AS IMPRESSES DIGITAIS DO DNA (DNA FINGERPRINTS)

GENOMA HUMANO ESTRUTURA

MICROSSATLITES
Seqncias hipervariveis (tambm chamadas polimrficas) repetitivas de 1 a 4 pb com distribuio ao longo do genoma. O polimorfismo destas seqncias resultado de diferentes rearranjos envolvendo segmentos de DNA de tamanhos diferentes. Herana Mendeliana (os filhos sempre recebem metade dos alelos de origem materna e metade de origem paterna). Exemplos de seqncias de microssatlites: Repetio de 1 base: GTAAAAAAAAAAAAAAAGGAT Repetio de 2 bases: GTCACACACACACACACAGGAT (dinucleotdeo) Repetio de 3 bases: GTCACCACCACCACCACCACGGAT (trinucleotdeo) Repetio de 4 bases: GTCAGACAGACAGACAGAGGAT (tetranucleotdeo) Polimorfismo so devido a diferenas no nmero de repeties. So tambm conhecidos como short tandem repeat(STR).

GENOMA NUCLEAR

IMPRESSES DIGITAIS DO DNA (DNA FINGERPRINTS) - O QUE SIGNIFICA?

Com base no estudo de uma bateria de 12-20 microssatlites, possvel obter perfis genticos praticamente indivduo-especficos, muito teis na investigao de paternidade, identificao de vtimas e criminosos.

- TCNICAS RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism). PCR (Polymerase Chain Reaction).

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RFLP

Eletroforese em gel de agarose

Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrio: P 1) Coleta de amostras biolgicas que podem ser saliva, sangue, esperma e cabelo, entre outros. 2) Extrao e purificao do DNA.

3) Corte com enzimas de restrio (tesouras moleculares que reconhecem e cortam seqncias especficas do DNA).

4) Eletroforese: onde, atravs de uma corrente eltrica, so separados os fragmentos de DNA por tamanho. A partir da, formada uma espcie de cdigo de barras que a identificao individual e intransfervel de cada indivduo.

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VISUALIZAO DO DNA

SONDAS : SLP (single-locus probe) e MLP (multi-locus-probe). SLP: detecta um nico segmento de DNA repetitivo em um nico cromossomo. Seu uso resulta em um padro que contm no mximo duas bandas: uma para cada segmento de DNA reconhecido em cada membro do par de cromossomos homlogos. Para a obteno de padres mais caractersticos de cada pessoa, so necessrias vrias sondas. Devido sua sensibilidade, so empregadas nas investigaes criminais.

5) Transferncia para membrana de nylon (southern blotting).

MLP: detecta vrios segmentos de DNA repetitivo localizados em muitos cromossomos. O padro obtido consiste em aproximadamente 20 a 30 bandas. Por isso, a probabilidade de duas pessoas tomadas ao acaso apresentarem todas as bandas exatamente com a mesma posio extremamente baixa (1:10 trilhes).

6) Uso de sondas: pequenos segmentos de DNA radioativados, cuja seqncia de bases conhecida. Acoplam-se s seqncias de DNA das quais so complementares, ligando-se s mesmas.

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RESULTADO DO TESTE R 1- Anlise forense: assassinato

3- Paternidade:

2- Anlise forense: estupro A simulao acima demonstra que, biologicamente, h apenas um filho e uma filha do casal.

No caso acima, a me no sabe quem o pai biolgico.

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Reao em Cadeia da Polimerase: permite que um fragmento especfico da molcula de DNA seja amplificado milhares de vezes em apenas algumas horas.

PCR

Parte a ser duplicada selecionada por dois iniciadores (primers) oligonucleotdeos sintticos de RNA, complementares ao DNA fitamolde combinam-se exatamente com cada regio terminal da parte a ser copiada. Mquina de PCR (termociclador) basicamente um forno controlado por computador, onde um programa controla o tempo e a temperatura.

VANTAGENS: Permite a amplificao de qualquer seqncia de DNA coletada de amostras de materiais biolgicos como sangue, urina, outros fluidos corporais, cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de microorganismos, clulas vegetais ou animais mesmo que com milhares de anos, tambm podem ser detectadas pela PCR. ETAPAS: 1- Extrao do DNA da amostra que se pretende estudar. 2- Purificao do DNA. 3- Preparao de uma mistura chamada Master Mix, que conter todas as substncias necessrias sntese de novas cpias de DNA. 4- Incubao em um termociclador, que o aparelho responsvel pela execuo de todos os ciclos da reao, aquecendo e resfriando os tubos. 5- Eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtos da PCR. A partir da PCR possvel obter-se cpias de uma parte do material gentico em quantidade suficiente que permita detectar e analisar a seqncia que alvo do estudo. Durante o processo, o DNA original copiado por uma enzima, a DNA-polimerase, que duplica uma pequena parte da molcula de DNA.
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6- Revelao e fixao do gel.

Cada ciclo dobra o nmero de cpias do DNA dupla fita.

TERMOCICLADOR (ETAPAS): Reao se processa em ciclos de diferentes temperaturas ~30 ciclos sntese exponencial de molculas de DNA. Etapas de cada ciclo: 1- Desnaturao (94-95C por 5 minutos) separao do DNAmolde dupla fita em duas fitas simples de DNA. 2- Pareamento ("Annealing ou anelamento) (55-60C) iniciadores ligam-se ao DNA fita simples. O tempo necessrio para o anelamento de 30-45 segundos. 3- Extenso (72C) DNA-polimerase termoestvel (taqpolimerase extrada da bactria Thermus aquaticus) adiciona nucleotdeos polimerizao cada uma das novas fitas extendidas a partir dos iniciadores serve de molde para a sntese de novas fitas.

Nmero de ciclos adequado: 30 (at o 3 ciclo no h produtos; nmero de ciclos maior do que 35 tem pouco efeito positivo mutaes). RESULTADO DO TESTE R 1- Anlise forense: estupro Mary Higgins foi violentada no Central Park em Nova York. Trs suspeitos foram presos. O DNA revelou o verdadeiro agressor. As evidncias (sangue do agressor e um fio de cabelo) foram usadas no teste para achar o culpado. O indivduo 2 foi condenado.

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2- Anlise forense: um crime (quase) perfeito. Uma esposa desaparecida. Um marido desesperado. Ingredientes de uma trama quase perfeita para eliminar uma pessoa. Phillipe Landmeier tinha planejado tudo. S no contava que oito anos depois o seu crime viria tona.

4- Anlise forense: o assassino de Rodman Dam, 1987. 1987: casal de noivos Matthew Brock e Kelly Lynn Perry (tambm estuprada) - achado baleado na cabea (bala de rifle calibre 30) em Rodman Dam, rea de recreao na Flrida. Principais suspeitos: os adolescentes Randall Scott Jones e Chris Reesh.

Phillipe aguarda a execuo desde 1995.

3- Anlise forense: o assassinato de JonBennet Ramsey: um crime sem soluo?

A morte da inocncia.

Tristeza ou remorso?
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