CENTRO FEDERAL DE EDUCAO TECNOLGICA DE QUMICA UNIDADE RIO DE JANEIRO COORDENAO DE BIOTECNOLOGIA BIOQUMICA (Laboratrio 318) PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS

DE PROTENAS Material por grupo: 12- Tubos de ensaio que caibam na centrfuga clnica !!! 2- Pipetas de 2 mL 3 -Pipetas de 5 mL 1- Pipeta de 10mL 2- Pr-pipetes 1- Banho maria (100o C) 15 mL de Soluo de (NH4)2SO4 60% p/v em um becker 10mL de Soluo de uria 8M em um becker 50mL de Soluo tampo fosfato (PBS) pH 7,4 em um becker Amostras de protenas: 20mL de Ovoalbumina (clara de ovo diluda em PBS 1:25 v/v) em um becker 20 ml de Casena (diluda em PBS 1 mg/mL) em um becker Material na capela: Acetona na Capela com 1 pipeta de 5 mL e 1 pr-pipete. Soluo de TCA (cido tri-cloro-actico) 12,5 % p/v com 1 pipeta de 5 mL e 1 pr-pipete. Mtodo: 1. Transfira, com auxlio de pipeta e pr-pipete, alquotas das solues de protena para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo:
Tubo no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ovoalbumina 4 mL 2 mL 2 mL 1 mL 1 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL casena 4 mL ensaio Efeito da temperatura Efeito da temperatura Efeito de solventes orgnicos Efeito de solventes orgnicos Efeito de altas concentraes salinas Efeito de altas concentraes salinas Efeito de cidos fortes Efeito de cidos fortes Efeito de agentes caotrpicos Efeito de agentes caotrpicos

Obs.: Anote o aspecto de cada amostra antes e depois da realizao de cada um dos ensaios!

2. Efeito da temperatura: leve os tubos 1 e 2 ao banho-maria fervente por 10 minutos; observe 3. Efeito de solventes orgnicos: utilizando a capela, transfira 2 mL de acetona para os tubos 3
e 4, homogeneizando-os; observe os resultados (aspecto da amostra) e reserve o material. os resultados (aspecto da amostra) e reserve o material.

4. Efeito de altas concentraes salinas: transfira 4 mL da soluo de (NH4)2SO4 para os

tubos 5 e 6, homogeneizando-os; observe os resultados (aspecto da amostra) e reserve o material. 5. Efeito de cidos fortes: utilizando a capela, transfira 2 mL da soluo de TCA para os tubos 7 e 8, homogeneizando-os; observe os resultados (aspecto da amostra) e reserve o material. 6. Efeito de agentes caotrpicos: transfira 2 mL da soluo de uria para os tubos 9 e 10, homogeneizando-os; observe os resultados (aspecto da amostra) e reserve o material.

7. Aps a concluso dos ensaios, separe os tubos que sofreram alteraes. Esses tubos devero ser tarados (use a balana), e posteriormente centrifugados a 3000 RPM por 5 minutos em uma centrfuga clnica. 8. Oberve os resultados. Separe os tubos onde houve formao de um precipitado (pellet), descartando o seu sobrenadante cuidadosamente para que no haja ressuspenso do pellet. 9. Adicione 6 mL da soluo tampo fosfato (PBS) aos precipitados, com auxlio do vortex, homogeize-os procurando ressolubilizar o pellet. Relatrio: Deve ser feito seguindo-se o roteiro de confeco de relatrios vigente. Organize seus resultados em uma tabela. No esquea de discutir o motivo das diferenas entre os resultados obtidos com a amostra de casena e de ovoalbumina, qual o mecanismo de ao de cada um dos agentes fsicoqumicos utilizados e por que houve a ressolubilizao do pellet em alguns ensaios e noutros no