulas so lavadas 2 vezes e ento suspensas em salina a 0,85% (12 g clulaspeso seco) ou (30 g de clulas em 150 ml). 3) A suspenso celular autoclavada a 120C por 15-30 minutos. 4) Aps o resfriamento, a suspenso centrifugada (15.000 X G; 4C; 15 minutos) e o sobrenadante filtrado e dializado em gua destilada (3 x 100 volumes) a 4C por pelo menos 2 dias. 5) O fluido dializado ultracentrifugado (100.000 X G; 4C; 6-8 hours). 6) O sedimento ressuspenso em uma pequena quantidade de gua destilada e liofilizado. 7) O antigeno reconstitudo em gua destilada (para uso em IDGA) ou em tampo salina-veronal (para uso no teste de FC) ou em tampo carbonato-bicarbonado (para uso em ELISA). 8) A titulao feita contra os soros-controle positivos e negativos. Ensaio imunoenzimtico (ELISAi) H inmeras variaes do ensaio imunoenzimtico. O teste descrito aqui um teste de ELISA indireto, utilizando o ABTS (2,2-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) como cromgeno. Os testes so realizados em placas de ELISA com fundo chato com 96 orificios. Os reagentes e as diluies so realizadas em PBS pH 7,2 com a adio Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS de 0,05% de Tween 20 (PBST). As diluies do antgeno so realizadas com tampo carbonato-bicarbonato com pH 9,6. As placas so lavadas com PBST, aps a fixao do antgeno. O antgeno termorresistente e o conjugado so titulados e as diluies so selecionadas para dar a melhor relao entre o soro padro positivo e negativo. Secundariamente os anticorpos (anti-ovino IgG [H+L cadeias]) so geralmente conjugadas peroxidase, embora outras enzimas possam ser utilizadas. Se o conjugado com peroxidase utilizado, o cromgeno (ABTS) diludo em tampo substrato pH 4 (composto de cido ctrico trisdico e cido ctrico). A isso adicionada gua oxigenada (H2O2), e as placas incubadas por 1560 minutos a temperatura ambiente. A reao bloqueada com 1 mM de azida sdica e a mudana de cor lida em espectrofotmetro com filtro de 405-414 nm. O antgeno utilizado no ELISA o termorresistente estoque (1 mg/ml em tampo de sensibilizao) titulado com diferentes diluies do antgeno, de conjugado e de substrato, contra um soro padro ou contra diluies seriais de um painel de soros que so positivos e negativos para B. ovis, visando a determinao da diluio mais adequada (geralmente 510 g/ml). As placas de ELISA so sensibilizadas com 100 l de uma predeterminada diluio de antgeno em tampo carbonato, pH 9,6 para cada poo. As placas so incubadas por 2 horas a 37C ou overnigh a 4C. Posteriormente, elas so lavadas 4 vezes para remover o antgeno no ligado e, em seguida, so secas com batidinhas firmes com elas viradas para baixo sobre toalhas absorventes. As placas sensibilizadas podem ser utilizadas imediatamente ou estocadas a 4C (a estabilidade nessas condies adequada por pelo menos 1 mes). Diluir os soros controles positivos e negativos a 1/200 pela adio de 10 l do soro a 2 ml PBST. Adicionar um volume de 100 l da amostra em duplicata na microplaca. As placas so cobertas, incubadas a 37C por 1 hora; lavadas 3 vezes com tampo de lavagem. O conjugado titulado e diludo em PBST adicionado (100 l) a cada poo e as placas cobertas e incubadas por 1 hora a 37C. Aps a incubao, as placas so lavadas novamente 3 vezes com PBST. Soluo de ABTS no tampo adicionada (100 l/orifcio); as placas so incubadas por 15-60 minutos a temperatura ambiente com agitao continua. A absorvncia lida automaticamente no espectrofotmetro com o comprimento de onda entre 405 a 414 nm. Os valores de absorvncia podem ser expressos em percentagens de absorvncia mdia dos controles positivos. Os valores de absorvncia podem ser expressos como percentuais de absorvncia mdios do controle positivo transformados em unidades ELISA calculados, tanto manualmente quanto pelo programa de computador que calcula a curva de uma curva-padro construda com uma srie de resultados de diluies do controle positivo. O limiar deve ser calculado, testando uma quantidade grande da populao ovina livre da infeco e a sensibilidade do teste sendo controlados na populao de animais infectados pela B. ovis. Estudos comparativos evidenciaram que o teste de ELISA possui melhor sensibilidade que a IDGA ou a FC. A existncia de alguns soros ELISA-negativos e IDGA positivos faz com que a combinao de IDGA com ELISA melhore a especificidade. Entretanto a combinao do teste de FC e ELISA ou CF e IDGA no melhoram a Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS sensibilidade do teste de ELISA sozinho. O teste de FC possui outras desvantagens, tais como: a) Complexidade, b) Obrigatoriedade de inativao das amostras de soros; c) Atividade anticomplementria de alguns soros; d) Dificuldade de realizao com soros hemolisados e e) Fenmeno de pr-zona. A IDGA o teste mais prtico no diagnstico de rotina em laboratrios menos especializados por sua sensibilidade, simplicidade e fcil interpretao.
Brucella canis
BRUCELOSE CANINA
INTRODUO A brucelose canina era uma enfermidade associada B. abortus, B. suis e a B. melitensis, antes do isolamento da B. canis, em 1966. A fonte de infeco em quase todos os casos era o consumo de animais domsticos infectados ou pelo contato de ces com derivados destes. Em contraste forma espordica da brucelose canina, h outra, extremamente infecciosa para os ces, causada por uma nova espcie de Brucella. Em 1966, Carmichael, nos Estados Unidos, durante uma investigao sobre a causa de abortos em ces da raa Beagle, isolou um cocobastonete Gram negativo de vrios fetos abortados. Mais tarde, vrias outras observaes deram suporte incluso deste organismo no gnero Brucella, sendo denominada B. canis. AGENTE-INFECO A B. canis o agente etiolgico da brucelose canina; enfermidade caracterizada por manifestaes clnicas variadas. A maioria dos ces infectados no apresenta sinais clnicos perceptveis, mostrando-se clinicamente normais. As manifestaes clnicas indicativas da enfermidade no so exuberantes, mas associadas com o trato reprodutor. O sinal clnico primrio na fmea infectada o aborto, podendo ser acompanhado ou no de mortes embrionrias ou natimortos. Nos machos, os sinais clnicos mais comuns so: epididimite, orquite e/ou atrofia testicular e dermatite de escroto. Outras manifestaes podem incluir: linfadenites e esplenites, leses oculares, discoespondilites e osteomielites. A contaminao ocorre, atravs das mucosas (oral, vaginal ou ocular). A bactria fagocitada e ser transportada por macrfagos e granulcitos para os linfonodos regionais e sistema circulatrio. Bacteremia aparece entre 1 a 4 semanas, aps a infeco, podendo durar seis meses e, algumas vezes, podendo persistir por 60 meses. A fase de bacteremia acompanhada de sinais clnicos como febre discreta, linfadenopatia discreta e astenia de inconstante a moderada. A fase de bacteremia pode levar leses inflamatrias nos discos intervertebrais (discoespondilite), no globo ocular (uvete) e nos rins (glomerulonefrite), mas o mais importante, que o agente atinge o trato reprodutos de machos e fmeas prenhas. Nos machos, causa espermatozides anormais, levando esterilidade, aps cinco semanas ps-infeco. Outros sinais como orquite, epididimite, hipertrofia prosttica, edema do escroto podem ser detectados. Nas formas crnicas, h atrofia de um ou ambos os testculos. Na fmea prenha, a infeco geralmente leva a morte embrionria entre os dias 10 e 20 aps a concepo ou ao abortamento entre 45 e 59 dias de gestao. O aborto seguido de secreo vaginal que pode persistir de 1 a 6 semanas. Geralmente a cadela pare filhotes Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS mortos ou filhotes que sobrevivem apenas algumas horas ou dias. Raramente, a prenhez chega a termo. As fontes de infeco so representadas por smen, urina, fetos abortados ou secreo vaginal. Os animais so infectados por via venrea ou pela ingesto de material infectado. Infeco iatrognica (transfuso de sangue, uso de material de injeco contaminado) possvel. ZOONOSE Os tcnicos (laboratrio, os proprietrios de animais, veterinrios) podem ser infectados, apesar de o homem ser relativamente resistente a B. canis. Os sinais clnicos (febre, calafrios, fadiga, perda de peso, linfadenopatia) so mais moderados do que aqueles observados em outras espcies e, em muitos casos, so completamente assintomticos. As complicaes so raras (artrite, meningite, endocardite), mas foram descritas. A presena da brucelose canina nos centros urbanos brasileiros preocupante, pois representa risco sade pblica, pelo estreito convvio ou contato com os seus familiares, tanto pela populao de ces infectados e no domiciliados quanto por aqueles ces infectados dentro de criatrios. Estudos epidemiolgicos dirigidos brucelose canina nestes centros urbanos forneceram dados importantes quanto a sua apresentao, distribuio, comportamento da enfermidade venrea para os caninos, mas tambm como uma zoonose, especialmente para criadores, proprietrios, tratadores e clnicos veterinrios. IMPACTO ECONMICO O impacto econmico decorrente da infeco pela B. canis nos criatrios complexo e difcil de estimar, pois as perdas incluem principalmente a queda brusca no nmero de filhotes, eliminao de reprodutores infectados (machos e fmeas) da reproduo; perda de material gentico superior; gastos com a reposio de animais hgidos; os gastos com diagnstico, tratamento, desinfeco e preveno da infeco; gastos com monitoramento do criatrio e a perda de confiana entre quem os criam e quem os compram. Talvez essas dificuldades sejam, em parte, razo para que nenhuma medida seja tomada por parte da sociedade interessada somente no comercio de animais a despeito do bem estar animal. hora de estimar os prejuzos causados com a brucelose canina em criatrios, pois a infeco causada pela B. canis acomete um grande nmero de animais (canis), onde ela ocorre sob a forma silenciosa ou sob a forma de pequenos surtos, envolvendo animais com alto valor zootcnico. EPIDEMIOLOGIA A enfermidade foi registrada nos Estados Unidos; em pases da Europa; no Japo, Madagascar e Mxico. Na Amrica do Sul, especialmente no Peru, Argentina e Brasil. Estudos epidemiolgicos mostraram que a prevalncia da infeco causada pela B. canis varivel, dependendo da rea geogrfica e do tipo de teste aplicado. Estudos sorolgicos obtidos tm permitido valiosa informao sobre a enfermidade na populao canina bem como na populao humana, representando, deste modo, mais um risco sade pblica.
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS BRUCELOSE CANINA NO BRASIL No Brasil, os primeiros relatos ocorreram simultaneamente em So Paulo e no Rio Grande do Sul, em 1976. Sandoval e colaboradores estimaram a infeco em 3,61%, dentre as 221 amostras de soro de ces apreendidos no centro de zoonoses da prefeitura municipal de So Paulo. Wald e Fernandes (1976-7), no Rio Grande do Sul, estimaram a prevalncia da brucelose canina em 12% dentre as 192 amostras testadas de ces atendidos aleatoriamente pelo ambulatrio do Hospital de Clnicas Veterinrias, em Porto Alegre. Pereira Filho e colaboradores, em 1978, na Bahia quantificaram a enfermidade em 1,43%, das 1.393 amostras de soro canino testadas em Salvador. Larsson, em 1979, obteve um percentual de 7,0% num levantamento realizado na populao canina da cidade de So Paulo. Germano e colaboradores, em 1987, em Campinas, obtiveram um percentual de 5,4% de reagentes. Schlemper e Vaz, em 1990, em Santa Catarina, estimaram em 6,0% entre as 334 amostras de soro examinadas de ces na regio do Planalto Catarinense. Magalhes Neto e colaboradores em 1992, em Pelotas, obtiveram uma prevalncia de 22,7% entre 304 amostras de soro canino. Poester ecolaboradores, em 1994, estimaram a infeco em 7,4 % das 95 amostras da zona urbana de Uruguaiana. O isolamento da B. canis considerado como o "padro-ouro" no diagnstico da brucelose canina. Ela chave importante para a aplicao de medidas no diagnstico, controle e preveno da infeco/doena. ISOLAMENTO NO MUNDO E BRASIL O isolamento da B. canis pode ser obtido do sangue perifrico de animais com ttulos altos de anticorpos (Moore e Kakuk, 1969). Serikawa et al., (1978) isolaram B. canis da urina e da prstata de ces infectados. Ueda et al., (1974) isolaram B. canis do bao, epiddimo, prstata e linfonodos poplteos e ilacos. Harris et al., (1974) isolaram B. canis do sangue, fluido cerebrospinal e de vrios rgos de fmeas com sinais neurolgicos. Henderson et al., (1974), nos Estados Unidos, isolaram a B. canis de 3 ces com leses de osteomielite vertebral na regio traco-lombar (discoespondilites). Riecke e Rhoades (1974) e Seagusa et al., (1977) isolaram B.canis de leses oculares. Schoeb e Morton (1978) isolaram o agente da brucelose canina de lcera exsudativa escrotal. No Brasil, Fernandes e Wald em (1976-7) isolaram, pela primeira vez, no Brasil a B. canis do humor aquoso de co da raa Boxer, com leses oculares. Em 1977, em Minas Gerais, Godoy e colaboradores isolaram a B. canis em hemocultura de uma fmea que havia abortado recentemente. Larsson e Costa (1980), em So Paulo, isolaram trs amostras de B. canis, sendo 1 amostra de fmea com histrico de infertilidade, e as outras duas de uma fmea e de um macho sem sinais clnicos. Vargas et al., (1996), em Santa Maria, isolaram B. canis da placenta, de fetos abortados e neonatos de um canil com reprodutores caninos de vrias origens. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS Gomes et al., (1999), em Porto Alegre, isolaram B. canis do epiddimo e testculo de um co com epididimite e orquite clnica. No Rio de Janeiro, Ferreira e colaboradores (2003) isolaram e identificaram B. canis de dois ces com sinais clnicos de brucelose canina de um canil comercial. DIAGNSTICO LABORATORIAL O diagnstico laboratorial da brucelose canina uma tarefa difcil e complexa, incluindo as tcnicas de isolamento, segundo evidencia a Tabela 1. O diagnstico sorolgico uma probabilidade diagnstica, pois dependem da relao agente-hospediero e o tempo de infeco. Eles incluem o teste de fixao do complemento (FC), soroaglutinao lenta (SAL), soroaglutinao rpida (SAR), imunofluorescncia (IF), o teste de ELISA e imunodifuso (IDGA). A imunodifuso em gelose de agar (IDGA) a tcnica mais utilizada no diagnstico laboratorial da infeco por ser de fcil realizao, rpida e barata. Alm disso, esta tcnica possibilita utilizar, tanto o antgeno superficial rugoso da B. ovis quanto da B. canis e da RB51. HEMOCULTIVO O hemocultivo da B. canis pode ser obtid atravs da seguinte tcnica: 1- Um volume de 0,1 mL de sangue, colhido com heparina ou citrato de sdio semeado em placas de agar sangue (Brucella agar, Triptose agar); incubadas a temperatura de 37C em atmosfera normal. 2- Um volume de 5 mL de sangue semeado em 10 mL de caldo. O caldo inoculado deve ser congelado de 12 a 24 h a -20C. Posteriormente, a amostra congelada deve ser descongelada e incubada por 6 dias a 37C. Aps esse tempo, a amostra repicada em 2 meios em paralelo (seletivos e no seletivo). Os meios de Caldo Brucella soro; Triptose soro; Kuzdas e Morse tornam-se seletivo pela adio de cicloheximida (100 mg/L), bacitracina (25 000 U/L) e polimixina B (6 000 U/L), do bons resultados. SMEN e URINA Smen e urina devem ser cultivados por 4-7 dias em caldo seletivo e posteriormente em gelose. Outras amostras clnicas eventualmente so trituradas em stomacher; inoculadas em paralelo em meios seletivos e no seletivos. As placas devem ser conservadas por 30 dias; examinada periodicamente em estereoscpio com luz obliqua. As colnias suspeitas devem ser submetidas ao exame bacterioscpico, teste de oxidase e tipo respiratrio. A identificao precisa da espcie est reservada aos laboratrios especializados que pode pesquisar a aglutinao com antissoro preparado com uma cepa de Brucella em fase R (geralmente uma cepa de Brucella ovis) posteriormente se estudar as caractersticas bioqumicas; lisotipia e oxidao de acares e aminocidos.
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS Tabela 1 Resultados Esperados no isolamento da B. canis em amostras clinicas Amostra(s) Fluidos (vaginal placenta, aborto) Smen Isolamento Ps-Infeco (PI) Positivo
Positivo entre 3 a 11 semanas PI Positivo ou negativo em 12 a 60 semanas PI Negativo para alm de 60 semanas PI
Sangue
Positivo entre 5 a 30 semanas PI 80% positivo em 6 a 12 meses PI 50 80% positivo em 24 a 48 meses PI 25 50% positivo em 48 a 58 meses PI 0 25% positivo para alm 58 meses PI
Urina Epiddimo
Geralmente positivo (geralmente ) entre 8 - 30 semanas PI 50 100% positivo entre 35 - 60 semanas PI Negativo alm de 24 meses PI
Prstata Linfonodo, bao, medula ssea
Geralmente positivo at 64 semanas PI Geralmente positivo quando o animal est na fase de bacteremia
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS CONTROLE E PREVENO O controle torna-se um dilema, quando a brucelose foi diagnosticada num criatrio, A eliminao da infeco demanda tempo e custos, mas a doena pode apresentar uma crise emocional ou quando ces de valor gentico so acometidos. A preveno particularmente importante nos canis. Ao contrrio da brucelose nos outros animais domsticos, a brucelose canina no uma doena de notificao obrigatria e sua prevalncia est baseada em limitados estudos sorolgicos. A incidncia da enfermidade nos ces pouco diferente de quando ela foi reconhecida nos anos sessenta; com exceo de alguns criatrios comerciais e organizaes de criadores de ces ou clubes de caa que instituram medidas preventivas de maneira privada. A preveno da reproduo em canis/criatrios dever incluir um plano de monitoramento alem de cuidados sanitrios e de higiene. Os testes sorolgicos incluem vantagens e desvantagens que devem ser conhecidas pelos clnicos veterinrios conforme tabela 2. 1-Os testes sorolgicos devem ser realizados duas vezes com intervalos de um ms em todos os ces introduzidos em um canil de reproduo. 2-As cadelas de um criatrio/canil devem ser testadas vrias semanas antes do cio esperado. Se outros testes alem do SAT-2ME so necessrios para certificao de livres de brucelose, haveria tempo para aplicar aqueles procedimentos antes do perodo do cio. 3-Nenhum animal novo deve ser introduzido na reproduo at que tenham sido considerados negativos a dois testes com um ms de intervalo. 4-Testes anuais devero ser aplicados em todos os animais ou quando houver alteraes reprodutivas ou abortos. 5-H fortes suspeitas de brucelose canina nos casos de aborto at que seja provado o contrrio. 6-Ces com testes de triagem positivos ou inconclusivos devem ser isolados e avaliados por hemocultura e sorologia, utilizando testes mais especficos como AGID, utilizando antgeno de protenas citoplasmticas. 7-Todo co infectado deve ser removido do canil e eliminado. Em alguns casos, h recusa por parte dos proprietrios e, nesses casos, h indicao da castrao concomitantemente terapia com antimicrobianos e acompanhamento do caso, em pelo menos, trs meses.
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS Tabela. 2 Comportamento dos testes aplicados Brucelose canina por B. canis
Teste Positivar Resultados Persistncia Positividade Vantagens e Desvantagens
Aglutinao rpida em lmina (antgeno corado com Rosa Bengala), aps tratamento do soro com 2ME Aglutinao lenta em tubos
Simples, rpido, sensvel, poucos falsos negativos. 3 a 4 semanas PI At 3 meses ps bacteremia Muitos falsos positivos (teste com resultados positivos devem ser confirmados por outra tcnica).
3-6 semanas PI
At 3 meses ps bacteremia
Tcnica semi-quantitativa. Numerosos falsos +, inutilisvel com soros hemolisados, fenmeno de zona possvel. Tcnica semi-quantitativa, + especifica que aglutinao lenta em tubos. Inutilisvel com soros hemolisados, fenmeno de zona possivel, necessita 48 h de incubao
Aglutinao lenta em tubos na presena de 2-ME
At 3 meses ps bacteremia 1,2-2 meses PI
IDGA (antgeno LPS) 1,5-2,5 meses PI
At 4 meses ps bacteremia
Sensvel, + especfico que os testes anteriores. Tcnica complexa, interpretao delicada
IDGA (antgenos citoplasmticos, de natureza proteca)
At 3 anos ps bacteremia 2-3 meses PI
O teste mais especfico (detectar animais infectados por outras espcies do gnero Brucella, mas no apresenta reao cruzada com outros gneros bacterianos), detecta infectado cronicamente. Teste complexo, sensbilidade menor que o anterior
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS VACINAO No existe vacina e a profilaxia baseia-se sobre as medidas de ordem sanitrias tais como isolamento do agente; eutansia dos infectados; desinfeco dos locais; quarentena e vigilncia serolgica antes da introduo em uma criao. O tratamento com antimicrobiano no 100% eficaz. Ele geralmente est associado ao uso de tetraciclinas a aminosdio durante um ms. SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS A B. canis in vitro sensvel s tetraciclinas; ao cloranfenicol; aos aminosdios; rifampicina, s fluoroquinolonas e s sulfamidas. Muitas linhagens apresentam resistncia cruzadas aos macrolidios. Quadro I. Percentual de reagentes contra a B. canis, na IDGA, (antgeno LPS) no LABACVET-UFRGS
Ano 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 N Amostras 47 29 130 72 108 34 ? 76 35 27 145 79 184 424 70 31 3 Reagentes 5 2 7 4 15 8 ? 02 0 5 29 12 23 93 4 1 1 % 10,63 6,89 5,38 5,55 13,88 23,52 ? 2,63 00 19,23 20,00 15,10 12,50 22,00 5,70 3,2 33,3
PERSPECTIVAS A preocupao em conhecer dados sobre brucelose canina nas diferentes faculdades de veterinria do pas tem como objetivos: 1) Obter dados quanto prevalncia de brucelose canina em ces atendidos pelo servio de atendimento policlnico nas instituies de ensino superior, especialmente por no haver muitos registros. 2) Isolar a B. canis em amostras clnicas bem como aplicar testes sorolgicos no monitoramento e controle da infeco. 3) Prestao de servio especializado comunidade acadmica pelo treinamento de tcnicos, estudantes e outros profissionais 4)Garantir segurana dos acadmicos e professores quando do manuseio desses animais em aulas prticas de clinica mdica e cirurgia. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Brucelose nos Mamferos Marinhos

Prof. Marcos JP Gomes SINONMIA: Brucella ceti : "Brucella cetaceae". Brucella pinnipedialis: "Brucella pinnipediae". CONSIDERAES GERAIS Os estudos de hibridizao do ADN-ADN tm mostrado que o gnero Brucella constitui uma nica espcie genmica. Segundo as regras de prioridade, Verger e colaboradores propuseram que o nome de B. melitensis, B. abortus, B. canis, B. neotomae, B. ovis e B. suis deveriam ser considerados como simples biovares da Brucella melitensis. Esta proposio respeitou (e respeita hoje) os critrios utilizados para a definio de uma espcie bacteriana apesar de que em 1988, o subcomit de taxonomia de o gnero Brucella ter considerado a existncia de uma nica espcie no gnero Brucella, este mesmo comit admite o uso da nomenclatura anterior bem como o uso corrente em trabalhos baseados na taxonomia. A reduo do gnero Brucella a uma nica espcie no adotada por parte da grande maioria dos bacteriologistas e compreende parte dos especialistas do gnero Brucella. Depois da reunio de 11 septembro de 2003, o subcomit de taxonomia de Brucella decidiu por unanimidade rever a situao anterior e de reconhecimento existncia de novas espcies dentro do gnero Brucella. O reconhecimento dessas espcies justificado por estudos fenotpicos, pela epidemiologia, pela importncia dessas bactrias dentro da Sade Animal e Humana e pela utilizao potencial delas em guerra bacteriolgica. Classicamente, as espcies do gnero Brucella foram isoladas de mamferos terrestres. Mais tarde, a partir de 1994, amostras do gnero Brucella spp foram isoladas de mamferos marinhos. As caractersticas fenotpicas, os estudos de hibridizao, sequenciamento do ARNr 16S e o sequenciamento do gene recA mostraram que essas cepas ou linhagens pertenciam ao gnero Brucella. O estudo do metabolismo oxidativo permitiu individualizar as amostras isoladas de mamferos marinhos, permitindo que Jahans e colaboradores propusessem a espcie "Brucella maris". Posteriormente, a ribotipagem (estudo dos fragmentos de restrio dos genes codantes para o ARNr obtido pela enzima HindIII), a presena do segmento de insero IS711 em aval do gene bp26 e a presena de motifs especficos dentro da sequncia dos genes omp2 confirmaram que as cepas isoladas de mamferos marinhos eram distintas daquelas isoladas de mamferos terrestres. As linhagens isoladas de mamferos marinhos podem ser diferenciadas em 2 grupos. As cepas isoladas principalmente de penpedes possuem uma cpia dos genes omp2a e omp2b enquanto que as cepas isoladas principalmente de cetceos possuem 2 cpias do gene omp2b. Assim, em 2001, Cloeckaert e colaboradores propuseram a nomenclatura de "Brucella pinnipediae" para as cepas principalmente isoladas de penpedes e a nomenclatura de "Brucella cetaceae" para as linhagens isoladas principalmente de cetceos. A tcnica de IRS-PCR (Interspersed Repetitive Sequence-PCR) permitiu Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS igualmente reconhecer a existencia de 2 grupos de cepas. A nomenclatura de "Brucella cetaceae" e da "Brucella pinnipediae" no correta. Em 2007, Foster e colaboradores propuseram a nomenclatura de B. ceti (para as cepas isoladas de cetceos) e de B. pinnipedialis (para cepas isoladas de penpedes). Essa nomenclatura foi validada e publicada em 08 novembro de 2007. A Brucella foi cultivada ou detectada com tcnicas de DNA em pinpedes e muitas espcies de cetceos, incluindo focas comuns foca do porto (Phoca vitulina), foca anelada (Phoca hispida), focas harpa (Phoca groenlandica), foca de capuz (Cystophora cristata), foca cinzenta (Halichoerus grypus), boto (Phocoena phocoena), curto-bico golfinhos comuns (Delphinus delphis), golfinhos listrados (Stenella coeruleoalba), golfinhos-roaz (Tursiops truncatus), os golfinhos de lado branco do Atlntico (Lagenorhynchus acutus), golfinho de bico branco (Lagenorhynchus albirostris), os golfinhos de Maui (Cephalorhynchus hectori Maui), golfinhos-cabea-branca ou golfinho de Hector (Cephalorhynchus hectori), a baleia minke (Balaenoptera acutorostrata) e uma lontra europeia (Lutra lutra). CARACTERSTICAS GERAIS As novas espcies B. ceti e B. pinnipedialis so constituidas de cocos, cocobastonetes e/ou de bacilos curtos; Gram negativos; com 0,5 a 0,7m de dimetro e de 0,6 a 1,5m de comprimento; se apresentam de maneira isolada ou agrupada em curtas cadeias ou em pequenos filamentos; possuem os antgenos do gnero Brucella; so imveis e desprovidas de flagelos, aerbias; catalase, oxidase nitrato redutase e urease positivos; indol negativas; H2S negativas; incapazes de liquefazer a gelatina e no acidificam os acares contidos em meios convencionais. Crescimento obtido em temperatura compreendida entre 20 e 40C (temperatura tima 37 C) e pH timo compreendido entre 6,6 e 7,4. No AS com sangue ovino, as colnias so visveis aps 3 a 4 dias de incubao a 37C. Elas so convexas, circulares, de contorno regular, no hemoltica e com 0,5 a 1,0 mm de tamanho. O crescimento estimulado pela adio de soro ou sangue. No meio de gelose glicose-soro, as colnias so transparentes, convexas, lisas, brilhantes, de contornos regulares e apresentam uma colorao mel plida quando examinadas sob iluminao oblqua. B. ceti capaz de crescer em 3 a 4 dias em meio Farrell enquanto que o crescimento da B. pinnipedialis retardado (7 a 10 dias) ou no observado. A grande parte das cepas da B. ceti cultivada na ausncia de CO2 enquanto que o CO2 necessrio para a grande maioria das amostras da B. pinnipedialis. As caractersticas que permitem diferenciar a B. ceti e B. pinnipedialis das outras espcies esto contidas no Quadro 1.
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS Quadro 1. Diferenciao entre espcies do gnero Brucella spp 1) B. abortus ; 2) B. canis ; 3) B. ceti ; 4) B. melitensis ; 5) B. microti* ; 6) B. neotomae ; 7) B. ovis ; 8) B. pinnipedialis ; 9) B. suis biovar 1 ; 10) B. suis biovar 2 ; 11) B. suis biovar 3 ; 12) B. suis biovar 4 ; 13) B. suis biovar 5
1 Urease VP Fago Tb** (Tbilisi) Fago Wb** (Weybridge) Fago Iz** (Izatnagar) Fago** R/C L-Alanina*** L-Arabinose*** L-Arginina*** LAsparagina*** mesoEritritol*** D-Galactose*** L-cido glutmico*** L-Lisina*** DL-Ornitina*** D-Ribose*** D-Xilose*** Hospedeiros preferenciais +**** + + + + + + + + + + Bov 1 2 + + + d + d + + Can 2 3 + + + + d + + + + Cet 3 4 + + + + + + Pr 4 Cd 5 5 + + + 6 + d + + + + + + + d Neo 6 7 + d + + Ov 7 8 + -***** + + + + + Penip 8 9 + + + d + + + + d + + + + Sui 9 10 + + + + + d + + + d + + d Sui, Leb 10 11 + + + d + + + d + + d Sui 11 12 + + + + + + d + + d Re 12 13 + + + + d + + d + + d Sui 13
1) B. abortus ; 2) B. canis ; 3) B. ceti ; 4) B. melitensis ; 5) B. microti* ; 6) B. neotomae ; 7) B. ovis ; 8) B. pinnipedialis ; 9) B. suis biovar 1 ; 10) B. suis biovar 2 ; 11) B. suis biovar 3 ; 12) B. suis biovar 4 ; 13) B. suis biovar 5
* : Outras caract. permitem diferenciar a B. microti das outras espcies do gnero Brucella esto contidas na tabela II ** : Lticos na diluio corrente. *** : Oxidao **** : A cepa de referencia 544 assim como qualquer outra d resultado negativo. ***** : Todas as amostras da Brucella pinnipedialis so lisadas pelo fago Tb. B: Bovinos; Ca: Cd dos campos (Microtus arvalis); Can: Caninos; Ce: Cetceos; Pr: Pequenos Ruminantes; Ov: Ovinos Ne: Neotomos; Sui: Suinos; Leb: Lebres; Re: Renas.
SINAIS CLNICOS As alteraes reprodutivas como aborto, em fmeas; orquite/epididimite, leses granulares, em machos, so sinais primrios da brucelose nos animais terrestres. A avaliao da fertilidade em animais marinhos de vida livre difcil, entretanto nos Estados Unidos, em 1999, Miller e colaboradores relataram casos de aborto em dois golfinhos (Tursiops truncatus) capturados. O DIAGNSTICO DIFERENCIAL Em golfinhos com meningite, o diagnstico diferencial inclui parasitismo (Nasitrema spp), infeco estafiloccica, herpes e infeces por Morbillivirus. Outras doenas que causam aborto, orquite, epididimite, abscessos e doenas sistmicas devem ser consideradas e evidncia de infeco por Brucella. ESTUDOS MOLECULARES Os estudos moleculares evidenciaram que as cepas dos mamferos marinhos diferem das dos mamferos terrestres e mesmo entre as linhagens que acometem os cetceos e os pinpedes. Algum tempo atrs, pesquisadores sugeriram a criao de uma nova espcie denominada B. maris, entretanto ela no foi aceita. Mais recentemente, duas novas espcies foram sugeridas; a B. cetaceae e a B pinnipediae, as quais ainda no foram oficialmente aceitas nem rejeitadas. Em 2007, Foster e colaboradores sugeriram os nomes de B. ceti e B. pennipedialis para as brucelas de cetceos e de focas, respectivamente (Foster et al 2007). ZOONOSE A brucelose uma importante zoonose para o homem causando a grande variedade de sinais e sintomas clnicos, incluindo febre ondulante, fadiga, prostrao, dor articular, mialgia, depresso e anorexia. Frequentemente ocorrem sequelas e perodos de recrudescncia, aps o episdio inicial de infeco. A brucela pode ser transmitida de animais para o homem pelo contato direto com animais infectados; pela ingesto de produtos infectados e pela inalao de aerossis. Quatro espcies do gnero Brucella (classif. atual) so causas primrias de infeco no homem. A B. melitensis bastante infecciosa, sendo transmitida por caprinos e ovinos. A B. abortus transmitida por bovinos. A B. suis transmitida por sunos e a B. canis transmitida por ces. As outras espcies de Brucella infectam raramente ou no infectam o homem. H alguns poucos relatos na literatura relativos infeco humana causada por linhagens de Brucella de mamferos marinhos. Brew et al. 1999 registraram o caso ocorrido em um laboratorista que adquiriu os sinais clnicos compatveis com brucelose. A infeco foi confirmada pelo isolamento, testes diagnsticos sorolgicos, PCR, RFLP de Brucella de origem marinha (). Sohn et al. (2003) relataram em dois pacientes peruanos, os quais foram diagnosticados como portadores de neurobrucelose. O quadro clnico foi confirmado pelos Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS testes diagnsticos (isolamento, PCR, sequenciamento de DNA) como infectados naturalmente por linhagens de Brucella de mamferos marinhos. Na Nova Zelndia, McDonald e colaboradores, em 2006, relataram um caso em um homem de 43 anos, morando em Auckland - Nova Zelandia, o qual apresentou sinais de osteomielite espinal por 2 semanas com sinais de febre, rigor e fraqueza lombar. Os testes aplicados reagiram tanto para a B. suis quanto B. melitensis. As amostras foram ento enviadas ao laboratrio de Referncia internacional que o identificou como relacionado a Brucella originria dos Estados Unidos de golfinhos (Tursiops truncatus) e da foca comum (Phoca vitulina). EPIDEMIOLOGIA PREVALNCIAS H na literatura relatos em muitos lugares e em diversas ocasies de isolamento de Brucella e comprovao sorolgica em muitos mamferos marinhos, especialmente no Hemisfrio Norte. A prevalncia da deteco de anticorpos contra Brucella nos animais marinhos variou, segundo diversos autores entre 0 a 38% dos cetceos, dos penpedes e musteldeos (Jepson et al. 1997; Tryland et al. 1999; Calle at al. 2002; Hanni et al. 2003; Maratea et al. 2003; Ohishi et al 2003; Nielsen et al 2005). Um grande estudo, envolvendo 1.855 penpedes dos EUA e 1.386 penpedes e cetceos do Atlntico Norte revelaram que 3,1 e 8,2% tinham sorologia positiva para brucelas marinhas, respectivamente (Tryland et al 1999; Nielsen et al 2001). Amostras de Brucella foram isoladas em 31% (54/175) dos mamferos marinhos provindos de diferentes origens (Forbes et al 1993; Ewalt et al 1994; Ross et al 1994; Foster et al 1996; Clavareau et al 1998; Miller et al 1999; Tryland et al 1999; Gonzalez et al 2002; Maratea et al 2003; Tryland et al 2005). H poucos relatos de sorologia positiva em penpedes e cetceos no Hemisfrio Sul. Retamal e colaboradores, na Antrtica, em 2000, estimaram em 3,5% (6/17) das amostras de penpedes positivas para brucelose. Van Bressem e colaboradores, em 2001 quantificaram em 55, 2% (32/58) das amostras reagentes prova de brucelose nos cetceos examinados, nas costas peruanas do Pacfico Sul. Na Austrlia, Dawson (2005) detectou reaes sorolgicas positivas em 3 espcies incluindo 75% (9/12) dos lees marinhos (Neophoca cinerea). Na Nova Zelndia, Mackereth e colaboradores, em 2005 no detectaram reagentes positivos em 1001 lees marinhos da Nova Zelndia (Arctocephalus hookeri). LESES Pequenas alteraes patolgicas tm sido relatadas nos primeiros estudos nos animais marinhos encalhados no leste do Atlntico Norte apesar do sucesso no isolamento de agentes cepas pertencentes ao gnero Brucella. Contrariamente com as leses granulomatosas e caseosas observadas e relatadas nas gnadas da baleia minque (B. acutorostrata) no Oeste do Pacfico. Leses granulomatosas caseosas testiculares foram constatadas em 31% (11/35) e 38% (35/93) em machos da baleia minque do Pacfico Norte capturados em 2000 e 2001 respectivamente. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS COLETA DE AMOSTRAS As amostras so isoladas de pulmes, do bao, do fgado, do lquido peritoneal, do corao, dos rins, do epiddimo, dos ovrios, do leite, de abscesso, dos linfonodos e do sangue. Em alguns animais, nenhuma patologia pode ser associada presena do agente, enquanto em outros animais pode-se notar epididimite discoespondilite, meningite, leses purulentas, necrose heptica, necrose esplnica, necrose dos linfonodos, peritonite, mamite e endometrite. O diagnstico presuntivo da infeco pode ser evidenciado atravs da presena de anticorpos anti-Brucella em outras espcies: golfinho sombra (Lagenorhynchus obscurus), marsopa espinosa (Phocoena spinipinnis), baleia piloto (Globicephala melas), baleia comum (Balaenoptera physalus), baleia boreal (Balaenoptera borealis), foca de Weddell (Leptonychotes weddellii), mora do Atlantico (Odobenus rosmarus rosmarus), foca de Kerguelen (Arctocephalus gazella) . Estudo realizado em animais vivos nas costas da Esccia mostrou que aproximadamente 49% das focas comuns e 33% dos botos eram soropositivos. A ingesto de mamferos marinhos ou alimentos contaminados por esses animais podem representar perigo para os animais silvestres e domsticos. Os ursos polares consomem grandes quantidades de focas e um estudo mostrou que 5,4% dos ursos polares apresentarm anticorpos anti-Brucella. As carcaas dos mamferos marinhos encontrados nas praias podem representar um risco para os animais que crculam naquele ambiente. A inoculao experimental por via intravenosa de cepas de Brucella isoladas de mamferos marinhos em bovinos provocou abortos e a mesma amostra pode ser reisolada do feto. Por sua vez, a inoculao por via intraconjuntival no provoca soroconverso. Em cabras prenhes, a inoculao por via conjuntival provocou uma soroconverso transitria. DIAGNSTICO LABORATORIAL O isolamento realizado em paralelo em meio de Farrell (incubado pelo menos por 14 dias aps a concluso do cultivo) e em AS incubado a 37 C em atmosfera enriquecida com 10% de CO2. O meio de Farrell deve conter concentraes menores de bacitracina e/ou de cido nalidxico, pois favorecem o cultivo da Brucella pinnipedialis. O aspecto da colnia; o exame microscpico aps a colorao de Gram e a pesquisa de anticorpos aglutinantes em lmina com soro anti-Brucella abortus permitem orientao do diagnstico. O diagnstico da espcie mais complexo, devendo ser confiado a laboratrios especializados. O diagnstico sorolgico emprega os testes clssicos utilizados para o diagnstico de brucelose dos mamferos terrestres (AAT, FC, ELISA, etc.). Embora esses testes ainda no estejam validados. CONTROLE Mtodos especficos de controle no foram estabelecidos para a brucelose em mamferos marinhos. Princpios gerais de controle de infeco, incluindo o isolamento, desinfeco e higiene devem ser utilizadas com os animais infectados em instalaes Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS martimas de mamferos. Alguns autores sugerem que os centros envolvidos na reabilitao de mamferos marinhos devem rotineiramente selecionar animais para Brucella spp.
Brucella microti
Prof. Marcos JP. Gomes INTRODUO Atualmente, alm das oito espcies descritas, h mais outra espcie que foi adicionada s isoladas. A nova espcie chama-se B. microti, espcie isolada do camundongo do campo (Microtus arvalis). Este roedor do campo provoca grandes prejuzos s colheitas de cereais na Europa e reservatrio para outros agentes como Leptospira interrogans, Francisella tularensis e Babesia microti. Em 1996, a populao de camundongos do sul da Morvia (Repblica Tcheca) foi objeto de um levantamento para melhor conhecer a dinmica das populaes. Entre 19992003, os pequenos roedores foram vtimas de uma epidemia com grande mortalidade. As observaes microscpicas das leses permitiram demonstrar cocobastonetes Gram negativos. O exame bacteriolgico efetuado em quatro animais capturados, em setembro de 2000, permitiu isolar em cultivo puro, oito amostras nas quais cinco pareciam assemelharse com amostras do gnero Ochrobactrum spp. Duas dessas amostras, as amostras CCM 4915 e CCM 4916, foram de fato submetidas a um estudo bacteriolgico mais completo, sendo identificadas como cepas de Ochrobactrum intermedium. O O. intermedium um germe do solo, raramente responsvel por infeco em vertebrados, sendo pouco provvel que o O. intermedium fosse a origem das epidemias observadas nos camundongos. As amostras CCM 4915 e CCM 4916 foram submetidas a um estudo taxonmico. O sequenciamento dos genes rrs, recA, omp2a e omp2b, assim como a hibridizao ADN-ADN permitiu colocar as duas cepas dentro do gnero Brucella. A sequncia dos genes rrs (1422 pb) e recA (897 pb) apresentaram 100% de semelhana com as seqncias das Brucella spp. As sequncias dos genes omp2a (1104 pb) apresentaram 100 % de semelhana com a sequncia da cepa 6516/98 da B. pinnipedialis, enquanto que a sequencia dos genes omp2b apresentou 99% de semelhana com a cepa B3196 da B. abortus e 99 % de similitude com a linhagem B. suis 1330. A tcnica de AMOS (AMOS para AbortusMelitensisOvisSuis) permite detectar e diferenciar B. abortus, B. melitensis, B. ovis e B. suis, permitiu obter um fragmento de 2.000 pb ausente nas outras Brucella spp. A amplificao da regio situada em direo ao gene bp26 conduz a obteno de um amplicon de 1029 pb, caracterstico das Brucella spp isoladas de mamferos terrestres. A tcnica de MLVA [multilocus VNTR (variablenumber-tandem-repeats) analysis] efetuadas nas amostras CCM 4915 e CCM 4916 e em 424 amostras de Brucella spp revelaram que as cepas isoladas de roedores formavam um grupo distinto das outras espcies do gnero Brucella. As caractersticas fenotpicas permitem diferenciar as cepas CCM 4915 e CCM 4916 das outras espcies do gnero Brucella. Assim, em fevereiro de 2008, Scholz e colaboradores sugeriram o nome de B. microti para esta bactria. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
CARACTERSTICAS GERAIS As cepas de B. microti so cocobastonetes ou de bastonetes curtos, Gram negativos, com 0,5 a 0,8 m de diametro por 0,6 a 1,4 m de comprimento, e apresentam-se isoladas ou agrupadas em filamentos irregulares, aerbias, imveis, no esporuladas, oxidase positiva, catalase positiva, metabolismo oxidativo e aglutinao pelo soro anti-M diludo a 1/80. CARACTERSTICAS BIOQUMICAS Apresentam resposta positiva aos testes: Reduo dos nitratos (com formao de gas), Reduo dos nitritos, Urease, VP, Fenilalanine desaminase, assimilao (galeria API 20 NE) de Adipato, L-arabinose, Nacetil-glucosamina, D-glicose, Maltose e D-manose, Oxidao (utilizao do meio OF, Difco), Frutose, Glucose, Maltose e Xilose. Apresentam resposta negativa aos testes ADH, LDC, ODC, Produo de H2S, Citrato de Simmons, ONPG, hidrlise do ADN, do amido, da caseina, da esculina, da gelatina, da lecitina, da tirosina, Assimilao (galeries API 20 NE) do caprato, do citrato, do gluconato, do malato, do D-manitol e do fenil-acetato. Apresentam resposta positiva no API ZYM Fosfatase cida, fosfatase alcalina, leucina arilamidase, valina arilamidase, cistina arilamidase, alpha-glicosidase e esterase lipase. Apresentam resposta negativa no API ZYM Esterase, lipase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, beta-glucuronidase, betaglucosidase, alfa-manosidase, alfa-fucosidase, N-acetil-beta-glucosaminidase. Outras caractersticas fenotpicas podem ser estudadas utilizando um sistema miniaturizado, denominado Micronaut (Merlin microbiological diagnostics company) o kit de identificao utilizado por Scholz e colaboradores no relatado no catlogo da (Merlin microbiological diagnostics company). Os autores no deram nenhum detalhe sobre este kit, citando apenas uma publicao de Neubauer et al. 2000. A B. microti cultivada na presena de tionina (diluida 1/25.000) e na presena de fucsina bsica (diluida 1/50.000). Nenhum crescimento evidenciado em caldo contendo 6,5% de NaCl. Os cultivos so lisados pelos fagos Tbilisi, F1 e F25 a 10.000 RTD (Routine Test Dilution, Dilution) e pelo fago Weybridge na diluio de rotina. O cultivo facilmente obtido no agar nutritivo incubado na temperatura entre 25 e 42C, em atmosfera aerbia no enriquecida em CO2. Aps 24 a 48 horas de incubao a 28-37C, as colnias so lisas, transparentes, beges, ligeiramente cncavas de bordos regulares e com dimetro de 1 a 2 mm. No AS, as colnias no so hemolticas. Aps 72h Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS de incubao a 37C, as colnias possuem um tamanho compreendido entre 6 e 9 mm e de colorao amarronzada. A B. microti sensvel a gentamicina, tobramicina, ofloxacina e a associao de trimetoprima-sulfametoxazol. Resistncia observada para a colistina, piperacilina, da ceftazidima e tazobactam. PATOGENICIDADE A infeco dos camundongos provoca caquexia, edema de extremidades dos membros, artrites, orquites e adenites. Esses abscessos so, algumas vezes, sobre os membros e sua ruptura causa perfuraes na pele. Na necropsia, h presena de abscessos peritoniais, esplenomegalia, hepatomegalia pouco pronunciada e hemorragias intestinais moderadas. A inoculao por via subcutnea de 2,5 x 107 microrganismos em camundongos de laboratrio (Cd SPF da linhagem ICR) provoca, em 4 a 69 dias, morte de 50 % dos animais. Os camundongos mortos apresentam abscesso, uma ligeira esplenomegalia, um exsudato peritonial contendo bactrias Gram negativas observadas nas leses. Patogenicidade para o homem ou para outras espcies animais no foi ainda documentada. DIAGNSTICO B. microti facilmente isolada das leses em agar nutritivo e no TSA. A identificao delicada, pois a B. microti pode ser confundida com uma espcie do gnero Ochrobactrum, especialmente quando se utiliza a galeria API 20 NE conduzindo a uma identificao errnea de Ochrobactrum anthropi. De qualquer forma a ausncia de motilidade permite distinguir facilmente B. microti de Ochrobactrum spp. BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA PARA O GNERO Aguirre, NP.; Vanzini, VR.; Torion de Echaide, S.; Valentn, BS.; De Lucca, G.; Aufranc, C.; Canal, A. & Nielsen, K. Antibody dynamics in holstein friesian heifers vaccinated with Brucella abortus strain 19, using seven serological tests. J. Immunoassay Immunochemistry , v. 23, p. 471-478, 2002. Alton, GG.; Jones, LM.; Angus, RD.; Verger, JM. Tecniques for the Brucellosis Laboratory. 1 Edio Paris: Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), 190 p. 1988. Anon, Joint FAO/WHO Expert Committee on Brucellosis. WHO Technical Report Series 740, WHO. Genebra, 1986. Anon, Manual of Standards for diagnostic Tests and Vaccines. 3 Ed., Paris: OIE. 2000. Web address: http://www.oie.int/eng/normes/manual/A-00048htm. Azevedo, SS.; Vasconcellos, SA.; Alves, CJ. Brucelose canina por Brucella canis. Revista CRMV Ano X n.31, jan/fev/mar/abr p. 38-46, 2004 Blasco, JM. Brucella ovis. In: Animal Brucellosis, Nielsen K.; Duncan JR., eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 351-378, 1990. Brew, SD.; Perrett, JA.; Stack, AP.; MacMillan, AP.; Staunton, NJ. Human exposure to Brucella recovered from a sea mammal. Vet. Rec., v. 144, p. 483, 1999. Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS
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Gnero Brucella spp

Homem: FEBRE ONDULANTE, FEBRE DE MALTA OU DO MEDITERRNEO, FEBRE

Caprinos Eqinos Sunos

B. abortus B. suis B. melitensis** B. abortus B. abortus B. melitensis** B. suis B. canis

B. abortus B. melitensis** B. suis B. inopinata** B. ceti** B.pinnipedialis** B. neotomae**

Roedores (Neotoma lepida) Camundongo campo (Microtus arvalis) Cetceos Penpedes

** No h registro dessas espcies do gnero Brucella no Brasil, at o presente momento.

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B. canis B. ovis B. neotomae

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Quadro II. Sobrevivncia da B. abortus, segundo o ambiente e o tempo

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Can Cet Cap Mar Nle Ov 2 3 4 5 6 7

Sui, Sui Ren Ren Leb 10 11 12 13

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Microbiologia Clnica Veterinria VET 3225 REA DE BACTERIOLOGIA 2011-2 UFRGS

Quadro V. Amostras de soro trabalhadas no LABACVET-UFRGS entre 2001-2011

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Prstata Linfonodo, bao, medula ssea

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Aglutinao lenta em tubos na presena de 2-ME

At 3 meses ps bacteremia 1,2-2 meses PI

IDGA (antgeno LPS) 1,5-2,5 meses PI

Sensvel, + especfico que os testes anteriores. Tcnica complexa, interpretao delicada

IDGA (antgenos citoplasmticos, de natureza proteca)

At 3 anos ps bacteremia 2-3 meses PI

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Brucelose nos Mamferos Marinhos

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