Aula Replicao e Reparo do DNA

Prof. Jonas Contiero -2006

Watson e Crick previram a Replicao Semi-conservativa do DNA

Watson e Crick: No escapou a nossa observao que o pareamento especfico (base) que ns postulamos sugere imediatamente um mecanismo de possvel cpia p/ o material gentico." O mecanismo: separao das fitas, seguido pela cpia de cada fita. Cada fita separada age como um modelo para a sntese de uma nova fita complementar.

O Modelo Semiconservativo
Matthew Meselson e Franklin Stahl verificaram o modelo semi-conservativo Cpia de DNA com nucleotdeos contendo 15N (mais denso do que o DNA normal) Cpia de DNA contendo nucleotdeos 14N (DNA sintetizado novamente era menos denso) DNA isolado em diferentes tempos e fracionado em gradiente de densidade DNA mais denso/ mais pesado, encontrado em gradientes mais baixo. DNA menos denso/mais leve, encontrado em gradientes mais alto.

Experimento de Meselson-Stahl a) Clulas crescidas por muitas geraes em meio contendo 15N b) Clulas transferidas para meio contendo 14N c) Replicao por uma segunda gerao, produo de dois DNAs Hbridos

Replicao bidirecional

 Tamanho do genoma de E. coli = 4.6 X 106 bp Bactrias tm cromossomos circulares com uma nica origem de replicao. Taxa de replicao ~1000 pares de base por segundo. Cromossomo duplicado em 38 minutos.

 Eucariotos tm genomas maiores 3 X 109 bps Taxa de replicao do cromossomo de Eucariotos mais lenta Mas devido aos cromossomos de eucariotos terem mltiplas origens de replicao, isto leva o mesmo tempo para replicar o genoma completo.

Replicao do DNA Semidescontnua

Sntese do DNA prossegue na direo 5 3e semidescontnua. A formao da fita contnua (fita Lder) ocorre na mesma direo do movimento da forquilha. A formao da fita descontnua (fita atrasada) ocorre em direo oposta ao movimento da forquilha

Fragmentos Okazaki

A Enzimologia da Replicao do DNA

Se Watson e Crick estavam certos, ento deveria existir uma enzima que faz cpias de DNA de um modelo de outro DNA Em 1957, Arthur Kornberg e colegas demonstraram a existncia da DNA polimerase H 3 tipos DNA polimerases em E. coli - DNA polimerase I repara o DNA e participa da sintese de filamentos tardios - DNA polimerase II repara o DNA - DNA polimerase III principal polimerase envolvida na replicao do DNA.

Equao geral da reao: (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi

DNA respectivamente DNA alongado dNMP e dNTP so os desoxinucleosdeos 5monofosfato e 5trifosfato

Alongamento de uma cadeia de DNA

Praticamente todas DNAs polimerases possuem atividades exonuclesica 3 5verifcando cada nucleotdeo aps adio (Atividade revisora)

Contribuio da geometria do par de bases para a fidelidade da replicao. A) A geometria dos pares A=T e GC so semelhantes e um stio ativo para acomodar uma, acomodaria a outra B) Geometria depares incorretos podem exclu~-los do stio ativo.

Atividade exonuclesica 3 5 da DNA polimerase I Base despareada (C A) impede a translocao da DNA polimerase para o stio seguinte. Deslizando para trs a enzima faz correo atravs da atividade exonuclesica 35 e aps reassume atividade polimersica na direo 53

Formas tautomricas da uracila

E. coli possui pelo menos cinco DNA polimerases. DNA polimerase I realiza funes de limpeza (atividade exonuclesica 5 3 ( essa atividade pode substituir um fragmento de DNA nick translation ) e 3 5 A maioria das outras DNAs polimerase no possuem atividade 5 3

Deslocamento do Corte (nick translation) Fita de DNA ou RNA pareada a um molde de DNA simultneamente degradada pela atividade 5 3e substituda pela atividade polimersica da mesma enzima. Essas atividades possuem papel importante tanto no reparo como na remoo de RNAs iniciadores. Um corte ocorre onde a sntese de DNA deve comear. A DNA polimerase estende a fita no molde do DNA e desloca o corte. O corte permanece onde a DNA polimerase I dissociar e ser selado por outra enzima

DNA Polimerase III uma Enzima de Multisubunidades

Organizao da subunidade da DNA Polimerase III

Replicao de DNA um Processo Processivo.

DNA Polimerase permanece ligada a forquilha de replicao Dmero de -subunidades formam estrutura de anel em torno das cadeias de DNA crescentes.

DNA Polimerase tambm tem funo prova de leitura

As reaes de polimerizao tem uma taxa de erro de 1 para 100,000 pares de base incorporados (1 X 10-5 erros por base) DNA polimerase tem funo 3 a 5 exonuclease (subunidade epsilon) que reconhece pares de base colocados errneamente e os remove. Por isso a funo de prova de leitura ajuda eliminar erros que poderiam conduzir a mutaes detrimentais. Entretanto a prova de leitura relizada pela exonuclease tem taxa de erro 1 para 100 pares de bases (1 X 10-2 erros por base) No total a taxa de erro 1 X 10-7 erros por base.

Estgios da Replicao de DNA

Iniciao Elongao Terminao

Incio da Replicao
Em E. coli
A replissomo (complexo envolvendo sistema de replicao, chamado sistema da DNA replicase) consiste de: DNA-desenrolando protenas, o complexo ini-ciador (primosomo) e 2 equivalentes de DNA polimerase III - holoenzima Iniciao: protena DnaA (componente chave no processo) liga-se em repetioes (quatro repeties de 9 pares de bases na origem) em oriC (origem da replicao em E. coli), iniciando a separao das fitas e DnaB, a helicase enviada pela DnaC, posteriormente desenrola. Primase ento liga-se e constri o primer de RNA

Protenas necessrias para iniciar a replicao em E. coli

Estgio de Elongamento da Replicao

Envolve duas fases: sntese da fita lider e da fita atrasada Elongao envolve DnaB helicase desenrolando, ligao da SSB p/ manter separadas as fitas. Complexo Primase sintetiza pequenos primers de RNA. DNA polimerase trabalha sempre em ambas as fitas Topoisomerase II (DNA girase) produz um super espiralamento que permanece

Primer (RNA) iniciador produzido pela iniciase. DNA olimerase III se liga e adiciona nucleotdeos Ambas as fitas so produzidas por um nico dmero assmetrico da DNA polimerase III (ala do DNA da fita atrasada)

DnaB helicase desenrola DNA

Sntese completa as subunidades da DNA polimerase III dissociam-se da braadeira

DNA iniciase se associa com DnaB helicase e forma um RNA iniciador

Nova braadeira posicionada

DNA Polimerase I/ Ligase Requerida para ligar fragmentos Okazaki

DNA polimerase I tem atividade exonuclease 5 3 que remove primer de RNA. Tambm tem atividade DNA polimerase de 5 3 para preencher espaos. (atividade de prova de leitura de exonuclease 3 5) Ligase conecta-se a terminais soltos. Usa NAD+ em uma reao de transferncia de grupos fosforilas, no h reao de redox

A) Remoo dos RNA iniciadores atravs da atividade exonuclesica (5 3) da DNA polimerase I B) Envolvimento do NAD+ e ATP no mecanismo da DNA ligase

Trmino da Replicao
Terminao ocorre na regio ter do cromossomo de E. coli. Regio ter rica em Gs e Ts, sinaliza o fim da replicao. Substncia de utilizao de terminao (Tus) liga-se regio ter. Tus previne forquilha de replicao atravs da inibio da atividade de helicase.

Trmino da replicao a) Sequncia Ter so posicionadas no cromossomo em dois agregados com orientaes diferentes Circulos catenados (interligados topologicamente, somente separados pela ao das topoisomerases

b)

Replicao de DNA em Eucariotos

Ocorre similarmente ao que ocorre em procariotos. Mltiplas origens da replicao (sequncia de replicao autnoma ARS) Replicao mais lenta que em procariotos. 5 diferentes DNA polimerases em Eucariotos.

DNA Polimerases Eucaritica

Alpha () sntese de Primer e reparo do DNA Beta () repara o DNA Gamma () replicao de DNA Mitocondrial Delta () Leva e sintetiza fita atrasada, e repara o DNA Epsilon () Repara e preenche os espaos em fitas atrasadas.

PCNA anlogas subunidade- da DNA polimerase de E. coli

Proliferao de antgeno nuclear celular Protena Trimrica Deslizamento da estrutura grampo liga-se ao novo filamento de DNA sintetizado

 Uma diferena fundamental do RNA, protena, lipdeo, etc. Em todos estes outros pode ocorrer substituio, mas DNA deve ser preservado Clulas requerem um meio p/ reparar perdas, bases alteradas ou incorretas, protuberncias devido a insero ou deleo, dmeros de pirimidina induzidos por UV, quebras de fitas ou crosslinks (lig. cruzada) 2 mecanismos principais: metdos p/ danos qumicos reverssveis e reparo de exciso.

Reparo do DNA

Despareamento

Despareamento DNA velho marcado por metilao (Dam metilase) para ser distinguido do novo. Dam metila o DNA na posio N6 de todas as adeninas que ocorrem nas sequncias (5)GATC

Reparo por exciso de base

DNA glicosilase reconhece uma base lesada e cliva entre a base e o esqueleto da desoxirribose Uma AP endonuclease cliva o esqueleto fosfodiester perto do stio AP (stio apurnico ou apirimidinico no DNA) DNA polimerase I inicia o reparo sintetizando a partir da extremidade 3OH do corte, removendo uma poro da fita lesada(atividade nuclesica 5 3) e substituindoor DNA no lesado DNA ligase faz a ligao

Mecanismo de reparo por exciso de nucleotdeos na E. coli e humanos

Excinuclease cliva, Helicase ajuda na remoo, DNA polimerase preenche a lacuna e DNA ligase sela o corte remanescente

Reparo de Dmeros de Timina induzidos por UV

Via de excisoreparo geral

Sistemas de reparo por exciso procuram DNAs duplex p/ bases incorretamente pareada, faz a exciso da regio pareada errneamente e a repe

Reparo de danos resultantes da desaminao da citosina

Desaminao de citosina a uracil um das formas mais comuns de danos ao DNA DNA glicosilases cliva bases nas ligaes N-glicosdicas, deixando esqueleto de acar-fosfato. Endonuclease identifica base ausente e acar fosfato. O espao ento preenchido pela DNA polimerase e ligase.