DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL PARTE I EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL ACTIVO Y EL TIPO MICROORGANISMO

1. OBJETIVO Determinar el efecto del tipo de microorganismo y la concentracin del activo sobre el dimetro del halo de inhibicin para la evaluacin de una sustancia antimicrobiana por difusin el gel. 2. MATERIALES (Materiales por grupo de Trabajo) Tubo de ensayo con 4 ml de inculo Tubo de ensayo con 2 ml de solucin estndar del antibitico de 1mg/ml 1 Tubos de ensayo pequeos vacos Recipiente con 60 ml de agar antibitico No.1 fundido a 50C Recipiente con 15 ml de agua destilada estril Cajas de petri vaca estril con 11 cilindros de acero Pipeta de 10 ml estril Pipeta de 1 ml estril Pinza estril 3. MICROORGANISMOS Escherichia coli Pseudomonas eruginosa Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Streptococcus faecalis De los anteriores microorganismos cultivar dos cepas de cada uno en 5 ml de caldo MH incubados a 35C por 24 horas. 10 1 1 1 1 12 1 1

4. PROCEDIMIENTO 4.1. Preparacin del Activo 4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.1.4. 4.1.5. 4.1.6. Marque los tubos pequeos del 1 al 10 Con ayuda de la pipeta de 10 ml adicione 1 ml de agua destilada estril en cada tubo Tome 1 ml de la solucin estndar de antibitico de 1 mg/ml y colquelo en el tubo marcado como No 1 y homogenice. Del tubo 1 tome 1 ml de solucin y colquelo en tubo marcado como No. 2 y homogenice. Repita el procedimiento hasta el tubo marcado como No 10 y homogenice. Vea la Figura No. 1

Figura 1. Preparacin de las diluciones del activo 4.2. Preparacin del Inculo 4.2.1. 4.2.2. De cada microorganismo haga un cultivo masivo en agar MH e incube a 35C por 24 horas. Con caldo de preservacin coseche el microorganismo y prepare en el mismo caldo una suspensin del microorganismo de 25%T (600nm) 4.3. Desarrollo del Ensayo 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.3.4. 4.3.5. Con ayuda de una pinza distribuya los cilindros de acero en la caja de petri segn diagrama adjunto (Figura No. 2). Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibitico No. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y 50C con 1 ml del inculo de 25%T. Mezcle bien sin hacer burbujas y srvalo en la caja de petri sin tumbar los cilindros de acero. Deje endurecer el agar y con ayuda de la pinza retire los cilindros de acero Revise que los pozuelos no tengan agar en el interior

4.3.6. 4.3.7. 4.3.8. 4.3.9.

Dispense en cada pozuelo 0.1 ml de cada una de las diluciones de acuerdo con la distribucin que se ve en la Figura No 2. Agregue 0.1 ml de agua destilada en el pozuelo central. Incube las cajas a 35C por 24 horas Luego de incubar mida con un calibrador los dimetros de los halos de inhibicin.

1 10 6 9 5

4 7 2 8

Figura No.2. Distribucin de los pozuelos en el agar.

5. ANLISIS DE LOS RESULTADOS 5.1. Revise las caractersticas del halo de inhibicin y determine cuales microorganismos producen halos de inhibicin bien definidos. 5.2. Registre en la Tabla no. 1 los valores de los dimetros de los halos de los microorganismos seleccionados 5.3. Con la informacin realice el Grfico No. 1 de Dimetro del halo versus Logaritmo de concentracin 5.4. Calcule los valores de la corona ([Dimetro del halo Dimetro del Pozuelo]/2) 5.5. Con la informacin realice el Grfico No. 2 de Longitud de la Corona versus Logaritmo de concentracin. 5.6. Por medio de la regresin de mnimos cuadrados determine la ecuacin de las dos grficos, el valor de R2 y el del intercepto. 5.7. Para determinar el rango de concentracin con la mejor correlacin realice regresiones de mnimos cuadrados en grupos de cinco (5) concentraciones C1 a C5, C2 a C6, C3 a C7, C4 a C7, C5 a C9 y C6 a C10, en caso de ser posible. (Tenga en cuenta que el valor mximo de dimetro del halo puede estar entre 25 y 30 mm y el menor de 12 mm). 5.8. El valor del intercepto en la Grafica No 2, es equivalente a la concentracin mnima inhibitoria 5.9. Con al informacin calculada realice el anlisis de resultados y las conclusiones respectivas, que se emplearn para la segunda seccin del trabajo.

Tabla No. 1 CONCENTRACION mcg/ml LOGARITMO DE CONCENTRACION DIAMETRO DEL HALO (mm) LONGITUD DE LA CORONA (mm)

DOSIS

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10

500 250 125 62,5 31,25 15,625 7,8125 3,90625 1,953125 0,9765625

DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL PARTE II EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA DENSIDAD DEL INOCULO 6. OBJETIVO Determinar el efecto de la densidad del inculo sobre el dimetro del halo de inhibicin para la evaluacin de una sustancia antimicrobiana por difusin el gel. 7. MATERIALES (Por grupo de Trabajo) Tubo de ensayo con 2 ml de inculo Tubo de ensayo con 2 ml de solucin estndar del antibitico de 1mg/ml 1 Tubos de ensayo pequeos vacos Recipiente con 60 ml de agar antibitico No.1 fundido a 50C Recipiente con 10 ml de agua destilada estril Caja de petri vaca estril con 11 cilindros de acero Pipeta de 10 ml estril Pipeta de 1 ml estril Pinza estril 8. MICROORGANISMO Bacillus subtilis 9. PROCEDIMIENTO 9.1. Preparacin del Activo 9.1.1. 9.1.2. 9.1.3. De la primera parte se ha seleccionado el rango de mejor correlacin. A partir de la solucin de 1 mg/ml realice una dilucin que tenga la concentracin ms alta del rango seleccionado la cual llamaremos C1. A partir de C1 realice diluciones seriadas 1:1 hasta C5 esta actividad de la misma manera que se realiz en la seccin 4.1. 5 1 1 1 1 7 1 1

9.2. Preparacin del Inculo 9.2.1. 9.2.2. 9.2.3. 9.2.4. 9.2.5. Del Bacillus subtilis haga un cultivo masivo en agar MH suplementado con MnSO4 (0,3 g/l) e incube a 30C por al menos 5 das. Verifique al microscopio que el cultivo est totalmente esporulado. Con caldo de preservacin coseche el microorganismo y prepare en el mismo caldo una suspensin del microorganismo de 25%T (600nm). Lo llamaremos Inculo 1X Haga tratamiento trmico (70C por 10 minutos) para eliminar las formas vegetativas presentes en la suspensin. Para preparar el inculo de mayor densidad Tome 10 ml de la suspensin y centrifugue a 5000 rpm por 15 minutos; retire el sobrenadante; resuspenda en pellet en 1 ml de caldo de conservacin. Lo llamaremos Inculo 10X 9.2.6. Para los inculos menos densos haga una dilucin 1:100 de la suspensin de 25%T. lo llamaremos Inculo 10-2X 9.3. Desarrollo del Ensayo 9.3.1. 9.3.2. 9.3.3. 9.3.4. 9.3.5. 9.3.6. 9.3.7. 9.3.8. 9.3.9. Con ayuda de una pinza distribuya los cilindros de acero en la caja de petri segn diagrama adjunto (Figura No. 2). Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibitico No. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y 50C con 1 ml del inoculo 10X Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibitico No. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y 50C con 0,1 ml del inoculo 10X Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibitico No. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y 50C con 0,1 ml del inoculo 1X Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibitico No. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y 50C con 1 ml del inoculo 10-2X Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibitico No. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y 50C con 1 ml del inoculo 10-2X En cada caso mezcle bien sin hacer burbujas y srvalo en la caja de petri sin tumbar los cilindros de acero. Deje endurecer el agar y con ayuda de la pinza retire los cilindros de acero Revise que los pozuelos no tengan agar en el interior distribucin que se ve en la Figura No 3. 9.3.11. Agregue 0.1 ml de agua destilada en el pozuelo central. 9.3.12. Incube las cajas a 35C por 8 a 12 horas 9.3.13. Luego de incubar mida con un calibrador los dimetros de los halos de inhibicin.

9.3.10. Dispense en cada pozuelo 0.1 ml de cada una de las diluciones de acuerdo con la

C1 C5 C3 C4 C2

C2 C4 C1

C3 C5

Figura No.3. Distribucin de los pozuelos en el agar.

10. ANLISIS DE LOS RESULTADOS 10.1. 10.2. 10.3. 10.4. 10.5. Registre en la Tabla No. 2 los valores de los dimetros de los halos Con la informacin realice el Grfico No. 1 de Dimetro del halo versus Logaritmo de concentracin Por medio de la regresin de mnimos cuadrados determine la ecuacin de las dos grficos, el valor de R2 . Con los valores de pendiente e intercepto de cada grfico determine la influencia de la densidad del inculo sobre la respuesta del activo. Haga la respectiva discusin y las. conclusiones

Tabla No. 2 CONCENTRACION mcg/ml LOGARITMO DE CONCENTRACION DIAMETRO DEL HALO (mm)

DOSIS

C1 C2 C3 C4 C5

DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL PARTE III VALORACION DE LA POTENCIA DE UN ANTIBIOTICO 11. OBJETIVO Determinar la potencia de un antibitico comercial por difusin el gel. 12. MATERIALES Tubo de ensayo con 4 ml de inculo Tubo de ensayo con 2 ml de solucin estndar del antibitico de 1mg/ml 1 Tubos de ensayo pequeos vacos Recipiente con 60 ml de agar antibitico No.1 fundido a 50C Recipiente con 15 ml de agua destilada estril Cajas de petri vaca estril con 11 cilindros de acero Pipeta de 10 ml estril Pipeta de 1 ml estril Pinza estril 13. MICROORGANISMO Bacillus subtilis 14. PROCEDIMIENTO 14.1. Preparacin del Activo 5 1 1 1 1 3 1 1

14.1.1. De la primera parte se ha seleccionado el rango de mejor correlacin. 14.1.2. A partir de la solucin de 1 mg/ml del antibitico estndar realice una dilucin que tenga la concentracin ms alta del rango seleccionado la cual llamaremos C1. 14.1.3. Haga diluciones serias 1:1 hasta C5 de la misma manera que se hace en la seccin 4.1. 14.1.4. Diluya el producto en agua destilada hasta obtener una solucin de 1 mg/ml. 14.1.5. A partir de la solucin de 1 mg/ml del producto realice una dilucin concentracin ms alta del rango seleccionado la cual llamaremos P1. 14.1.6. Haga diluciones serias 1:1 hasta P5 de la misma manera que se hace en la seccin 4.1 que tenga la

14.2.

Preparacin del Inculo

14.2.1. Del Bacillus subtilis haga un cultivo masivo en agar MH suplementado con MnSO4 (0,3 g/l) e incube a 30C por al menos 5 das. 14.2.2. Verifique al microscopio que el cultivo est totalmente esporulado. 14.2.3. Con caldo de preservacin coseche el microorganismo y prepare en el mismo caldo una suspensin del microorganismo de 25%T (600nm). 14.3. Desarrollo del Ensayo

14.3.1. Con ayuda de una pinza distribuya los cilindros de acero en la caja de petri segn diagrama adjunto (Figura No. 2). 14.3.2. Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibitico No. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y 50C con 1 ml del inoculo 14.3.3. Mezcle bien sin hacer burbujas y srvalo en la caja de petri sin tumbar los cilindros de acero. 14.3.4. Deje endurecer el agar y con ayuda de la pinza retire los cilindros de acero 14.3.5. Revise que los pozuelos no tengan agar en el interior. En caso de presencia de residuos de agar retrelos con una esptula delgada estril. 14.3.6. Dispense en cada pozuelo 0.1 ml de cada una de las diluciones de acuerdo con la distribucin que se ve en la Figura No 4. 14.3.7. Agregue 0.1 ml de agua destilada en el pozuelo central. 14.3.8. Incube las cajas a 35C por 8 a 12 horas 14.3.9. Luego de incubar mida con un calibrador los dimetros de los halos de inhibicin. 15. ANLISIS DE LOS RESULTADOS 15.1. 15.2. 15.3. 15.4. 15.5. Registre en la Tabla No. 3 los valores de los dimetros de los halos Con la informacin realice el Grfico No. 1 de Dimetro del halo versus Logaritmo de concentracin Por medio de la regresin de mnimos cuadrados determine la ecuacin de las dos grficos, el valor de R2. Verifique que las curvas sean paralelas. Calcule la potencia del producto de acuerdo con las siguientes ecuaciones.

Distancia de Concentracin = 2 I = Log (2) E = [(C1 + P1) (C5 + P5)] F = 1/5[(P1+P2+P3+P4+P5) (C1+C2+C3+C4+C5)] b = I/E M = F/b Potencia = Antilogaritmo (M)

P1 P5 P3 P4 P2

C2 C4 C1

C3 C5

Figura No.4. Distribucin de los pozuelos en el agar.

Tabla No. 2 ESTANDARD DOSIS CONCENTRACION mcg/ml LOGARITMO DE CONCENTRACION DIAMETRO DEL HALO (mm) 1 2 3 4 5 MUESTRA DIAMETRO DEL HALO (mm)