Electroforesis de molculas anfotricas en un medio con gradiente de pH

ISOELECTROENFOQUE (IEF)

Comparacin entre electroforesis a pH continuo e isoelectroenfoque

IEF Zona de aplicacin de la muestra y control de enfocado

IEF: enfoque y concentracin en pH = pI

Equilibrio de transporte de masa por efectos elctrico y difusional: CmeE = D (dC/dx)

IEF: gradiente de pH con anfolitos carrier

IEF: formacin del gradiente natural de pH

Reaccin en el nodo: 6 H2O O2 + 4 H3O+ + 4 e

Reaccin en el ctodo: 4 H2O + 4 e 2 H2 + 4 OH

Soporte: gel de agarosa o poliacrilamida

Buena capacidad buffer en su pI Elevado nmero Tamao molecular entre 300 y 1000 Escasa absorcin a 280 nm No interaccionar con componentes de la muestra No txicos Conductividad apreciable en zona de pH pI

IEF: gradiente natural de pH ANFOLITOS CARRIER

IEF: gradiente de pH con immobilines

IEF: gradiente inmovilizado de pH immobilines

Derivados de acrilamida que contienen grupos carboxilo o de amina terciaria Copolimerizacin en la matriz del gel Componente buffer + contraion usado para ajuste de pH nico Soporte: gel de poliacrilamida Gradientes de pH estables

IEF: Efecto de la variacin de las condiciones de trabajo. Importancia del parmetro Voltxhora (Vh)
Soporte: 1 mm Poliacrilamida: T 5%, C 3% Gradiente natural de pH 3 -10

Gel 1: 50 W, anfolito 1:16, t:1h 42 min Gel 2: 8 W, anfolito 1:16, t: 3 h 57 min Gel 3: 50 W, anfolito 1:8, t: 2 h 5 min
A: 375 Vh B: 750 Vh C: 1500 Vh D: 3700 Vh

PARAMETROS CRITICOS EN IEF

DEPENDENCIA DE P, I y V
INTENSIDAD VARIABLE: cambios espontneos en la conductividad del sistema POTENCIA CONSTANTE: garantiza la aplicacin del mximo voltaje posible para cada valor de intensidad de corriente

IEF: poder resolutivo

Equilibrio de transporte de masa por efectos elctrico y difusional: CmeE = D (dC/dx) Distribucin de concentracin del compuesto anfotrico en la zona de pH = pI: C = C0.e
-(Efx2/2D)

= (-D/Ef)1/2

PODER RESOLUTIVO EN IEF

pI = k [D.(dpH/dx)/-E.(dme/dpH)]1/2

Efecto del gradiente de pH (dpH/dx)

IEF: PODER RESOLUTIVO

IEF: determinacin de pI
Medicin del gradiente de pH con electrodo de superficie (grfico pH vs. distancia entre electrodos). Electrodos de dimetro pequeo. Efectos de temperatura y disolucin de CO2. Medicin del gradiente de pH por elucin del gel (grfico pH vs. distancia entre electrodos). Efectos de temperatura y disolucin de CO2. Elevada manualidad. Incorporacin de marcadores de pI (grfico pI vs. distancia recorrida).

IEF Determinacin de pI

Desplazamiento (shift) del gradiente de pH

Electroendsmosis Oxidacin andica o reduccin catdica de los anfolitos Migracin de contaminantes Soporte: agarosa-IEF o acrilamida pretratada Anfolitos de elevada calidad Evitar tiempos prolongados Elegir electrolitos adecuados Evitar exceso de catalizadores e iniciadores de la polimerizacin Incorporar aditivos estabilizantes Precauciones para evitar interferencia de CO2

Interferencia por dixido de carbono ambiental: efecto predominante en la superficie del gel

IEF: curva de titulacin de protenas

IEF
Tcnica de equilibrio y punto final Tcnica de concentracin Elevado poder resolutivo Aplicaciones: Mtodo de referencia para identificacin (pI) Curva de titulacin de protenas Estudios de microheterogeneidad y mutaciones Control de pureza Tcnicas bidimensionales (protemica)