2011

Memoria prcticas ENZIMOLOGA

Sussane Ayed Jose Luis Prez

Prctica 1

Estudios cinticos en estadio preestacionario Actividad de la -Quimiotripsina con acetato de p-nitrofenilo

Introduccin La -quimiotripsina cata liza la hidrlisis del acetato de p-nitrofenilo a travs de un intermediario acil-enzima, segn el siguiente mecanismo: E AB E AB EA E A K 1, K 1 K2,B K3 Dnde B, se refiere al p-nitrofenol. Si la concentracione de AB es saturante, el primer equilibrio ser rpido alcanzndose antes de que se alcance el estado preestacionario. Esto se puede conseguir trabajando a condiciones no ptimas para el enzima, en este caso se modifica el pH a 5, lejos del pH ptimo 8, de forma que se enlentece el proceso y se puede seguir la cintica por mecanismos espectroscpicos simples, que se centra en la medida de la absorbancia del producto p-nitrofenol. La ecuacin cintica explcita para el mecanismo de una enzima hidrlitica es: [ B ]=[Eo]{ k 2 k 3 t / k 2k 3 k 2 /k 2k 3 2 [ 1e k k t ]} Si el tiempo es suficientemente largo ,la ecuacin se aproxima a una recta :
2 3

[B]=[Eo]{ k 2 k 3 t /k 2k 3 k 2 /k 2k 3 2 } Dnde la pendiente ser velocidad en estado estacionario ,Vmx , y la ordenada en el origen una componente llamada Vmx=m=[ Eo] k 2 k 3 /k 2k 3 =[Eo]k 2 /k 2k 32

Objetivo Determinar si la hidrlisis del p-nitrofenilo catalizado por la Quimiotripsina responde al mecanismo indicado anteriormente, calculando las constantes de velocidad de las etapas individuales, as como de la concentracin absoluta de Enzima. Por otro lado los ensayos con distinta concentracin de enzima permiten determinar el nmero de centros activos.

1.1 Determinacin de las concentraciones de p-nitrofenilo y -quimiotripsina Ya que ambos reactivos se preparan en el momento de realizar la prctica, una vez realizadas las diluciones de trabajo, las valoramos para comprobar su concentracin exacta para trabajar con las cantidades correctas. Para ello se realiza un espectro de Absorcin entre 340 y 230 nm en cubetas de cuarzo y utilizando la ley de Lambert-Beer-Bouguer podemos obtener la concentracin exacta de cada sustancia con la que trabajaremos ms adelante. p-nitrofenilo A
max 271

-quimiotripsina A
max 280

= 0,378 u.a

= 0,505 u.a

271 = 8145 M-1 cm-1

Mr = 181 Dilucin 1:800 L =1 A 0,378 C= = =4,64 105 M E 8145 4,64 105 800 1000=37,12 mM Como la queremos a 2 mM, la diluimos: 1mL 2mM=V 2 37,12 mM V 2=18,56 mL

280 46000 M-1 cm-1

Mr = 25000 Dilucin 1/500 L=1 A 0,505 C= = =1,09 105 M E 46000 1,09 105 M 500 1000=5,45 mM Queramos una disolucin de 120uL a 150mg/mL 5,43 mM 1,2 103 mL 25000=163,5 mg /mL No fue necesario modificarla.

Resultados experimentales. Cinticas.

Cinetica estado Pre-estacionario

Dilucion 1/50; aQuimiotripsina = 30uL
1,20E-004 1,00E-004

[p-nitrofenilo] (M)

8,00E-005 6,00E-005 4,00E-005 2,00E-005 0,00E+000

f(x) = 6,91E-08x + 7,99E-05 R = 9,78E-01

50

100

150

200

250

300

Tiempo (s)

Cinetica Pre-estacionaria
Dilucin 1/75; aQuimiotripsina 20uL
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 100 150 200 250
Tiempo (s) Cinetica Pre-estacionaria

[p-nitrofenilo] (M)

f(x) = 1,39E-07x + 5,19E-05 R = 4,35E-01

300

Dilucin 1/150; aQuimiotripsina 10 uL

0 0
[p-nitrofenilo] (M)

0 0 0 0 0 50 100 150
Tiempo (s)

f(x) = 3,22E-08x + 3,07E-05 R = 9,92E-01

200

250

300

D1/50 D1/75 D1/150

Eo (M) 1,09E-004 7,26E-005 3,63E-005

(M) 7,99E-005 5,19E-005 3,07E-005

m (M) 6,91E-008 1,39E-007 3,22E-008

Con lo que despejando de las ecuaciones llegamos a:

D1/50 1,09E-004 7,99E-005 6,04E-013 D1/75 7,26E-005 1,39E-007 6,26E-013 D1/150 3,63E-005 3,22E-008 9,66E-004

Eo (M) K2 (s-1) K3 (s-1)

Ajuste Iterativo: Los datos de laboratorio se analizaron con el programa Graffit, y realiz un ajuste iterativo a a la ecuacin terica, de forma que se obtuvieron los valores de Eo, K2 y K3 ajustados, de forma que podemos compararlos con los nuestros.
D1/50 8,00E-005 1,01E-001 8,30E-004 D1/75 7,00E-005 9,06E-002 7,60E-004 D1/150 3,00E-005 8,37E-002 9,80E-004

Eo (M) K2 (s-1) K3 (s-1)

Como vemos los valores varan mucho entre ambos mtodos. Esto pude deberse al error de medida experimental o a problemas de disolucin de la Enzima. En cualquier caso, tampoco debemos fiarnos mucho de los datos obtenidos en el ajuste dado que tienen mucho error.

Calculo de centros activos Dado que K3<<K3 podemos despreciar el valor de K3, de forma que: = Eo K 2 K 2 K 3
2

; K 30 ;

=Centros Activos Eo

7,99 105 D 1/ 50= =0,73 1,09 104 5,19 105 D 1/ 75= =0,71 7,26 105 3,63 105 D 1/ 150 = =1,18 3,07 105 0,730,711,18 =0,871 3 Haciendo la media de las aproximaciones podemos concluir que la aQuimiotripsina tiene un Centro Activo. Ademas esto concuerda con la realidad ya que sabemos que la enzima tiene un centro activo en el que se localiza un residuo de Serina 195, que es el responsable de la formacin del complejo enzima sustrato. Cuestiones a. Explicar cmo y por qu se han determinado las concentraciones exactas de los distintos reactivos utilizados. Primero se realizaron los clculos tericos y se realizo una primera disolucin tanto del pnitrofenilo, como de la enzima. Luego se midio la absorbancia de las disolucin, y con el mximo de absorbancia y a travs de la ley de Lambert-Beer, se obtiene la concentracin exacta de la disolucin. Los resultados entre las dos medidas pueden variar debido al error experimental, por esto es necesario realizar este paso, para conocer exactamente con que concentraciones estamos trabajando. b. Para que es conveniente obtener el espectro de Absorcin del sustrato y del Enzima? De igual modo, es conveniente para conocer las concentraciones de ambos reactivos, y asegurarnos de que trabajamos correctamente. c. Cul es la concentracin de enzima inicial utilizada en las distintas muestras? 30 106 L 5,45 103 M =1,09 109 M 6 1500 10 L 20 106 L 5,45 103 M 5 EoD1 /70= =7,26 10 M 6 1500 10 L 10 106 L 5,45 103 M Eo D1 /150 = =3,63 105 M 6 1500 10 L EoD1 /50=

d. De acuerdo con las estimaciones de k2 y k3, Se puede decir que la hidrlisis del pnitrofenilo por al Quimiotripsina sigue un mecanismo como el descrito en la introduccin? La reaccin enzimtica transcurrira siguiendo este mecanismo para cualquier valor de las constantes cinticas?Se utilizara el mismo procedimiento para estimarlas? A la vista de los resultados podemos ver como la aparicin de producto es marcadamente bifsica. Una primera fase de aparicin explosiva, y una siguiente en la que se estabiliza. Por tanto podemos ver claramente, el estado pre-estacionario y el estado estacionario. Se debe cumplir que las constantes sean positivas ya que si no la reaccin tal como la hemos planteado no tendra lugar. Tambin es necesario que K2>>K3, para que se forme y acumule p-nitrofenol. No, habra que buscar otros procedimientos, ya que si por ejemplo K3>>K2 no se acumulara el intermediario que hemos medido.

Practica 2

Estudios Cineticos en estado Estacionario

Resultados Experimentales: 1,1 Determinacin de la actividad de la ADH La pendiente de la recta tangente en el origen nos da la velocidad inicial de la reaccin (Vo). Vo = 0,00303 u.a/s

Actividad ADH
1,60E-04 1,40E-04 1,20E-04 1,00E-04

f(x) = 3,30E-03x + 1,26E-01 R = 9,89E-01

A340

8,00E-05 6,00E-05 4,00E-05 2,00E-05 0,00E+00

50

100

150

200

250

300

350

400

Tiempo (s)

NADH E340nm=6220 M 1 cm1 Dilucin 1/150 Volumen Dilucin 8 105 L Volumen Cubeta 1,2 103 L 3,03 103 ua /s Vo= =4,871 107 M / s 1 1 6220 M cm 1,2 103 L 7 4,871 10 M / s 150 =1,0959 103 mol NADH /s L de Enzima 5 8 10 L 3 1,0959 10 mol NADH / s L de Enzima /1000mL=1,0959 106 mol NADH / s mL de Enzima 1,0959 106 mol NADH / s mL de Enzima 60 s=6,57585 105 mol NADH /min mL de Enzima La actividad original ser de 6,57585 105 mol NADH /min mL de Enzima

1,2 Determinacin de la constante de equilibrio de la reaccin

Determinacin Keq
1,4 1,2 1 0,8

Del ultimo valor de Absorbancia: A=E C l 1,332=6220M1 cm1 C 1cm [ NADH ]=2,141 104 M Dado que la reaccin es : Etanol+ NAD Acetaldehdo+ NADH + H
0 50 100 150
Tiempo (s)

A340

0,6 0,4 0,2 0

200

250

300[ NADH ]=[ Acetaldehdo]=2,141 10

Para el Etanol : d =0,805 g /ml R=96 Mr=46 Da 0,805 g 0,96=0,7728 g de EtOH puro 0,7728 g de EtOH puro /46Da=0,168 mol EtOH /103 L=16,88 M Como hemos utilizado80uL en la cubeta de 1200uL : 8 106 L 16,88 M =[EtOH ]=1,12 M 1,2 103 L

Para el NAD+ : 3 Ci=5 10 M 5 Vi=8 10 L 5 3 8 10 L 5 10 M 4 =3,3 10 M 3L 1,2 10

La concentracin de protones vendr determinada por el pH del medio , pH =8 Luego H ' =8 108 M Contodos estos datos podemos abordar el clculo de la Keq Keq= [ Acetaldehdo ] [NADH ][ H ' ] [EtOH ][ NAD ' ]

[2,141 104 M ][2,141 104 M ][8 108 M ] Keq= [1,12 M ] [3,3 104 M ] Keq=9,92 10
12

2,3 Reversibilidad de la reaccin

Reversibilidad de la reaccin
1,4 1,2 1
A340

De igual manera que en el apartado anterior pero utilizando el ultimo dato de Absorbancia: 0,374=6220M1 cm1 C 1cm [ NADH ]=6,012 105 M La [ Acetaldehdo] ser la incial ms la aadida 50ul a 50mM que son una final de 2mM ; por tanto : [ Ac]=2,141 104 M + 2 103 M [ Acetaldehdo]=2,2141 103 M

0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400
Tiempo (s)

Para el resto de los reactivos tendremos encuenta que hemos modificado el Volumen final asi : 5 8 10 L 16,8 M [ EtOH ]= =1,0752 M 1,25 103 L 8 105 L 3,3 104 M [ NAD ' ]= =2,112 105 M 3 1,25 10 L Keq= [ Acetaldehdo][ NADH ] [H ' ] [2,2141 103 M ] [6,012 105 M ][8 108 M ] = [ EtOH ][ NAD ' ] [1,0752 M ][2,112 105 M ] Keq=4,68 1010

2,4 Determinacin de los parmetros cinticos En este apartado se mantiene constante la concentracin de enzima (D 1/150) y de NAD+ (5mM) y se vara la concentracin de EtOH entre 5 y 150mM. Esto permitir determinar la concentracin de esto EtOH a la que se satura la enzima, as como los parametros cinticos: Km, Vmax, kcat, kcat/Km; mediante el anlisis grfico de los resultados de la Vo.
A b s 3 4 0 n m a d is t in t a s [E t a n o l] (m M) 5 mM 10 mM 25 mM 75 mM 150 0,029 0,023 0,080 0,056 0,055 0,042 0,118 0,116 0,082 0,059 0,154 0,171 0,104 0,077 0,183 0,212 0,127 0,090 0,210 0,253 0,148 0,106 0,234 0,286 0,168 0,120 0,254 0,315 0,184 0,130 0,273 0,340

T ie m p o (s ) 15 30 45 60 75 90 105 120

mM 0,184 0,316 0,429 0,491 0,550 0,598 0,636 0,662

Ensayos a distintas [EtOH]

0,700 0,600 0,500
Abs 340 nm

Determinacin de Vo

5 mM Regresin lineal para 5 mM 10 mM Regresin lineal para 10 mM 25 mM Regresin lineal para 25 mM 75 mM Regresin lineal para 75 f(x) mM = 4,37E-03x + 1,88E-01

0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 20 40 60

Tiempo (s)

R mM 150= 9,35E-01 R = 9,79E-01

Regresin lineal para 150 f(x) = 2,67E-03x + 3,81E-02 mM

f(x) = 1,82E-03x + 6,51E-02 R = 9,85E-01 80 100 120 f(x) = 1,48E-03x + 1,19E-02 140 R = 9,95E-01 f(x) = 1,03E-03x + 1,16E-02 R = 9,94E-01

NADH E340nm=6220 M 1 cm1 Dilucin 1/150 Volumen Dilucin 8 105 L Volumen Cubeta 1,2 103 L [E ] ; 331u /mg ; 500u /mL ; 1,5105 mg /148000Da=1,0206 105 mol E 5 3 1,0206 10 mol /10 L=0,01020 M 1,48 103 ua / s 7 =2,3794 10 M / s 1 1 6220 M cm 1,2 103 L 2,3794 107 M / s 150 =5,3536 104 mol NADH / s L de Enzima 8 105 L 5,3536 104 mol NADH / s L de Enzima/ 1000mL=5,3536 107 mol NADH /s mL de Enzima 5,3536 107 mol NADH /s mL de Enzima 60 s=3,2122 105 mol NADH / min mL de Enzima 5 5 3,2122 10 mol NADH /min mL de Enzima /1,0206 10 mol de E 3,1473 mol NADH /min mol de Enzima Vo= As con el resto de concentraciones:
[E tO H] (mM) 5 10 25 75 150
Pendiente (ua/s)

Vo (molNAD H/minmL E )
3,21E-05 2,24E-05 3,95E-05 5,79E-05 9,48E-05

1,48E-03 1,03E -03 1,82E -03 2,67E -03 4,37E -03

Vo (molNAD H/minmolE ) 3,147 2,190 3,870 5,678 9,293

2.5 Inhibicin de la ADH por Metanol El metanol puede ser oxidado por la ADH, lo cual puede provocar la inhibicin de la actividad enzimatica. Para abordar el estudio de este proceso se ensaya la actividad variando la [EtOH] y manteniendo fija la [Metanol] a 50uL

T ie m p o (s ) 15 30 45 60 75 90 105 120

A b s 3 4 0 n m a d is t in t a s [E t a n o l] (m M) + 5 0 u L Me t a n o l 5 mM 10 mM 25 mM 75 mM 150 mM 0,002 0,011 0,025 0,091 0,112 0,009 0,018 0,033 0,149 0,192 0,014 0,025 0,044 0,195 0,276 0,021 0,032 0,052 0,235 0,346 0,027 0,039 0,062 0,272 0,400 0,033 0,046 0,070 0,309 0,455 0,040 0,053 0,080 0,335 0,500 0,046 0,059 0,088 0,362 0,543

Estudio de la Inhibicin por Metanol

Determinacin de Vo
0,600 0,500 0,400
Abs 340

5 mM Regresin lineal para 5 mM 10 mM Regresin lineal para 10 mM 25 mM

Regresin lineal para 25 mM 75 mM Regresin lineal para 75 mM 150 mM Regresin lineal para 150 mM

0,300 0,200 0,100 0,000 0 20 40 60

Tiempo (s)

f(x) = 4,09E-03x + 7,72E-02 R = 9,84E-01 f(x) = 2,54E-03x + 7,18E-02 R = 9,85E-01 f(x) = 6,06E-04x + 1,58E-02 R = 9,99E-01 f(x) = 4,61E-04x + 4,25E-03 140R = 1,00E+00 f(x) = 4,17E-04x - 4,18E-03 R = 9,99E-01

80

100

120

De igual manera que en el apartado anterior:

[E tO H] (mM) 5 10 25 75 150
Pendiente (ua/s)

Vo (molNAD H/minmL E )
9,05E-06 1,00E-05 1,32E-05 5,51E-05 8,88E-05

4,17E-04 4,61E -04 6,06E -04 2,54E -03 4,09E -03

Vo (molNAD H/minmolE ) 0,887 0,980 1,288 5,401 8,696

2.6 Clculos y representaciones grficas de

[E tanol] (mM) 5 10 25 75 150 1/[E tanol] (1/mM)

0,200 0,100 0,040 0,013 0,007

Vo (molNAD H/minmolE ) 3,147 2,190 3,870 5,678 9,293

Vo + I (molNAD H/minmolE ) 0,887 0,980 1,288 5,401 8,696

1/Vo (minmolE /molNAD H) 1/Vo+ I (minmolE /molNAD H)

0,318 0,457 0,258 0,176 0,108 1,128 1,020 0,776 0,185 0,115

Representacin de Dobles inversos

0,500 0,400 0,300
1/[EtOH] (mM)

0,200 0,100 0,000 -0,800 -0,300 -0,100

1/Vo

f(x) = 1,074x + 0,186 R = 0,414 f(x) = 0,147x - 0,023 R = 0,735

0,200

0,700

1,200

1,700

De la representacin, y sabiendo que: (-1/Km) corresponde al punto de corte en el eje Y 1/Vmax corresponde al punto de corte con el eje X Kcat conociento la Vmax y Eo; ya que: Vmax = Kcar Eo. En este caso la Vmax ser igual que Kcat
S in Metanol C on Metanol K m (m M) 0,931 6,803 V m a x (m o lN A D H /m in m o lE ) 5,376 43,478 K c a t (1 /m in ) 5,38 43,48 K c a t/K m (1 /m Mm in ) 5,77 6,39

Ya que: Km < Km (+I) Vmax < Vmax (+I) A la vista de los resultados no podemos concluir nada claro. Esperabamos una inhibicin de tipo competitivo, con Km<Km(ap), pero no esperabamos que la velocidad mxima se mantuviese igual, y no es el caso, si no que aumenta. Seguramente se debe a que los ajustes no son muy buenos y se no nos muestran una tendencia representativa.

Cuestiones a. Compara el valor de Km de ADH de levadura con el correspondiente al higado de caballo cuyo valor de Km es 5,5e-4 M. Qu puedes concluir? Nuestra Km es de 9,31e-4, lo que se mantiene en el mismo orden de magnitud que la de caballo. La ADH de caballo esta formada por un dmero de 83300 Da y la de levadura por un tetrmero de 148000 Da, con 4 sitios de unin, por lo que debera tener mayor finidad por el sustrato que la de caballo, aunque nuestros resultados no lo muestren. b. Disea un protocolo experimental par determianr la Km para el NAD+, sabiendo que es alrededor de 74 um para la ADH de la levadura. Procederiamos igual que para el Etanol.. Asegurandonos de que las concentraciones de etanol fuese limintante y la velocidad solo dependiese de la afinidad de la enzima por el NAD+. Dado que la km para la ADH de levadura es de 74uM partiriamos de una concentracin e iriamos incrementando la concentracin de NAD+ en los siguientes tubos. Obtendriamos de esta forma la Vo de cada tubo, y con esto calcular la Km. c. Sabiendo que el hgado humano si que puede oxidar el metanol Como se podra determinar la inhibicin ejercida? Tanto la oxidacin de metanol, como la de etanol, producen NADH, que es el producto que hemos ido siguiendo para determinar la cinetica. As que en este caso no podriamos, ya que no estariamos seguros de si proviene del etanol o del metanol. Para solucionarlo, podriamos acoplar una reaccin a de forma que reaccionase el acetaldehido producido, y medir el producto. Luego seguiriamos el mismo procedimiento de la practica para determinar los parmetros cinticos. Etanol + NAD+ <-------ADH-------> Acetaldehdo + NADH Metanol + NAD+ <---ADH------>Formaldehido + NADH d. El procedimiento utilizado en la prctica, sera adecuado para determinar el contenido de alcohol de las bebidas alcohlicas? No, no sera adecuado, porque solo determinamos el NADH, pero solo hasta que se alcanza el equilibrio. Aunque si que podramos desplazando la reaccin completamente hacia los productos, haciendo reaccionar alguno de ellos. En este caso el NAD+, no debera ser un factor limitante.

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA -AMILASA SALIVAR

Resumen En esta experiencia estudiaremos la variacin de la actividad -amilasa con el pH. A partir de este estudio se pretende determinar qu residuos estn implicados en la actividad de esta enzima. Se realizara la estimacin de la concentracin de enzima en los ensayos de actividad y tambin un estudio de la actividad -amilasa en funcin del pH. La enzima -amilasa est presente en la saliva, donde hidroliza los enlaces (1-4) que unen las glucosas en los polisacridos. El procedimiento para ensayar la actividad de la -amilasa, es el denominado mtodo CNPG3. Y finalmente determinaremos si la curva de actividad frente al pH de la enzima presenta forma acampanada. Palabras clave: actividad -amilasa, mtodo CNPG3, pH, pK, tampn, cloruro, concentracin de enzima, velocidad inicial.

Introduccin La curva de actividad frente al pH de una enzima tiene con frecuencia una forma en campana. La interpretacin es que el resultado de la composicin de dos curvas de titulacin estn solapadas, una correspondiente a un grupo que debe estar protonado para que la enzima tenga la actividad mxima, y otra correspondiente a un segundo grupo, que debe estar desprotonado. Las curvas de titulacin dependern del medio en el que se encuentran los grupos ionizables, de forma que la presencia en sus proximidades de grupos cargados positiva o negativamente influye en su ionizacin, conduciendo a cambios significativos en los valores de pK correspondientes. La -amilasa est presente en la saliva, donde hidroliza los enlaces (1-4) que unen las glucosas en los polisacridos. Tambin en anlisis clnicos bioqumicos sirve para determinar el diagnstico de pancreatitis aguda. Donde la enzima se encuentra aumentada. EL procedimiento que hemos realizado para determinar la actividad de la enzima en suero es el CNPG3. Donde a tasa de formacin de CNP, medida a 405 nm, es directamente proporcional a la actividad de la -amilasa. La reaccin consiste en: 10 CNPG3 9 CNP + 1 CNPG2 + 9G3 + G CNPG3: 2-cloro-4-nitrofenil malto trisido CNP: 2-Cloro-4-nitrofenol G3: Maltotriosa G: Glucosa

Materiales y mtodos

1. Estimacin de la concentracin de enzima en los ensayos de actividad La disolucin stock de -amilasa (la 1/1000 en tampn tris-maleato 5 mM, pH 7.0), preparamos disoluciones 1/5000, 1/10000, 1/20000 y 1/40000 (3 mL en tampn tris-maleato 100 mM, pH 7.0) y realizamos los ensayos de actividad. La reaccin se lleva a cabo en una cubeta del espectrofotmetro en la que se aaden 600L de la disolucin de -amilasa y 200 L de tampn de reaccin R1 (acetato clcico 5 mM, tiocianato potsico 1.5M, MES 10 mM, pH 6.0). Agitamos bien con una pipeta Pasteur y ajustamos a cero el espectrofotmetro. La reaccin se inicia aadiendo 200 L del sustrato CNPG3 (Preparado en disolucin R2) y se mide la variacin de la absorbancia a 405 nm, cada 10 seg, durante 2 minutos. Repetimos los ensayos con las diferentes disoluciones de enzima en las mismas condiciones. Tambin analizaremos tambin el efecto del cloruro en la actividad de la enzima, el procedimiento es idntico al anterior pero aadindole 50 L de NaCl 4M, antes de aadir el CNPG3 Eligimos la dilucin de enzima cuya variacin de A405 sea de entre 0.5 y 1 unidad de absorbancia en los dos minutos. La dilucin de enzima que seleccionamos es la 1/5000 tanto para la presencia y ausencia de cloruro.

2. Estudio de la actividad -amilasa en funcin del pH. Estimamos la variacin de la actividad de la enzima en funcin del pH, llevamos acabo experimentos como los descritos en el apartado anterior, preparando la enzima a la dilucin 1/5000, pero utilizando en cada caso el tampn correspondiente al pH a ensayar. Los pHs que se van a estudiar son los siguientes: 4.0, 4.5 ,5.0 ,6.0,7.0 ,7.5 y 8.0 A partir de los datos obtenidos en este apartado y en el anterior, discutiremos qu residuos parecen estar implicados en la actividad de la enzima.

Resultados y discusin 1. Estimacin de la concentracin de enzima en los ensayos de actividad La dilucin de enzima que seleccionamos es la 1/5000 tanto para la presencia y ausencia de cloruro.

Tabla 1. Medidas de absorbancia a 405 nm cada 10 segundos durante 2 minutos, para cada dilucin, en presencia y ausencia de cloruro. dilucion 1/5000 pH 7 A A(NaCl) 0.768 0.830 0.910 0.984 1.056 1.128 1.202 1.270 1.331 1.396 1.458 1.522 1.577 0.123 0.195 0.273 0.353 0.447 0.524 0.605 0.691 0.763 0.845 0.918 0.995 1.066 dilucion 1/10000 pH 7 A A(NaCl) 0.593 0.630 0.666 0.702 0.739 0.776 0.811 0.850 0.884 0.921 0.960 0.993 1.029 0.102 0.153 0.169 0.207 0.247 0.286 0.329 0.37 0.406 0.446 0.488 0.529 0.569 dilucion 1/20000 pH 7 A A(NaCl) 0.052 0.068 0.086 0.102 0.12 0.138 0.157 0.173 0.192 0.21 0.229 0.248 0.265 0.135 0.176 0.197 0.218 0.239 0.258 0.28 0.301 0.322 0.085 0.096 dilucin 1/40000 pH 7 A A(NaCl) 0.113 0.122 0.131 0.138 0.15 0.158 0.167 0.173 0.18 0.188 0.196 0.206 0.216 0.093 0.102 0.046 0.063 0.072

t 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

incr. A 120-0

0.809

0.943

0.436

0.467

0.213

0.237

0.103

incr. A 30-10

0.154

0.158

0.072

0.054

0.034

0.016

2. Estudio de la actividad -amilasa en funcin del pH. Para cada uno de los ensayos se representar la A405 frente al tiempo y se determinar la velocidad inicial de la reaccin enzimtica. Tabla 2. Medidas de absorbancia a 405 nm cada 10 segundos durante 2 minutos, para cada dilucin, en presencia y ausencia de cloruro pH 4 A(NaCl) 0.030 0.033 0.039 0.045 0.052 pH 4.5 A A(NaCl) 0.038 0.035 0.052 0.047 0.071 0.061 0.085 0.076 0.107 0.092 pH 5 A(NaCl) 0.063 0.146 0.223 0.299 0.38 pH 6 A(NaCl) 0.023 0.285 0.459 0.624 0.775

t 0 10 20 30 40

A 0.024 0.025 0.029 0.032 0.035

A 0.150 0.176 0.217 0.255 0.302

A 0.249 0.450 0.668 0.840 1.065

50 60 70 80 90 100 110 120

0.038 0.041 0.044 0.047 0.049 0.052 0.056 0.059

0.059 0.066 0.074 0.080 0.087 0.093 0.102 0.109

0.129 0.149 0.170 0.192 0.209 0.232 0.255 0.276

0.104 0.119 0.134 0.146 0.16 0.176 0.16 0.203

0.344 0.382 0.433 0.466 0.505 0.547 0.586 0.626

0.452 0.527 0.600 0.672 0.742 0.807 0.885 0.938

1.251 1.443 1.642 1.752 1.888 2.031 2.121 2.207

0.925 1.070 1.201 1.330 1.442 1.551 1.652 1.731

A 0.768 0.830 0.910 0.984 1.056 1.128 1.202 1.270 1.331 1.396 1.458 1.522 1.577

pH 7 A(NaCl) 0.123 0.195 0.273 0.353 0.447 0.524 0.605 0.691 0.763 0.845 0.918 0.995 1.066

A 0.103 0.146 0.200 0.256 0.318 0.369 0.420 0.480 0.531 0.585 0.637 0.690 0.750

pH 7.5 A(NaCl) 0.074 0.126 0.181 0.238 0.291 0.346 0.401 0.457 0.511 0.564 0.616 0.666 0.728

A 0.068 0.087 0.112 0.130 0.148 0.170 0.192 0.215 0.235 0.259 0.279 0.301 0.324

pH 8.0 A(NaCl) 0.037 0.066 0.084 0.1 0.119 0.136 0.154 0.172 0.189 0.207 0.225 0.243 0.261

t 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Figura 1. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4 en ausencia de cloruro.

Vo a pH 4
0,08 A405 0,06 0,04 0,02 0 0 20 40 60 t (s) 80 100 120 140 y = 0,0003x + 0,0231 R = 0,9979

Figura 2. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4 con presencia de cloruro.

Vo a pH 4 (NaCl)
0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0 20 40 60 Ttulo del eje y = 0,0007x + 0,0262 R = 0,9969

80

100

120

140

Ttulo del eje

Figura 3. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4.5 en ausencia de cloruro.

Vo a pH 4,5
0,3 A405 0,2 0,1 0 0 20 40 60 t(s) 80 100 120 y = 0,002x + 0,0308 R = 0,9977

Figura 4. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4.5 con presencia de cloruro.

Vo a pH 4.5 (NaCl)
0,25

0,2
A405 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 t (s)

y = 0,0014x + 0,0343 R = 0,9993

80

100

120

140

Figura 5. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 5 en ausencia de cloruro.

Vo a pH 5
0,800 0,600 A405 0,400 0,200 0,000 0 20 40 60 t (s) 80 100 120 140 y = 0,0041x + 0,14 R = 0,9991

Figura 6. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 5 con presencia de cloruro.

Vo a pH5 (NaCl)
0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 t(s) A405 y = 0,0014x + 0,0343 R = 0,9993

80

100

120

140

Figura 7. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 6 en ausencia de cloruro.

Vo a pH 6
2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 20 40 60 t(s) A405 y = 0,0167x + 0,3501 R = 0,9852

80

100

120

140

Figura 8. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 6 con presencia de cloruro.

Vo a pH 6 (NaCl)
2 1,5 A405 1 0,5 0 0 20 40 60 t(s) 80 100 120 140 y = 0,0139x + 0,1715 R = 0,9849

Figura 9. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7 en ausencia de cloruro.

Vo a Ph 7
2 A405 1,5 1 0,5 y = 0,0068x + 0,7772 R = 0,9983

0
0 20 40 60 t(s) 80 100 120 140

Figura 10. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7 con presencia de cloruro,

Vo a pH 7 (NaCl)
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 t(s) A405 y = 0,008x + 0,1214 R = 0,9995

80

100

120

140

Figura 11. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7.5 en ausencia de cloruro.

Vo a pH 7.5
0,8 A405

0,6
0,4 0,2 0 0 20 40 60

y = 0,0054x + 0,0964 R = 0,9997

80

100

120

140

t(s)

Figura 12. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7.5 con presencia de cloruro,

Vo a pH 7.5 (NaCl)
0,8 A405 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 t(s) 80 100 120 140 y = 0,0054x + 0,0738 R = 0,9999

Figura 13. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 8 en ausencia de cloruro

Vo a pH 8
0,4 0,3 A405 0,2 0,1 0 0 20 40 60 t(s) 80 100 120 140 y = 0,0021x + 0,0659 R = 0,9995

Figura 14. Representacin de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 8con presencia de cloruro,

Vo a pH 8 (NaCl)
0,3 A405 0,2 0,1 y = 0,0018x + 0,0448 R = 0,9985

0
0 20 40 60 t (s) 80 100 120 140

Tabla 3. Valores de Vo. pH 4 4.5 5 6 7 7.5 8 Vo 0.0003 0.002 0.0041 0.0167 0.0068 0.0054 0.0021 Vo(NaCl) 0.0007 0.0013 0.0073 0.0139 0.008 0.0054 0.0018

Representaremos de velocidad frente a pH, a partir de la cual se debe estimar el pH ptimo de la enzima. Figura 15. Ausencia de cloruro, velocidad frente a pH
0,018 0,016 0,014 0,012 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0 0 2 4 pH 6 8 10

velocidad

Figura 16. Presencia de cloruro, velocidad frente a pH

0,016 0,014 0,012 Velocidad 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0 0 2 4 pH 6 8 10

Tabla 4. Valores de pKa en ausencia de cloruro. Valor 5.5691 6.7377 Std. Err. 0.1126 0.1108

pKa 1 pKa2

Tabla 4. Valores de pKa en presencia de cloruro Valor 6.1589 6.9952 Std. Err. 0.175 0.1754

pKa 1 pKa2

Los resultados obtenidos del tratamiento de datos experimentales nos indican que la enzima amilasa posee una actividad mxima ptima a pH 6.1, en ausencia de cloruro y a ph 6.75 en presencia de cloruro. Como la mayora de los enzimas son muy sensibles a cambios de pH, se puede observar como variaciones de pocas decimas por encima o por debajo del pH ptimo varia drsticamente la actividad. Esta campana es en realidad dos curvas de titulacin, donde el punto de inflexin nos indica los valores de pKa, a partir de los cuales vamos a poder deducir que grupos ionizables estn implicados en la actividad dde la enzima. Si observamos los alores de actividad mxima, vemos que es mayor en presencia de cloruro, por lo que podemos deducir que el cloruro es un activador de la -amilasa. El efecto que eerce este in sobre la actividad reside en su interaccin con un residuo de lisisna cargado positivamente presente en el centro activo, lo cual debe generar un cambio de pKa en el entorno qumico que rodea a los aparticos implicados en la reaccin, ocasionando una modificacin del pH optimo del enzima que aumenta acercndose al ph neutro, lo cual en condiciones biolgicas favorecer la reaccin y la velocidad de la misma ejerciendo por ello como activador.

Los aminocidos suelen tener grupos ionizables en funcin de cul sea el aminocido. En nuestra experiencia, observando la figura 15, hemos obtenido que los valores de pKa, en ausencia de cloruro , son aproximadamente 5.3 y 7.1. En presencia de cloruro los valores de pka son de 5.6 y 7.4, aproximadamente. A partir de estos valores podemos deducir(aunque bastante subjetivamente) que los grupos implicados podrn ser el grupo amino N-terminal (pKa=7.5), y el grupo imidazol de una histidina. Sin embargo, el hecho de que los pk estn prximos entre ellos pueden provocar que exista una interferencia entre ellos, y que verdaderamente no sean los valores reales. Para acercarnos ms al valor real de la pK, recurriremos al anlisis de datos mediante ordenador. Los valores obtenidos mediante ajuste interactivo son: pKa=5.6 y pKa=6.7 en ausencia de cloruro, y pKa=6.2 pKa=7 en presencia de este in. Estos valores podran corresponder como hemos indicado antes al grupo amino N-terminal(pKa=7.5) y el grupo imidazol de una histidina(pka=6.3). Si observamos el articulo de Buoisson et al., sobre la estructura tridimensional de la amilasa pancretica de porcino, descubrimos que los residuos responsables de la actividad cataltica son 2 residuos de aspartico. Este hecho nos deja entrever que puede ser que nuestros resultados pK obtenidos estn influenciados por el entorno aminocido que a ocasionado una variacin significativa de los pK de los residuos determinados. Adems como hemos citado antes, la proximidad de los valores de pK corroborado por la existencia de 2 asparticos responsables de actividad cataltica segn estos autores puede ocasionar interferencias en los valores de pK obtenidos. Sin embargo, podemos pensar tambin que segn Buisson et al., hay residuos de histidina que intervienen en la unin del enzima al sustrato, y que por lo tanto, la distinta ionizacin de este residuo tambin puede causar la variacin de la actividad de la amilasa.

Cuestiones 1- Los grupos ionizables de los que depende la actividad de la enzima, se encuentran necesariamente en el centro activo de la enzima? Justifica tu respuesta. No. Una protena adquiere su estructura nativa activa al obtener un determinado plegado o estructura tridimensional, sin la cual su funcin no tendra lugar. En esta estructura queda determinada adems un ambiente aminoacidico caracterstico. Si esta estructura o conformacin nativa e la protena queda alterada o modificada de algn modo, este hecho quedara reflejado en una disminucin de la actividad. Un ejemplo de ello es la presencia de grupos ionizables, que segn su estado de protonacin-desprotonacin puede conllevar a un cambio en el entorno aminoacidico, as como una alteracin de determinadas interacciones entre diferentes partes de la cadena polipeptidica como las cadenas laterales. Esta alteracin de la actividad de la protena tendra su punto ms sensible en los cambios de ionizacin en aminocidos de superficie o interior proteico, ms bien cercanos al centro activo que ocasione cambios en la conformacin nativa o el ambiente aminoacidico, que conllevan una variacin en la actividad enzimtica. 2- Las curvas de titulacin obtenidas se utilizarn para determinar los valores de pK de los grupos implicados en la actividad de la enzima Permiten estos valores una indudable identificacin de los aminocidos implicados? Pueden presentarse variaciones significativas en estos valores de pK? En qu condiciones? No, no podemos identificar de manera indudable los grupos implicados en la actividad ya que no es lo mismo que el aminocido se encuentre libre o formando part de la protena. El entorno varia y como consecuencia los valores de pk tambin. Los valores de pk determinados en la prctica se dan por tanto de manera aproximada pudiendo deducir que grupos podrn estar implicados en la actividad, aunque no de manera indudable, los valores de pk por tanto, varan conforme cambian las condiciones del entorno. Por ejemplo , un aminocido como un grupo carboxilo en su cadena lateral que est cercano a un grupo amino cargado positivamente (NH3+), tiende a tener todas sus formas en estado desprotonado cargado negativamente (-COO-), debido a la interaccin de sus cargas. Este hecho ocasiona que el pk de este grupo carboxilo disminuya, necesitando un ph ms bajo para que se produzca su protonacion. Lo mismo ocurrira, pero de manera contraria a un grupo amino (NH 3+) cercano a un carboxilo cargado negativamente, el cual necesitara un ph ms alto para desprotonarse. As pues ante determinadas condiciones de pH, y en consecuencia del entorno aminoacidico (aminocidos en determinados estados inicos), se puede provocar variaciones bastante significativas del pk. 3- Los grupos que has determinado con las curvas de titulacin, seran los nicos grupos ionizables localizados en el centro activo de la enzima? Por qu? No. Se destacan contentamente 2 grupos ionizables. En primer lugar el grupo ionizable que ocasiona la actividad repentina del enzima (primer punto de inflexin a pH aproximadamente 5,3 figura 15), pero para que esto tenga lugar se ha tenido que producir la modificacin previa (desprotonacin) de determinados grupos ionizables que ocasionen en conjunto el estado activo de la protena. En la prctica tambin detectamos el grupo ionizable que ocasiona la bajada brusca de la actividad ( segundo punto de inflexin aproximadamente a ph 7.2) pero para que esto ocurra se tiene que dar tambin la modificacin (desprotonacin) de otros residuos que ocasionan el cese de la actividad enzimtica a valores mayores de pk.

4- Qu otros tipos de curvas de variacin de actividad enzimtica frente al pH pueden encontrarse? Relaciona cada uno de ellos con el requerimiento de grupos ionizables para la actividad de la enzima. Podramos obtener variaciones de la actividad con respecto al ph aproximadamente de este tipo:

Actividad en funcin del pH

Vo

pH Este tipo de variacin implica un aumento del ph provoque una disminucin en la actividad enzimtica. Este hecho nos deja entrever que se requieren determinados grupos ionizables protonados para que se de la actividad enzimtica, ya que cuando el pH es inferior al pK tenemos la actividad optima (grupos protonados), y cuando el pH es inferior al pK tenemos la actividad ptima (grupos protonados) y cuando el pH es superior al pK se da el cese de la actividad enzimtica (grupos desprotonados). El otro tipo de variacin de la actividad en funcin del pH sera aproximadamente el siguiente:

Actividad en funcin del pH

Vo

pH Este tipo de variacin implica que un aumento del ph provoque u aumento de la actividad enzimtica. Este hecho nos deja entrever que se requieren determinados grupos ionizables en estado desprotonado, ya que cuando el ph es inferior al pk no se da actividad enzimtica (grupos protonados), y cuando el ph es superior al pK tenemos el ptimo de la actividad enzimtica (grupos desprotonados).

Bibliografa Threee dimensionan estructure of porcine pancratic a-amilasa at 2.9 A resolution.Role of calcium in structure an activity. G.Buisson et al. Cuadernillo prcticas

TITULACIN DE GRUPOS TIOL DEL CENTRO ACTIVO DE LA ALDOLASA Y MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA RESIDUAL.

Resumen Procederemos a estudiar la accesibilidad del los grupos tiol de la aldolasa al reactivo Ellmans, [5,5-ditio-bis(2 nitrobenzoato)] DTNB, cuando la protena se encuentra en distintos niveles de plegamiento por la presencia o no de urea, y la cuantificacin de la actividad enzimtica residual tras la titulacin parcial de los grupos tiol. Realizaremos una medida de la actividad del los grupos tiol en la aldolasa donde estudiaremos la accesibilidad de los residuos de cistena a la modificacin qumica cuando se desnaturaliza la aldolasa en presencia de urea. Tambin analizaremos la cintica de valoracin de grupos tiol y actividad aldolasa residual, donde se cuantificara la actividad de la aldolasa tras la valoracin parcial de los grupos tiol, bajo condiciones suaves de reaccin.

Palabras clave: aldolasa, reactivo Ellmans, DTNB, grupos tiol ,residuos de Cys, urea, centro activo.

Introduccin La reaccin de con reactivos capaces de reaccin qumicamente residuos especficos en las protenas, tiene cierta dificultad. La principal es conseguir que los reactivos sean capaces de actuar en condiciones de reaccin suaves y que, en condiciones ideales, reaccionen especficamente con un nico tipo de residuo. Estos reactivos pueden ser utilizados para analizar la accesibilidad de los residuos en una protena y poder correlacionar, por ejemplo en una enzima, cmo dicho residuo afecta a su actividad. Es decir, si esos residuos pueden encontrarse en el centro activo o ser al menos necesarios para la catlisis enzimtica. Utilizararemsos la aldolasa de msculo de conejo que cataliza la reaccin: D-fructosa-1,6-bisfosfato D-gliceraldehido-3-fosfato + dihidroxiacetona fosfato La aldolasa tiene una masa molecular relativa de 160000 y est formada por 4 cadenas polipeptdicas idnticas. Para medir la actividad aldolasa, la reaccin se puede acoplar a dos reacciones adicionales aadiendo a la mezcla de reaccin dos enzimas suplementarios. Por una parte, la enzima triosafosfato isomerasa, interconvierte las dos triosas fosfato producidas en la reaccin de la aldolasa. Puesto que la cetona predomina en el equilibrio (96:4), la enzima est transformando el gliceraldehido-3-fosfato en dihidroxiacetona fosfato. La segunda enzima accesoria, la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, reduce el grupo oxo generado a grupo alcohol produciendo glicerol-3- fosfato. La reaccin global de los tres enzimas ser por tanto: fructosa-1,6-bisfosfato + 2NADH + 2H+ 2 glicerol-3-fosfato + 2NAD+ Si se aade suficiente cantidad de las enzimas accesorios, la velocidad de la reaccin de la aldolasa estar determinada por la velocidad de oxidacin del NADH. El NADH absorbe fuertemente a 340 nm mientras el NAD+ no absorbe a esta longitud de onda, por tanto, la actividad de la aldolasa se puede medir cuantificando la disminucin de la absorbancia a 340 nm en la reaccin global.

Mtodos y materiales 1. Medida de la reactividad de grupos tiol en la aldolasa Para ello se ponen en la cubeta del espectrofotmetro 800L de agua, 15 L de tampn tris-HCl 1M pH 8.4 y 150 L de DTNB 1 mM. Se ajusta a cero la A412, se aaden 35 L de la disolucin de aldolasa y se mide la variacin de A412 cada 10s durante 4 min. Repetimos el experimento poniendo la disolucin de 8M de urea en lugar de agua. Para transformar la A412 a unidades de concentracin de grupos tiol valorados, se asume que el coeficiente de extincin molar del producto de la reaccin es de 13600 M-1cm-1 a 412 nm, independientemente de la concentracin de urea. Preparamos la dilucin con reactivo de Ellmas: DTNB 1mM (0,4 mg/ml) ms tampo tris-HCL 1M ph 8,4.

Dilucin aldolasa: 4mg/ml en tampn Tris-HCL 5 mM ph=7.5 Volumen total 600l V1C1= V2C2

V1=

, enrasamos hasta 1.2 ml.

Concentracin enzima aldolasa

Mr=160000

n moles= 0.1410-3gr /160000 = 8.7510-10 M Volumen Total= 1 ml

[aldolasa]M=n/V= 8.7510-10/110-3= 8.7510-7 M

2. Cintica de valoracin de grupos tiol y actividad aldolasa residual En este apartado hacemos una valoracin parcial de grupos tiol en condiciones suaves (urea 4M) y una cuantificacin simultanea de la actividad residual de la aldolasa mediante el acople de dos reacciones a la reaccin que queremos estudiar. 1) Para valorar los grupos tiol con el reactivo DTNB, se prepara un tubo con 740 L de urea 4M, 40 L de tampn tris-HCl 1M pH 8.4 y 160 L de aldolasa, se trasfiere a la cubeta de electroforesis,y se ajusta a cero la A412. A continuacin se aaden 60 L de reactivo DTNB 1 mM para iniciar la cintica de valoracin de los grupos tiol y se mide la variacin de absorbancia cada 15s durante 5 min. 2) Por otra parte, para cuantificar la actividad aldolasa residual tras la valoracin de los grupos tiol, se preparan 6 tubos con 74 L urea 4M, 4 L de tampn tris-HCl 1M pH 8.4 y 16 L de aldolasa. Las soluciones preparadas son equivalentes (con 1/10 del volumen de aquel) al tubo con el que se han valorado los grupos tiol. La cintica de valoracin de tioles se lleva a cabo aadiendo a cada tubo 6 L de DTNB 1mM, con lo que se inicia la cintica, y parando la

reaccin por adicin de 500L de tris-HCl 0.1M pH 7.0, EDTA 1 mM a los tiempos 0s (tubo1, control), 15s (tubo2), 30s (tubo 3), 1 min (tubo 4), 2 min (tubo 5) y 5 min (tubo 6) de inicio de reaccin. Debemos de homogenizar la mezcla de la reaccin, agitando inmediatamente despus de aadir cada reactivo. Para valorar la actividad aldolasa presente en estas disoluciones se prepara una mezcla stock de reaccin que contiene y debemso ajustar volumtricamente. 4 mL de tampn tris-HCl 0.3M pH 7.5

5 mL de fructosa-1,6-bisfosfato 5 mM

10 L de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (24 mg/mL)

V1C1= V2C2

V2=

5 L de triosa fosfato isomerasa (7 mg/mL)

V1C1= V2C2

V2=

A continuacin se coloca en el colormetro 1 mL de la mezcla stock de reaccin, se ajusta a cero la A340, se aaden 250 L de NADH 1mM, 200 L de la disolucin de aldolasa tratada con DTNB (t= 0s) y se mide la A340 cada 15s durante 2 min. El proceso se repite con los tubos de la aldolasa tratada con DTNB durante 15s, 30s, 1 min, 2 min y 5 min. La concentracin del enzima ser la siguiente: [E]=((4 mg/ml)/160000g/mol)160/1000=410-6M Resultados y discusin 1. Medida de la reactividad de grupos tiol en la aldolasa El coeficiente de extincin molar del producto de la reaccin es de 13600 M-1cm-1 a 412 nm.

Determinacin Sin urea:

tiempo (s) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240

A412 0.015 0.032 0.039 0.043 0.045 0.047 0.049 0.051 0.053 0.055 0.057 0.058 0.06 0.062 0.063 0.065 0.066 0.069 0.07 0.071 0.072 0.073 0.074 0.076 0.077

[Cys modificada] 1.10294E-06 2.35294E-06 2.86765E-06 3.16176E-06 3.30882E-06 3.45588E-06 3.60294E-06 0.00000375 3.89706E-06 4.04412E-06 4.19118E-06 4.26471E-06 4.41176E-06 4.55882E-06 4.63235E-06 4.77941E-06 4.85294E-06 5.07353E-06 5.14706E-06 5.22059E-06 5.29412E-06 5.36765E-06 5.44118E-06 5.58824E-06 5.66176E-06

nCys/molcula 1.2605042 2.68907563 3.27731092 3.61344538 3.78151261 3.94957983 4.11764706 4.28571429 4.45378151 4.62184874 4.78991597 4.87394958 5.04201681 5.21008403 5.29411765 5.46218487 5.54621849 5.79831933 5.88235294 5.96638655 6.05042017 6.13445378 6.21848739 6.38655462 6.47058824

Cysteinas accesibles en estado nativo

7 6 5 4 3 2 1 0 Tiempo en 10 segundos Tiempo en 4 minutos

Determinacin con urea: tiempo (s) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 A412 0.233 0.237 0.241 0.236 0.236 0.236 0.236 0.236 0.235 0.235 0.234 0.234 0.233 0.233 0.233 0.233 0.233 0.233 0.233 0.234 0.234 0.234 0.233 0.234 0.233 [cys modificada] 1.71324E-05 1.74265E-05 1.77206E-05 1.73529E-05 1.73529E-05 1.73529E-05 1.73529E-05 1.73529E-05 1.72794E-05 1.72794E-05 1.72059E-05 1.72059E-05 1.71324E-05 1.71324E-05 1.71324E-05 1.71324E-05 1.71324E-05 1.71324E-05 1.71324E-05 1.72059E-05 1.72059E-05 1.72059E-05 1.71324E-05 1.72059E-05 1.71324E-05 n cys/molecula 19.5798319 19.9159664 20.2521008 19.8319328 19.8319328 19.8319328 19.8319328 19.8319328 19.7478992 19.7478992 19.6638655 19.6638655 19.5798319 19.5798319 19.5798319 19.5798319 19.5798319 19.5798319 19.5798319 19.6638655 19.6638655 19.6638655 19.5798319 19.6638655 19.5798319

Cysteinas accesibles en estado desnaturalizado

25 20
15 10 5 0 Tiempo10 segundos Tiempo en 4 minutos

En la determinacin sin urea estamos obteniendo las cistenas accesibles en condiciones nativas, que son las de la superficie y las del centro activo. Sin embargo cuando aadimos urea 8 M estamos desnaturalizando la enzima con lo que se puede valorar los grupos tiol del interior ms los valorados antes, es decir los que hay en la protena. Si observamos los datos podemos ver como en la primera valoracin se modifican los grupos tiol poco a poco con el tiempo, primero los del centro activo y luego los de la superficie, ya que tienen distintas constantes de modificacin debido a su distinto entorno. Por el contrario en la valoracin con urea los grupos se modifican mas rpidamente y al mismo tiempo ya que todos estn igual de accesibles al estar la protena desnaturalizada. 2. Cintica de valoracin de grupos tiol y actividad aldolasa residual 2. 1. Valoracin los grupos tiol con el reactivo DTNB Tiempo (s) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 270 285 300 A412 0.344 0.425 0.468 0.505 0.540 0.572 0.601 0.628 0.652 0.674 0.694 0.711 0.728 0.742 0.754 0.784 0.792 0.800 0.807 [Cys modificada] 2.52941E-05 0.00003125 3.44118E-05 3.71324E-05 3.97059E-05 4.20588E-05 4.41912E-05 4.61765E-05 4.79412E-05 4.95588E-05 5.10294E-05 5.22794E-05 5.35294E-05 5.45588E-05 5.54412E-05 5.76471E-05 5.82353E-05 5.88235E-05 5.93382E-05 n cys/molecula 6.32352941 7.8125 8.60294118 9.28308824 9.92647059 10.5147059 11.0477941 11.5441176 11.9852941 12.3897059 12.7573529 13.0698529 13.3823529 13.6397059 13.8602941 14.4117647 14.5588235 14.7058824 14.8345588

Los datos obtenidos se expresan como un porcentaje de actividad aldolasa respecto al control no tratado con DTNB que ser el 100 % de actividad. 2.2 Cuantificacin la actividad aldolasa residual tras la valoracin de los grupos tiol. Tiempo 0 seg
tiempo (s) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Tubo 1 0,360 0,101 0,084 0,083 0,083 0,083 0,083 0,082 0,082 0,400 0,300 A412 0,200 0,100 0,000 0 2 4 6 8 t(s) 10 12 14 16 y = -0,0173x + 0,36 R = 1

Tiempo 0

Tiempo 15 seg
tiempo (s) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Tubo 2 0,459 0,406 0,345 0,281 0,218 0,158 0,106 0,086 0,084 0,500 0,400 A412

Tiempo 15 s

0,300
0,200 0,100 0,000 0 20 40 t(s) 60 80 100 y = -0,004x + 0,4621 R = 0,9992

Tiempo 30 seg
tiempo (s) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Tubo 3 0,397 0,373 0,344 0,313 0,281 0,252 0,221 0,191 0,162

Tiempo 30 seg
0,450 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 0 20 40 60 t(s)

A412

y = -0,002x + 0,4011 R = 0,9994

80

100

120

140

Tiempo 1 min
tiempo (s) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Tubo 4 0,477 0,465 0,452 0,438 0,426 0,414 0,402 0,391 0,379 0,600 0,500 0,400 A412 0,300 0,200 0,100 0,000 0 20

Tiempo 1 min

y = -0,0008x + 0,4766 R = 0,9991

40

60 t(s)

80

100

120

Tiempo 2 min
Tiempo 2 min
tiempo (s) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Tubo 5 0,438 0,428 0,417 0,407 0,395 0,385 0,374 0,362 0,352 0,500 0,450 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 0 20 40 60 y = -0,0007x + 0,4387 R = 0,9997

A412

80

100

120

140

t(s)

Tiempo 5 min
tiempo (s) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Tubo 6 0,460 0,445 0,427 0,409 0,389 0,370 0,351 0,332 0,313 0,500 0,400 A412 0,300 0,200 0,100 0,000 0 20

Tiempo 5 min

y = -0,0012x + 0,463 R = 0,9992

40

60 t(s)

80

100

120

140

Tiempo (s) 0 15 30 60 120 300

n cys/molecula 6.323 7.8125 8.6029 9.9264 11.9852 14.8348

Actividad -0.0173 -0.0040 -0.0020 -0.0008 -0.0007 -0.0012

Actividad % 100 23.12 11.56 4.62 4.05 6.94

16,0000 14,0000 12,0000 % Actividad 10,0000 8,0000 6,0000 4,0000 2,0000 0,0000 0 100 200 Tiempo (s) 120,00 100,00 % Actividad 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 0 100 200 Tiempo (s) 300 300; 6,94 400 % Actividad 300 400 n Cys modif

Segn el artculo de Heyduk et al., la aldolasa de musculo de conejo se compone por 4 subunidades aproximadamente idnticas que forman un tetrmero de 160000 Da. En cada una de las subunidades destacan 4 grupos sulfhdricos (cistenas) expuestos y potros cuatro enterraos en el interior de la protena. Por tanto en el tetrmero encontramos un total de 32 residuos de cistena entre los cuales 16 estaran en el interior hidrofbico y 16 en la regin expuesta de la protena. Heyduk et al. Hablan de una gran flexibilidad conformacional de la aldolasa, en la que la modificacin e interaccin entre los diferentes grupos sulfhdricos afectan de manera importante a la actividad de la protena. Entre estos residuos destacan el residuo Cys239 y el Cys289 localizados fuera dl centro activo, los cuales ejercen un gran efecto sobre la actividad de la protena. El objetivo principal de Hayduk et al. En su experimento fue el de demostrar que la modificacin de residuos que no formaban parte del centro activo de la protena podan afectar al plegamiento y actividad de dicha enzima,

es decir, no son nicamente los residuos situados en el centro activo los principales responsables de la actividad del enzima. Nosotros conseguimos valorar 19 casi 20 de los 32 residuos de cistena en la protena desnaturalizada. De estos residuos 14 (casi 15) estn accesibles en la protena y casi 7 en el interior hidrofbico, esto se deduce a partir de la desnaturalizacin con urea 8 M en la que encontramos 20 residuos frente a la desnaturalizacin gradual con urea 4M, en la que solo conseguimos valorar 15, y de aqu sabemos que hay 7 no accesibles. De los 14 que se encuentran accesibles, podemos suponer que la mayor parte se encuentran en el centro activo, pero no afirmarlo categricamente puesto que como se nos indica el autor del artculo, pueden existir residuos que no estn en el centro activo, y sin embargo sean tan accesibles como estos y modifican la actividad del enzima. En nuestros resultados observamos que para que se origine prcticamente el cese de la actividad enzimtica, se tiene que dar la modificacin de aproximadamente 8 residuos de cistena. Estos 8 residuos corresponderan con las 8 cisteinas esenciales, dentro de las cuales se encontraran las Cys mencionadas anteriormente. La diferencia entre el numero de cistenas que hemos conseguido valorar (aproximadamente 20), y el expuesto en el artculo (concretamente 32) puede ser causada por la mala exposicin de todos los residuos conseguida al desnaturalizar la protena, causando la no interaccin del DTNB con estos. La diferencia en cuanta a numero de residuos de cistena expuestos en la superficie, obtenidos en la prctica (aproximadamente 6) y el encontrado por Heyduk et al. (16 residos), puede ser debida nuevamente a la no interaccin del DTB con estos, o que las condiciones de ensayo no fueran las mejores, causando cierta modificacin de la conformacin tridimensional, ocasionada por su gran flexibilidad, ocasionando el error de la estimacin del numero de residuos de cistena expuestos en la superficie de la protena.

Cuestiones 1.- Cuntos residuos tiol se han podido valorar en la protena? Cuntos grupos tiol es necesario valorar para que la actividad residual aldolasa sea prcticamente cero? Si el nmero de grupos tiol en ambos casos es diferente, Cul puede ser la causa de esa diferencia? En la protena se ha podido valorar casi 20 residuos (19,60), en el experimento con urea 8M ya que en este caso es cuando valoramos todos los grupos tiol de la protena tericamente, al ser un agente desnaturalizante fuerte. La disminucin brusca en la actividad residual aldolasa se produce cuando el nmero de cistenas modificadas por molcula es aproximadamente ocho, que ha de ser una aproximacin a las cistenas presentes en el centro activo del enzima y cuya modificacin afecta a su actividad. El nmero de grupos tiol es distinto debido a que adems de los grupos que afectan a la actividad , que se encuentran en el centro activo, tenemos otras cistenas en diversos sitios de la protena tales como cistenas superficiales que tambin se modifican en diversos sitios de la protena tales como cistenas superficiales que tambin modifican en estado nativo aunque ms tarde que las del centro activo, y otras no accesibles al DNTB por encontrarse en zonas internas de la protena, las cuales no permiten el paso del modificador tanto por restricciones de tamao como por impedimentos de tipo estrico o por efectos de carga, por lo que solo con la protena completamente desnaturalizada es posible que el DNTB acceda a ellas, lo que supondr un aumento de las cistenas que detectamos. 2.- Por qu se necesitan condiciones suaves de reaccin con el DTNB para valorar los grupos tiol que determinan la prdida de la actividad aldolasa Porque el objetico que buscamos es observar cambios graduales en la cintica de valoracin del enzima a la que se le modifican determinados grupos o residuos puntuales, y ver la prdida gradual de actividad para conocer as los residuos del centro activo o que son importantes para que el enzima sea activo. Por ello, como vemos en el caso de urea 8M, en condiciones fuertes la protena se desnaturaliza completamente y no sabemos que residuos afectan al centro activo ya que se modifican todos, mientras que en el caso de de no poner urea solo veremos aquellos residuos a los que el DTNB pueda acceder, que no tienen por qu ser todos los implicados en la actividad del enzima, adems de no apreciar la perdida completa de actividad por no poder valorar algunos residuos. Por todo ello, unas condiciones suaves ayudan a ver como se pierde la actividad progresivamente y a valorar por tanto la relacin entre residuos modificaos y a funcionales y la prdida de actividad pudiendo de esta forma determinar cuntos residuos son necesarios para que el enzima sea funcional.

Bibliografa

Long-range Effects and Conformational Flexibility of Aldolase. Tomasz Heyduk, Ryszard Michalczykg, and Marian Kochman. Cuadernillo de prcticas