SELECCIN DE BACTERIAS AISLADAS DE SEDIMENTOS DEL CARIBE COLOMBIANO CON CAPACIDAD DEGRADADORA DE HIDROCARBUROS

SILVIA NARVEZ FLOREZ

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el ttulo de Microbiologa Industrial

Director MARTHA LILIANA GMEZ Msc. Investigador Asistente INVEMAR

Codirector MARIA MERCEDES MARTNEZ Msc. Profesor Asociado Universidad Javeriana

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL BOGOT D.C 2005

TABLA DE CONTENIDOS Pgina RESUMEN ABSTRACT 1. 2. 2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 2.3 2.4 2.4.1. 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.5 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4 2..5.5 2.5.6 2.6 2.6.1 2.6.2 3. 3.1 3.2 4. INTRODUCCIN MARCO TERICO HIDROCARBUROS Hidrocarburos alifticos Hidrocarburos aromticos PETRLEO Y ACPM BIODEGRADACIN BIORREMEDIACIN Atenuacin natural Bioaumentacin Bioestimulacin Bioventeo, Composteo, Biolabranza y Fitorremediacin FACTORES QUE AFECTAN LA BIORREMEDIACIN Composicin del petrleo y sus derivados Estado fsico del hidrocarburo Temperatura Aceptores de electrones Nutrientes pH TECNICAS PARA EL ANLISIS DE HIDROCARBUROS Fluorometra Cromatografa de gases OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECFICOS MATERIALES Y MTODOS 7 8 9 12 12 13 14 16 17 20 21 21 23 24 25 25 26 26 27 28 28 29 29 29 30 35 35 31

4.1. 4.1.2 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.3 4.3.1 4.3.2. 4.3.3 4.4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4 4.5 4.6 5 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.2 5.2.1 5.2.2. 5.2.3 6. 7. 8. 9

MICROORGANISMOS Aislamiento de microorganismos

SELECCIN DE CEPAS PARA ENSAYO DE DEGRADACIN

31 31 32 32 32 33 33 33 34 34 36 36 36 36 37 37 38 39 39 39 41 43 48 49 52 54 58 59 60 70

Seleccin horizontal en petrleo crudo y ACPM Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) Identificacin Microbiana ENSAYOS DE DEGRADACIN DE ACPM Preparacin de inculos Ensayos de degradacin Curva de crecimiento DETERMINACIONES QUMICAS Extraccin de hidrocarburos Medicin de hidrocarburos alifticos Medicin de Hidrocarburos Aromticos Totales (HAT) Parmetros analticos PORCENTAJE DE DEGRADACIN ANLISIS ESTADSTICO RESULTADOS Y DISCUSIN SELECCIN DE CEPAS PARA ENSAYOS Seleccin horizontal en petrleo crudo y ACPM Concentracin de ACPM Mnima Inhibitoria Caracterizacin e Identificacin Microbiana ENSAYOS DE DEGRADACIN DEL ACPM Degradacin de alifticos Degradacin de aromticos Curva de crecimiento CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS

INDICE DE TABLAS Fuentes de hidrocarburos del petrleo al mar (106 Ton /ao) Composicin del ACPM Cepas aisladas en la regin Caribe, con su contaminante y departamento de aislamiento respectivamente 4. Seleccin horizontal en petrleo crudo y ACPM de las cepas del Cepario de Bacterias Marinas 5. Caractersticas morfolgicas de las cepas seleccionadas para el ensayo de degradacin de ACPM 6. Porcentaje de remocin y degradacin de hidrocarburos alifticos del ACPM por factores biticos y abiticos 7. Comportamiento de las cepas en ACPM a travs del tiempo 56 45 49 40 39 Pgina 12 17

1. 2. 3.

INDICE DE FIGURAS Pgina 1. Estructura molecular de los compuestos del grupo BTEX (Benceno, Tolueno, Xileno y Etilbenceno) 2. Estructuras moleculares de Hidrocarburos Aromticos Polinucleares (HAP) 3. Esquema de ensayo de degradacin de ACPM para el anlisis microbiolgico y qumico del tratamiento y control abitico. 4. Porcentaje de cepas resistentes a concentraciones de ACPM de 1-10 % (v/v) 5. Caractersticas microscpicas (100x) y macroscpicas de las cepas seleccionadas. (A) cepa BCH28- Chromobacterium sp. (B) BCH30Klebsiella (C) cepa BCH31-Enterobacter cloacae (D) cepa BCH34 5 Caractersticas microscpicas (100x) y macroscpicas de las cepas seleccionadas (E) BCH35-Flavimonas oryzihabitans (F) BCH36Bacillus brevis aeuroginosa. 5. Caractersticas microscpicas (100x) y macroscpicas de las cepas seleccionadas. (I) cepa BCH74 Bacillus cereus (J) cepa BCH76 (K) BCH135-Bacillus pumillus. 6 7 Perfil cromatografico del da 0 y 21 de los n-alcanos del ACPM. Abundancia relativa de los n-alcanos en relacin con C-15 durante los 21 das de exposicin del ensayo. 8 9 Concentracin de HAT (mg/mL) de ACPM Caribe Cromatogramas de hidrocarburos aromticos (A) da 0 (B) da 21 del tratamiento 10 11 Curva de crecimiento del cultivo bacteriano mixto Caribe en ACPM Curva de crecimiento del cultivo bacteriano y porcentaje residual de hidrocarburos alifticos y aromticos en 21 das 56 53 54 51 52 48 51 (G) cepa BCH52 (H) cepa BCH56-Pseudomonas 47 46 42 35 16 15

INDICE DE ANEXOS Pgina 1. 2. 3. 4. Medios de cultivo Recuentos de clulas / ml de los inoculos en ACPM al 2% Curva de calibracin de hidrocarburos aromticos del ACPM Scan de absorcin de los hidrocarburos aromticos del ACPM-longitud de onda 310- 360 nm 5. Ensayos de concentracin mmima inhibitoria de las 22 cepas tolerantes a petrleo crudo y ACPM 6. Cromatogramas de n-alcanos da 0, 10 y 21 del tratamiento y el control abitico 7. Datos de hidrocarburos aromticos totales (mg/ ml) espectrofluorometra. 8 Recuentos microbiano del tratamiento (cultivo mixto) en ACPM al 2% v/v. 9 Anlisis estadsticos del tratamiento y el control abitico 81 80 medidos por 79 76 74 75 70 72 73

RESUMEN A partir del proyecto de investigacin Seleccin y aplicacin de bacterias marinas nativas con capacidad degradadora de compuestos orgnicos persistentes (COP) en el Pacfico y Caribe colombiano realizado en sedimentos de la regin Caribe, se aislaron 26 cepas tolerantes a hidrocarburos, las cuales fueron sometidas a un proceso de seleccin con el fin de escoger bacterias competitivas y evaluar su capacidad de degradacin. Por medio de una prueba de seleccin horizontal y un ensayo de Concentracin de ACPM Mnima Inhibitoria se escogieron 11 cepas capaces de tolerar crudo y ACPM en un rango del 1-8% v/v. Klebsiella sp., Chromobacterium sp., Flavimonas orizihabitans , Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeuroginosa, Bacillus Brevis, B. cereus y B. pumillus se identificaron bioqumicamente mediante el sistema BBL cristal y API 50 CHB/E. Basados en las capacidades degradativas individuales de las 11 cepas se conform un cultivo bacteriano mixto y se evalu su capacidad de degradacin de hidrocarburos en un cultivo a escala de laboratorio con una concentracin del 2% v/v de ACPM en un periodo de 21 das. Recuentos de las UFC/mL fueron empleados para elaborar la curva de crecimiento del cultivo mixto y se realizaron mediciones de hidrocarburos alifticos por cromatografa de gasesmasas e hidrocarburos aromticos por espectroflurometra. El cultivo mixto fue capaz de degradar el 68.6 % de los hidrocarburos alifticos en 21 das, con preferencia de los n-alcanos cadena larga (C12- C31) y alcanz un crecimiento mximo de 3.13 (+/1.41) x 109 UFC / mL. No se observ la degradacin de hidrocarburos aromticos, para lo cual es necesario prolongar el tiempo de evaluacin. Las cepas evaluadas tienen un potencial enzimtico para la degradacin de hidrocarburos y es necesario caracterizarlas con el fin de conformar en una fase posterior un consorcio que pueda ser aplicado efectivamente en campo.

ABSTRACT From the investigation project "Selection and application of native marine bacteria with degradative ability of organic compound persistent (COP) in the Pacific and the Colombian Caribbean" made in sediments of the Caribbean region, were isolated 26 tolerant strains to hydrocarbons, which were put under a process of selection with the purpose of choosing competitive bacteria and evaluating their capacity of degradation. By means of a test of horizontal selection and a test of Inhibiting Concentration of Minimum ACPM 11 strains able to tolerate crude oil and ACPM in a range of the 1-8% v/v were chosen. Eight of eleven strains were identified biochemically by system BBL crystal and API 50 CHB/E as Klebsiella sp., Chromobacterium sp., Flavimonas orizihabitans, Enterobacter cloacae,

Pseudomonas aeuroginosa, Bacillus brevis, B. cereus and B. pumillus. Based on the individual degradation capabilities of the 11 strains were composed a mixed bacterial culture and its ability of hydrocarbon degradation was evaluated in a assay on scale of laboratory with a concentration of 2% v/v of ACPM in a period of 21 days. Counts of the colonies forming units (CFU)/ mL were used to elaborate the curve of growth of the mixed culture and the hydrocarbon removal was quantified by gas chromatography. The mixed culture was able to degrade 68,6 % of aliphatic

hydrocarbons in 21 days, with preference of the n-alkanes long chain (C12- C31) and achieved a maximum growth of 3,13 (+/- 1,41) x 109 UFC/mL. The aromatic

hydrocarbon degradation was not observed for which it is necessary to prolong the time of evaluation. The evaluated strains have an enzymatic potential for the

hydrocarbon degradation and is necessary to characterize them with the purpose of conforming in a later order consortium that can indeed be applied in field.

1. INTRODUCCIN La contaminacin por hidrocarburos del petrleo es una problemtica de carcter mundial y como cualquier otro tipo de contaminacin se presenta con intensidad en los centros de mayor poblacin. Las principales fuentes son las actividades domsticas, industriales, martimas y procesos de explotacin, transporte y manejo del petrleo y sus derivados. Colombia, siendo el nico pas de Sudamrica que cuenta con costas en los dos ocanos, se ve enfrentado a la problemtica de contaminacin por hidrocarburos en sus mares y costas.

La produccin mundial de petrleo a finales del 2000 alcanz los 880 toneladas/ da, de los cuales el 40% fue transportado va martima y cerca del 9% se liber al mar por accidentes. En Colombia la produccin alcanz un volumen de 688 kB/da, de los cuales 3470 kB aproximadamente fueron transportados desde los puertos de Tumaco y Cartagena para cumplir la demanda interna.

En el Caribe los procesos de poblamiento e industrializacin sumados al aporte del ro Magdalena, han contribuido con una descarga continua de contaminantes a los mares; de igual forma los procesos de acumulacin de hidrocarburos en el Caribe se han visto favorecidos por sus caractersticas de mar cerrado, de aguas someras, ms tranquilo y donde rara vez la marea sube por encima de 60 cm (Garay y Velez, 2004).

Las zonas mas afectadas por hidrocarburos y derivados del petrleo en la costa Caribe son Santa Marta, Barranquilla, Cartagena y los Golfos de Morrosquillo y Urab. Algunas zonas como el sur de la Guajira y San Andrs tienen un impacto medio y regiones como el norte del Magdalena y norte de la Guajira permanecen relativamente limpias de este tipo de contaminantes. Histricamente en la zona costera del Atlntico, Bolvar y Magdalena se han encontrado valores de

Hidrocarburos Disueltos y Dispersos (HDD) que superan los 10 g/l establecidos

como norma para aguas marinas y costeras no contaminadas por la UNESCO (UNESCO, 1974, en INVEMAR; 2001)

Los hidrocarburos (e.g. petrleo, kerosene, ACPM) en el mar pueden encontrarse de forma dispersa o disuelta dentro de la columna de agua, ser adsorbidos por la materia orgnica y los limos y permanecer en los sedimentos largos periodos de tiempo o acumularse en los organismos, gracias a sus propiedades lipofilicas. Los hidrocarburos, como los poli aromticos nucleares (HAP), pueden entrar en la cadena alimentara y ser concentrados gradualmente a travs de los niveles trficos hasta llegar al hombre ocasionando efectos nocivos a largo plazo, por lo que estn considerados parte del grupo de compuestos peligrosos de la Agencia de Proteccin Ambiental de Estados Unidos.

Con el fin de contrarrestar los efectos nocivos causados por la presencia del petrleo en los ecosistemas marinos se han desarrollado tcnicas fsicas, qumicas y biolgicas que buscan remover el mayor porcentaje del contaminante y disminuir el impacto generado tras un derrame o acumulacin progresiva.

La biorremediacin emplea la accin de microorganismos, las condiciones fsicoqumicas del rea y el contaminante y un adecuado monitoreo, para lograr la mayor remocin del contaminante. Significantes y cuantiosos adelantos han sido realizados en este campo, se han adelantado gran cantidad de investigaciones en la bsqueda de microorganismos con potencial degradador que lleven a mejoras biotecnolgicas y al diseo de estrategias efectivas de remediacin.

Bajo este marco de referencia y con el propsito de conocer el potencial biorremediador de los microorganismos nativos que a futuro puedan ser usados para descontaminar y recuperar ecosistemas afectados por hidrocarburos el Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras-INVEMAR con el apoyo de COLCIENCIAS adelanta el proyecto Seleccin y aplicacin de bacterias marinas nativas con

10

capacidad degradadora de compuestos orgnicos persistentes (COP) en el Pacfico y Caribe colombiano dentro del cual se enmarca el presente trabajo de investigacin enfocado en la capacidad de degradacin de ACPM por bacterias nativas aisladas del mar Caribe.

11

2. MARCO TERICO 2.1 HIDROCARBUROS Los hidrocarburos del petrleo (HP) son considerados altergenos ya que por sus caractersticas en el medio marino producen efectos nocivos a los recursos vivos y a la vida marina, peligros para la salud humana, obstaculizacin de las actividades martimas, incluidas la pesca y otros usos legtimos del mar, deterioro de la calidad del agua de mar para su utilizacin y menoscabo de los lugares de esparcimiento (Tejada et al., 2003). Se calcula que en promedio 1.7 - 8.8 x 106 toneladas de hidrocarburos son descargados anualmente a las aguas marinas y estuarinas del mundo (Head y Swanell, 1999), ya sea a travs de actividades antropognicas, como el transporte y explotacin de crudo; como producto de fuentes biognicas, como las algas (Prince et al., 2003) o por la descarga de aguas residuales industriales y municipales (tabla 1). Tabla 1 Fuentes de hidrocarburos del petrleo al mar (106 Ton /ao) Actividad Transporte Produccin, refinamiento y carga en terminales Aguas industriales Aguas de desecho municipales Deposicin atmosfrica Produccin por fitoplancton marino Desages urbanos Aguas rivereas Deposicin atmosfrica a
a

Industria del Petrolera 1.15 0.12

Otras 0.22

Total 1.37 0.12

0.15 0.30 0.60 26.000 0.40 1.40 100-4000

producto de la biosintesis. Tomada de Kennish, 1994.

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Los hidrocarburos pueden clasificarse segn la forma estructural en hidrocarburos de cadena abierta e hidrocarburos cclicos. Dentro de los hidrocarburos de cadena abierta o alifticos se encuentran los alcanos, los cuales pueden ser saturados y no saturados (alquenos y alquinos) (Brown et al., 1997). Dentro de los cclicos se encuentra el grupo de hidrocarburos aromticos de bajo y alto peso molecular. Su persistencia, toxicidad, y biodegradabilidad depende de las cantidades en las que estn presentes en el petrleo crudo y sus derivados.

2.1.1

Hidrocarburos alifticos

Los hidrocarburos alifticos se pueden clasificar en alcanos, alquenos y alquinos, dependiendo de la saturacin de sus enlaces. Los alcanos constituyen el mayor componente de los combustibles del petrleo (So y Young, 1999) y son los compuestos ms simples, poseen hidrgeno y carbono unidos por enlaces sencillos. Los alquenos son hidrocarburos que poseen al menos un doble enlace entre carbonos, mientras los alquinos son compuesto ms reactivos que los alquenos y presentan enlaces triples entre sus carbonos (Brown et al., 1997).

Dependiendo del grado de insaturacin (dobles o triples enlaces), la longitud de las cadenas y las ramificaciones, vara la susceptibilidad del hidrocarburo a la degradacin y su toxicidad. Siendo ms fcilmente degradables los compuestos menos saturados, de cadenas cortas y poco o nada ramificados (Sikkema et al., 1995).

Los hidrocarburos alifticos son indicadores de contaminacin reciente, ya que las transformaciones de estos hidrocarburos en el medio acutico, se produce rpidamente por fenmenos de volatilizacin, foto-oxidacin, dilucin, dispersin y biodegradacin (Marrugo, 1995).

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2.1.2

Hidrocarburos aromticos

Los hidrocarburos aromticos que se encuentran en el ambiente, son producto de fuentes antropognicas como los derrames de petrleo, plantas generadoras de gas y en menor cantidad por la produccin biolgica en sedimentos anxicos por parte de cianobacterias (Meckenstock et al., 2004). De acuerdo al nmero de anillos se clasifican en mono aromticos y en poli aromticos.

Un grupo de relevancia dentro de los mononucleares son los compuestos denominados BTEX ( Benceno, Tolueno, Xileno, Etilbenceno) (Figura 1). Los BTEX son hidrocarburos monoaromticos no oxigenados, altamente solubles en agua, voltiles y hacen parte del crudo, de la gasolina y otros derivados del petrleo
(Margesin

y Schinner, 2001). Estos compuestos son empleados como solventes en las

industrias de plsticos, fibras sintticas y pesticidas (Harwood y Gibson, 1997) las cuales vierten el contenido de sus aguas de desecho en ros (Kennish, 1994), que finalmente desembocan en los ocanos. Debido a sus caractersticas carcinognicas y txicas los compuestos BTEX estn clasificados como contaminantes primarios por la Agencia de Proteccin Ambiental (EPA) (Tsao et al., 1998).

Estos compuestos son considerados como uno de las mayores fuentes de contaminacin de hidrocarburos en aguas, puesto que los tanques de almacenamiento subterrneos presentan fugas de combustible que continuamente se vierten en los suelos y acuferos subterrneos (Penet, 2004; Head y Swanell, 1999). Se estima que aproximadamente el 35% de 1.4 millones de tanques de almacenamiento de gasolina en los Estados Unidos presentan escapes que junto con las descargas provenientes de la produccin petrolera y los terminales martimos, son un riesgo en diversos ecosistemas.

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Figura 1. Estructura molecular de los compuestos del grupo BTEX (Benceno, Tolueno, Xileno y Etilbenceno) Los Hidrocarburos Aromticos Polinucleares (HAP) se encuentran presentes en combustibles fsiles y se forman durante la combustin incompleta de materia orgnica. Estos hidrocarburos forman parte de la lista de compuestos peligrosos de la EPA (Witt, 1995). Las actividades de transporte y refinamiento del petrleo y las deposiciones atmosfricas, producen las mayores descargas en el ambiente

(Phothuluri y Cerniglia, 1994). Los HAP estn compuestos por dos o ms anillos aromticos fusionados y sus propiedades qumicas y degradacin ambiental depende del tamao y patrn de fusin de los anillos (Kanaly y Harayama, 2000) (Figura 2). De acuerdo con lo anterior se distinguen HAP de bajo y HAP de alto peso molecular. En el primer grupo se encuentran los compuestos de dos o tres anillos como naftaleno y antraceno que presentan toxicidad aguda. En el segundo grupo se encuentran las molculas de cuatro a seis anillos como pireno y fluoranteno que tiene alto potencial carcinognico y genotxico (Witt, 1995).

El incremento en el tamao de las molculas de HAP genera un aumento en la hidrofobicidad y estabilidad qumica, por lo cual aumenta la persistencia de estas molculas en el ambiente se hace mayor (Daane et al., 2001). Como consecuencia de su caracterstica hidrofobica, los HAP pueden migrar a los sedimentos de los

ecosistemas acuticos, bioacumularse y biomagnificarse a travs de la cadena trfica (Kanaly y Harayama, 2000).

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Figura 2. Estructuras moleculares de Hidrocarburos Aromticos Polinucleares (HAP) Los HAP tienen capacidad de interferir en el metabolismo de lpidos y protenas (Hyland y Scheider, 1976). En bioensayos con organismos marinos adultos se demostr que los efectos letales de la fraccin soluble del petrleo ocurren en un rango de 1 a 10 mg/L, mientras que para los estadios larvales y juveniles estos se presentan a menores niveles (0.1 mg/L). Tambin se ha comprobado que la radiacin solar eleva significativamente la toxicidad de la fraccin aromtica del petrleo, debido a la fotoxidacin de las molculas de HAP, bastante menos (Antn y Lizaso, 2002)

2.2 PETRLEO Y ACPM El petrleo crudo es una mezcla compleja de hidrocarburos que al fraccionarse por cromatografa en slica gel se presentan tres fracciones: un grupo de compuestos saturados o fraccin aliftica, una fraccin aromtica y una asfltica o polar. La fraccin saturada esta compuesta por n-alcanos, alcanos ramificados y cicloalcanos o naftenos (Atlas, 1981). En la fraccin aromtica se encuentran compuestos mononucleares (un solo anillo) conocidos como BTEX (Margesin y Schinner, 2001) y los Hidrocarburos Aromticos Polinucleares (PAH) de bajo y alto peso molecular que tiene dos o ms anillos (Kanaly y Harayama, 2000).

El diesel o aceite combustible para motores (ACPM), es un destilado medio del petrleo crudo. Se encuentra clasificado por la National Fire Protection Association dentro de la norma 321, como un lquido inflamable clase II que posee las

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caractersticas de ser

irritante, no oxidativo, no corrosivo y como todos los

hidrocarburos es insoluble en agua. El diesel presenta una mezcla compleja de alcanos lineales, ramificados, cicloalcanos y compuestos aromticos (Tabla 2).

Tabla 2. Composicin del ACPM Hidrocarburos Saturados Parafinas: 21.22% Monociclofinas: 21.84 % Ditritetracicloparafinas:15.71% Hidrocarburos Aromticos Aromticos Azufrados

Monoaromticos:16.60% Benzotiofeno: 4.45% Dibenzotiofeno: 2.58 % Di Aromticos: 13.54% Tri Aromticos: 3.91% Naftobenzotiofeno: 0% Tetra Aromticos: 0.13% Penta Aromticos: 0.01 Datos tomados de http://www.ecopetrol.com.co/

2.3 BIODEGRADACIN La biodegradacin esta definida como la transformacin o detoxificacin parcial o total de contaminantes por microorganismos y plantas (Sylvia et al., 1998) en compuestos no peligrosos e inocuos que puedan ser integrados dentro de los ciclos biogeoqumicos (Margesin y Schinner, 2001). En este proceso se puede lograr la mineralizacin o no de los compuestos, obteniendo como resultado la conversin total de un contaminante orgnico a sus constituyentes inorgnicos, esta transformacin puede ser realizada por una sola especie o un consorcio de microorganismos (Ghazali et al., 2004) .

La habilidad de las poblaciones nativas para degradar los hidrocarburos, constituye uno de los mecanismos principales para mitigar el impacto causado por la presencia del petrleo crudo y sus derivados. Los microorganismos con capacidad enzimtica para degradar los hidrocarburos del petrleo pueden ser aislados de suelos y aguas que han sido expuestos a estos compuestos (Mrquez et al., 2001). Investigaciones realizadas han demostrado que el nmero de degradadores de hidrocarburos en el rea se incrementa despus de un derrame o liberacin de petrleo crudo o sus derivados,

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llegando a una proporcin de 10% del total de la poblacin bacteriana del sitio contaminado (Lee y Merln, 1999; Atlas, 1995).

Hasta el momento han sido identificados varios gneros con capacidad degradadora de hidrocarburos, dentro de los cuales se encuentran especies de Pseudomonas sp, Rhodanobacter sp., Flavobacterium sp., Thermomonas sp. (Kaplan y Kitts, 2004), Brevibacillus sp., Paenibacillus sp., Alcaligenes sp., Nocardia sp. (Daane et al., 2001), Ralstonia sp. y hongos de los gneros de Penicillium sp., Trichoderma sp., Alternaria sp. y Aspergillus sp. (Chvez et al., 2003) entre otros. De igual forma se han reportado microorganismos con capacidad para degradan diesel de forma natural como Acinetobacter lwoffi, Pseudomonas stutzeri (Gallego et al., 2001), Pleurotus ostreatus, Pseudomonas sp., Serratia sp., y Flavobacterium spp. (Marquez et al., 2001).

Con frecuencia en ambientes marinos pueden ser aisladas bacterias pertenecientes a los gneros Achromobacter sp., Acinetobacter sp., Alcaligenes sp., Arthrobacter sp., Bacillus sp., Flavobacterium sp., Nocardia sp. y Pseudomonas spp. Entre los hongos se encuentran Aurebasidium sp., Candida sp., Rhodotorula sp. y Sporobolomyces spp. (Leahy y Colwell, 1990).

La biodegradabilidad de los diferentes hidrocarburos del petrleo vara en funcin de sus caractersticas fsicas y qumicas, de la presencia de grupos sustituyentes en las cadenas hidrocarbonadas, el tamao del hidrocarburo y la fusin de los anillos (Leahy y Colwell, 1990). Las tasa de biodegradacin de los HP puede variar entre 70 y 97% dependiendo de la cepa microbiana involucrada, las condiciones de temperatura, salinidad, pH, oxigeno, nutrientes, concentracin del contaminante y flora microbiana en el lugar (Prince et al., 2003; Muherji y Vijay, 2002). El proceso de biodegradacin de los HP esta mediado en primer lugar, por el acceso que tenga la bacteria al contaminante. Este puede ser a travs de un movimiento

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quimiotctico hacia la interfase agua-aceite donde se da el proceso catablico o por la adhesin mediada por la formacin de biopelculas (Pandey y Jain, 2002).

La quimiotaxis bacteriana se conoce como el movimiento bajo influencia de un gradiente de concentracin qumica, el cual si va en direccin hacia el contaminante, es llamado quimiotaxis positiva, pero si es en contra, se denomina quimiotaxis negativa. Este movimiento ayuda al microorganismo a encontrar ptimas condiciones para el crecimiento y supervivencia. Los hidrocarburos del petrleo quienes son empleados como fuente de carbono y energa, actan en muchos casos como compuestos quimioatrayentes y de acuerdo al nivel de tolerancia a la toxicidad por el microorganismo pueden o no convertirse en compuestos quimiorepelentes; confiriendo una ventaja selectiva para la degradacin bacteriana guiando la sensibilidad y ubicacin del contaminante en el ambiente (Pandey y Jain, 2002).

En contacto con los microorganismos los hidrocarburos son incorporados dentro de las clulas, generalmente por transporte pasivo, aun cuando se han encontrado

diferentes adaptaciones en las vas asimilativas, como el caso de las inclusiones formadas a partir de la membrana de Lipopolisacaridos (LPS), presente solamente en bacterias Gram negativas, que son liberadas para encapsular gotas de hidrocarburos y poder pasar a travs de la membrana como ha sido reportado en cepas de Pseudomonas sp. y levaduras, o por inclusiones formadas a partir de la membrana citoplasmtica en cepas de Acinetobacter sp. La membrana citoplasmtica presenta una baja permeabilidad para las molculas cargadas y polares, de tal forma que los compuestos apolares como los hidrocarburos pueden penetrar fcilmente la bicapa lipidica o pueden ser acumulados dentro de la membrana causando en ciertos casos problemas de toxicidad (Sikkema et al., 1995).

Las reacciones enzimticas llevadas a cabo por bacterias y hongos para la degradacin aerbica de hidrocarburos involucra la oxidacin de los sustratos por enzimas de tipo oxigenasas, que requieren una molcula de oxigeno. Los alcanos son

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convertidos primero a alcoholes, cetonas y subsecuentemente a cidos carboxlicos, para posteriormente ser degradados va -oxidacin (Whyte et al., 1998). Por otro lado los anillos de los hidrocarburos aromticos, por lo general, son hidroxilados y forman dioles. Los anillos son clivados resultando en la formacin de catecoles que van a ser intermediarios de la va de los cidos tricarboxlicos (Atlas, 1995) La presencia de las enzimas requeridas para estas transformaciones pueden encontrase en un solo microorganismo, pero la mayora de las veces este proceso se efecta gracias a la accin conjunta de diferentes bacterias que establecen relaciones de cooperacin y mutualismo. Estas asociaciones son conocidas como consorcios y tienen la habilidad para complementar sus funciones metablicas y poder de esta forma degradar ciertos compuestos (Sylvia et al., 1998). En varios estudios sobre la transformacin del petrleo se han empleado mezclas de bacterias o bacteriahongos en un esfuerzo por maximizar la biodegradacin. La ventaja de emplear cultivos mixtos esta atribuida a los efectos de las interacciones sinrgicas entre miembros de la asociacin. Es posible que algunas especies remuevan los metabolitos txicos, mientras otras sean capaces de degradar totalmente el compuesto que las primeras solo degradaron parcialmente (Ghazali et al., 2004).

2.4 BIORREMEDIACIN La biorremediacin es una estrategia que usa procesos biodegradativos

(microorganismos, plantas o enzimas) para detoxificar y recuperar un ambiente contaminado (Dua et al., 2002; Gallego et al., 2001). Dentro de las estrategias de biorremediacin desarrolladas se encuentra la atenuacin natural, la bioestimulacin, el bioventeo, la bioaumentacin, landfarming (Biolabranza), el compostaje y la fitorremediacin (Sylvia et al., 1998), pero las tres tcnicas que predominan en la actualidad son la atenuacin natural, la bioestimulacin y bioaumentacin ( Kaplan y Kitts, 2004).

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2.4.1

Atenuacin natural

La atenuacin natural es un mtodo que consiste en monitorear la concentracin del contaminante para asegurar que el proceso de degradacin esta activo y es realizado en forma segura, teniendo en cuanta la ecotoxicidad de los productos metablicos que se generan (Kaplan y Kitts, 2004). Su principal caracterstica es el empleo de los procesos fsico-qumicos de interaccin contaminante-ambiente y los procesos de biodegradacin que tienen lugar de forma natural en el medio, conocidos de forma conjunta como procesos de biotransformacin. Entre estos procesos se encuentran el efecto de dilucin, dispersin, volatilizacin, adsorcin y biodegradacin. Los procesos de biotransformacin en condiciones favorables y sin intervencin humana deben reducir la masa, toxicidad, volumen y concentracin del contaminante (EPA, 1999).

2.4.2

Bioaumentacin

La bioaumentacin se relaciona con la adicin de microorganismos, en lugares donde las poblaciones degradadoras no estn presentes o son muy bajos los niveles encontrados, esta tcnica no siempre ha resultado ser efectiva debido a que los microorganismos introducidos deben competir con las poblaciones autctonas, que se encuentran mejor adaptadas a las condiciones ambientales (Kaplan y Kitts, 2004).

Los microorganismos con capacidad de degradacin de hidrocarburos se encuentran distribuidos de forma ubicua y el nmero de estos incrementa tras sucesivas exposiciones al contaminante (Lee y Merln, 1999), razones por las cuales esta tcnica ha presentado algunos inconvenientes y no se ha podido establecer si realmente estimula o no los procesos de remocin de hidrocarburos.

Goldstein y colaboradores (1985), establecieron que la bioaumentacin no es efectiva cuando la concentracin del contaminante es txica para el inoculante y los microorganismos adicionados son susceptibles a las toxinas generadas naturalmente

21

y/o a los predadores del ambiente, cuando el inoculante no es capaz de moverse en el ambiente en direccin de la fuente contaminante (Swanell et al., 1996).

Varios experimentos han sido realizados para evaluar el efecto de la bioaumentacin en los procesos de biorremediacin y los resultados obtenidos varan

circunstancialmente; Tagger et al. (1983) notaron que al adicionar microorganismos a una parcela de agua de mar de 10m3, estos desaparecan rpidamente y no se observaba incremento del potencial de degradacin de los hidrocarburos, mientras que en ausencia de la adicin de microorganismos bajo las mismas condiciones la poblacin microbiana nativa se adapt a la exposicin del contaminante en un periodo de cuatro das contribuyendo efectivamente con su transformacin.

Por otro lado en investigaciones realizadas por Christon et al., (1997) en donde se adicionaron inculos para estimular la biorremediacin en zonas donde el recuento de microorganismos degradadores de petrleo era bajo (103 a 104 UFC/g), se obtuvo como resultado una eliminacin cercana al 95% de los hidrocarburos del crudo que haba sido inoculado, contra una desaparicin del 14% en los campos de crudo que no fueron tratados. Por el esfuerzo que supone implantar un proceso de biorrecuperacin, este debe demostrar ser eficaz, lo cual significa que la remocin del contaminante sea debida realmente a la biodegradacin y no a otros procesos en los cuales las tasa de remocin sean mayores que los que se presentan en condiciones naturales.

La adaptacin de las poblaciones naturales a la degradacin de diferentes compuestos pone de manifiesto que no es necesario la adicin de un inoculo bacteriano para biorremediar, puesto que ambientalmente se cuenta con el potencial para hacerlo y la bioaumentacin ha resultado ser poco eficiente para el tratamiento en mares abiertos contaminados con crudo o sus derivados (Lee y Merln, 1999).

22

2.4.3

Bioestimulacin

La bioestimulacin provee a las comunidades bacterianas de un ambiente favorable en el cual pueda ser efectiva la degradacin del contaminante, para lo cual el rea a biorremediar es suplida con nutrientes, cosustratos u oxigeno, de acuerdo a los requerimiento especficos para cada rea (Van Gestel et al., 2003), Puede darse por medio de fertilizantes orgnicos o inorgnicos y ha demostrado ser una estrategia efectiva especialmente donde los limitantes para la degradacin son los nutrientes, logrando un aumento en de tres a cinco veces las tasas de degradacin (Lee y Merln, 1999; Atlas, 1995).

Los nutrientes pueden ser aplicados en forma de fertilizante orgnicos o inorgnicos, se encuentran en presentaciones granulares, liquidas y talcos cada uno presenta variantes en cuanto a la aplicacin y efectividad. Tal es el caso de algunos fertilizantes de liberacin lenta que generalmente no es adecuado situarlos de forma individual por que pueden ser removidos rpidamente por accin del oleaje y de las mareas. Los fertilizantes granulares son de fcil aplicacin y liberan los nutrientes por disolucin cuando entran en contacto con el agua (Swanell et al., 1996) Los

fertilizantes oleofilicos son preferidos por que promueven el crecimiento de los microorganismos degradadores de hidrocarburos al proveer los nutrientes a las poblaciones en la interfase agua-aceite, en donde se presenta la biodegradacin de los hidrocarburos pero tienen la misma desventaja de otros fertilizantes orgnicos,

presenta una fuente de carbono orgnica la cual puede ser biodegradada primero que los hidrocarburos (Pandey y Jain, 2002).

Al contrario de la bioaumentacin la bioestimulacin, aun cuando es difcil de aplicar en mares abiertos (Lee y Merln, 1999), ha demostrado ser efectiva en varios incidentes como el caso del Exxon Valdez donde incremento hasta tres veces las tasas de remocin de los HP por la aplicacin de dos fertilizantes, el Custombler y el Inipol EAP 22, que adems de estimular la biodegradacin del crudo por adicin de

23

nutrientes, aparentemente ayuda a promover la formacin de microemulsiones aguaaceite, por reduccin de la viscosidad y la tensin interfacial (Swanell et al., 1996).

2.4.4

Bioventeo , Composteo, Biolabranza y Fitorremediacin

El bioeventeo es una variante de la bioestimulacin en donde se inyecta a la zona no saturada del suelo, gases como metano u oxigeno, para estimular la actividad

microbiana (Sylvia et al., 1998). El landfarming consiste en la incorporacin de contaminantes en superficies no contaminadas aprovechando las poblaciones bacteriana autctonas (Kaplan y Kitts, 2004) o bioaumentando (Sylvia et al., 1998), con el fin de llevar a cabo las reacciones de biotransformacin necesarias.

El composteo es un proceso ex situ, aerobio, donde se emplean microorganismos termoflicos (Ryckeboer et al., 2003; Sylvia et al., 1998), y el contaminante a remediar esta agrupado en pilas con material lignocelullisico (Fernndez et al., 1998).

La fitorremediacin es el empleo de plantas para remover contaminantes, ya sea por acumulacin dentro de sus tejidos o por estimulacin de la poblacin microbiana en la rizosfera (Lee y Merln, 1999).

La esencia de la biorremediacin de los ambientes marinos es suplementar con macronutrientes exgenos, (Maki et al., 2003), empleando de forma individual y conjunta las tcnicas de biestimulacin y bioaumentacin, teniendo en cuenta que la bioestimulacin al contrario de la bioaumentacin, aun cuando es difcil de aplicar en mares abiertos (Lee y Merln, 1999) ha demostrado ser efectiva en varios incidentes, (Swanell et al. 1996).

En Colombia los procesos de biorremediacin han sido desarrollados desde hace algunos aos por instituciones como ECOPETROL y British Petroleum con el propsito de degradar hidrocarburos presentes en los cortes de perforacin, refineras

24

y campos de produccin, donde se han tratado mas de un milln de metros cbicos de lodos aceitosos con 30 60 % de hidrocarburos, logrando recuperar suelos y cuerpos de agua a condiciones ambientales favorables (en:

www.colciencias.gov.co/simbiosis/ directorios/vegetal_detalle.htm ).

De igual manera el Instituto Colombiano del Petrleo (ICP), ha estudiado la aplicacin de la industria del proceso de biodegradacin de aguas fenolicas en sistemas continuos que le ha permitido reducir cerca del 95% de los fenoles, manejando flujos hasta de doscientos mil barriles por da. Paralelamente a la biodegradacin de fenoles se han reducido los niveles de nitrgeno amoniacal e hidrocarburos en cerca del 40% (en: www.colciencias.gov.co/

simbiosis/percepcion/c1mambiente.htm - 20k).

As mismo el Centro de Investigaciones Microbiolgicas de la Universidad de los Andes ha desarrollado diferentes estudios en el campo de la biorremediacion como es el caso del empleo de bacterias nativas degradadoras de crudo y fenol en la regin de Cao Limn (Dussn, 2000). Otras investigaciones han adelantado estudios de aislamiento, caracterizacin y aplicacin de microorganismos degradadores de compuestos orgnicos en ambientes marinos como los realizados en biodegradacin de hidrocarburos con bacterias aisladas de la Baha de Cartagena (Salamanca, 1999).

2.5

FACTORES

QUMICOS

FSICOS

QUE

AFECTAN

LA

BIORREMEDIACIN Los procesos de biorremediacin pueden verse afectados o beneficiados por caractersticas presentes en la zona a tratar o por propiedades inherentes al contaminante. Tal es el caso de

2.5.1

Composicin del petrleo y sus derivados

Tisson y Welte (en: Prince et al., 2003) determinaron que en promedio el petrleo crudo estaba conformado por un 58.2% de compuestos saturados, 28.6% de

25

aromticos y 14.2% de compuestos polares. Las variaciones dentro de estas relaciones y la presencia o no de ciertos compuestos le confieren resistencia a la degradacin y persistencia en el ambiente (Atlas, 1981). Algunas bacterias requieren de ciertos hidrocarburos, en especial los alcanos, fuente rica de energa, para poder degradar otros en forma cometabolica (Van Hamme et al., 2003).

2.5.2

Estado fsico del hidrocarburo

La biorremediacin esta influenciada por el estado fsico en el que se encuentran los hidrocarburos. Cuando ocurre un derrame de crudo, se tiende a formar una mancha en el mar que por accin del oleaje genera emulsiones, las cuales aumentan el rea de superficie de los hidrocarburos dentro de la columna de agua, siendo as mas biodisponibles para el ataque microbiano (Leahy y Colwell, 1990), este proceso se conoce como pseudosolubilizacin (Atlas, 1981).

Algunos hidrocarburos pueden variar su disponibilidad dependiendo de si se encuentran en estado lquido o slidos. Los hidrocarburos aromticos lquidos son utilizados por bacterias en la interface agua-aceite, pero no pueden ser metabolizados a 30oC por encontrarse en su estado slido. De igual forma el naftaleno no puede ser utilizado en su estado slido y debe ser disuelto en otro hidrocarburo lquido para poder ser catabolizado por determinadas bacterias (Atlas, 1981).

2.5.3

Temperatura

La temperatura de un ambiente a biorremediar tambin afecta las propiedades del hidrocarburo derramado y la actividad metablica de los microorganismos. A bajas temperaturas la viscosidad y solubilidad en agua de los aceites incrementa, mientras la volatilizacin se reduce, alterando la biodisponibilidad del hidrocarburo (Venosa y Zhu, 2003; Leahy y Colwell, 1990).

26

A nivel del metabolismo microbiano la degradacin ptima se lleva a cabo en un intervalo de temperaturas de 10-40oC (Fernndez et al., 1998). La biodegradacin de hidrocarburos puede ser llevada a cabo en un amplio rango de temperaturas aunque por lo general, la tasa de biodegradacin desciende generalmente con el descenso de temperatura. Las altas tasas de remocin de los hidrocarburos se presentan generalmente en un rango de 30-40 oC en suelos, 20-30 oC en aguas dulces y de 1520 oC en ambientes marinos (Venosa y Zhu, 2003). Las aguas del Caribe presentan temperaturas aproximadas de 28 oC, pero en las proximidades del departamento del Magdalena la temperatura puede descender hasta los 25 oC o menos por efecto de la surgencia.

Sorkhoh et al. (Margesin y Schinner, 2001) tras un estudio de reas contaminadas en Kuwait, regin que se distingue por que la temperaturas ambientales cercanas a 50oC, encontraron densidades de bacterias de 3x103 hasta 1x107 por gramo de suelo, aislaron 368 cepas que en su mayora eran bacilos pertenecientes a la especie Bacillus stearothermophilus y dos de las cepas fueron capaces de degradar entre el 80-89% de crudo a concentracin de 5g/l en cinco das, con un optimo de temperatura de 60oC.

2.5.4

Aceptores de electrones

Los procesos de biodegradacin se pueden llevar a cabo empleando diferentes aceptores de electrones como el oxigeno, los nitratos, sulfatos y algunos compuestos orgnicos (Fernndez et al., 1998) y dependiendo del tipo de aceptor de electrones empleado se establece la clase de metabolismo. En ambientes marinos, cuando los niveles de oxigeno descienden, los aceptores de electrones ms importantes son el hierro, manganeso y sulfatos (Head y Swanell, 1999), pero debido a la abundancia del sulfato en los ambientes marinos los procesos de sulfato reduccin son predominantes; estudios realizados en la Baha de San Diego reportaron que la oxidacin de naftaleno, fenantreno, metilnaftaleno, fluoreno y fenantreno en muestras

27

de sedimentos se lleva a cabo bajo condiciones sulfato reductoras (Coates et al., 1997). Weiner y Lovley (1998) encontraron que en un acufero contaminado con petrleo crudo, el benceno era degradado de forma natural a metanol y dioxido de carbono bajo condiciones de reduccin de Fe (III) generando intermediarios como acetato, propionato y fenol y obteniendo porcentajes de mineralizacin del 53%.

2.5.5

Nutrientes

Despus de un derrame de hidrocarburos las relaciones C:N:P se ven alteradas por el exceso de carbono que desfavorece el crecimiento microbiano (Leahy y Colwell, 1990). Para alcanzar un equilibrio es necesario suplementar con nutrientes, como nitrgeno y fsforo, en forma de fertilizantes orgnicos u inorgnicos. Teniendo en cuenta que en el medio marino el efecto de dispersin y la accin del oleaje conlleva a una disminucin casi instantnea de las concentraciones aplicadas, pero que en reas de menor movimiento la aplicacin exagerada de nitrgeno y fsforo puede generar eutroficacin (Swanell et al., 1996).

2.5.6

pH

El pH afecta la cintica de las enzimas involucradas en la degradacin, las cuales tiene rangos ptimos de accin que varan de acuerdo a su estabilidad. En general se ha encontrado que la transformacin de hidrocarburos es ms eficaz a valores de pH 7 (Fernndez et al., 1998) sin dejar de presentarse adaptaciones a ambientes extremos que permiten tasas de degradacin significativas alcalfilos (Margesin y Schinner, 2001). en valores de pH cidos o

El pH del agua de aguas marinas es generalmente estable y ligeramente alcalino (Venosa y Zhu, 2003), en el ao 2004 en el Caribe Colombiano se registro un valor promedio en los ecosistemas marinos de 8.07 (Marn et al., 2004).

28

2.6 TCNICAS PARA ANLISIS DE HIDROCARBUROS La fluorometra y la cromatografa de gases son tcnicas empleadas para la determinacin y cuantificacin de hidrocarburos que presentan ciertas diferencias en cuanto a la clase de compuestos que pueden determinar.

2.6.1

Fluorometra

La fluorometra esta relacionada con la cuantificacin de la fluorescencia emitida por una especie que ha absorbido una radiacin incidente (Schenk et al.,1984). Los hidrocarburos aromticos son los nicos capaces de emitir fluorescencia; por esta razn esta tcnica solo es aplicada para la determinacin de Hidrocarburos Disueltos y Dispersos (HDD) en aguas (Garay et al., 1993). En la fluorescencia las sustancias son irradiadas a una longitud de onda, los compuestos absorben esta energa e irradian otra longitud de onda mas larga y de menor energa que la radiacin que ha sido absorbida, la intensidad con la que es emitida esta longitud de onda es analizada por medio de un sistema ptico y un fotodetector.

Para el anlisis de hidrocarburos del petrleo se emplea una longitud de onda de excitacin de 310 nm y de emisin de 360 nm (Garay et al., 2003) y estndares, como criseno, que permiten determinar errores al cuantificar con esta tcnica.

2.6.2

Cromatografa de gases.

La cromatografa de gases es una tcnica de separacin en donde se emplea una fase mvil (gas de arrastre) y una estacionaria adsorbente con el fin de obtener

compuestos individuales. Los extractos obtenidos son inyectados en una columna donde son movidos por el gas de arrastre. Cada componente presenta un tiempo de retencin particular, que sumado a la altura del pico y al rea bajo la curva resultante, es proporcional a la cantidad del hidrocarburo presente en la muestra original (Garay et al., 2003). Esta tcnica discrimina cada uno de los compuestos presentes en una muestra y representa con mayor exactitud concentraciones precisas en las cuales se encuentran tanto hidrocarburos lineales como aromticos y cclicos.

29

3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL Seleccionar bacterias aisladas de sedimentos del caribe colombiano con capacidad de degradar hidrocarburos. 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS Seleccionar del Cepario de Bacterias Marinas (CBM) cepas tolerantes a Hidrocarburos (ACPM y crudo). Establecer la concentracin de ACPM mnima inhibitoria sobre las cepas tolerantes a hidrocarburos (ACPM y crudo). Identificar bioqumicamente las cepas bacterianas tolerantes a hidrocarburos. Determinar la capacidad de degradacin de las cepas seleccionadas en trminos de porcentaje de degradacin de hidrocarburos del ACPM.

30

4. MATERIALES Y MTODOS

4.1 MICROORGANISMOS Los microorganismos que se emplearon en el presente estudio hacen parte del Cepario de Bacterias Marinas (CBM) del Laboratorio de Microbiologa del INVEMAR. Fueron aislados de sedimentos del mar Caribe como parte del proyecto Seleccin y Aplicacin de Bacterias Marinas Nativas con Capacidad Degradadora de Compuestos Orgnicos Persistentes (COP) en el Pacfico y Caribe Colombiano desarrollado con el apoyo de COLCIENCIAS. Los microorganismos se aislaron y cultivaron bajo las condiciones descritas a continuacin

4.1.2 Aislamiento de microorganismos En la fase de campo se tomaron 500 g de sedimento con una draga metlica Ekman de 0.05 m3, a una profundidad no mayor a los 15 cm, se colocaron en papel aluminio previamente tratado con hexano y se transportaron al laboratorio en bolsas plsticas con sello hermtico a 4C.

En la fase de laboratorio se tom 50g del sedimento recolectado y se coloc en un erlenmeyer de 1000 mL que contena 450 mL de agua de mar estril. Se agit en un shaker orbital por 15 minutos, 180 rpm a temperatura ambiente, se dej reposar por 10 minutos para permitir que el sedimento se separara de la fase acuosa (sobrenadante). Posteriormente se tom 1ml del sobrenadante para ser inoculados en 9 mL de Caldo de preenriquecimiento N y P (Anexo 1) con crudo al 1% y ACPM al 1%. Los caldos de preenriquecimiento con crudo y ACPM se incubaron a 35C con una agitacin de 180rpm cada 12 horas por 7 das. Transcurrido este tiempo se tom 1ml de cada uno de los caldos de preenriquecimiento y se adicion a 9ml de Caldo MMS (Medio Mnimo de Sales) (anexo 1) mas Crudo 1% v/v y ACPM 1% v/v (por separado) durante 7 das, Transcurrido este tiempo se realiz un pase (1ml) a Caldo MMS fresco por 7 das ms de incubacin. Completados 21 das de crecimiento se

31

realiz el aislamiento de bacterias tolerantes a Crudo y a ACPM en agar nutritivo (Haines et al., 1996; Rojas-Avelizapa et al., 1999; Nez, 2003). Las cepas aisladas se conservaron en el CBM del INVEMAR a 4oC en tubo inclinado con medio Gorvienko (anexo 1) y medio MMS, suplementados con 1% de ACPM y 1% de petrleo crudo (PC) de acuerdo al contaminante de aislamiento y aceite mineral.

4.2 SELECCIN DE CEPAS PARA ENSAYO DE DEGRADACIN Con el fin de elegir microorganismos que presentaron una capacidad de degradacin competitiva se efectuaron dos pruebas: seleccin horizontal en PC y ACPM y Concentracin Mnima Inhibitoria.

4.2.1

Seleccin horizontal en petrleo crudo y ACPM

Las cepas se reactivaron en tubos con cinco mL de caldo nutritivo (Merck) (Anexo1), los cuales se incubaron a 35oC por 24 horas. Finalizado el tiempo de incubacin, los cultivos se ajustaron al tubo No.1 del patrn de MacFarland (3x108 clulas/mL). Posteriormente, de cada tubo se realiz un pase de forma masiva a cajas con agar MMS suplementado con 1% de PC y cajas con agar MMS suplementadas con 1 % de ACPM. Los pases se realizaron por triplicado y las cajas se incubaron a 35oC durante siete das. Al cabo se este tiempo se observ si las cepas tenan la capacidad de crecer en ambos contaminantes.

4.2.2

Concentracin de ACPM Mnima Inhibitoria (CMI)

Los ensayos de CMI se realizaron por triplicado y se evalu un rango de concentraciones en una escala de 1%, 2%, 4%, 6%, 8% y 10% de ACPM teniendo como referencia las concentraciones evaluadas por diferentes autores (MrquezRocha et al., 2005; Rojas- Avelizapa et al., 1999, Ururahyl et al., 1998), para lo cual se prepararon tubos de ensayo con cinco mL de medio MMS adicionado con ACPM, por cada bacteria a evaluar. Cada serie se inocul con una alcuota de 0.5 mL de un

32

cultivo de 24 de horas de crecimiento, ajustado al tubo No.1 del patrn de MacFarland. Los cultivos se incubaron a 35oC y se realizaron observaciones peridicas por un periodo de 21 das. Se estableci como tubos positivos aquellos donde se present crecimiento por turbidez y disgregacin del ACPM (Haines et al., 1996; Brown y Braddock, 1990). Se consider la CMI de ACPM como la concentracin ms baja de este compuesto a probar donde no se present crecimiento y ausencia de disgregacin del ACPM (Surez, 2004).

4.2.3

Identificacin Microbiana

Las cepas seleccionadas se caracterizaron macroscpicamente y microscpicamente de acuerdo a las caractersticas descritas en la gua de referencia del Cepario del Laboratorio de Microbiologa del INVEMAR y se identific bioqumicamente mediante el sistema BBL Crystal y API 50 CHB/E, basados en la utilizacin y degradacin microbiana de sustratos especficos detectados por varios sistemas indicadores (Avelizapa et al., 1999).

4.3 ENSAYOS DE DEGRADACIN DE ACPM En el montaje de los ensayos, el material de vidrio (Schott Duran) empleado se someti a un tratamiento qumico para evitar la contaminacin cruzada e interferencias. El material se lav inicialmente con detergente y se trat con solucin sulfocrmica, posteriormente se enjuag con agua de la llave, agua destilada y preextrada; a continuacin se hizo un lavado con metanol, acetona y un enjuague con una solucin de hexano. Finalmente se someti a un tratamiento trmico de 150oC por tres horas (Garay et al., 2003).

4.3.1

Preparacin de Inculos

A cada una de las cepas provenientes de las pruebas de seleccin se le hizo un pase a un erlenmeyer de 250 mL con 125 mL de medio MMS suplementado con 2% v/v de ACPM. Los cultivos se incubaron por 24 horas a 30 oC y agitaron a 200 rpm (Shaeker orbital BWR DS-500). Transcurridas las 24 horas se realiz un recuento en cmara de

33

Neubauer para determinar las concentraciones celulares de cada inoculo (Nez, 2004 com pers.) (Anexo 2).

4.3.2

Ensayos de degradacin

Los ensayos de degradacin se realizaron evaluando la actividad en conjunto de las cepas seleccionadas. El ensayo const de un tratamiento y un control abitico. En el tratamiento cada unidad experimental se constituy de 500 mL medio MMS, ACPM al 2% v/v y el cultivo bacteriano mixto. El cultivo mixto estuvo conformado por cada cepa proveniente del inculo, a una concentracin final de 105 clulas/mL (Marquz et al., 2001, Palittapongarnpim et al., 1998). El control abitico se constituy por 500 mL de medio MMS y ACPM al 2% v/v (17600 mg/ L). Los cultivos se incubaron a 30 oC en agitacin a 200 rpm cada 12 horas (Shaeker orbital BWR DS-500) (Solano et al., 2000) Cada uno se realiz por triplicado. Las determinaciones microbiolgicas se hicieron cada tres das, a partir del da cero y los anlisis qumicos cada cinco das para hidrocarburos aromticos y los das 0, 10 y 21 para alifticos (Mrquez-Rocha et al., 2005) durante tres semanas (Figura 3). El tiempo de incubacin y de las mediciones se estableci con base a los estudios reportados por otros autores (Kaplan y Kitts, 2004; Mrquez et al., 2001, Ururahyl et al, 1998).

4.3.3

Curva de Crecimiento.

De cada botella con el tratamiento y el control abitico se realiz el recuento de viables a partir de da cero hasta el da 21, por la tcnica de dilucin y recuento en placas de agar nutritivo (Palittapongarnpim et al., 1998). Con los resultados obtenidos se elabor la curva de crecimiento. Adicionalmente se realizaron observaciones de las colonias recuperadas en los recuentos y se comparo con las caractersticas morfolgicas de las cepas iniciales con el objeto de establecer un patrn de comportamiento del cultivo mixto en ACPM a travs del tiempo.

34

Figura 3. Esquema de ensayo de degradacin de ACPM para el anlisis microbiolgico y qumico del tratamiento y control abitico.

35

4.4 DETERMINACIONES QUMICAS El anlisis de hidrocarburos aromticos totales (HAT) y alifticos se realiz siguiendo los mtodos de extraccin y medicin de hidrocarburos descritos en el manual de tcnicas analticas del INVEMAR (Garay et al., 2003).

4.4.1 Extraccin de hidrocarburos Las muestras s transfirieron a un embudo de decantacin y se extrajeron con nhexano. Posteriormente, las fracciones fueron separadas por cromatografa en columna de Almina (120 - 230 mesh). La columna se lav con n-hexano y se sembr el extracto de la muestra. Para el fraccionamiento se utilizaron como eluyentes las siguientes soluciones: n-hexano para la recuperacin de los hidrocarburos alifticos (F1); n-hexano:diclorometano (7:3) para hidrocarburos mono-aromticos (F2); y diclorometano para hidrocarburos poli-aromticos (F3).

4.4.2 Medicin de hidrocarburos alifticos El anlisis de hidrocarburos alifticos se realiz los das 0, 10 y 21con la tcnica de cromatografa de gases. Se emple un cromatgrafo de gases con detector selectivo de masas (GC/MSD) HP 6890/5973, equipado con una columna capilar HP5-MS de 30 m de longitud, 0.25 mm de dimetro interno y pelcula de 0.25 m. El cromatgrafo oper con las siguientes condiciones: programacin de temperatura del horno desde 60 C (1 min) hasta una temperatura final de 300 C (8 min) a 8 C/min, inyeccin Splitless (0.75 min) y temperatura del inyector 280 C. Como gas de arrastre se utiliz helio a flujo constante de 1 mL/min. Los espectros de masa fueron adquiridos con un detector MSD (280 C) en un rango de 35-450 amu a 3.8 scan/s.

4.4.3 Medicin de Hidrocarburos Aromticos Totales (HAT) Mediante tcnica fluoromtrica se determin la concentracin de HAT en las fracciones F2 y F3, empleando un Espectrofluormetro Shimadzu RF-5301 PC. Los resultados fueron cuantificados con base a una curva de calibracin externa generada a partir de soluciones estndar de ACPM (anexo 3). Las lecturas se realizaron a una

36

longitud de onda de excitacin de 310 nm y de emisin de 360 nm. La longitud de onda se estableci despus de realizar un scan del ACPM y determinar en que rango se presentaba la mayor absorcin por parte de los hidrocarburos aromticos del ACPM (anexo 4). Adicionalmente las muestras del da 0 y 21 se leyeron por cromatografa de gases-masas con el fin de establecer la identidad de los hidrocarburos aromticos (mono y polinucleares) individuales.

4.4.4 Parmetros analticos Para determinar los parmetros analticos como error relativo, limite de deteccin, porcentaje de recuperacin y el aporte de las clulas a la emisin de fluorescencia se mont una serie de siete replicas de hidrocarburos mas ACPM y siete blancos de reactivo, y una muestra compuesta por el medio de cultivo (sin ACPM) ms clulas (APHA, 1998).

4.5 PORCENTAJE DE DEGRADACIN El porcentaje de degradacin del cultivo mixto se estableci por medio de la diferencia de los porcentajes de remocin del tratamiento y el control abitico en el tiempo 0 y 21 del ensayo. La diferencia en el rea bajo los picos (Sharma y Pant, 2000) y la diferencia de las concentraciones de HAT obtenidas por fluorometra entre el tratamiento y el control abitico fue el empleado para calcular el porcentaje de remocin de hidrocarburos alifticos y aromticos respectivamente. De acuerdo con Gmez, 2003; Palittapongarnmin et al. 1998 (1, 2, 3).
Area H cos Re sueltos (Da 21) 100 % Remocin Alifticos = 1 Area H cos Re sueltos (Da 0 )

(1)

mg / mL HAT ACPM (Da 21) % Remocin Aromticos = 1 mg / mL HAT ACPM (Da 0) 100

(2)

37

 % Re mocin % Re mocin % Degradacin = Tratamiento Control abitico E n donde: HAT: Hidrocarburos Aromticos Totales; Tratamiento: Cultivo bacteriano mixto

(3)

4.6 ANLISIS ESTADSTICO

Inicialmente se procedi a determinar si los datos correspondientes se distribuan normalmente mediante la prueba de Shapiro Wilk y si las varianzas entre los dos grupos eran homogneas por medio del test de Bartletts. Cumplidos estos dos supuestos se realiz un anlisis de varianza con un nivel de significancia del 5% para determinar si existan diferencias entre los factores biticos y abiticos en la degradacin de ACPM a travs del tiempo de muestreo. Para la evaluacin de los datos se empleo el programa computarizado Statistix versin 8.

38

5. RESULTADOS Y DISCUSIN 5.1 SELECCIN DE CEPAS PARA ENSAYOS A partir de los sedimentos recolectados en la regin Caribe se aislaron 31 cepas bacterianas con capacidad de tolerar hidrocarburos del petrleo. Las cepas se aislaron en medio MMS con PC/ACPM y posteriormente se conservaron en el CBM del INVEMAR. De estas 31 cepas aisladas 26 fueron recuperadas, 12 cepas provenan de medio MMS con ACPM y 14 de medio MMS con PC (Tabla 3). A partir del grupo de 26 cepas se inici el proceso de seleccin, donde se evalu primero la capacidad de estas de tolerar PC y ACPM en una prueba de seleccin horizontal.

Tabla 3. Cepas aisladas en la regin Caribe, con su contaminante y departamento de aislamiento respectivamente.
Cepa BCH26 BCH27 BCH28 BCH30 BCH31 BCH32 BCH33 BCH34 BCH35 BCH36 BCH37 BCH38 BCH52 Contaminante ACPM ACPM ACPM ACPM ACPM Petrleo crudo Petrleo crudo Petrleo crudo Petrleo crudo Petrleo crudo Petrleo crudo Petrleo crudo Petrleo crudo Departamento Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Bolvar Cepa BCH53 BCH54 BCH55 BCH56 BCH71 BCH72 BCH73 BCH74 BCH76 BCH77 BCH79 BCH135 BCH136 Contaminante ACPM ACPM Petrleo crudo Petrleo crudo ACPM ACPM ACPM Petrleo crudo Petrleo crudo Petrleo crudo Petrleo crudo ACPM ACPM Departamento Bolvar Bolvar Bolvar Bolvar Sucre Sucre Sucre Sucre Sucre Cordoba Sucre Magdalena Magdalena

5.1.1 Seleccin horizontal en petrleo crudo y ACPM De las catorce cepas bacterianas aisladas de PC y evaluadas en ACPM se obtuvo que el 100% fueron capaces de crecer en ACPM, mientras que slo el 66.7% de las 12 cepas aisladas de ACPM presentaron la capacidad de crecer en PC. En total el 84.6% de las 26 cepas evaluadas crecieron en ACPM y PC (Tabla 4).

El petrleo crudo puede actuar como un agente selectivo de microorganismos (Wrenn y Venoza, 1996), ya que presenta una mezcla compleja de hidrocarburos, mayor concentracin de HAP de alto peso molecular que el ACPM (Wang et al., 2001),

39

compuestos txicos para algunos microorganismos y compuestos del tipo resinas y asfltenos resistentes a la degradacin (Venoza y Zhu, 2003).

Tabla 4: Seleccin horizontal en petrleo crudo y ACPM de las cepas del Cepario de Bacterias Marinas
Contaminante Aislamiento BCH26 ACPM 1% BCH27 ACPM 1% BCH28 ACPM 1% BCH30 ACPM 1% BCH31 ACPM 1% BCH32 Crudo 1% BCH33 Crudo 1% BCH34 Crudo 1% BCH35 Crudo 1% BCH36 Crudo 1% BCH37 Crudo 1% BCH38 Crudo 1% BCH52 Crudo 1% BCH53 ACPM 1% BCH54 ACPM 1% BCH55 Crudo 1% BCH56 Crudo 1% BCH71 ACPM 1% BCH72 ACPM 1% BCH73 ACPM 1% BCH74 Crudo 1% BCH76 Crudo 1% BCH77 Crudo 1% BCH79 Crudo 1% BCH135 ACPM 1% BCH136 ACPM 1% No. de cepas seleccionadas Cepas iniciales 26 (100%) Cepa No. Crecimiento Crudo 1% ACPM 1% A x A x P x P x P x x P x P x P x P x P x P x P x P P x P x x P x P A x P x A x x P x P x P x P P x P x 8 (12) 14(14) Cepas finales 22 (86,4%)

A: Ausencia; P: Presencia, X: contaminante donde se aisl inicialmente. Posiblemente el 100% de las bacterias aisladas de crudo crecieron en ACPM debido a que la variedad de sustratos presentes en el PC contribuye a la seleccin de

40

microorganismos con capacidades metablicas para degradar productos refinados del petrleo, como el ACPM, ya que se involucran genes, complejos enzimticos y vas metablicas relacionados. Este proceso se conoce como aclimatacin cruzada y ha sido descrito por Bauer y Capone (en: Leahy y Colwell, 1990) al observar que comunidades microbianas expuestas a fenantreno incrementan las tasas de metabolismo de otros compuestos de estructuras similares como el naftaleno y por Alvarez y Vogel (1991) reportan microorganismos aislados en presencia de tolueno como nica fuente de carbono, los cuales tambin pueden crecer en benceno y pxileno, aumentando la tasa de degradacin de estos cuando se cultiva en presencia del contamnante de donde fueron aislados. La capacidad de un microorganismo para asimilar diferentes mezclas de hidrocarburos como fuentes de carbono depende de la especificidad de sus enzimas, algunas monooxigenasas, dioxigenasas y

lipooxigenasas tienen el potencial para convertir sustratos de petrleo y sus derivados en enantiomeros que puedan ser asimilados, amplindose de esta forma el rango de sustratos disponibles para el metabolismo (Van Hamme et al., 2003; Smits et al., 2002, Mahajan et al., 1994;).

Slo aquellas cepas que crecieron en PC y ACPM (22 cepas) fueron sometidas a diferentes concentraciones de ACPM en con el objetivo de escoger las que toleraran una mayor concentracin de hidrocarburos.

5.1.2 Concentracin de ACPM Mnima Inhibitoria Las 22 cepas bacterianas (84.6%) provenientes de la seleccin horizontal se enfrentaron a concentraciones de ACPM entre1-10% v/v. Se encontr que el 50% de las cepas evaluadas toleraron un rango de 1%-8% v/v de ACPM, mientras que una concentracin mnima del 2% de ACPM inhibi el 50% de la poblacin restante (Figura 4 y Anexo 5). Mrquez-Rocha et al. (2005) y Rojas- Avelizapa et al. (1999) han reportado aislamientos de bacterias empleando concentraciones de ACPM del 7% y degradacin de ACPM en suelos contaminados hasta el 17.7 %. Ururahyl et al. (1998) describen una degradacin de hidrocarburos en lodos con crudo al 5% v/v del

41

76.9 %, mientras en lodos con 10 % v/v la mxima degradacin fue de 8.9 % en un periodo de 21 das posiblemente debido a los efectos txicos de los hidrocarburos o a un fenmeno de inhibicin por sustrato.
50% (11 cepas) 50% (11 cepas) 45% (10 cepas)

100% (22 cepas) 50% (11 cepas) 50% (11 cepas)

1% 2% 4% 6% 8% Concentraciones de ACPM

10%

Figura 4. Porcentaje de cepas resistentes a concentraciones de ACPM de 1-10 % (v/v) Elevadas concentraciones de ACPM inhiben el desarrollo microbiano, producen intoxicacin (LaGrega et al., 1996) e inducen en las bacterias una respuesta de stressy cambios celulares a nivel de la membrana, enzimas y protenas. Los hidrocarburos tienden a penetrar en la membrana de las bacterias alterando su estructura, fluidez y actividad enzimtica (Sikkema et al., 1995; Heipieper, 1994). Los microorganismos han desarrollado diferentes mecanismos que les permiten mantener la integridad de su membrana ante un flujo excesivo de hidrocarburos, por ejemplo un incremento en la rigidez de la membrana por descenso en el contenido de cidos grasos insaturados, alteracin en la conformacin cis/trans de los fosfolpidos y sistemas de exclusin homlogos a los empleados por las bacterias en la resistencia a antibiticos han sido desarrollados por Pseudomonas putida DOT-T1E, la cual es capaz de crecer en presencia de un 90 % v/v de tolueno.(Rojas et al., 2001; Ramos et al.,1997). Estas adaptaciones son dependientes de energa e influyen en las tasas de crecimiento, presentndose una disminucin de estas mientras aumenta la energa destinada al mantenimiento microbiano (Isken et al., 1999).

42

De acuerdo con las prueba de seleccin horizontal y CMI se escogieron 11 cepas para ser utilizadas en los ensayos de degradacin, destacando la capacidad que presentaron estas cepas de tolerar valores superiores a los establecidos por Franco et al. (2004) para describir un grado de contaminacin media-fuerte y la capacidad para crecer rpidamente en un rango de tres a diez das con ACPM y PC.

5.1.3 Caracterizacin e Identificacin Microbiana Las cepas bacterianas seleccionadas se caracterizaron macroscpica y

microscpicamente, encontrando que todas las cepas tuvieron morfologas bacilares, ocho gram negativas y tres gram positivas (Figura 5 y Tabla 5). Como han reportado otros autores, la mayora de las bacterias relacionadas con la degradacin de hidrocarburos pertenecen al grupo de gram negativas (Ruberto et al., 2003). Los lipopolisacaridos de las membranas de las bacterias Gram negativas ayudan en la formacin y estabilizacin de emulsiones de hidrocarburos en sistemas acuosos y contribuyen al incremento en la superficie de ataque del contaminante, confirindoles a estas una ventaja comparativa para la asimilacin de hidrocarburos (Sikkema et al., 1995).

Ocho cepas correspondientes a los gneros Klebsiella sp, Chromobacterium sp., Flavimonas orizihabitans, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeuroginosa y Bacillus (Bacillus brevis y B. pumillus, B. cereus) se identificaron mediante el sistema BBL Crystal y API 50 CHB/E (Tabla 5). Klebsiella sp. (Survery et al., 2004) Flavimonas orizihabitans (LanFraconi et al., 2003; Van Hamme et al., 2000) Enterobacter cloacae (Saadoun, 2002) y Bacillus (Mrquez Rocha et al., 2005; Kazunga y Aitken, 2002; Daz et al., 2000) han sido aisladas frecuentemente de lugares contaminados con hidrocarburos y pueden crecer sobre un rango amplio de hidrocarburos emplendolos como nica fuente de carbono y energa. Pseudomonas sp. es la bacteria ms frecuentemente aislada de ambientes contaminados con hidrocarburos (Norman et al., 2002) y de la cual mayor informacin ha sido reportada; se conoce su capacidad para crecer sobre una amplia variedad de

43

hidrocarburos del petrleo, benceno, naftaleno, tolueno ( Haigler et al., 1992), gasolina , kerosene, y diesel ( Wongsa et al., 2004). Tambin han sido estudiados los complejos enzimticos y los plasmidos relacionados en la asimilacin y degradacin de hidrocarburos (Smits et al., 2002; Hamamura et al., 2001) siendo tiles para el conocimientos de los mecanismos adaptativos desarrollados por los microorganismos degradadores de hidrocarburos.

Tambin se observ que las cepas BCH28 y BCH35 al realizarles un pase de un medio con la tensin del contaminante (MMS adicionado con ACPM/ crudo) a un medio nutritivo, formaban una sustancia mucoide alrededor de las colonias, hecho que se relaciona con la formacin de polisacaridos extracelulares que confieren a los microorganismos resistencia a ciertos hidrocarburos del petrleo (Iwabuchi et al., 2002).

44

Tabla 5. Caractersticas morfolgicas de las cepas seleccionadas para el ensayo de degradacin de ACPM
Cepa No Morfologa/Gram Forma Bordes Elevacin Color Superficie Consistencia Tamao mm Identificacin

BCH28

Bacilo Negativo

Redonda

Entero

Convexa

Crema

Lisa

Mucosa

1.82

Chromobacterium

BCH 30

Cocobacilo Negativo

Redonda

Entero

Convexa

Crema

Lisa

Mucosa

4.17

Klebsiella

BCH 31

Bacilo Negativo

Redonda

Entero

Convexa

Crema

Lisa

Mucosa

2.17

Enterobacter cloacae

BCH 34

Bacilo Negativo

Redonda

Entero

Convexa

Blanco

Lisa

Mucosa

4.76

No Identificada Flavimonas oryzihabitans

BCH 35

Cocobacilo negativo

Redonda

Entero

Plana

Crema

Lisa

Mucosa

2.5

BCH 36

Bacilo Positivo

Arrugada Compleja Redonda

Lobulado

Montuosa

Crema

Rugosa

Granigienta

3.8

Bacillus brevis

BCH 52

Bacilo Negativo

Entero

Convexa

Crema

Lisa

Mucosa

3.7

No Identificada

BCH 56

Bacilo Negativo

Redonda Festonada Redonda

Ondulado

Plana

Crema

Lisa

Mucosa

1.3

Pseudomonas aeuroginosa

BCH 74

Bacilo Positivo

Entero

Convexa

Amarillo claro

Lisa

Mucosa

1.1

Bacillus cereus

BCH 76

Bacilo Negativo

Redonda

Entero

Convexa

Crema Transparente

Lisa

Mucosa brillante

2.6

No Identificada

BCH 135

Bacilo Positivo

Irregular expansiva

Entero

Plana

Blanco

Lisa

Mucosa Brillante

4.3

Bacillus pumillus

45

D Figura 5. Caractersticas microscpicas (100x) y macroscpicas de las cepas seleccionadas. (A) cepa BCH28- Chromobacterium sp. (B) BCH30-Klebsiella (C) cepa BCH31-Enterobacter cloacae (D) cepa BCH34

46

H Continuacin Figura 5. Caractersticas microscpicas (100x) y macroscpicas de las cepas seleccionadas (E) BCH35-Flavimonas oryzihabitans (F) BCH36-Bacillus brevis (G) cepa BCH52 (H) cepa BCH56-Pseudomonas aeuroginosa.

47

K. Continuacin Figura 5. Caractersticas microscpicas (100x) y macroscpicas de las cepas seleccionadas. (I) cepa BCH74 Bacillus cereus (J) cepa BCH76 (K) BCH135-Bacillus pumillus.

5.2 ENSAYOS DE DEGRADACIN DEL ACPM Basados en las capacidades degradativas de cada cepa se conform un cultivo mixto, del cual se evalu su accin en conjunto frente a una concentracin de ACPM del 2% a travs de mediciones en los cambios de abundancia de hidrocarburos alifticos y concentracin de aromticos.

48

5.2.1 Degradacin de alifticos Finalizado el periodo de incubacin de los ensayos de degradacin de ACPM se evidenci una disminucin total de alifticos en trminos de n- alcanos del 92.15%, donde el cultivo bacteriano degradado el 68.61 %y por factores abiticos se removi el 23.54% (Tabla 6 y Anexo 6 ).Algunos autores han reportado una degradacin de la fraccin aliftica del 50% (Sharma y Pant, 2000), 70% (Plohl y Leskovsek, 2002), 90% (Mrquez-Rocha et al., 2001) y 91.3%(Palittapongarnmim et al., 1998) en un periodo de tres das a un mes.

Tabla 6. Porcentaje de remocin y degradacin de hidrocarburos alifticos del ACPM por factores biticos y abiticos. Parmetros % Remocin % Degradacin Ensayos Da 10| Da 21 Da 10 Da 21 31.28 92.15 9.42 68.61 Tratamiento 21.85 23.54 ---------Control abitico En la figura 6 se muestra el perfil cromatografico de masas del ACPM del da cero y 21 del tratamiento donde se observ la degradacin de los alcanos de cadena larga (C12- C31). Los alifticos de cadena corta, menores de 10 tomos de carbono, tienden a ser txicos y alterar las funciones de membrana y protenas de las bacterias o se volatilizan en las primeras horas posteriores a un derrame (Solano-Serena et al., 2000; Cookson, 1995). La alta solubilidad de estos compuestos en los medios de cultivo aumenta su toxicidad sobre los microorganismos (Plohl y Leskovsek, 2002) y disminuye su degradacin como se ha observado en otros experimentos (SolanoSerena et al., 2000).

En la figura 7. se observa el comportamiento individual de los n-alcanos en el tratamiento y el control abitico del da cero y 21 en trminos de abundancia relativa, por lo cual la abundancia de cada compuesto se encuentra comparada y manifestada en relacin con C-15 quien fue el alcano mas abundante en el da cero (abundancia relativa/C-15) de acuerdo con Guyomarch, (2002). Se destaca una disminucin

49

general de la abundancia de los alcanos de C24-C31 y el C13 con un porcentaje de degradacin del 75%- 85%. La degradacin de n-alcanos se encuentra ampliamente reportada (Daz et al., 2000; Sharma y Pant, 2000; Palittanpogarmin et al., 1998) siendo requerido para este proceso una adaptacin compleja de la superficie celular de los microorganismos para adherirse al ACPM y entrar en contacto directo con el sustrato (Norman et al., 2002). En el proceso de degradacin de n-alcanos se puede alcanzar la mineralizacin de los sustratos obteniendo como productos finales CO2, biomasa y agua o generarse productos intermedios en el proceso de oxidacin hasta cidos grasos, seguido por la -oxidacin (Plohl y Leskovsek, 2002).

El pristano y fitano son alcanos ramificados persistentes, empleados en la evaluacin de los procesos de remocin de hidrocarburos donde se revela el efecto de la degradacin microbiana, las transformaciones en un periodo de tiempo y el origen biognico o antropognico de la muestra (Wang y Fingas, 2003; Seklemova et al., 2001; Daz et al., 2000). En el ensayo se observ una degradacin de pristano y fitano del 30% y 73.8% respectivamente (Figura 7).En algunos casos se ha reportado la degradacin total de los alifticos lineales, mientras el pristano y fitano permanecen hasta el final de los ensayos (Ghazali et al., 2004; Penet et al., 2004), mientras en investigaciones llevadas a cabo por Sharma y Pant (2000) se alcanzaron valores en la degradacin del pristano del 30 %, sugiriendo la oxidacin del compuesto y formacin de cidos monoicos y dioicos. Hara et al. (2003) reportan la degradacin de pristano por una especie de Alcanivorax aislado del mar y establecen la importancia de la asimilacin de este compuesto ya que permite el crecimiento continuo de la cepa despus del consumo exhaustivo de n-alcanos, sin verse afectado por el mismo. La ruta de degradacin del pristano involucra la oxidacin a cido pristanico, seguido de la esterificacin y formacin de Pristanol CoA , compuesto que es transformado va -oxidacin con produccin final de Acetil CoA y Propionil CoA (Sakai et al., 2004)

50

Los microorganismos del cultivo mixto tienen potencial enzimtico para remover compuestos persistentes, teniendo en cuenta que han sido aislados de lugares contaminados con hidrocarburos por varios aos, metabolicamente se encuentran adaptados a la presencia del contaminante y pueden transformarlo rpidamente (Emtiazi et al, 2005, Chvez et al., 2003; Korda et al., 1997)

Figura 6. Perfil cromatografico del da 0 y 21 de los n-alcanos del ACPM.

Dia 0 Control Abitico Da 21 Cultivo bacteriano Dia 21

100

% Abundancia relativa /C15

80

60

40

20

0 C13 C14 C15 C16 C17 Pristano C18 Fitano C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 C28 C29 C30 C31

n-alcanos

Figura 7 Abundancia relativa de los n-alcanos en relacin con C-15 durante los 21 das de exposicin del ensayo.

51

5.2.2 Degradacin de Aromticos En los ensayos de degradacin de ACPM al cabo de 21 das no se observaron diferencias significativas en la remocin de HAT entre el tratamiento con bacterias y el control abitico (Figura 8y 9). El porcentaje de remocin del cultivo mixto fue de 3.5% y del control abitico 3.6 %. Los valores hallados entre estos dos tratamientos son similares y las diferencias alcanzadas se encuentran dentro del rango de error del mtodo de extraccin y cuantificacin empleado. El mtodo de extraccin y cuantificacin de hidrocarburos empleado tiene un porcentaje de recuperacin del 98%, con un error de 2.2% y el limite de deteccin se encuentra en 0.35 g/mL.

C o n c en t ra ci n H A T m g /m l d e A C P M

Con centracin H AT m g/m l ACP M

600

600

550

550

500

500

450
Caribe Tratamiento 1 (Bacterias + ACPM)

450

400 0 5 10 15 20 25

400 0 5 10 15

Caribe Tratamiento 2 (ACPM)

20

25

Tiempo (Das)

Tiempo (Das)

A) Tratamiento

B) Control abitico

Figura 8. Concentracin de HAT (mg/mL) de ACPM Caribe

El porcentaje de remocin de HAT alcanzado por el cultivo bacteriano no fue significativo, y las perdidas de HAT presentadas en el tratamiento 1 se atribuyen a fenmenos de volatilizacin y evaporacin, que como se conoce, minimizan el efecto causado por el metabolismo microbiano en un periodo inicial en todos los sistemas (Ruberto et al.,2003).

52

(A)

(B) Figura 9. Cromatogramas de hidrocarburos aromticos (A) da 0 (B) da 21 del tratamiento.

Otros autores como Mukherji et al. (2004) han reportado prdidas por factores abiticos del 10% en un periodo de 8 das y Ruberto et al. (2003) no encontraron diferencias significativas en los valores de hidrocarburos entre el control abitico y el tratamiento slo despus 20 das de haber iniciado el ensayo, sugiriendo que las

53

perdidas por factores abiticos solapan el metabolismo microbiano y se hace necesario prolongar el tiempo de las mediciones para su deteccin.

El ACPM esta compuesto de alcanos lineales, ramificados, hidrocarburos aromticos de dos y tres anillos en su mayora y pocos hidrocarburos aromticos de alto peso molecular (Wang et al., 2001). Los hidrocarburos aromticos no disminuyeron significativamente debido a la altas concentraciones de alifticos, que son preferidos por las bacterias para su metabolismo y son fcilmente degradables, an cuando se ha encontrado que algunos aromticos de bajo peso molecular son metabolizados antes que muchos compuestos saturados (Venoza y Zhu, 2003).

5.2.3 Curva de crecimiento El comportamiento exhibido por el cultivo bacteriano mixto en la curva de crecimiento mostr crecimiento exponencial entre los das cero y seis, con valores promedio de 2.98 (+/- 0.81) x 106 y 1.33 (+/- 1.41) x 109 UFC/mL respectivamente, seguido de un descenso poblacional en el da nueve y continuo ascenso en el da doce, punto donde inicia una etapa de declive que se extiende hasta el da 21 obteniendo un valor final de 1.29 (+/- 0.53) x 108 UFC/ml (figura 10).
25

Biomasa ( LN UFC/ mL)

20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25

Tiempo (Das)

Figura 10. Curva de crecimiento del cultivo bacteriano mixto Caribe en ACPM

Se determin que la curva logro su mximo crecimiento durante los das 6 y 12 con valores de 1.33 (+/- 1.41) x 109 UFC/ml y 3.13 (+/- 1.48) x 109 UFC/ml (Anexo 8), lo

54

cual deja de manifiesto que las cepas se encontraban creciendo a expensas de los hidrocarburos alifticos y que las cepas pueden emplear estos compuestos como fuente de carbono y energa. Los valores poblacionales alcanzados obedecen a una oferta elevada de sustratos. El Diesel o ACPM es una fuente rica de hidrocarburos alifticos y estos son mas susceptibles al ataque microbiano, seguidos por los hidrocarburos ramificados, aromticos de bajo peso molecular, y por ltimo los aromticos de alto peso molecular y ciclo alcanos (Plohl y Leskovsek, 2002; Leahy y Colwell, 1990).

La curva de crecimiento del cultivo mixto muestra un descenso poblacional en el da diez y la tendencia en el da 21 es a disminuir la tasa de crecimiento; estos cambios se llevan a cabo como producto de las sucesiones bacterianas al interior del cultivo mixto, donde cada cepa o genero tiene un papel fundamental en la transformacin de los hidrocarburos ya que generan compuestos intermediarios que pueden subsecuentemente ser empleados por otros organismos o beneficiar a otras cepas por remocin de compuestos txicos, estableciendo entre ellas relaciones sinrgicas que generan un proceso de degradacin mayor (Ghazali et al., 2004, Venoza y Zhu, 2003).

Kaplan y Kitts (2004), asocian los descensos poblacionales con cambios en las fases de degradacin rpida-lenta donde se presenta cambios en la dominancia y diversidad de determinadas especies. Los cambios en la curva, tambin se encuentran asociados con la disponibilidad de sustratos como se observa en el da 21 del ensayo donde la mayora de n-alcanos han sido degradados y la curva de crecimiento ha iniciado su descenso y mantenimiento (Figura 11).

Por otro lado, durante los recuentos microbianos se observ como algunas cepas aparecan y desaparecan a travs del tiempo, mientras otras permanecan a lo largo de los 21 das (Tabla 7), este fenmeno ha sido tambin reportado por Kasai et al. (2002) quien observo cambios en el patrn de las poblaciones bacterianas en un

55

ensayo de remocin de petrleo crudo realizado durante quince das. l estableci como bacterias del gnero Cyclocasticus pueden permanecer a lo largo del ensayo y jugar un papel importante en la degradacin de alquil aromticos, mientras otras cepas fluctan de acuerdo a la disponibilidad de sustratos.

% Residual de hidrocarburos

120 100 80

25 20 15

60 10 40 20 0 5 0

10 15 Tiempo ( Das)
% Residual aromticos

20

25

% Residual alifticos

Biomasa (Ln UFC/ mL)

Figura 11. Curva de crecimiento del cultivo bacteriano y porcentaje residual de hidrocarburos alifticos y aromticos en 21 das.

Tabla 7. Comportamiento de las cepas en ACPM a travs del tiempo Cepa BCH28 BCH30 BCH31 BCH34 BCH35 BCH36 BCH52 BCH56 BCH74 BCH76 BCH135 Da 0 X X X X X X Da 3 X X X X Da 6 X X X X X X Da 9 X X X X X X X X Da 12 X X X X X X X X Da 15 X X X X X X X Da 18 X X X X X X Da 21 X X X X X X -

Independientemente de la frecuencia de aparicin una cepa en el transcurso del ensayo no se puede subestimar su papel hasta que no se identifique el papel exacto

56

Biomasa (LN UFC/ mL)

que cumple en la asociacin y como se puede ver afectada la efectividad del cultivo, porque cada miembro puede ser necesario para la dependencia o presencia de otras especies capaces de sobrevivir cuando la fuente de energa se encuentra limitada y confinada en carbonos complejos (Ghazali et al., 2004).

Las asociaciones bacterianas mediante la aplicacin de cultivos mixtos o consorcios permite incrementar los porcentajes de remocin de los contaminantes debido a los efectos sinrgicos y las relaciones de mutualismo que se presentan entre los miembros, evitando la acumulacin de metabolitos txicos y logrando en condiciones ideales la mineralizacin de los contaminantes (Solano-Serena et al., 2003), como es referido en las investigaciones de Nakamura y colaboradores (1996) sobre un consorcio de Acinetobacter sp y Pseudomonas putida que degradan secuencialmente petrleo crudo. En una primera fase Acinetobacter sp. degrada los alcanos y produce una acumulacin de metabolitos sobre los cuales Pseudomonas putida inicia su crecimiento para finalmente degradar los .compuesto aromticos.

57

6. CONCLUSIONES

De un total de 26 cepas, 22 son tolerantes a petrleo crudo y ACPM en una concentracin del 1% v/v y 11 de estas cepas toleran concentraciones de ACPM en un rango del 1-8% v/v.

De las once cepas pertenecientes al cultivo mixto ocho se identificaron bioqumicamente como Klebsiella sp., Chromobacterium sp., Flavimonas orizihabitans, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeuroginosa, Bacillus brevis, B. cereus y B.pumillus.

El cultivo bacteriano mixto conformado por las once cepas seleccionadas degrad el 68.6% de los hidrocarburos alifticos en trminos de n-alcanos y transformo el pristano y fitano, compuestos resistentes a la degradacin e indicadores de degradacin microbiana en un 30 % y 70 % respectivamente.

La degradacin de hidrocarburos aromticos no se observ durante los 21 das del ensayo, debido a la oferta abundante de alifticos degradables por los microorganismos.

58

7. RECOMENDACIONES

Es necesario evaluar la degradacin de los hidrocarburos aromticos en un periodo ms largo de tiempo (30-60 das), teniendo como base las curvas de crecimiento de cada microorganismo y las relaciones microbianas que se pueden establecer entre ellos.

Con los microorganismos seleccionados en las diferentes pruebas realizadas se puede conformar un consorcio bacteriano y evaluar la accin individual de cada una de las cepas en la asociacin.

Teniendo en cuenta que las cepas presentan capacidades metablicas para degradar hidrocarburos alifticos en un alto grado, se debe continuar caracterizando los productos metablicos finales e intermediarios con el objeto de determinar sino se producen compuestos intermediarios txicos.

59

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9. ANEXOS ANEXO 1- MEDIOS DE CULTIVO Caldo de Pre-Enriquecimiento N Y P Solucin de Preenriquecimiento de nitrgeno y fosfato. Usado en los primeros das de incubacin de bacterias marinas K2HPO4 NH4 SO4 Agua pH 100 mg/L 100 mg/L 1L 7.0-8.0

Medio MMS (Nez, 2004) Medio para el cultivo de microorganismos degradadores de hidrocarburos Ca(NO3)2 Na2H CO3 KNO3( NH4Cl KH2PO4 FeSO4.7H2O MnCl2.H2O ZnSO4 Petrleo / ACPM pH 60mg/L 125mg/L 70mg /L 70mg/L 100mg/L 10mg/L 7mg/L 1.5mg/L 10mg/L 8.0

Cuando el medio es preparado en forma slida se adiciona agar-agar ( 14g/l), primero se prepara una emulsin de 10 ml de Petrleo crudo/ ACPM en 90 mL de agua ms 1mL de Tween 80%, esta emulsin se coloca en agitacin (200 rpm) durante 4 horas. Las sales del medio se mezclan junto con el agar agar y el agua. Cuando las dos soluciones estn listas se mezclan y se llevan al autoclave a 121oC, 121 lb de presin, 15 minutos.

70

Medio Gorvienko Medio para la conservacin de bacterias aisladas de medio marino (Gorvienko, 1961). Extracto de carne Peptona Extracto de Levadura Agua de mar Agua destilada Agar- Agar pH 3 g/L 5 g/L 5g/L 750 mL 250 mL 14 g/ L 7.0

Caldo Nutritivo Peptona de carne Extracto de carne Agua pH 5.0 g/L 3.0 g/L 1L 7.0

71

ANEXO 2 RECUENTOS DE CLULAS / mL DE LOS INOCULOS EN ACPM AL 2%

Cepa BCH28 BCH30 BCH31 BCH34 BCH35 BCH36 BCH52 BCH56 BCH74 BCH76 BCH136

Clulas / mL 4.4 x 106 2.8 x 107 6.5 x 106 1.2 x 108 5.1 x 107 1.0 x 108 3.7 x 107 1.2 x 108 8.4 x 106 9.0 x 106 5.6 x 106

72

ANEXO 3 CURVA DE CALIBRACIN DE HIDROCARBUROS AROMTICOS DEL ACPM

Concentracin ppm Intensidad 0 2,35 5 101,388 10 200,751 20 410,498 30 578,642 40 766,087

Curva de Calibracin ACPM

800
y = 19,101x + 9,0232 Concentracin ppm

600 400 200 0 0 10

R = 0,9989

20

30

40

50

Inte nsidad

73

ANEXO 4 SCAN DE ABSORCIN DE LOS HIDROCARBUROS AROMTICOS DEL ACPM-LONGITUD DE ONDA 310- 360 nm.
Scan ACPM
35 30 25

Intensidad

20 15 10 5 0 280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

Longitud de Onda (nm )

74

ANEXO 5 ENSAYOS DE CONCENTRACIN MMIMA INHIBITORIA DE LAS 22 CEPAS TOLERANTES A PETRLEO CRUDO Y ACPM

Concentraciones de Diesel/ ACPM

Nm ero Cepa 28 30 31 32 33 34 35 36 37 38 52 53 54 55 56 72 74 76 77 79 135 136 SubTotales

2%

4%

6%

8%

10%

R1 si si si no no si si si no no no no no no si no si si no no si no

R2 R3 Prom edio si si si si si si si si si no no no no no no si si si si no si si si si no no no no no no si si si no no no no no no no no no si si si no no no si si si si si si no no no no no no si si si no no no 11

R1 R2 R3 Prom edio si si si si si si si si si si si si no no no no no no no no si si si si no si si si si si si si no no no no no no si no no si si si no no no no no no no no no no no no si si si si no no no no si si si si si si si si no no no no no no no no no si si si no no no no 11

R1 R2 si si si si no si no no no no si si si si si si no no no si si si no no no no no no si si si no si si si si no no no no si si no no

R3 Prom edio si si si si si si no no no no si si no si si si no no no no si si no no no no no no si si no si si si no si no no no no si si no no 11

R1 R2 R3 Prom edio si si si si si si si si no si si si no no no no no no no no si si si si no si si si si si si si no no no no si no no no no si si si no no no no no no no no no no no no si si si si no no si si si si si si si si no si no no no no no no no no si si si si no no no no 11

R1 R2 R3 Prom edio si si si si si si si si si si no si no no no no no no no no si si si si no no no no si si si si no no no no si no no no si si no si no no no no no no no no no no no no si si si si si no no no si si si si si si si si no no no no no no no no si si si si no no no no 10

---- Cepas Seleccionadas para el ensayo de degradacin.

75

ANEXO 6 CROMATOGRAMAS DE n-ALCANOS DA O, 10 Y 21 DEL TRATAMIENTO Y EL CONTROL ABITICO

DIA O TRATAMIENTO Y CONTROL ABITICO

76

DIA 10 DELTRATAMIENTO

DA 21 DEL TRATAMIENTO

DA 10 DEL CONTROL ABITICO

77

DA 21 DEL CONTROL ABITICO.

78

ANEXO 7 DATOS DE HIDROCARBUROS AROMTICOS TOTALES (mg/ ml) MEDIDOS POR ESPECTROFLUOROMETRA.

Da 0 5 10 15 21

Replica 1 597,47 509,93 572,12 574,84 590,89

Tratamiento mg/ml ACPM Replica 2 Replica 3 592,49 614,0 543,28 584,53 568,78 609,94 582,88 590,93 572,84 576,62

Promedio 601,32 545,91 583,62 582,88 580,12

DS 11,26 37,37 22,86 8,05 9,52

Da 0 5 10 15 21

Replica 1 597,98 593,43 592,57 607,66 572,00

Control abitico mg/ml ACPM Replica 2 Replica 3 599,44 594,10 560,92 550,68 597,68 576,73 582,61 579,83 591,10 564,46

Promedio 597,17 568,34 589,00 590,03 575,85

DS 2,76 22,32 10,92 15,33 13,73

DS: desviacin estndar.

79

ANEXO 8 RECUENTOS MICROBIANO DEL TRATAMIENTO (CULTIVO MIXTO) EN ACPM al 2% v/v. Da 0 3 6 9 12 15 18 21 Replica 1 2.18 x 106 3.56 x 107 Incontables 9.45 x 107 2.46 x 109 2.46 x 108 2.79 x 108 1.33 x 108 Replica 2 3.18 x 106 5.24 x 107 2.14 x 109 1.28 x 108 3.93 x 109 9.28 x 108 2.32 x 108 1.21 x 108 Replica 3 3.60 x 106 9.61 x 107 5.15 x 108 1.34 x 108 3.00 x 109 7.95 x 107 5.75 x 107 1.34 x 108 Promedio 2.98 x 106 6.13 x 107 1.33 x 109 1.19 x 108 3.13 x 109 4.18 x 108 1.89 x 108 1.29 x 108 Desviacin Estandar 8.10 x 105 3.61 x 107 1.41 x 109 3.27 x 107 1.48 x 109 4.32 x 108 1.07 x 108 5.32 x 107

80

ANEXO 9 ANLISIS ESTADSTICOS DE LOS TRATAMIENTOS

PRUEBA DE NORMALIDAD DEL TRATAMIENTO Shapiro-Wilk Normality Test Variable T1D0 T1D10 T1D15 T1D21 T1D5 N 3 3 3 3 3 W 0.9123 0.8104 1.0000 0.8988 0.9963 P 0.4259 0.1396 0.9993 0.3817 0.8834

PRUEBA DE NORMALIDAD DEL CONTROL ABITICO Shapiro-Wilk Normality Test Variable T2D10 T2D15 T2D21 T2D5 T2DO N W 3 0.9196 3 0.8241 3 0.9409 3 0.9170 3 0.9359 P 0.4509 0.1734 0.5312 0.4420 0.5112

Interpretacin: Todas las muestras se distribuyen normalmente. Los valores de p no son menores de 0.05.

ANLISIS DE VARIANZA DE LAS CONCENTRACIONES DE HIDROCARBUROS AROMTICOS TOTALES DEL TRATAMIENTO Y EL CONTROL ABITICOS DIA O One-Way AOV for: T1D0 T2DO Source DF SS MS F P Between 1 0.001 0.001 0.00 0.9982 Within 4 589.273 147.318 Total 5 589.274 Grand Mean 597.19 CV 2.03

81

Chi-Sq DF P Bartlett's Test of Equal Variances 3.67 1 0.0553 Cochran's Q 0.9741 Largest Var / Smallest Var 37.682 Component of variance for between groups -49.1058 Effective cell size 3.0 Interpretacin: Las varianzas del tratamiento y el control abitico son homogneas, el valor de p es mayor a 0.05. Variable Mean T1D0 597.20 A T2DO 597.17 A Observations per Mean 3 Standard Error of a Mean 7.0076 Std Error (Diff of 2 Means) 9.9102 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test Variable Mean Homogeneous Groups T1D0 597.20 T2DO 597.17 Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 9.9102 Critical Q Value 3.930 Critical Value for Comparison 27.542 Interpretacin: No hay diferencias significativas entre el tratamiento y el control abitico 1 One-Way AOV for: T1D5 T2D5 Source DF SS MS F P Between 1 754.66 754.657 0.80 0.4226 Within 4 3789.42 947.355 Total 5 4544.08 Grand Mean 557.13 CV 5.52 DIA 5

Chi-Sq DF P Bartlett's Test of Equal Variances 0.41 1 0.5233 Cochran's Q 0.7370 Largest Var / Smallest Var 2.8030

82

Component of variance for between groups -64.2327 Effective cell size 3.0 Interpretacin: Las varianzas del tratamiento y el control abitico son homogneas, el valor de p es mayor a 0.05. Variable Mean T1D5 545.91 T2D5 568.34 Observations per Mean 3 Standard Error of a Mean 17.770 Std Error (Diff of 2 Means) 25.131 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test Variable Mean Homogeneous Groups T2D5 568.34 A T1D5 545.91 A Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 25.131 Critical Q Value 3.930 Critical Value for Comparison 69.844 Interpretacin: No hay diferencias significativas entre el tratamiento y el control abitico 2.3.1 One-Way AOV for: T1D10 T2D10 Source DF SS MS F P Between 1 43.42 43.417 0.14 0.7317 Within 4 1283.86 320.964 Total 5 1327.27 Grand Mean 586.30 CV 3.06 DA 10

Chi-Sq DF P Bartlett's Test of Equal Variances 0.80 1 0.3701 Cochran's Q 0.8141 Largest Var / Smallest Var 4.3799 Component of variance for between groups -92.5160 Effective cell size 3.0

83

Interpretacin: Las varianzas del tratamiento y el control abitico son homogneas, el valor de p es mayor a 0.05. Variable Mean T1D10 583.61 T2D10 588.99 Observations per Mean 3 Standard Error of a Mean 10.344 Std Error (Diff of 2 Means) 14.628 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test Variable Mean Homogeneous Groups T2D10 588.99 A T1D10 583.61 A Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 14.628 Critical Q Value 3.930 Critical Value for Comparison 40.654 Interpretacin: No hay diferencias significativas entre el tratamiento y el control abitico 2.3.2 One-Way AOV for: T2D15 T1D15 Source DF SS MS F P Between 1 76.684 76.684 0.51 0.5139 Within 4 599.357 149.839 Total 5 676.041 Grand Mean 586.46 CV 2.09 DA 15

Chi-Sq DF P Bartlett's Test of Equal Variances 0.62 1 0.4298 Cochran's Q 0.7840 Largest Var / Smallest Var 3.6302 Component of variance for between groups -24.3852 Effective cell size 3.0 Interpretacin: Las varianzas del tratamiento y el control abitico son homogneas, el valor de p es mayor a 0.05.

84

Variable Mean T2D15 590.03 T1D15 582.88 Observations per Mean 3 Standard Error of a Mean 7.0673 Std Error (Diff of 2 Means) 9.9946

Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test Variable Mean Homogeneous Groups T2D15 590.03 A T1D15 582.88 A Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 9.9946 Critical Q Value 3.930 Critical Value for Comparison 27.777 Interpretacin: No hay diferencias significativas entre el tratamiento y el control abitico 2 One-Way AOV for: T2D21 T1D21 Source DF SS MS F P Between 1 27.264 27.264 0.20 0.6814 Within 4 558.358 139.590 Total 5 585.622 Grand Mean 577.99 CV 2.04 DA 21

Chi-Sq DF P Bartlett's Test of Equal Variances 0.21 1 0.6467 Cochran's Q 0.6754 Largest Var / Smallest Var 2.0807 Component of variance for between groups -37.4419 Effective cell size 3.0 Interpretacin: Las varianzas del tratamiento y el control abitico son homogneas, el valor de p es mayor a 0.05. Variable Mean T2D21 575.85 T1D21 580.12 Observations per Mean

85

Standard Error of a Mean 6.8213 Std Error (Diff of 2 Means) 9.6467 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test Variable Mean Homogeneous Groups T1D21 580.12 A T2D21 575.85 A Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 9.6467 Critical Q Value 3.930 Critical Value for Comparison 26.810 Interpretacin: No hay diferencias significativas entre el tratamiento y el control abitico

86