INSTITUTO DE AGROQUMICA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS (IATA)

Control de calidad y seguridad de la carne y productos crnicos curados mediante el uso de sensores enzimticos

Tesis Doctoral
Presentada por:
Aleida Selene Hernndez Czares

Dirigida por:
Prof. Dr. Fidel Toldr Vilardell Dra. M Concepcin Aristoy Albert
Valencia, Octubre de 2010

MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACION

INSTITUTO DE AGROQUMICA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS (IATA)

D. Fidel Toldr Vilardell, Profesor de Investigacin del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC) en el Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (IATA) y Da. M Concepcin Aristoy Albert, Investigador Titular de OPIs del el mismo Instituto, HACEN CONSTAR: Que el trabajo de investigacin titulado Control de calidad y seguridad de la carne y productos crnicos curados mediante el uso de sensores enzimticos que presenta Da. ALEIDA SELENE HERNNDEZ CZARES para optar al grado de Doctor por la Universidad Politcnica de Valencia, ha sido realizada bajo su direccin y supervisin en el Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos, reuniendo las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor.

Valencia, 1 de Octubre de 2010

Fdo. Prof. Dr. Fidel Toldr Vilardell

Fdo. Dra. M Concepcin Aristoy Albert

www. iata.csic.es

APARTADO DE CORREOS, 73 46100 BURJASSOT (VALENCIA) ESPANA TEL.: +34 96 390 00 22 FAX.: +34 96 363 63 01 Acda. Agustn Escandino, 7 46980 PATERNA (VALENCIA)

Resumen
Inmediatamente despus del sacrificio del animal, se inician en la carne un gran nmero de cambios bioqumicos que son crticos para definir el desarrollo de la calidad. La evaluacin de algunos metabolitos derivados de estos procesos ha sido propuesta como mtodo rpido y simple para determinar la calidad de la carne y de los productos crnicos. Actualmente, la tcnica ms utilizada en la deteccin de estos compuestos es la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). Sin embargo, el creciente inters de la industria, especialmente del sector alimentario, por realizar un control de calidad ms rpido y econmico, demanda mtodos analticos que sean compatibles con sus necesidades y que puedan ser usados en lnea. En este contexto, el desarrollo de sensores enzimticos de tipo amperomtrico juega un papel muy importante y suponen una herramienta til en el control de la calidad y la seguridad alimentaria. En la presente Tesis Doctoral se han desarrollado dos sensores enzimticos, utilizando principios simples de construccin, para su aplicacin en la determinacin de hipoxantina (Hx) y aminas bigenas (AB), como marcadores de frescura, maduracin y seguridad, en la carne y en productos crnicos (embutido fermentado y jamn curado). El sensor enzimtico consisti de un oxmetro en combinacin de una enzima libre o inmovilizada. Las enzimas utilizadas fueron la xantina oxidasa (XO) para la determinacin de Hx y la diamina oxidasa (DAO) para la determinacin de AB. Adems, los sensores enzimticos fueron validados, correlacionando sus resultados con los obtenidos por HPLC, como mtodo de referencia. Cabe destacar que se desarroll un nuevo mtodo rpido de anlisis de nucletidos y sus derivados basado en la cromatografa lquida de interaccin hidroflica (HILIC), siendo este una alternativa muy interesante a los mtodos ya existentes.

Abstract

Immediately after the animal is slaughter, a large number of biochemical changes in the meat take place, which are critical to characterise the quality development. The evaluation of some metabolites derived from these processes has been proposed as a rapid and simple method to determine the quality of meat and meat products. Currently, the high performance liquid chromatography (HPLC) is the technique commonly used in the detection of these compounds. However, the demands of the food industry for a rapid and cheap quality control require analytical methods that can be used on-line. In this sense, enzyme-based amperometric biosensors play a very important role and mean a useful tool for quality control and food safety. In the present Thesis, two enzyme sensors using simple principles of construction have been developed to determine hypoxanthine (Hx) and biogenic amines (BA), as markers of freshness, ripeness and safety in meat and meat products (fermented sausage and cured ham). The enzyme sensor consisted of an oximeter in combination with a free or immobilized enzyme. The enzymes xanthine oxidase (XO) and diamine oxidase (DAO) were used for the determination of Hx and BA, respectively. Furthermore, enzymatic sensors were validated, by correlating their results with those obtained by HPLC as reference method. In addition, a new rapid method for analysis of nucleotides and their derivatives was developed based on hydrophilic interaction chromatography (HILIC), which could be used as a very interesting alternative to current methods.

Resum

Immediatament desprs del sacrifici de l'animal, s'inicien en la carn un gran nombre de canvis bioqumics que sn crtics per tal de definir el desenvolupament de la qualitat. L'avaluaci d'alguns metabolits derivats d'aquestos processos ha estat proposada com a mtode rpid i simple per tal de determinar la qualitat de la carn i dels productes crnics. Actualment, la tcnica ms emprada en la detecci d'aquests compostos s la cromatografia lquida d'alta resoluci (HPLC). No obstant aix, el creixent inters de la indstria, especialment del sector alimentari, per realitzar un control de qualitat ms rpid i econmic, demanda mtodes analtics compatibles amb les seves necessitats i que puguen ser utilitzats en lnia. En aquest context, el desenvolupament de sensors enzimtics de tipus amperomtric juga un paper molt important i suposa una ferramenta til en el control de la qualitat i la seguretat alimentria. En la present Tesi Doctoral s'han desenvolupat dos sensors enzimtics, utilitzant principis simples de construcci, per a la seua aplicaci en la determinaci de hipoxantina (Hx) i amines bigenes (AB), com a marcadors de frescor, maduraci i seguretat, en la carn i en productes crnics (embotit fermentat i pernil curat). El sensor utilitzat va consistir en un oxmetre en combinaci amb l'enzim lliure o immobilitzada. Les enzimes utilitzades van ser la xantina oxidasa (XO) per a la determinaci de Hx i la diamina oxidasa (DAO) per a la determinaci de AB. A ms, els sensors enzimtics van ser validats, correlacionant els seus resultats amb els obtinguts per HPLC, com a mtode de referncia. Cal destacar que es va desenvolupar un nou mtode rpid d'anlisi de nucletids i derivats basat en la cromatografia lquida d'interacci hidroflica (HILIC), sent aquest una alternativa molt interessant als mtodes ja existents.

A mis padres

Agradecimientos
A mis directores, el Dr. Fidel Toldr Villardel y la Dra. M Concepcin Aristoy Albert, por darme la oportunidad de realizar esta Tesis, confiar en m y apoyarme en todo momento. El ms profundo y sincero agradecimiento por su valiosa ayuda en mi formacin profesional e investigadora. Al Colegio de Postgraduados (C.P.) y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) de Mxico por la beca otorgada y hacer posible la realizacin de mis estudios de Doctorado. Asimismo, agradezco al Ministerio de Ciencia e Innovacin de Espaa, atravs del proyecto AGL-2007-65379-C02-01 y al proyecto Agroalimed de la Consellera de Agricultura, Pesca y Alimentacin la financiacion recibida para la realizacin de este trabajo. A la Dra. Mnica Flores, al Dr. Miguel ngel Sentandreu y al Dr. Jose Luis Navarro por su colaboracin y su disponibilidad a resolver mis inquietudes. Al personal Tcnico del laboratorio de Carnes, M Pilar, Maribel y M Angeles, y a todos aquellos estudiantes de prcticas y proyectos de fin de carrera, por su ayuda y buenos momentos que compartimos. A mis compaeros de laboratorio, para quienes ya se han ido y para los que se quedan, que durante estos aos han compartido conmigo su amistad y me han brindado sus consejos y apoyo: Alicia, Eli, Susana, Patricia, Mnica, Liliana, Sara y Carlos. A Leticia Mora por su amistad, ayuda y colaboracin en el desarrollo de este trabajo. A mis hermanos Edna e Ivn y mis sobrinos Zaid, Axel, Aleida y Camila, porque a pesar de la distancia, el nimo y alegrias que me brindan me dieron la fortaleza para continuar y seguir adelante.

A mis amigos: Rogelio, Mayte, Joel Ramn, Cynthia, Marcela, Thalia y Guillermo por estar siempre ah, aunque en la distancia a lo largo de este proceso, su apoyo, nimo y consejos fueron de gran ayuda para m. A Adriana, Rocio y Carlos por su amistad, confianza, apoyo y sobre todo por esos buenos momentos y experiencias compartidas durante mi estancia en esta ciudad.

A todos mi agradecimiento!

ndice

NDICE
1. Introduccin.. 1.1. Calidad de la carne de cerdo y sus productos crnicos.. 1.1.1. Carne....................................................................................................................... 1.1.2. Embutidos curados fermentados........................................................................ 1.1.2.1. Importancia del proceso de fabricacin.... 1.1.3. Jamn curado........ 1.1.3.1. Importancia del proceso de fabricacin....................... 1.2. Principales cambios bioqumicos en la carne y productos crnicos curados durante la maduracin.. 1.2.1 Gluclisis............ 1.2.2.Proteolisis ......... 1.2.3. Liplisis........... 1.2.4. Transformacin de nucletidos y nuclesidos................................. 1.2.5. Generacin de aminas bigenas..... 1.2.6. Otros cambios debidos a reacciones qumicas... 1.3. Mtodos analticos para la determinacin de nucletidos y sus derivados y de aminas bigenas en la carne y productos crnicos............................ 1.3.1. Nucletidos y sus derivados..... 1.3.2. Aminas bigenas.............................................................................................. 1.4. Biosensores.... 1.4.1. Clasificacin de los biosensores por su elemento de reconocimiento... 1.4.1.1. Biosensores catalticos.. 1.4.1.2. Biosensores por afinidad.. 1.4.2. Clasificacin de los biosensores por su tipo de transduccin... 1.4.2.1. Biosensores electroqumicos. 1.4.2.2. Biosensores pticos... 1.4.2.3. Biosensores trmicos... 1.4.2.4. Biosensores piezoelctricos.. 35 35 37 38 39 39 40 40 40 43 44 44 17 17 19 24 26 30 33 3 4 4 9 10 12 14

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1.4.3. Sensores enzimticos.............................................................................................. 1.4.3.1. Inmovilizacin de la enzima 1.4.3.1.1. Materiales soporte para la inmovilizacin de la enzima 1.4.3.1.2. Materiales de construccin del transductor 1.4.3.2. Principio de operacin.. 1.4.4. Aplicacin de los sensores enzimticos en el sector crnico....... 2. Objetivos.. 3. Plan de Trabajo.... 4. Materiales y Mtodos........... 4.1. Materiales... 4.1.1. Materias Primas..... 4.1.2. Reactivos qumicos.. 4.1.3. Instrumentacin.. 4.2. Mtodos de fabricacin, seguimiento y obtencin de muestras 4.2.1. Maduracin de la carne 4.2.2. Fabricacin del embutido fermentado curado. 4.2.3. Fabricacin del jamn curado..... 4.3. Mtodos analticos. 4.3.1. Extraccin de nucletidos y sus derivados. 4.3.2. Determinacin de nucletidos y sus derivados por HPLC 4.3.2.1. Anlisis en carne 4.3.2.1.1. Cromatografa en fase reversa con par inico (IP-RP-HPLC). 4.3.2.1.2. Cromatografa de interaccin hidroflica (HILIC).. 4.3.2.2. Anlisis en productos curados.... 4.3.2.2.1. Cromatografa en fase reversa (RP-HPLC). 4.3.2.3. Rectas de calibrado..... 4.3.3. Determinacin de hipoxantina con el sensor enzimtico.. 4.3.3.1. Sistema enzimtico con la enzima libre

45 48 49 51 51 53 63 67 73 73 73 74 76 77 77 78 80 83 83 84 84 84 84 86 86 87 88 90

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4.3.3.1.1. Evolucin de la reaccin enzimtica..... 4.3.3.2. Sistema enzimtico con la enzima inmovilizada.... 4.3.3.2.1. Inmovilizacin de la enzima xantina oxidasa... 4.3.3.3. Ensayos de validacin del sensor enzimtico.. 4.3.4. Extraccin de aminas bigenas. 4.3.5. Determinacin de aminas bigenas en productos curados por IP-RPHPLC y derivatizacin post-columna.. 4.3.6. Determinacin de aminas bigenas con el sensor enzimtico... 4.3.6.1. Inmovilizacin de la enzima diamina oxidasa............................ 4.3.6.2. Ensayos de validacin del sensor enzimtico...... 4.4. Anlisis estadstico de resultados.................................. 5. Resultados y Discusin...................................... 5.1. Puesta a punto y optimizacin del sensor enzimtico. 5.1.1.Sensor enzimtico con la enzima xantina oxidasa... 5.1.1.1. Sistema enzimtico con la enzima libre... 5.1.1.2. Sistema enzimtico con la enzima inmovilizada. 5.1.1.3. Estudio de la oxidacin de la hipoxantina.. 5.1.2. Sensor enzimtico con la enzima diamina oxidasa. 5.1.2.1. Inmovilizacin de la enzima diamina oxidasa.... 5.2. Evolucin nucletidos y sus derivados analizados por HPLC en la carne y productos crnicos.... 5.2.1. Maduracin de la carne.. 5.2.1.1. Evolucin de nucletidos y sus derivados por IP-RP-HPLC............... 5.2.1.2. Optimizacin del mtodo cromatogrfico HILIC.. 5.2.1.2.1. Carne fresca.. 5.2.1.2.2. Productos crnicos 5.2.2. Proceso de curado de un embutido fermentado.......................... 5.2.2.1. Evolucin de los parmetros fisicoqumicos.... 5.2.2.2. Evolucin de nucletidos y sus derivados por RP-HPLC..

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5.2.3. Proceso de curado de jamn... 5.2.3.1. Evolucin de los parmetros fisicoqumicos.... 5.2.3.2. Evolucin de nucletidos y sus derivados por RP-HPLC.. 5.3. Determinacin de hipoxantina con el sensor enzimtico y su correlacin con los valores obtenidos por anlisis cromatogrfico........ 5.3.1. Maduracin de la carne....... 5.3.2. Proceso de curado de un embutido fermentado............................... 5.3.3. Proceso de curado de jamn...... 5.4. Determinacin de la generacin de aminas bigenas en los productos crnicos por HPLC... 5.4.1. Embutidos fermentados curados... 5.4.2. Jamn curado. 5.5. Determinacin de aminas bigenas en los productos crnicos analizados con el sensor enzimtico y su correlacin con HPLC. 5.5.1. Embutidos fermentados curados...... 5.5.2. Jamn curado. 6. Conclusiones.... 7. Bibliografa. 8. Anexos. A. Hypoxanthine-based enzymatic for determination of pork meat B. Hydrophilic interaction chromatographic determination of adenosine
triphosphate and its metabolites .

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C. Hydrophilic interaction chromatographic (HILIC) in the analysis of relevant

quality and safety biochemical compounds in meat, poultry and processed meats...

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D. Nucleotides and its derivated compounds during the processing of dry-cured

ham and its detection with an enzyme sensor..

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Lista de figuras

Lista de figuras
Figura 1 Diagrama de flujo de la elaboracin de embutidos crudos curados fermentados.... 2 Diagrama de flujo de la elaboracin del jamn curado... 3 Proceso de gluclisis en condiciones aerobias y anaerobias.. 4 Esquema general de la proteolisis y las reacciones de transformacin de los aminocidos libres..... 5 Esquema general de la liplisis... 6 Estructura qumica de los nuclesidos y nucletidos.... 7 Esquema de la degradacin del ATP en el msculo post-mortem. 8 Ruta metablica de la formacin de aminas bigenas. 9 Esquema genrico de un biosensor... 10 Esquema general de un biosensor ptico.... 11 Esquema general de un transductor termomtrico... 12 Secuencia de una reaccin de oxidacin catalizada por una enzima oxidasa empleando oxgeno molecular como aceptador de electrones 13 Esquema del Oximetro Mod. 20 Rank Brothers Ltd.... 14 Esquema del montaje de las membranas en el sensor de oxgeno.. 15 Respuesta del sensor enzimtico en el sistema con la enzima libre representada como oxgeno consumido en funcin del tiempo de reaccin. 18.72 M de Hx en tampn fosfato 50 mM, pH 7.6 a 30 C y 0.0169 U de xantina oxidasa..... 16 Efecto del pH sobre la velocidad de reaccin de la enzima xantina oxidasa determinado en el sensor enzimtico con la enzima libre. 20 L de patrn de Hx (1 mM), en tampn fosfato sdico a diferentes pH, 0.0169 U de XO a 30C... 17 Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reaccin de la enzima xantina oxidasa determinada por HPLC con la enzima libre 18 Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reaccin de la xantina oxidasa determinado en el sensor enzimtico con la enzima libre. 20 L de patrn de Hx (1mM), en tampn fosfato pH 7.6, 0.0169 U de XO a diferentes temperaturas... Pgina 11 16 19 20 24 26 28 32 39 44 44 47 77 89

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Curva de calibrado de hipoxantina en el sensor enzimtico con la enzima libre. (Consumo de oxgeno (mg 02/L) a 190 s frente a la concentracin de Hx (mM))..... Estabilidad de la xantina oxidasa en disolucin en almacenamiento a 4 C Curva de calibracin de hipoxantina en el sensor enzimtico con la enzima -1 xantina oxidasa inmovilizada. (Consumo de oxgeno (mg 02/L s ) a 10 s frente a la concentracin de Hx (mM))... Estabilidad de operacin de la membrana de xantina oxidasa () 0-30 inyecciones () 31-50 y ( ) 51-70 inyecciones... Estabilidad de la membrana de xantina oxidasa almacenada a 4 C. () Curva de calibracin de hipoxantina durante dos meses (n=5 membranas) () Curva de calibracin de hipoxantina despus de tres meses. Evolucin de la reaccin de oxidacin de hipoxantina en presencia de la enzima xantina oxidasa a 30 C y medida por HPLC... Respuesta del sensor enzimtico representado por el consumo de oxgeno acumulado () y el cambio de corriente () en funcin del tiempo de reaccin en un patrn de histamina (0.02 mg/mL) en tampn fosfato 100 mM, pH 7.4 a 30 C.... Evaluacin de la selectividad de la diamina oxidasa (DAO) en el sensor enzimtico con patrones de histamina (HI), putrescina (PU), cadaverina (CA), tiramina (TY), SD spermidina (SD), spermina (SM) a una concentracin de 0.01 mg/mL en tampn fosfato 100 mM, pH 7.4 a 30 C Efecto del pH sobre la seal de respuesta de la enzima diamina oxidasa inmovilizada en el sensor sobre la histamina y putrescina a una concentracin de 0.02 mg/mL utilizando un tampn fosfato 100 mM, pH 7.2 a 30 C.... Respuesta del sensor enzimtico de un extracto crnico del msculo Semimembranosus de jamn (O das) enriquecido con patrn de histamina en cido perclrico neutralizado a diferentes concentraciones a 30 C. Estabilidad de la diamina oxidasa inmovilizada en almacenamiento a 4 C en tampn fosfato 100 mM, pH 7.2... Cromatograma de IP-RP-HPLC correspondiente al anlisis de muestras de carne de cerdo (Longissimus dorsi) a 5 (lnea contina) y 9 (lnea quebrada) horas post-mortem. Evolucin de nucletidos y sus derivados en el msculo Longissimus dorsi durante el proceso de maduracin....

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Cromatogramas correspondiente al anlisis de muestras de carne de cerdo (Longissimus dorsi) a 5 horas (A) y a 27 horas (B) post-mortem. Hipoxantina (Hx), inosina (Ino), adenosn monofosfato (AMP), dinucletido de nicotinamida adenina (NAD+), inosina 5 monofosfato (IMP), adenosn difosfato (ADP) y el adenosn trifosfato (ATP). ... Cromatograma correspondiente a la separacin de los patrones de los analitos estudiados junto con la creatinina (Cn), cido rico (AU), guanosina (G), guanosn monofosfato (GMP), guanosn difosfato (GDP) y guanosn trifosfato (GTP) ..... Correlacin entre el mtodo HILIC y el mtodo IP-PR-HPLC con respecto a las concentraciones de los analitos estudiados. La lnea continua indica la correspondencia perfecta (x=y) y la lnea quebrada las correlaciones obtenidos tras el anlisis... Cromatograma correspondiente al anlisis de jamn curado de 11 meses por HILIC usando una columna ZIC-pHILIC (Sequant, 4.6 x 150 mm, 5m). Cn (creatinina), Hx+X (hipoxantina+xantina), Ino (inopina), G (guanosina) . Evolucin de las prdidas de peso (nitrito () nitrato ()) contenido de humedad (nitrito ( ) nitrato ( )) y temperatura (lnea continua) durante el proceso de curado de los embutidos fermentados.... Poblacin de estafilococos (nitrito () nitrato ()), bacterias cido lcticas (nitrito ( ) nitrato ( )) y evolucin del pH ( nitrito y nitrato) durante el proceso de curado de los embutidos fermentados... Cromatograma de RP-HPLC correspondiente al anlisis de una muestra de un embutido fermentado de 24 das de curado (lnea continua) y la separacin del patrn de xantina (X) (lnea quebrada). Creatinina (Cn), hipoxantina (Hx) y xantina (X). La deteccin se realiz a 254 nm, 236 nm (creatinina) y 270 nm (xantina) .. Evolucin de nucletidos y sus derivados durante el proceso de fermentacin, maduracin, secado y almacenamiento envasado al vaco de embutidos fabricados con nitrito () o nitrato ().. Evolucin de la humedad en el msculo semimembranosus durante el proceso de curado de jamn con tres diversas formulaciones de la sal. 100 % del NaCl, FI (), 50 % NaCl y 50 % KCl, FII () y 55 % NaCl, 25 % KCl, 15 % CaCl2 y 5 % MgCl2, FIII ( )...

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Evolucin del pH en el msculo semimembranosus durante el proceso de curado de jamn con tres diversas formulaciones de la sal. 100 % del NaCl, FI (), 50 % NaCl y 50 % KCl, FII () y 55 % NaCl, 25 % KCl, 15 % CaCl2 y 5 % MgCl2, FIII ( )..... Evolucin de nucletidos y sus derivados en el msculo semimembranosus durante el proceso de curado de jamn usando tres diversas formulaciones de la sal. 100 % del NaCl, FI (), 50 % NaCl y 50 % KCl, FII () y 55 % NaCl, 25% KCl, 15 % CaCl2 y 5 % MgCl2, FIII ().. Evolucin del contenido de hipoxantina durante el proceso de maduracin en carne de cerdo (Longissimus dorsi) obtenida por HPLC y el sensor enzimtico en el sistema con la enzima libre e inmovilizada.. Correlacin entre el contenido de hipoxantina obtenida por HPLC y el sensor enzimtico en el sistema con la enzima libre e inmovilizada en muestras de carne de cerdo (Longissimus dorsi) a distintos tiempos post-mortem.. Evolucin del contenido de hipoxantina durante el proceso de curado de un embutido fermentado obtenido por HPLC y el sensor enzimtico en el sistema con la enzima libre e inmovilizada.. Correlacin entre el contenido de hipoxantina obtenida por HPLC y el sensor enzimtico en el sistema con la enzima inmovilizada durante el proceso de curado de un embutido fermentado. () seal directa del sensor (Hx+X) y () seal ajusta da (Hx) ... Evolucin del contenido de hipoxantina + xantina en el jamn curado (100 % del NaCl, FI (), 50 % NaCl y 50 % KCl, FII ()) durante el proceso de curado obtenido por HPLC y el sensor enzimtico con la enzima inmovilizada. Formulacin I (100 % del NaCl) y formulacin II (50 % NaCl y 50 % KCl) . Correlacin entre el contenido de hipoxantina + xantina durante el proceso de curado del jamn obtenida por HPLC y el sensor enzimtico con la enzima inmovilizada en jamn curado. () 100 % NaCl, FI y () 50 % NaCl y 50 % KCl, FII.... Evolucin del contenido total de aminas bigenas durante el proceso de curado de un embutido fermentado fabricado con adicin de nitrito () o nitrato ()... Evolucin de aminas bigenas en el embutido fermentado durante el proceso de curado en presencia de nitrito () o nitrato ()...

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Evolucin de aminas bigenas en el msculo Semimembranosus durante el proceso de curado de jamn usando tres diversas formulaciones de sal. 100 % del NaCl, FI ( ), 50 % NaCl y 50 % KCl, FII ( ) y 55 % NaCl, 25 % KCl, 15 % CaCl2 y 5 % MgCl2, FIII ( ).. Correlacin entre el contenido de aminas bigenas obtenida por HPLC y el sensor enzimtico DAO durante el proceso de curado de un embutido fermentado con nitrito () o nitrato ().... Correlacin entre el contenido de aminas bigenas totales en jamones curados de 11 meses obtenida por HPLC y el sensor enzimtico DAO..

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ndice de tablas

ndice de Tablas
Tablas 1 Clasificacin de calidad de la carne de cerdo.. 2 Categoras de calidad de carne en funcin del pH, color y prdidas por goteo. 3 Tipos de jamn curado en el mundo 4 Clasificacin de enzimas segn el tipo de reaccin que catalizan 5 Sensores enzimticos utilizados para evaluar los ndices de frescura y/o maduracin de pescado y carne.. 6 Sensores enzimticos utilizados para determinar hipoxantina en pescado y carne.. 7 Sensores enzimticos para la determinacin de aminas bigenas en pescado y carne....... 8 Selectividad de la enzima diamina oxidasa segn su fuente de extraccin 9 Ingredientes y aditivos usados en la fabricacin del embutido fermentado curado..... 10 Tratamientos de salado propuestos en el estudio de nucletidos y sus derivados y aminas bigenas en jamn curado... 11 Condiciones de fase mvil y gradiente en el anlisis de nucletidos y sus derivados en carne fresca por IP-RP-HPLC.... 12 Condicin de fase mvil y gradiente en el anlisis de nucletidos y sus derivados en carne fresca por HILIC.... 13 Condiciones de fase mvil y gradiente en el anlisis de nucletidos y sus derivados en productos curados por RP-HPLC..... 14 Gradiente de fase mvil para el anlisis de aminas biognas por IP-RP-HPLC y derivatizacin post-columna... 15 Resultados de validacin del sensor enzimtico en ambos sistemas, libre e inmovilizada...... 16 Recuperacin de la hipoxantina en muestras de lomo de cerdo (Longissimus dorsi) de 7 horas post-mortem en el sensor enzimtico con la enzima inmovilizada...... 17 Tiempos de retencin y rectas de calibracin obtenidos en el anlisis de los patrones de hipoxantina (Hx), inosina (Ino), adenosn monofosfato (AMP), dinucletido de nicotinamida adenina (NAD+), inosina 5 monofosfato (IMP), adenosn difosfato (ADP) y adenosn trifosfato (ATP) ..... Pgina 7 8 14 46 55 56 58 59 79 81 84 85 87 95 115

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ndice de tablas

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Limite de deteccin (LD), repetibilidad y reproducibilidad calculados en muestras de lomo de cerdo de 5 horas post-mortem.... Recuperacin de los analitos estudiados en muestras de lomo de cerdo de 5 horas post-mortem... Concentracin de perxido de hidrgeno (H2O2) en muestras de embutido fermentado curado, fabricados solo con nitrito sin la adicin de especias y en un proceso de fermentacin lenta. ....

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1. Introduccin

Introduccin

1. Introduccin
El valor nutritivo de la carne de cerdo la seala como uno de los alimentos ms completos y de gran importancia en la dieta humana, debido en gran parte a su aporte en protenas de alto valor biolgico (18-20 g protena/100 g de carne) con un alto contenido en aminocidos esenciales, lpidos (5-10 %), carbohidratos (1 %) y minerales (1 %). Se estima que 100 g de carne de cerdo cubren el 7 % de las recomendaciones de ingesta diaria de hierro, 11 % de potasio 6 % de magnesio, 15 % de zinc, adems de ser una fuente importante de fsforo y vitamina B1 (Schweigert, 1994). Sin embargo, durante muchos aos la carne de cerdo ha tenido una imagen equivocada (alimento pesado, graso, con muy alto contenido en caloras y colesterol y asociado a enfermedades cardiovasculares y parsitos). Ante esta situacin, los productores de carne y la industria crnica en los ltimos aos han buscado la manera de obtener productos que minimicen los riesgos para el consumidor. En principio mediante la seleccin gentica de los animales para producir ms carne y menos grasa y/o modificando los procesos tecnolgicos para mejorar las caractersticas nutritivas de los productos crnicos a fin de mejorar su imagen y adaptarse a las necesidades del mercado (menos grasa, menos sal). Sin embargo, estas acciones han dado lugar a la aparicin de defectos de calidad de la carne que afectarn a su aptitud para ser transformada en productos elaborados de calidad y a su conservacin. Por todo ello, la deteccin rpida de este tipo de defectos es fundamental para determinar el destino de la carne y/o el control del proceso para definir la calidad del producto.

En Espaa, la produccin de carne de cerdo fue de 3,290.566 miles de toneladas en 2009 (Subdireccin General de Estadstica del Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino MARM, 2009), del cual el 58 % se destin al consumo en fresco y el resto a la industria crnica. Adems, cuando se habla de carne porcina se distinguen dos tipos, la proveniente del cerdo blanco y la del cerdo ibrico. En el

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primero de ellos se obtiene un mayor rendimiento de canal y su carne resulta ms magra, mientras que el cerdo ibrico es alimentado con bellotas y se destina principalmente a la industria de jamones y embutidos de calidad. La produccin de embutidos curados en 2006 represent el 15.40 % de la produccin de elaborados crnicos con una produccin de 193 mil toneladas (Asociacin de la Industria de la Carne de Espaa AICE, 2006), siendo el salchichn y el chorizo los productos ms importantes. Mientras que la produccin de jamn y paleta curados en los ltimos 10 aos se ha incrementado en un 42.20 %, lo que implica un consumo per cpita de 5 Kg (Cruz, 2007). Debido a la importancia que tiene la carne de cerdo y sus productos derivados es importante conocer el proceso qumico y bioqumico que tienen lugar durante su maduracin y curado, por las implicaciones que tiene estos en el desarrollo de la calidad y seguridad.

1.1. Calidad de la carne de cerdo y sus productos crnicos.

1.1.1. Carne La carne segn el Cdigo alimentario Espaol se define como la parte comestible de los animales sanos sacrificados en condiciones higinicas. En general, la composicin de la carne se establece durante la vida del animal, mientras que su calidad se ve fuertemente afectada por factores ante-mortem y post-mortem. Aunque, la importancia de los diferentes aspectos cualitativos de la calidad de la carne difiere en funcin del segmento de la cadena crnica en que se analice (produccin, industrializacin o comercializacin).

Los atributos organolpticos son de gran importancia para el consumidor cuando se habla de carne fresca. El consumidor asocia como atributos de calidad de la carne el color (intensidad y coloracin), la terneza, la jugosidad, la apariencia (grasa intramuscular, marmorizacin, exudacin), el sabor y el aroma. Mientras que la industria centra ms la atencin en factores como pH, la capacidad de retencin de

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agua (CRA), textura, estabilidad oxidativa y ausencia de sabores anmalos. Estos atributos estn influenciadas por factores como la raza, la edad, la dieta, el manejo ante-mortem, los procesos de matanza y las prcticas de manejo post-mortem, las caractersticas intrnsecas del msculo y tejido conectivo, intensidad de proteolisis post-mortem en las clulas musculares y temperatura de coccin de la carne. En general, para definir la calidad de la carne y sus productos crnicos se deben considerar las cualidades que constituyen el valor sensorial (calidad organolptica) y nutritivo (calidad nutritiva) que junto con una serie de propiedades funcionales necesarias en el procesado y la fabricacin de los productos crnicos se incluye la calidad tecnolgica y la calidad higinico-sanitaria.

Desde el punto de vista bioqumico, la carne es el resultado de una serie de transformaciones y reacciones bioqumicas que tienen lugar en el msculo tras la muerte del animal, que definirn en gran parte la calidad de la carne. El proceso de conversin de msculo a carne se lleva a cabo en tres fases. La fase de demora del rigor o pre-rigor, comprende el tiempo, tras el sacrificio del animal en que las protenas del msculo todava no han sufrido cambios y el msculo an es estirable y elstico; en cerdo vara de 15 minutos a 3 horas. La fase de rigor mortis que consta a su vez de dos etapas, el acortamiento de los sarcmeros (formacin de enlaces entrecruzados entre filamentos finos y gruesos) y la rigidez (tensin continua de las fibras musculares). As, en esta fase se forma el complejo proteico actina/miosina por agotamiento del ATP (adenosn trifosfato), se produce cido lctico y el msculo se vuelve duro (Andujar et al., 2003). Finalmente en la fase de resolucin o maduracin, la extensibilidad de los msculos se recupera y la carne sufre un proceso de ablandamiento paulatino (Ouali y Sentandreu, 2002). Durante esta ltima etapa, la textura y el sabor mejoran sustancialmente despus de un perodo de almacenamiento en temperatura de refrigeracin (Vzquez y Vanaclocha, 2004). Aunque, dependiendo de la velocidad con que se lleve a cabo el metabolismo post-

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mortem, la carne de cerdo puede experimentar una gran variedad de cambios que definirn su calidad y esto tiene un gran impacto econmico durante su venta como carne fresca o procesada. La temperatura a la cual se almacenan las canales de los animales recin sacrificados influye de manera definitiva en la velocidad con que ocurren dichas reacciones qumicas. Sin embargo, el cambio de pH durante la transformacin post-mortem del msculo a carne es posiblemente la causa ms importante de la variacin existente en la calidad, afectando sustancialmente al color y a la capacidad de retencin de agua (CRA), atributos importantes desde el punto de vista tecnolgico.

Por lo tanto en funcin de cmo sucede el proceso de maduracin post-mortem, la carne se ha clasificado en cuatro grandes categoras de calidad (PSE, RSE, DFD, RFN) (Kauffman et al., 1992), como se describen en la tabla 1. En este contexto, la deteccin rpida de la calidad de la carne es de suma importancia para la industria ya que esto permite optimizar las condiciones de procesamiento y distribucin. Los msculos Longissimus dorsi y Semimembranosus son los ms susceptibles a sufrir problemas de PSE y hace que stos tengan una menor aceptacin por su apariencia (Bravo-Sierra et al., 2005). Adems, la carne PSE no resulta apropiada, por su escasa capacidad de retencin de agua, para la elaboracin de jamn cocido extra (separacin de gran cantidad de gelatina) ni para elaborar jamn curado (elevadas prdidas por secado, mayor absorcin de sal, color plido y escaso aroma) (Arnau et al., 1995). En cambio, la carne DFD es apropiada para productos del tipo emulsin crnica (mortadelas y salchichas) y jamones cocidos, pero tampoco es aconsejable para fabricar jamn curado (especialmente peligroso en el caso de jamones con hueso) debido a su poca difusin de sal (Flores y Bernell, 1984), su fcil alteracin microbiana ya que presentan texturas anmalas y precipitados de fosfato (Arnau et al., 1998).

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Tabla 1. Clasificacin de calidad de la carne de cerdo. Categora de calidad/Caractersticas PSE del ingls: Pale, soft and Exudative = Plida, blanda y exudativa Este tipo de carne se caracteriza porque sufre una cada rpida de pH despus del sacrificio que combinada con una elevada temperatura provoca la desnaturalizacin de aproximadamente el 20 % de las protenas sarcoplasmticas y miofibrilares, por consiguiente la disminucin de la CRA. Esta condicin hace a la carne altamente exudativa, le da una apariencia plida al desnaturalizarse la mioglobina y una textura blanda, poco apetecible para los consumidores. La causa principal de la aparicin de este tipo de carne se asocia con la susceptibilidad hereditaria del estrs porcino (PSS, por sus siglas en ingls Porcine Stress Syndrome), relacionado con la presencia del gen recesivo Halotano (asociado a hipertrofia muscular) y del gen Rendement Napole (RN), presentndose con mayor frecuencia en canales de animales mejorados genticamente, para obtener un mayor rendimiento o desarrollo muscular. Aunque otros factores de manejo tanto del animal vivo (transporte, manejo violento, sacrificio con aturdimiento defectuoso) como de la canal inmediatamente despus del sacrificio (enfriamiento deficiente) pueden influir en la incidencia y magnitud de esta condicin. DFD del ingls: Dark, firm and dry = Oscura, firme y seca Carne tpica de animales sometidos a situaciones de estrs moderado pero prolongado en el tiempo (transportes inadecuados en grandes distancias o ayunos largos), lo que hace que las reservas de glucgeno antes del sacrificio sean mnimas. El valor de pH se mantiene alto (> 6.0) debido a que el msculo no tiene suficiente sustrato (glucgeno) para utilizar en la gluclisis anaerobia y no se produce cido lctico o se produce en muy poca cantidad. Presenta una alta retencin de agua al estar el pH alejado del punto isoelctrico de las protenas musculares, la mioglobina se desnaturaliza en menor medida provocando una carne oscura y son muy sensibles a contaminacin microbiana lo que hace difcil su conservacin bajo refrigeracin. RFN del ingls: Red, firm and non-exudative = Roja, firme y no exudativa Calidad de carne que se considera como la ideal, se trata de una carne roja, firme y normal. Esta caracterstica la hacen adecuada tanto para el consumo en fresco como para la fabricacin de productos crnicos. RSE del ingls: Reddish-pink, soft and exudative = Rojiza-roscea, blanda y exudativa Esta carne se caracteriza por tener niveles de desnaturalizacin de protena y prdidas por goteo similares a las carnes PSE pero esta mantiene una coloracin caracterstica, debido posiblemente a un enfriamiento rpido de la canal despus del sacrificio o por disposicin gentica.

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Actualmente, los mtodos ms usados para clasificar y predecir las diferentes calidades de la carne de cerdo en las plantas de sacrificio son la medicin de pH, el color y las prdidas por goteo (drip loss) (Kauffmann et al., 1993; Warner et al., 1997; Flores et al., 1999). Aunque todos estos mtodos poseen una justificacin bioqumica ninguno de ellos por s solo es suficiente para asegurar la correcta clasificacin de las distintas calidades de la carne, por lo que se propone la combinacin de varios de ellos como se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Categoras de calidad de carne en funcin del pH, color y prdidas por goteo.
Categora
PSE RSE RFN DFD

pH
pH2h < 5.8 pH2h < 5.8 pH2h > 5.8 pH24h < 6.0 pH24h > 6.0

Color (Brillo-L)
L > 50 44 L 50 44 L 50 44 < L

Prdidas por goteo (%)

>6% >6% <6% <3%

(Modificado de Flores et al., 1999).

Por otro lado, a fin de mejorar la prediccin de la calidad de carne, nuevos ensayos bioqumicos han sido correlacionados con la calidad de la carne a fin de obtener una clasificacin ms adecuada. Flores et al., (2000) proponen el anlisis de determinadas fracciones peptdicas a las 2 horas post-mortem para predecir y discriminar entre carnes exudativas y no exudativas. Mientras que Toldr y Flores, (2000) sugieren el anlisis de la actividad de las exo-proteasas (dipeptidil-peptidasa y amino-peptidasas) a las 2 y 24 horas post-mortem para predecir la calidad de la carne. Asimismo, Tsai et al., (1972); Honikel y Fischer, (1977) y Batlle et al., (2000), tras el sacrificio del animal, han detectado que el ATP se degrada ms rpido en msculos PSE y ms lento en DFD que en msculos normales, esta observacin ha constituido la base para el desarrollo de distintos mtodos de deteccin postmortem de la calidad de la carne (descritos en el apartado 1.2.4.). Recientemente, Castro-Girldez et al., (2010), analizaron los cambios en las propiedades dielctricas

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de la carne durante su maduracin demostrando que esta tcnica es til para discriminar carne PSE y DFD a las 24 horas post-mortem. 1.1.2. Embutidos curados fermentados. Los embutidos curados son productos tradicionales de inestimable valor gastronmico, que se originaron probablemente en la cuenca mediterrnea (Lcke, 1994) y se definen como aquellos derivados, preparados a partir de carnes autorizadas, picadas o no, sometidos a procesos de curacin, adicionados o no de despojos comestible y grasas de cerdo, productos vegetales, condimentos y especias e introducidos en tripas naturales o artificiales. Las caractersticas sensoriales (color, textura, sabor y aroma) del producto final vienen definidas por complejas transformaciones qumicas y enzimticas (musculares y microbianas) de los hidratos de carbono, protenas y lpidos de la masa crnica inicial, todas ellas moduladas por las condiciones fsicas concretas en las que se lleva a cabo el proceso, as como por el efecto de las especias y de los agentes de curado. Los microorganismos desempean un papel decisivo en la fabricacin de los embutidos fermentados, si la materia prima es de buena calidad higinica y se mantienen las condiciones de maduracin adecuadas se pueden fabricar embutidos tradicionales de excelente calidad. Sin embargo, la microbiota inicial de la masa crnica (bacterias cido lcticas (BAL) y Micrococcaceas) en general es muy heterognea por lo que el uso de cultivos iniciadores o starters ha sido una prctica industrial muy utilizada para obtener una mayor homogeneidad, estabilidad y seguridad (Leistner, 1992).

El color es una propiedad sensorial muy importante en estos productos ya que influye en gran manera en su aceptacin por parte de los consumidores. La presencia de nitrito, ascorbato o de microbiota con actividad nitratorreductasa (Micrococcaceae) favorecen la formacin de nitrosomioglobina, otorgndole al embutido el color caracterstico. El desarrollo de la textura se debe a la acumulacin

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de cido lctico, producto de la fermentacin de carbohidratos. Como consecuencia de esto, el pH desciende hasta valores que se aproximan al punto isoelctrico de las protenas miofibrilares reduciendo su CRA con el consecuente incremento de la firmeza de la masa crnica (Gimeno et al., 1999). Mientras que el aroma y sabor son resultado de una combinacin equilibrada entre los compuestos voltiles (alcohol, acetonas, aldehdos y furanos) y no voltiles (aminocidos, pptidos, azucares y nucletidos) procedentes de las materias primas o generados a partir de las reacciones bioqumicas (proteolisis y liplisis) que suceden durante la maduracin (Flores et al., 1997; Toldr, 1998; Fadda et al., 2002).

La amplia variedad de embutidos crudos curados fermentados que existen en el mercado radica en una tecnologa de fabricacin flexible que permite modificaciones siempre que se mantengan las reducciones adecuadas de pH y actividad de agua (aw). La figura 1 muestra el diagrama de flujo general del proceso de elaboracin. Las diferencias y excepciones utilizadas en la industria se basan en la realizacin de un estufaje (perodo de incubacin) ms o menos intenso al que se somete la pasta crnica recin embutida, provocando que la fermentacin pueda ser ms lenta o ms rpida en funcin de la adicin o no de azcares, cultivos iniciadores y algunos otros aditivos (Rncales, 1994). 1.1.2.1. Importancia del proceso de fabricacin. Durante el proceso de fabricacin, la carne y la grasa deben tener un grado de picado ptimo para evitar una consistencia muy blanda. La grasa aporta a los embutidos caractersticas importantes en el desarrollo de la calidad sensorial (jugosidad, untuosidad, suavidad, aroma y sabor); sin embargo, sta debe agregarse lo ms fresca posible, debido a la susceptibilidad que tiene para oxidarse, causando enranciamiento de los lpidos y, por tanto, de los olores, sabores y colores que lo caracterizan (Roncals, 1994).

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Figura 1. Diagrama de flujo de la elaboracin de embutidos crudos curados fermentados.

La sal adems de ser un ingrediente que mejora el sabor, proporciona cierto efecto antimicrobiano al provocar un descenso inmediato de la actividad de agua (aw=0.96) que restringe las condiciones de desarrollo de algunos microorganismos indeseables. Desde el punto de vista tecnolgico ejerce un papel primordial en la ligazn de la pasta ya que favorece la solubilidad de las protenas miofibrilares del msculo, y con ello el desarrollo de la textura (Lcke, 1994). Los azcares fermentables (glucosa o sacarosa), como sustrato para el crecimiento microbiano (BAL), generan cido lctico con el subsiguiente descenso de pH. El compuesto activo de las sales de curacin es el nitrito (aadido directamente o proveniente de la reduccin de nitrato) acta como agente antimicrobiano, inhibiendo la formacin

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y el crecimiento de Clostridium botulinum, contribuye a la formacin del color caracterstico del curado (por formacin del complejo nitrosomioglobina) y previene la oxidacin de los componentes lipdicos al igual que el ascorbato. Las cantidades legalmente autorizadas en Espaa son de 150 ppm para el nitrito y 330 ppm para el nitrato y las cantidades residuales no deben superar los 50 y 250 ppm, respectivamente (Real Decreto 142/2002 BOE 20/2/2002). Las especias se adicionan como potenciadores del sabor y por su actividad antioxidante (pimienta negra y jengibre) y antimicrobiana (ajo). El cultivo iniciador constituido principalmente por BAL (Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus) crece rpidamente durante la fermentacin (108-109 u.f.c./g) y se mantiene prcticamente estables hasta el final del secado. Las BAL son agentes esenciales en la fermentacin de la carne mejorando la calidad higinica y sensorial del producto final. Su metabolismo fermentativo impide el deterioro y desarrollo de microbiota patgena por la acidificacin del producto, contribuye a la estabilizacin del color y mejora la textura (Fadda et al., 2010). La presencia o la adicin de cultivos iniciadores que contengan adems bacterias pertenecientes a la familia Micrococcaceae (Kocuria varians, Staphylococcus carnosus y xylosus) es muy importante por su actividad nitrato reductasa que es la responsable de la reduccin del nitrato a nitrito, contribuye a la reduccin del nitrito residual y poseen actividad catalasa para la proteccin del color y prevencin de la rancidez. Los mohos (Penicillium) que se aaden sobre la superficie de la tripa de los embutidos metabolizan los cidos orgnicos y ejercen desaminacin oxidativa de los aminocidos produciendo amonio que eleva el pH de los embutidos y potencia el aroma y sabor tpicos (Marchesini et al., 1992).

1.1.3. Jamn curado El jamn curado, definido por el Cdigo Alimentario Espaol como un producto crnico elaborado mediante la salazn en seco con posterior desecacin y maduracin, de la extremidad posterior del cerdo, seccionada por la snfisis-pubiana,

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que conserva todos sus huesos, msculos, tejido adiposo de infiltracin, vasos y nervios, as como una porcin variable de la piel y el tejido adiposo de revestimiento, constituye uno de los productos tradicionales ms importantes de la carne de cerdo, tpicos de la gastronoma espaola. Debido a la demanda de este producto en los ltimos aos, la elaboracin del jamn curado tradicional ha pasado a ser mayoritariamente industrial, introduciendo la mecanizacin del proceso y el uso de secaderos con control de temperatura y humedad relativa. De este modo, se puede producir jamn curado en cualquier poca del ao y en cualquier zona geogrfica. As, numerosas variedades de jamn curado se han desarrollado a lo largo del mundo (Tabla 3). Espaa es el pas con el mayor reconocimiento gastronmico en este producto, con la presencia de dos tipos de jamn curado, cuya clasificacin la marca la raza de los cerdos de los que proviene: jamn procedente de cerdo ibrico y jamn procede de cerdo blanco. Al primero de ellos se le considera como el jamn curado de mxima calidad, debido a que presenta una excelente calidad sensorial, aunque ms del 80 % de la produccin de jamn se elabora de jamones y paletas de cerdo blanco.

El jamn presenta un color rojizo que se debe a la interaccin qumica del xido ntrico (formado por la reduccin del nitrito) y mioglobina para formar nitrosomioglobina, compuesto estable al calor pero muy lbil a la oxidacion. La textura depender de varios factores tales como el grado de secado durante el proceso, del alcance de la proteolisis, y del contenido en grasa y tejido conectivo (Toldr, 2006b).

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Tabla 3. Tipos de jamn curado en el mundo.

Pas Espaa Jamn curado Jamn Ibrico (cerdo Ibrico) De cebo De cebo campo De recebo De bellota Jamn Serrano (Cerdo Blanco) Bodega Reserva Gran reserva Portugal Jamn Chaves Jamn Ibrico alentejano Italia Jamn de Parma Jamn San Daniele Jamn de Carpegna Jamn de Toscana Jamn de Venecia Jamn de Bayonne Jamn de Corsica Jamn Fenalar Jamn Spekeskinke Jamn ahumado 3-5 3-5 3-9 3-6 3-6 Jamn ahumado Jamn ahumado 12 - 18 9 - 18 Duracin de proceso (meses) 24-36 Comentarios Denominacin de origen (DOP)1: Jamn de Huelva, Los Pedroches, Jamn de Guijuelo y Dehesa de Extremadura. Denominaciones comerciales: Jamn de Pata Negra, Jamn de Jabugo o Jamn 5J 9 - 18 9 - 12 15 mas de 15 DOP: Jamn de Teruel. Indicacion de Origen Protegida (IGP): Jamn de Trevlez. Especialidad Tradicional Garantizada (ETG)2: Jamn de Chato murciano o Jamn de cerdo Duroc Jamn de Pata Blanca Jamn Ibrico puro DOP. Barrancos. Jamn de Pata Negra DOP: Jamn de Parma DOP: Prosciutto di San Daniele

Francia Noruega

9 - 12 24

Alemania Jamn Schinken Jamn Westphalian Jamn Katenschinken USA China

1 2

Country-style Ching Hua Yunnan

Las DO estn protegidas legalmente por el Reglamento Europeo (CE) n 510/2006 del Consejo de la Unin Europea Regulado por el Reglamento comunitario 2082/92

Modificado de Toldr, 2002.

1.1.3.1. Importancia del proceso de fabricacin. La calidad del jamn curado est condicionada en gran medida por la materia prima utilizada para su produccin, la cual es afectada directamente por factores ante-mortem (raza, edad, tipo de alimentacin, condiciones previas al sacrificio, cantidad de grasa, capacidad proteoltica, etc), post-mortem (refrigeracin, congelacin, etc) y del proceso tecnolgico aplicado. El pH es un parmetro importante para seleccionar el jamn adecuado al proceso (eliminado aquellos con un pH mayor de 6.20). El uso de jamones congelados facilita la disolucin de la sal en la superficie, la migracin hacia el interior y probablemente el transporte de agua

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hacia el exterior, aunque tambin facilita la cristalizacin de tirosina durante la maduracin, dando lugar a un mayor numero de pintas blancas (Arnau et al., 1994). En particular, la cantidad de grasa y el peso del jamn definirn el tiempo de procesado. La presencia de grasa infiltrada y una cierta cantidad de grasa superficial frena el proceso de secado, confiriendo una sensacin untuosa en la boca y un sabor muy apreciado (Arnau, 1998).

El proceso de fabricacin del jamn curado (Figura 2) comprende bsicamente cuatro etapas importantes: pre-salado, salado, post-salado y secado/maduracin (que puede incluir una fase de estufaje y una de bodega), que tras el curado y como consecuencia de mltiples reacciones qumicas y bioqumicas reguladas por la temperatura, humedad y tiempo de curado, facilitan el desarrollo del color, textura y sabor caractersticos (Toldr, 1998). El pre-salado consiste en la adicin de una mezcla de sal con las sales de curado (nitrito y nitrato) y en algunas ocasiones ascorbato y azcar mediante masajeado para facilitar la penetracin de esa mezcla y se lleve a cabo la nitrificacin. El salado debe realizarse cuando el jamn alcanza una temperatura de 1-3 C, ya que a esta temperatura se logra inhibir el desarrollo de microorganismos anaerobios alterantes y potencialmente patgenos (Clostridium botulinum) y, se produce la paulatina deshidratacin del jamn (Toldr, 2002). La sal contribuye a la disminucin de la actividad de agua, a la solubilizacin parcial de las protenas miofibrilares, y al sabor caracterstico. Entre los procedimientos ms utilizados en Espaa de salado por va seca se distinguen el apilado de los jamones (mximo 6) recubiertos de sal y la aplicacin de una cantidad fija de sal por Kg. de jamn y el salado en cubos o contenedores que son procesos ms higinicos. Adems se ha propuesto la impregnacin de sal al vaco como mtodo de salado (Barat et al., 1998). La distribucin homognea de la sal absorbida en la etapa de salado se desarrolla en una etapa de post-salado al tiempo que se inicia el proceso de deshidratacin del producto. Finalmente, en la etapa de secado-maduracin se

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logra la estabilizacin del producto, alcanzando una prdida de peso alrededor del 32-36 % y la intensidad de la proteolisis y liplisis que condicionan el aroma se incrementan (Toldr, 1998 y 2002).

Figura 2. Diagrama de flujo de la elaboracin del jamn curado.

Actualmente la tendencia por parte de los consumidores es demandar productos elaborados bajos en sal, debido a que la ingesta excesiva de sal (ms de 6 g/da/persona) est estrechamente asociada con la hipertensin y, en consecuencia un mayor riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares (Ruusunen y Puolane, 2005). Algunos estudios encaminados a reducir el contenido en sal (Andrs et al.,

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2004) y/o el tiempo de salado (Arnau et al., 1997) o a substituir el NaCl por otras sales (Blesa et al., 2008) han sido desarrollados en este tipo de productos. Sin embargo, la principal dificultad surge porque estas acciones pueden alterar la bioqumica de proceso, la cual es muy importante para el correcto desarrollo de la textura y el sabor.

1.2. Principales cambios bioqumicos en la carne y productos crnicos curados durante la maduracin.
Durante la maduracin de la carne y los productos crnicos curados ocurren una serie de cambios bioqumicos que son esenciales para el desarrollo de la calidad ya que gran variedad de enzimas permanecen activas en el msculo post-mortem e intervienen en mltiples vas metablicas. Las ms importantes estn relacionados con el metabolismo de los hidratos de carbono (enzimas glucolticas) en el proceso de la gluclisis, con la degradacin de las protenas (endopeptidasas y exopeptidasas) en el proceso de proteolisis, con la hidrlisis de triglicridos y fosfolpidos (lipasas y fosfolipasas) en el proceso de liplisis y finalmente con la transformacin de los nucletidos (Toldr, 2006a). Todas las reacciones ocurren de forma simultnea con mayor o menor preponderancia segn las condiciones concretas de cada proceso.

1.2.1. Gluclisis El ATP es la fuente principal de energa para el proceso de contraccin y relajacin en el msculo vivo, tras el sacrificio el mecanismo aerobio de obtencin de ATP cesa, por lo que es necesario obtenerla a partir del metabolismo celular va gluclisis anaerobia, fosforilacin oxidativa a partir de la degradacin irreversible de la creatina fosfato (CP) o de la condensacin de dos molculas de ADP (adenosn difosfato) (Toldr, 2006a). La gluclisis es la ruta principal en el metabolismo de la glucosa o del glucgeno para sintetizar el ATP en condiciones aerobias o anaerobias,

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como se muestra en la figura 3. En condiciones aerobias este proceso consiste en una serie de diez reacciones enzimticas catablicas o degradativas en presencia de enzimas endgenas (glucohidrolasas), que convierten la glucosa en cido pirvico (piruvato) y se lleve acabo la respiracin celular. Al momento de la muerte del animal, el mayor cambio que experimenta el msculo tiene que ver con esa sntesis energtica. El aporte de oxgeno derivado de la circulacin sangunea al tejido muscular se interrumpe, la respiracin celular se paraliza y surge la sntesis anaerobia de energa con un rendimiento mucho menor en la generacin de ATP. El msculo anaerobio no puede mantener su nivel normal de ATP y la gluclisis postmortem provoca la reduccin del cido pirvico en presencia de la enzima lactato deshidrogenasa a cido lctico, con la consecuente disminucin de pH en el msculo. El descenso de pH hace que las protenas miofibrilares se aproximen a sus puntos isoelctricos y se desnaturalicen. La desnaturalizacin va acompaada de una reducida capacidad de retencin de agua de las protenas (CRA), fenmenos causantes de la exudacin y por ende de la aparicin de las diversas calidades de carne, como ya se ha descrito en el apartado 1.1.1.

En los productos fermentados se dan adems reacciones glucolticas de origen exgeno. Los hidratos de carbono adicionados sirven de sustrato para el crecimiento de los microorganismos presentes o los adicionados en los cultivos iniciadores y su fermentacin produce acido lctico que resulta tambin en una cada de pH. La intensidad de acidificacin depender en gran parte del tipo de BAL presentes en el cultivo iniciador, la cantidad de carbohidratos aadidos y de la temperatura de fermentacin (Toldr, 2008).

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Figura 3. Proceso de gluclisis en condiciones aerobias y anaerobias.

1. Hexoquinasa o glucoquinasa, 2. Fosfoglucoisomerasa, 3. Fosfofructoquinasa, 4. Fructosa1,6-bis-fosfato aldolasa, 5. Triosa-fosfato isomerasa, 6. Gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa, 7. Fosfoglicerato quinasa, 8. Fosfoglicerato mutasa, 9. Enolasa, 10. Piruvato quinasa, 11. Lactato deshidrogenasa

1.2.2. Proteolisis La proteolisis es un proceso bastante complejo en el cual participan dos grandes grupos de enzimas; la proteasas de tipo endopeptidasas (-calpana (I), m-calpana (II), catepsinas B, D, H y L y proteosoma) y las exopeptidasas (Tri-peptidilpeptidasas I y II, dipeptidilpeptidasas I, II, III y IV, carboxipeptidasas y alanil-, arginil-, metionil-, leucil-, y piroglutamil- aminopeptidasas) (Toldr y Flores, 1998). Las endopeptidasas son las enzimas responsables de la degradacin de las protenas miofibrilares principalmente y en menor grado de las sarcoplsmicas, generando fragmentos

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proteicos y peptdicos que van a servir de sustrato a las exopeptidasas (Toldr y Flores, 1998; Toldr, 2006b), las cuales hidrolizan las cadenas peptdicas a partir de sus extremos terminales. Las peptidasas son las responsables de la generacin de di y tripptidos, mientras que las aminopeptidasas y carboxipeptidasas liberan aminocidos libres (Figura 4). Estos compuestos son la base para el desarrollo de nuevas reacciones qumicas (reaccin de Maillard y/o degradacin de Strecker), importantes en el desarrollo del sabor y aroma, como se describir ms adelante.

Figura 4. Esquema general de la proteolisis y las reacciones de transformacin de los aminocidos libres. (Modificado de Toldr, 2002).

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Carne El ablandamiento o terneza de la carne durante la maduracin es debida principalmente a la degradacin de las protenas que constituyen la estructura muscular. Esta ruptura proteica es debida a la accin sinrgica de las peptidasas endgenas que incluyen a las calpanas, catepsinas, proteosoma y las caspasas (Toldr, 1998; Santandreu et al., 2002, Toldr y Aristoy, 2010), aunque la actividad de estas enzimas puede variar dependiendo de la gentica, la edad de los animales, el tipo de msculo y de las condiciones de procesamiento de la carne (Toldr, 1998). Algunos autores han estudiado ampliamente los cambios post-mortem de las protenas musculares con el fin de mejorar la calidad de la carne (Maltin et al., 2003; Koohmaraie y Geesink., 2006; te Pas et al., 2009; Kemp et al., 2010). Las calpanas han sido consideradas las responsables principales de la proteolisis de la carne en los primeros das post-mortem al degradar las protenas de la lnea Z. Su activacin inicia como respuesta a la liberacin de iones Ca2+ (al descender el pH durante el perodo post-mortem) a bajas concentraciones para las calpanas I (50 a 70 M), mientras que altas concentraciones (5 mM) son requeridas para activar la calpana II. Sin embargo, ambas enzimas se ven reguladas por una tercera protena denominada calpastatina. Existen evidencias que la relacin calpastatina/calpana puede ser un buen indicador para pronosticar la dureza o blandura de la carne (Koohmaraie, 1994). Mientras que las catepsinas (B, D, H y L), que se encuentra en los lisosomas, se activan al descender el pH durante el perodo post-mortem y han sido relacionadas con la degradacin autoltica de la estructura miofibrilar al ser capaces de hidrolizar miosina, actina, nebulina, titina, tropomiosina, troponina T y colgeno.

Productos crnicos curados (embutido fermentado y jamn curado) Las reacciones proteolticas que ocurren durante el proceso de curado de embutidos fermentados y jamn curado han sido estudiadas extensamente (Flores et al., 1997; Toldr y Flores, 1998; Toldr, 2006b; Toldr, 2008). La proteolisis es la

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transformacin con mayor impacto en estos productos debido a que afecta directamente la percepcin sensorial de los mismos, al producir un incremento en la concentracin de pptidos y aminocidos, que estn estrechamente relacionados con el sabor e indirectamente con el aroma (Nishimura, 2002), adems de tener un impacto sobre la textura al ser responsable de la hidrlisis de las protenas miofibrilares (Toldr y Flores 1998). Segn qu aminocido, base o pptidos predominen en el producto, ste puede ser ms dulce (glicina, alanina, serina, treonina, lisina, prolina, hidroxiprolina, glucosa, fructosa, ribosa), salado (glutamanto y aspartato), amargo (creatina, creatinina, hipoxantina, anserina, carnosina, fenilalanina, arginina, metionina, histidina, valina, leucina, isoleucina, triptfano y tirosina), cido (cido asprtico, glutmico, succnico, lctico, etc) o umami (glutamato, IMP y pptidos) (Toldr, 1994).

En los embutidos fermentados, estos cambios se deben tanto a la actividad de las enzimas endgenas como a la de las enzimas procedentes de microorganismos exgenos nativos o adicionados (cultivos iniciadores) (Sanz et al., 1999 y 2002; Toldr, 2008). Aunque la hidrlisis primaria de la protenas a polipptidos es realizada mayoritariamente por las enzimas musculares endgenas. Las BAL y los micrococcus, tienen cierta actividad proteoltica y pueden contribuir a la degradacin de las protenas musculares, en mayor medida sobre las protenas miofibrilares. Incluso, se ha sealado que la enzimas intracelulares (amino, di- y tripeptidasas) de Lactobacillus son las responsables de la generacin de pequeos pptidos y aminocidos que contribuyen al proceso, ya sea como potenciadores del sabor o como precursores de otros compuestos aromticos durante la maduracin de los embutidos crudos curados (Sanz et al., 2002). Los agentes de curado y las condiciones de proceso (temperatura, pH, duracin del proceso) en estos productos actan como reguladores de la actividad de la exopeptidasas (Sanz et al., 2002). El pH controla en mayor grado la hidrlisis, los embutidos fermentados con pH ms

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cidos (4.60) se caracterizan por una alta concentracin de pptidos y poca produccin de amoniaco, debido en gran medida a la catepsina D, que es activa a pH cidos. La sal (2-3 %) inhibe parcialmente a las catepsinas pero activa a las calpanas y aminopeptidasa B. Durante el secado y maduracin se incrementa el contenido de los pptidos de bajo peso molecular y los aminocidos libres (Toldr y Flores, 1998; Toldr et al., 2000) que mediante reacciones qumicas y/o enzimticas como la descarboxilacin, desaminacin, deaminacin y transaminacin se generan compuestos voltiles y no voltiles de gran importancia en el desarrollo del aroma y sabor de estos productos (Figura 4). Adems, en presencia de bacterias de deterioro inducirn en gran medida la descarboxilacin de los aminocidos, produciendo aminas bigenas (ver apartado 1.2.5.).

En el jamn curado, la proteolisis es uno de los grupos de reacciones bioqumicas ms importantes en la generacin del aroma y sabor durante el procesado. El tiempo de maduracin y procesado es mucho mas largo (12-24 meses) lo que hace que la rotura de la estructura miofibrilar sea mucho ms intensa y completa dando lugar a una gran cantidad de aminocidos libres y pptidos pequeos (Aristoy y Toldr, 1995). Las calpanas estn activas tan solo en las primeras semanas (etapa de post-salado) mientras que las catepsinas (B, H y L) son muy estables y se mantienen hasta 15 meses a lo largo de todo el proceso (Toldr et al., 1993). El descenso de la actividad de agua (aw < 0.84) que se produce durante el secado del jamn, provoca una disminucin de la actividad de las catepsinas (Toldr et al., 1992). As, la mayor parte de los aminocidos libres que se generan son resultado de la accin de las aminopeptidasas (Toldr et al., 1997), aunque estas se ven inhibidas por la acumulacin de los aminocidos libres al final del proceso (Flores et al., 1998). Sin embargo, la accin de estas enzimas depender en gran medida de la temperatura y del tiempo de maduracin, el grado de secado, la cantidad de sal y el pH.

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1.2.3. Liplisis La liplisis es un conjunto de reacciones enzimticas que suponen la hidrlisis de los lpidos musculares o del tejido adiposo, separando los cidos grasos de las molculas de glicerol de los triglicridos (lipasas) e hidrolizando los enlaces ster de los fosfolpidos (fosfolipasas) (Toldr, 2006a). El resultado final de la accin de ambos grupos de enzimas consiste en la generacin de numerosos cidos grasos libres (Figura 5), tanto saturados como mono y poliinsaturados, que posteriormente se relacionan con procesos de oxidacin qumica o enzimtica, contribuyendo al aroma del producto (Estvez et al., 2009).

Figura 5. Esquema general de la liplisis (Toldr, 2002).

Carne En el msculo las enzimas ms importantes son la lipasa cida lisosomal, que hidroliza los tri-, di- y monoglicridos y tiene un pH ptimo comprendido entre 4.5 y 5.0 y las fosfolipasas A1 y A2 que catalizan la hidrlisis de los fosfolpidos. Otras enzimas lipolticas musculares de menor importancia son la lipasa neutra y la lipasa monoglicrida, responsables de la generacin de cidos. Las enzimas principales del tejido adiposo son la lipasa sensible a hormona, la lipasa lipoproteica, la esterasa cida y la esterasa neutra (Toldr y Flores, 1998).

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Embutido fermentado curado En la elaboracin de embutidos curados fermentados donde la grasa es uno de los componentes mayoritarios se observa una intensa liplisis (Navarro et al., 1997) que puede deberse a la actividad enzimtica endgena (destacando la lipasa cida lisosomal) o aquella de origen bacteriano (Micrococcaceae, hongos y levaduras). Durante la liplisis se generan cidos grasos libres que influyen de manera directa con el sabor (ligera acidez) e indirectamente con el aroma a travs de procesos de oxidacin que conduce a la generacin de sustancias tales como aldehdos, cetonas, alcoholes, steres y alcanos (Marco et al., 2006; Toldr, 2008). Aunque estas enzimas muestran buena estabilidad durante los procesos de secado (Toldr, 2006b), su estabilidad depender del pH, contenido de sal, temperatura de maduracin y actividad de agua (Toldr, 2008).

Jamn curado En el jamn curado la hidrlisis enzimtica de los lpidos ocurre a dos niveles: a) sobre el tejido adiposo afectando principalmente a los triglicridos generando di y monoglicridos, liberando una gran cantidad de cidos grasos libres (Motilva et al., 1993) y, b) sobre la grasa intramuscular, actuando sobre los lpidos que se encuentran en el interior del msculo, los cuales constan de triglicridos y fosfolpidos, aunque a este nivel la hidrlisis ocurre principalmente sobre estos ltimos. As, las fosfolipasas actan sobre los fosfolpidos rompiendo sus enlaces para generar cidos grasos libres (Motilva et al., 1993), los cuales son posteriormente oxidados y pueden considerarse como precursores importantes de un buen aroma, siempre y cuando no se supere la intensidad que la haga negativa por predominar los olores y sabores rancios. Durante la maduracin del jamn las lipasas musculares (cida lisosomal y neutral) demuestran una gran estabilidad permaneciendo activas a los 15 meses de proceso. (Toldr y Flores, 1998).

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1.2.4. Transformacin de nucletidos y nuclesidos Los nuclesidos son las molculas resultantes de la unin de una base nitrogenada (purina o pirimidina) y una molcula de azcar (ribosa o desoxirribosa), mediante un enlace N-glucosdico. Las bases pirimdicas incluyen al uracilo, citosina, y timina, mientras que las base pricas incluyen a la adenina, guanina, hipoxantina y xantina. Los nucletidos son los esteres fosfricos de los nuclesidos al formase por la unin de estos con una molcula de cido fosfrico en forma de in fosfato (PO43). El ATP (adenosn trifosfato), fuente principal de energa de la clula utilizada en una gran variedad de reacciones metablicas, es el nucletido mayoritario en msculo vivo y se forma por la unin de una base nitrogenada de adenina con una ribosa y tres fosfatos (Figura 6). Tras la muerte del animal, la concentracin de ATP se reduce y sta es la principal causa de la instauracin del rigor mortis en la carne (Greaser, 1986).

Figura 6. Estructura qumica de los nuclesidos y nucletidos (Modificado de Aristoy et al., 2010)

La degradacin del ATP ocurre rpidamente, por accin de enzimas endgenas del msculo, como se observa en la figura 7, dando lugar a la acumulacin de ADP (adenosn difosfato) y AMP (adenosn monofosfato). El ADP, resultado de la actividad ATPasa, es refosforilado a ATP a partir de la fosfocreatina (CP) por la enzima creatina-quinasa o por gluclisis anaerobia degradando al glucgeno. Sin embargo, con el tiempo post-mortem se van agotando estas reservas y el ciclo de

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contraccin-relajacin se detiene hasta llegar a un estado de contraccin sostenida por la formacin irreversible del complejo actiomiosina. Posteriormente el AMP es desaminado a IMP (inosn 5monofosfato), el cual se descompone en inosina (INO) y posteriormente a hipoxantina (Hx) (Burns y Ke, 1985). La oxidacin de la Hx a xantina (X) y cido rico (AU) es un proceso lento y participan tanto enzimas autolticas como microbianas (Surette et al., 1988). Paralelo a este proceso, aunque en menor medida, ocurre la degradacin de la guanosina monofosfato (GMP) a guanosina (GUA) y guanina (G), la cual es desaminada y contribuye tambin a la formacin de X y AU (Urich, 1990).

El anlisis de estos compuestos ha sido propuesto como mtodo rpido y simple para determinar la frescura y calidad de la carne durante los primeros momentos post-mortem. Incluso, se han desarrollado mtodos rpidos para la evaluacin postmortem de la carne. Uno de los mtodos, hace uso del denominado valor R, que consiste en medir la relacin entre las absorbancias a 250 y 260 nm, para distinguir entre PSE y DFD, solo necesita entre 3 y 4 minutos para su determinacin, que por la rapidez de medida se ha sugerido como mtodo interesante para el control de calidad en el matadero (Honikel y Fischer, 1977). Por su parte, Batlle et al., (2000 y 2001) propusieron la variacin del valor R a valor R', calculando la relacin entre concentraciones de los compuestos derivados de la inosina y los de la adenosina. Este valor demostr ser til para discriminar entre carnes PSE, normales y DFD a las 2 horas post-mortem e incluso a las 8 horas, pero deja de ser til a las 24 horas. De igual manera se propuso la utilizacin de la relacin IMP/ATP para discriminar carnes PSE tan solo a las 2 horas post-mortem.

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Figura 7. Esquema de la degradacin del ATP en el msculo post-mortem. (Adaptacin de Aristoy et al., 2009).

Como resultado de los procesos catablicos del ATP, algunos de los compuestos derivados de su degradacin o el cociente entre ellos se han propuesto como ndices o indicadores de la frescura y maduracin en diversas especies de pescado (Saito et al., 1959), conejo y ternera (Nakatani et al., 1986), cerdo y pollo (Fujita et al., 1988, Batlle et al., 2000 y 2001). Aunque, la determinacin simple de la concentracin de

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Hx acumulada durante el almacenamiento, ha sido considerada tambin como un excelente ndice de la maduracin y calidad de la carne (Tsai et al., 1972; Yano et al., 1995a y Batlle et al., 2001). El ndice de frescura o valor K (1) propuesto por Saito et al., (1959) se basa en los cambios autolticos en pescado, proporcionando una puntuacin de frescura relativa, de modo que cuando ms alto es el valor de K, menor es el nivel de frescura.

K (%) =

[Ino] + [Hx ] x 100 [ATP ] + [ADP ] + [AMP ] + [IMP ] + [Ino] + [Hx ]

(1)

Sin embargo, dado que algunos metabolitos como el ATP, ADP y AMP desaparecen a las 24 horas despus de la muerte del animal, Karube et al., (1984) sugirieron simplificar el valor K por el valor K' o Ki (2).

K i (%) =

[Ino] + [Hx ] x 100 [IMP ] + [Ino] + [Hx ]

(2)

Por su parte, Nakatani et al., (1986) y Fujita et al., (1988) propusieron otro ndice (Ko), para determinar la frescura en carne de conejo, ternera, pollo y cerdo (3).

K 0 (%) =

[Ino] + [Hx ]+ [X ] x100 [ATP]+ [ADP ]+ [AMP ]+ [IMP ]+ [Adeno sin a]+ [Ino]+ [Hx ] + [X ]

(3)

En general el valor K' o Ki resulto ser el ndice ms utilizado de frescura del pescado (Mulchandani et al., 1990; Okuma et al., 1992; Carsol y Mascini, 1998) y tambin de maduracin de la carne (Shahidi et al., 1994; Yano et al., 1995; Park et al., 2000; Batlle et al., 2001).

A partir de estas relaciones y debido a la gran variabilidad en el contenido de nucletidos y sus derivados encontrados en diferentes especies de pescado, se han propuesto nuevos ndices de frescura y calidad. Luong y Male (1992) propusieron la

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Introduccin

utilizacin del valor H (4) para especies de pescado con altas concentracin de Ino e Hx, aunque Park et al., (2000) han utilizado este ndice para determinar la frescura en carne de ternera y pollo.

H(%) =

[Hx ] x100 [IMP] + [Ino] + [Hx]

(4)

Burns et al., 1985, han sugerido la utilizacin del valor G (5) como indicador de calidad en pescado magro en congelacin y el valor P (6) para detectar el nivel de deterioro en las primeras etapas de almacenamiento en refrigeracin.

G=

[Hx ] + [Ino] [IMP ] + [Ino] + [AMP ]

(5)

P=

[Hx ] + [Ino] [IMP ] + [Ino] + [Hx ] + [AMP ]

(6)

El relacin [Hx]/[AMP] se consider una adecuada alternativa para caracterizar la frescura de pescado debido a su incremento constante con el tiempo (Massa et al., 2002), la relacin [IMP]/[ATP] fue propuesta para detectar carne PSE (Batlle et al., 2000) y finalmente la [Hx] para evaluar el tiempo post-mortem como una medida de calidad dada su alta correlacin con las perdidas de frescura y deterioro de la carne.

Por otro lado, los nucletidos y nuclesidos se han relacionado con atributos sensoriales de la carne, algunos de estos compuestos como el IMP y el GMP afectan al sabor de la carne, actuando como potenciadores del mismo y contribuyendo al sabor umami (Aristoy y Toldr, 2009), mientras que la hipoxantina junto con algunos aminocidos y pptidos pueden contribuir al sabor amargo en la carne (Tikk et al, 2006).

1.2.5. Generacin de aminas bigenas. Las aminas bigenas (AB) son compuestos orgnicos nitrogenados de bajo peso molecular con estructura aliftica (putrescina, cadaverina, agmatina, espermina y

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espermidina) y aromtica (tiramina, histamina, -feniletilamina, octapamina, dopamina, serotonina y triptamina). Se producen principalmente por

descarboxilacin microbiana de sus aminocidos precursores (Silla-Santos, 1996) o por aminacin y transaminacin de los aldehdos y cetonas (Maijala y Eerolas, 1993). En funcin del nmero de grupos amino las AB tambin se clasifican en monoaminas (histamina, feniletilamina, tiramina), diaminas (putrescine, cadaverina) o poliaminas (espermidina, espermina). Las poliaminas, son de origen natural o fisiolgico y se forman como consecuencia de distintos procesos metablicos a partir de la arginina (putrescina, agmatina, espermina y espermidina) o de la lisina (cadaverina). La figura 8 esquematiza las rutas biosintticas de las AB y las principales enzimas descaboxilasas implicadas. Aunque la sntesis de las aminas naturales sigue rutas ms complejas que las de las AB, en las primeras etapas tambin se incluyen reacciones de descarboxilacin aminoacdica. Las AB se pueden encontrar en alimentos como el pescado, pero tambin en aquellos con alto contenido de protena y que han sufrido una fermentacin con gran liberacin de aminocidos como por ejemplo, queso, productos crnicos crudos-curados (embutidos), vino, cerveza, etc.

Las diaminas y poliaminas son componentes indispensables de las clulas vivas, a bajas concentraciones son importantes en la regulacin de la funcin de los cidos nucleicos, sntesis de protenas y probablemente en la estabilizacin de las membranas celulares protegindolas del estrs oxidativo (Maijala y Eerolas, 1993; Halsz et al, 1994). Sin embargo, el consumo de AB en altas concentraciones pueden tener efectos nocivos y provocar dolores de cabeza, hipo e hipertensin, nuseas, palpitacin cardiaca, intoxicacin renal, en casos graves hemorragia cerebral e incluso la muerte (Shalaby, 1996). La putrescina y cadaverina pueden reaccionar con nitrito dando lugar a la formacin de nitrosaminas, sustancias con efecto cancergeno. Las monoaminas, histamina y tiramina, tienen propiedades vasoactivas

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y psicoactivas que provocan hipotensin, migraas e hipertensin. Adems de sus efectos toxicolgicos, las AB estn relacionadas con la higiene de los alimentos, su presencia en elevadas concentraciones puede ser indicativa de uso de materias primas de baja calidad, de contaminacin y condiciones inapropiadas durante el procesamiento y almacenamiento de los alimentos (Bover-Cid et al., 1999).

Figura 8. Ruta metablica de la formacin de aminas bigenas. (Modificado de Halsz et al.,

1994). 1.Histidn-descarboxilasa, 2.Lisina-descarboxilasa, 4.Tirosina-descarboxilasa, 5.Triptfano-descarboxilasa. 3.Ornitina-descarboxilasa,

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La carne fresca, en condiciones normales debe contener tan solo poliaminas fisiolgicas (espermina y espermidina); sin embargo, contiene una elevada actividad de agua y un alto contenido en nutrientes que contribuyen y favorecen el desarrollo de microorganismos indeseables que se relacionan con alteraciones de la carne y son capaces de producir AB, por lo que pueden ser utilizadas como compuestos marcadores de la calidad. En los productos crudos curados sometidos a un proceso de fermentacin y/o maduracin, el desarrollo y la actividad de una gran variedad de microorganismos (potenciales aminognicos), los procesos proteolticos que aumentan la disponibilidad de aminocidos precursores y una ligera acidificacin contribuyen a la formacin de AB. En el caso del jamn (producto madurado a partir de piezas enteras) la formacin de AB esta fuertemente limitada por la cantidad de sal adicionada, por lo que su concentracin es muy baja. Adems, los recuentos microbianos son muy bajos en este producto. 1.2.6. Otros cambios debidos a reacciones qumicas. Degradacin y oxidacin de los lpidos La degradacin de los lpidos consiste en primer lugar en una hidrlisis enzimtica, como anteriormente fue descrito, generando cidos grasos libres que son susceptibles de oxidacin. Esta oxidacin se inicia con la formacin de radicales libres por accin de distintos catalizadores como la luz, oxgeno, iones metlicos, temperatura, humedad o enzimas como la lipoxigenasa, formndose hidroperxidos. Aunque estos compuestos carecen de olor, van a ser el origen de los productos secundarios de la oxidacin, rompindose en molculas voltiles de bajo peso molecular (aldehdos, cetonas, alcoholes, hidrocarburos y cidos) o reaccionando con protenas, pptidos y aminocidos que segn su composicin pueden ocasionar malos olores o contribuir a la mejora del aroma (Toldr, 1994; Estvez et al., 2009).

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Reaccin de Maillard La reaccin de Maillard (glucosilacin no enzimtica de las protenas) es una de las principales rutas de formacin del aroma de la carne y productos crnicos. Esta reaccin ocurre cuando los grupo amino libres de compuestos proteicos (protenas, pptidos o aminocidos) se combinan con los grupos carbonilo de los azcares para formar glucosilaminas. Esta reaccin ocurre a cualquier temperatura, pero sucede ms rpidamente a altas temperaturas, es responsable del color, aroma y sabor durante diferentes formas de preparacin de alimentos. Dentro de los compuestos del aroma a carne destacan los compuestos azufrados, que se forman de la combinacin de los azcares reductores con cistena o metionina va la degradacin de Strecker (Mottram, 1998). En el jamn curado la formacin de este tipo de productos ocurre durante la fase final de la maduracin, cuando las condiciones ambientales de la cmara son favorables y disminuye la actividad de agua (Ventanas et al., 1992), generando un gran nmero de compuestos voltiles: carbonilos (aldehdos y cetonas), furanos, cidos grasos, pirazinas y compuestos azufrados (sulfuros, tiazoles, tioles y tiofenos) (Garca et al., 1991; Flores et al, 1997).

Reaccin de Strecker. Las reacciones de Strecker constituyen otra ruta de formacin de compuestos voltiles y forma parte del mecanismo de pardeamiento no enzimtico (Cremer y Eichner, 2000), involucrando la desaminacin oxidativa y la descarboxilacin de aminocidos en presencia de compuestos -dicarbonilos, para producir

aminocetonas, aldehdos y dixido de carbono (Figura 4). Los compuestos generados poseen caractersticas aromticas intensas y pueden contribuir al desarrollo del aroma final caracterstico del jamn curado.

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1.3. Mtodos analticos para la determinacin de nucletidos y sus derivados y de aminas bigenas en la carne y productos crnicos.
1.3.1. Nucletidos y sus derivados Los mtodos analticos propuestos para el anlisis de nucletidos y sus derivados incluyen en primer lugar la extraccin de los compuestos de estudio de la matriz crnica. A fin de realizar un anlisis correcto de los compuestos relacionados con el ATP se debe tener en cuenta que el msculo en sus primeros momentos postmortem es muy sensible a la temperatura y la degradacin del ATP ocurre muy rpidamente, incluso a temperatura de refrigeracin (Aristoy et al., 2010). Durante la toma de muestras es muy importante detener esa degradacin para lo cual el msculo recin extrado se congela inmediatamente mediante inmersin en nitrgeno lquido (Batlle et al., 2000). A partir de aqu, el procedimiento tpico de extraccin y desproteinizacin consiste en homogenizar las muestras de carne y/o productos crnicos con un disolvente cido concentrado como el cido perclrico (0.6 M) (Saito et al., 1959; Fujita et al., 1988; Batlle et al., 2001) o el cido tricloroactico (Jones et al., 1964; Okuma y Abe, 1992), que desnaturalizan las enzimas de degradacin del ATP y desproteiniza la muestra. A continuacin, los extractos crnicos cidos se neutralizan (pH 7.0) con carbonato potsico o hidrxido de potasio para estabilizar la muestra. Los extractos crnicos parecen ser estables si se mantienen congelados (- 25 C) por varias semanas.

Para el anlisis de nucletidos y sus derivados se ha utilizado una gran variedad de mtodos tales como la cromatografa en capa fina (Dingle et al., 1968), espectroscopia de resonancia magntica nuclear (Van den Thillart et al., 1990), electroforesis capilar (Nguyen et al., 1990; Luong et al., 1992), radioinmunoensayos (Roberts et al., 1991), cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) de intercambio inico (Lamb y Ye, 1992; Gao et al., 2006), en fase reversa (RP-HPLC) (Veciana Nogus et al., 1997; Kuda et al., 2007), en fase reversa con par inico (IP-RP-HPLC)

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(Murray y Thomson, 1983; Meynial et al., 1995; Veciana-Nogus et al., 1997). Adems, se han desarrollado algunas tcnicas enzimticas utilizando sensores enzimticos, como se describirn en el apartado 1.4.4.

El HPLC es la tcnica ms empleada para el anlisis especfico de los compuestos derivados de la degradacin del ATP en carne (Tsai et al., 1972; Batlle et al., 2000 y 2001) y productos crnicos (Mateo et al., 1996). En particular, la RP-HPLC e IP-RPHPLC son los mtodos de eleccin y dependiendo del analito de inters ser el tipo de separacin. El anlisis cromatogrfico en RP-HPLC se desarrolla normalmente en un cromatgrafo de lquidos equipado con un detector ultravioleta (254nm) (Diode Array Detection, DAD) y se caracteriza por separar molculas en base a su polaridad. La columna ms utilizada en este tipo de anlisis es una columna tipo C18, que consiste en un soporte de slice con cadenas n-alquil (n=18) enlazadas. La separacin de los analitos suele realizarse utilizando un tampn fosfato a diversos pH como fase mvil, aunque para mejorar la resolucin de los compuestos y reducir el tiempo del cromatgrama se puede combinar con una elucin en gradiente con metanol o acetonitrilo. La identificacin de los compuestos se realiza mediante la comparacin de los tiempos de retencin y sus espectros con los patrones respectivos. La adicin de par inico, generalmente sales de amonio cuaternarios, a la fase mvil incrementa el tiempo de retencin (Veciana-Nogus et al., 1997) y mejora la separacin de molculas cargadas como los nucletidos (ATP, ADP, AMP). El mecanismo que se genera hace a la tcnica menos dependiente del tipo de columna y de la resolucin debido a la naturaleza de los steres fosfato que facilitan la fuerte interaccin con el par inico a un apropiado pH de la fase mvil (Aristoy et al., 2010). Sin embargo, este mtodo es ms costoso que la RP-HPLC, ya que los reactivos de par inico son caros. Recientemente, se ha empleado la cromatografa lquida de ultra alta resolucin con espectrometra de masas en tndem (UPLC-MS/MS) para

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analizar los nucletidos y nuclesidos de la carne fresca, jamn curado y jamn cocido (Clariana et al., 2010). 1.3.2. Aminas bigenas El inters en analizar las AB de un alimento se debe en gran parte a su potencial toxicidad, pero tambin a que pueden ser utilizadas como marcadores de calidad. As pues, el anlisis de las AB ha sido enfocado al control de calidad de las materias primas, productos intermedios y productos finales, al seguimiento de los procesos de fermentacin y al control de procesos (nal, 2007). La cromatografa en capa fina (Latorre-Moratalla et al., 2009) result ser un mtodo simple, rpido y econmico, pero la mayora de los trabajos publicados indican que se requiere de excesivo tiempo para el anlisis y los resultados obtenidos tan solo permiten la semicuantificacin del contenido de AB. La cromatografa de gases se ha utilizado tambin para el anlisis de aminas, pero esta tcnica ha sido adecuada para el anlisis de compuestos voltiles, por lo que adems de extraer la muestra hay que formar esos compuestos, alargando y complicando el anlisis. Staruszkiewicz y Bond, (1981), han utilizado esta tcnica para la deteccin de putrescina y cadaverina en pescado y camarn. Otros mtodos como la electroforesis capilar (Lange et al., 2002) o la combinacin de sta con tcnicas de deteccin conductimtrica (Kvasnicka y Voldrich, 2006) para reducir los tiempos y costo del anlisis en productos como salami, queso, vino y cerveza han sido utilizadas. En el caso de la cromatografa lquida para la determinacin de AB es necesario realizar un paso adicional de derivatizacin, pre o post-columna, con el fin de facilitar su determinacin, debido a que muchas AB carecen de grupos cromforos para su determinacin directa. Aunque estos mtodos consumen mucho tiempo, la IP-RP-HPLC con derivatizacin post-columna seguida de deteccin fluorescente (Veciana Nogus et al., 1995; Hernndez-Jover et al., 1996) ha sido el mtodo que

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ms veces se ha citado en el anlisis de AB en carne y productos crnicos. Dicho mtodo conlleva la formacin de pares inicos entre las AB y el octanosulfonato sdico que se adiciona a la fase mvil y la separacin se realiza previa derivatizacin con orto-ftaldehdo. Recientemente, se ha empleando la cromatografa lquida de ultra alta resolucin (UHPLC) con derivatizacin post-columna para separar y cuantificar AB (Latorre-Moratalla et al., 2009) en carne, jamn curado y jamn cocido. Por otro lado, tambin se han desarrollado mtodos enzimticos basados en la actividad de la mono y diamino oxidasa (Yano et al., 1995b; Bouvrette et al., 1997) como se describe en el apartado 1.4.4.

1.4. Biosensores
La industria alimentaria actualmente demanda herramientas de monitorizacin y control que puedan brindar datos en tiempo real para el aseguramiento de la calidad fisicoqumica, microbiolgica, bromatolgica, sensorial y de la estabilidad de materias primas procesos y productos (Jimnez y Len, 2009). Los mtodos analticos tradicionales carecen en muchos casos de la sensibilidad adecuada para la determinacin a nivel de trazas, adems de tener poca especificidad. Aunque los mtodos cromatogrficos constituyen herramientas robustas, reproducibles y sensibles, son costosos e implican tratamientos exhaustivos de la muestra. En este contexto, el uso de biosensores constituye una alternativa para inspeccionar la calidad del producto y de los procesos debido a su especificidad, selectividad, versatilidad, sencillez, corto tiempo de anlisis, bajo costo y fcil manejo.

El biosensor segn la IUPAC (International Union of Pure and Applies Chemistry) se define como un dispositivo analtico que incorpora un elemento biolgico, ntimamente asociado con un transductor fisicoqumico, que en presencia del analito produce una seal elctrica que es proporcional a la cantidad presente del mismo (Turner et al., 1987). El principio de deteccin se basa en la interaccin especfica

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Introduccin

entre el compuesto de inters (analito) y el elemento de reconocimiento biolgico (enzima, anticuerpos, tejidos, receptores celulares, microorganismos o cidos nucleicos), que produce variacin en una o varias propiedades fsico-qumicas (pH, transferencia de electrones, calor, cambios de masa, variacin de las propiedades pticas, cambios de potencial, etc.) en el medio de reaccin, las cuales son detectadas por un transductor especfico que debe ser capaz de convertir esa reaccin biolgica en una seal detectable (Prodromidis y Karayannis, 2002). La seal luego es amplificada y procesada y estar relacionada con la concentracin del analito (Figura 9). El transductor, determina la eficacia (sensibilidad) en el procesamiento de la seal del biosensor, mientras que la selectividad se define por la particular interaccin del componente biolgico con el analito.
Receptor biolgico
1.20

Muestra
Consumo 02 (mg/L)

1.00

0.80

0.60

0.40

0.20

0.00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 Tiempo (seg)

Transductor

Seal

= analito

Figura 9. Esquema genrico de un biosensor

As pues, los biosensores se clasifican atendiendo a diferentes criterios, como la naturaleza del elemento de reconocimiento (catalticos y de afinidad) o el tipo de transductor utilizado (electroqumico, ptico, piezoelctrico y trmico), siendo este ltimo el sistema ms aceptado, aunque puede darse una combinacin de ambos.

1.4.1. Clasificacin de los biosensores por su elemento de reconocimiento. 1.4.1.1. Biosensores catalticos. Estos biosensores, se basan en la utilizacin de catalizadores (enzima, anticuerpos, tejidos, receptores celulares, microorganismos) como elementos de

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Introduccin

reconocimiento biolgico, los cuales favorecen que ocurra una reaccin qumica a partir de uno o varios sustratos para producir uno o varios productos, sin el consumo del biocatalizador, que se regenera y puede ser reutilizado. Las enzimas son los elementos ms comnmente utilizados para la fabricacin de estos biosensores debido a su bajo costo, disponibilidad en el mercado y fcil manipulacin (Eggins, 2002), denominndose sensores enzimticos y sern descritos con detalle en el apartado 1.4.3. 1.4.1.2. Biosensores por afinidad. La operacin de estos biosensores se basa en la interaccin del analito de inters con el elemento de reconocimiento que pueden ser macromolculas (cidos nucleicos, anticuerpos carbohidratos, ADN, ARN) o ensambles moleculares organizados. Es decir, monitorizan la unin del analito con su receptor sin llevar a cabo transformaciones qumicas (Jimnez y Len, 2009), pero producen una reaccin de equilibrio en la que se forma un complejo analito-receptor (Mello y Kubota, 2002). Dicha interaccin demanda sistemas de alta sensibilidad y precisin para ser detectadas y su cuantificacin se realiza de forma indirecta a travs del seguimiento cintico del proceso en presencia de inhibidores competitivos, marcaje isotpico, comportamiento ptico del proceso o variaciones gravimtricas (Jimnez y Len, 2009). Entre ellos se encuentran los inmunosensores y los basados en quimiorreceptores. 1.4.2. Clasificacin de los biosensores por su tipo de transduccin. 1.4.2.1. Biosensores electroqumicos En los ltimos 30 aos, los biosensores electroqumicos han cobrado gran importancia, especialmente en aplicaciones industriales y se han convertido en los ms utilizados debido a sus ventajas prcticas, simplicidad de operacin, bajos costos de fabricacin y deteccin en tiempo real (Dzyadevych et al., 2008). Estos

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Introduccin

sensores qumicos o biosensores electroqumicos se basan en el hecho que durante un proceso de bio-interaccin, especies electroqumicas como los electrones se consuman o generen produciendo una seal electroqumica que a su vez puede ser medida por un detector electroqumico, que luego es amplificada, procesada y convertida a la forma deseada (Figura 9). En funcin del tipo de seal electroqumica, estos biosensores se pueden clasificar en amperomtricos, potenciomtricos y conductimtricos.

a. Amperomtricos. Dentro de los biosensores electroqumicos, los amperomtricos son los que han mostrado mayor avance, debido a su extensa aplicacin dentro del anlisis mdico llegando a ser una herramienta prometedora en el rea de alimentos. stos miden los cambios de corriente en un electrodo de trabajo (platino, oro, derivados del grafito - carbono vitrificado o grafito piroltico-, polmeros conductores, etc.) como resultado de la aplicacin de un potencial fijo sobre un electrodo de referencia (Ag/AgCl), debido a la oxidacin de los sustratos o productos de una reaccin bioqumica. Los transductores amperomtricos se fundamentan en la

proporcionalidad que existe entre la concentracin de una determinada especie electroactiva y la corriente elctrica registrada (Chaubey y Malhotra, 2002). Esta relacin se comporta segn el modelo simplificado de la Ley de difusin de Fick (7), obtenindose una relacin lineal entre ellos. La corriente que se origina durante la reaccin qumica es de tipo faradaico y es una medida de la velocidad de la reaccin electroqumica que se produce en el electrodo.
nFAD 0 C 0 ; simplificando

I=

I=K C 0

(7)

donde, F, es la constante de Faraday, A es el rea del electrodo de trabajo, Do y Co son los coeficientes de difusin y la concentracin del analito, respectivamente y tamao de la capa de difusin.

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Introduccin

b. Potenciomtricos. El fundamento terico de estos sensores se establece por la ecuacin de NernstDonnan (8), la cual se basa en la determinacin de la diferencia de potencial (voltaje) entre un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia. Funcionan en condiciones de equilibrio, a corriente cero, y monitorizan la acumulacin de carga creada por la actividad del propio analito.
E = E0 + RT In a i + nF k
j zi pot i ,j

* aj

zj

(8)

donde, ai es la actividad del in principal, aj la actividad del in interferente, zi y zj, las cargas de los iones principal e interferentes, y kipot es el coeficiente de selectividad. ,j

Estos dispositivos constan de un dispositivo de medida del potencial, un electrodo de referencia y una membrana selectiva de iones (ISE) o de gases, como electrodo de trabajo (Terry et al., 2005). En matrices biolgicas complejas la ISE puede detectar iones como el Na+, K+, Ca2+, H+ o NH4+ mediante la deteccin de cambios en el potencial del electrodo cuando los iones se unen a una membrana de intercambio inico adecuada. Barat et al., (2008) propusieron la utilizacin de este tipo de sensor para el seguimiento del tiempo post-mortem y la frescura del pescado, mediante su correlacin con el valor K1 (ver apartado 1.2.4.). Recientemente han aparecido un nuevo tipo de sensores selectivos de iones denominados sensores voltamperomtricos los cuales miden la variacin de la corriente cuando cambia el potencial. Estos utilizan un sistema de tres electrodos: un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un electrodo auxiliar o contraelectrodo (platino) que permite conducir la electricidad desde la fuente que la produce hasta el electrodo de trabajo. En este subgrupo se pueden incluir los sensores basados en electrodos qumicamente inertes, electrodos qumicamente

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Introduccin

activos y electrodos modificados. Santos et al., (2009) propusieron la aplicacin de esta tcnica para la determinacin de nitrito en embutidos y vegetales en salmuera.

c. Conductimtricos. Este tipo de dispositivos miden los cambios de conductividad entre dos pares de electrodos metlicos a un voltaje constante, como consecuencia de reacciones bioqumicas que especficamente consumen o producen iones (Chaubey y Malhotra, 2002), ya sea en la disolucin de medida o en una membrana selectiva. En uno de los pares de electrodos se coloca la membrana con el elemento de reconocimiento mientras que en el segundo par se coloca una membrana en blanco. As, la presencia de elementos inicos en una muestra genera un incremento en la conductividad ( ) que es proporcional a la concentracin de iones, segn la ecuacin (9). La desventaja de estos sensores es la alta fuerza inica de las matrices biolgicas lo que dificulta la deteccin de pequeos cambios de conductividad causados por la reaccin bioqumica (Mikkelsen y Rechnitz, 1989).
= k C

(9)

donde, k es la conductividad especifica y C es la concentracin de iones.

1.4.2.2. Biosensores pticos Estos sensores se basan en la medida de la variacin de las propiedades pticas (absorbancia, reflectancia, fluorescencia, ndice de refraccin, dispersin de la luz, efecto optotrmico) como consecuencia de la interaccin del analito con la parte receptora (Figura 10). Estos dispositivos presentan la ventaja de no ser destructivos, pero la unin no especfica del analito produce seales falsas. Entre stos se destaca los sensores de fibra ptica que han sido aplicados al aseguramiento de la calidad microbiolgica de embutidos mediante la deteccin de Listeria monocytogenes (Geng et al., 2004) o Escherichia coli O157:H7 (Radke y Alocilja, 2005).

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Introduccin

Fibra Membrana

Receptor

Luz

Figura 10. Esquema general de un biosensor ptico.

1.4.2.3. Biosensores Trmicos Estos dispositivos son capaces de medir la concentracin de un sustrato utilizando la variacin de entalpa de la interaccin entre el analito y el receptor, convirtindolo en una seal elctrica. Una enzima inmovilizada (Figura 11) transforma al sustrato y libera o consume caloras durante la reaccin que puede detectarse en los termistores o dispositivos piroelctricos. Existe en el mercado, uno de estos sensores, el ThermoMetric (ThermoMetric Inc. Jarfalla, Sweden, Luong et al., 1997). Estos biosensores se han aplicado tambin a la deteccin de interacciones antgenoanticuerpo; sin embargo, estos instrumentos son sofisticados y caros lo que es el mayor inconveniente de esta tcnica.
Termistor

Enzima inmovilizada Orificios Proteccin de vidrio

Figura 11. Esquema general de un transductor termomtrico.

1.4.2.4. Biosensores Piezoelctricos Conocidos tambin con el nombre de sistemas de traduccin msicos, gravimtricos o acsticos. Son dispositivos que, sobre una superficie de un cristal piezoelctrico (cuarzo) o un dispositivo de onda acstica superficial, se detecta la

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Introduccin

variacin en la frecuencia de resonancia caracterstica del cristal debido a un aumento de masa (Terry et al., 2005). En el sector alimentario ha permitido el seguimiento de propiedades reolgicas como la textura mediante la deteccin de vibraciones por fractura de la muestra de inters (Taniwaki et al., 2006). 1.4.3. Sensores enzimticos Los sensores enzimticos se incluyen dentro de los biosensores de tipo cataltico (apartado 1.4.1.) y se han elegido para el desarrollo de este trabajo por su adecuacin al anlisis de los analitos de inters; nucletidos y sus derivados (Watanabe et al., 1983) y aminas bigenas (Bouvrette et al., 1997; Yano et al., 1996).

El concepto de electrodo enzimtico fue introducido por Clark y Lyons en 1962 (Clark y Lyons, 1962) para determinar la concentracin de glucosa en la sangre a travs de la reaccin catalizada por la glucosa oxidasa acoplada a un electrodo selectivo de oxgeno. Incluso, fue el primer biosensor disponible comercialmente (Yellow Spring Instrument, USA) en 1975.

Los biosensores electroqumicos basados en enzimas (sensores enzimticos) son dispositivos que combinan la ventaja de la elevada selectividad, especificidad y versatilidad de las enzimas para reconocer molculas particulares, con un transductor para medir la concentracin de un analito. Las enzimas son protenas capaces de catalizar una reaccin qumica. Reaccionan de manera selectiva con el analito. El mecanismo bsico de la catlisis enzimtica para reacciones en las que se ve involucrado un nico sustrato, es el siguiente (10):
k1

E+S
k-1

E-S
k2

E+P

(10)

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Introduccin

donde S es el sustrato, E la enzima, E-S el complejo enzima-sustrato y P el producto,

k1., k2., k-1.son las constantes cinticas para cada una de las etapas de reaccin. As,

para una concentracin de enzima determinada, la velocidad de reaccin catalizada enzimticamente se define por la ecuacin de Michaelis-Menten (11).

v=

[E o ]Vmax
k M + [S ]

(11)

donde Vmax es la velocidad mxima de reaccin y kM es la constante de MichaelisMenten que corresponde a la concentracin de sustrato para la cual la velocidad es igual a la mitad de la velocidad mxima. La actividad enzimtica esta regulada por el pH, la fuerza inica del medio y la temperatura y, requiere en algunos casos la presencia de un cofactor (nicotinamida adenn dinucletido -NAD+ u oxgeno) para que se ocurra la reaccin. La zona activa o sitio activo de las enzimas les confieren la especificidad y suele estar situada en el interior de stas. Existen diferentes tipos de enzimas, clasificadas segn el tipo de reaccin que llevan a cabo (Tabla 4.).
Tabla 4. Clasificacin de enzimas segn el tipo de reaccin que catalizan.
Enzima Transferasas Hidrolasas Liasas Isomerasas Ligasas Oxidoreductasas
Fuente: Nelson y Cox, 2001.

Tipo de reaccin Catalizan la transferencia de un grupo qumico, de un sustrato a otro. Catalizan reacciones de hidrlisis. Rompen las biomolculas con molculas de agua. Catalizan adiciones de grupos a dobles enlaces o formaciones de dobles enlaces por eliminacin de grupo. Catalizan la interconversin de ismeros. Cuando un ismero se transforma a otro. Catalizan la formacin de enlaces C-C, C-S, C-O Y C-N por reacciones de condensacin acopladas a la hidrlisis de ATP. Catalizan reacciones de oxidorreduccin. Transferencia de hidrgeno o electrones de un sustrato a otro.

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Introduccin

Las enzimas comnmente utilizadas en el diseo de los sensores enzimticos son de tipo oxido-reductasas, ya que en la conversin enzimtica del sustrato (oxidacin) tiene lugar una reaccin de transferencia de electrones (Reviejo y Pingarrn, 2000; Thvenot et al., 2001) y con ello el cambio de la enzima a estado reducido, que dependiendo de la capacidad de la enzima para donar dos o cuatro electrones al oxgeno (O2), el producto final puede ser agua (H2O) o perxido de hidrgeno (H2O2) (Figura 12).
Sustrato
O2 H2O H2O2

Producto
O2

Membrana enzimtica

e-

Enzima reducida

Enzima oxidada

Figura 12. Secuencia de una reaccin de oxidacin catalizada por una enzima oxidasa empleando oxgeno molecular como aceptador de electrones (Modificado de Reviejo y Pingarrn, 2000).

En el caso de los sensores con enzimas deshidrogenasas (Haouz et al., 1994) es necesaria la presencia del cofactor NAD+ y el seguimiento de la reaccin cataltica se realiza mediante la oxidacin de NADH. El inconveniente de estos cofactores es la necesidad de aplicar potenciales muy altos, que pueden oxidar o reducir a su vez otros analitos que haya en el medio y puedan interferir con la seal detectada.

En este sentido, el correcto funcionamiento de un sensor enzimtico depende en gran medida de la naturaleza de la enzima pero tambin de su inmovilizacin, del material de soporte que se utilice en sta y del material con que se construya el transductor.

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Introduccin

1.4.3.1. Inmovilizacin de la enzima. Aunque existen mtodos enzimticos que utilizan la enzima libre en disolucin (Luong et al., 1992), los ms frecuentes son aquellos en los que la enzima se encuentra inmovilizada en un soporte. La inmovilizacin de la enzima es el proceso ms importante en la construccin del sensor, ya que caractersticas como el tiempo de vida, sensibilidad y estabilidad durante el almacenamiento, dependen en gran medida de este proceso. Entre las ventajas del empleo de la enzima inmovilizada cabe destacar el aumento de la estabilidad de la enzima y su posible reutilizacin, disminuyendo el costo del proceso. Sin embargo, la inmovilizacin puede alterar su conformacin resultando en prdidas en su actividad cataltica. Estas limitaciones han sido minimizadas y se han desarrollado numerosas tcnicas de inmovilizacin. En general, los mtodos de inmovilizacin de enzimas se clasifican en dos grandes grupos; retencin fsica (atrapamiento, microencapsulacin) y retencin qumica (adsorcin a la superficie, acoplamiento covalente o por entrecruzamiento o crosslinking) (Sharma et al., 2003; Eggins, 2002; Nunes y Marty, 2006). A continuacin se describen los tipos de inmovilizacin ms comnmente utilizados en la fabricacin de stos sensores enzimticos.
Atrapamiento fsico. Retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa (polmeros de poliacrilamida, celulosa, colgeno, alginato, carragenato, resinas de poliuretano o membranas de dilisis, grafito ms agente aglutinante). La enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura. La desventaja de este sensor es la barrera creada que dificulta la difusin del analito hasta el centro activo de la enzima, aumentando el tiempo de respuesta. Por lo tanto se requiere de un control riguroso de las condiciones de polimerizacin. Microencapsulacin. En este mtodo se encapsulan gotas de una disolucin enzimtica en microcpsulas semipermeables fabricadas de polmetros orgnicos, que permiten el paso de las molculas de sustrato y productos pero no del enzima. Este mtodo permite que el material biolgico est en contacto directo con el transductor, manteniendo, a su vez, la alta sensibilidad de los enzimas puesto que no se ven afectadas por los cambios de pH, temperatura o fuerza inica del medio.

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Introduccin

Absorcin en superficie. El principio de inmovilizacin de este mtodo se basa en la asociacin de la enzima a un soporte mediante interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y puentes de hidrgeno. Es el mtodo ms simple de inmovilizacin y la absorcin se obtiene por volatilizacin del tampn que contiene la enzima y no requiere de reactivos qumico, pero no es muy estable y la unin con el soporte es muy dbil. El pH, la fuerza inica y la presencia de iones como cofactores de la enzima influyen en la desorcin de la enzima. Entrecruzamiento (cross-linking). Esta tcnica consiste en la utilizacin de reactivos bi o multifuncionales (glutaraldehdo, hexametildisocianato, 1,5-dinitro-2,4-diflorobenzeno) que originan uniones intermoleculares entre molculas de enzima. El agente bifuncional tiene dos grupos aldehdos en sus extremos que reaccionan con el grupo amino de una enzima o protena. El entrecruzamiento permite evitar las prdidas de actividad enzimtica y puede combinarse con otros mtodos de inmovilizacin consiguindose una elevada carga enzimtica. Enlace covalente. La metodologa del enlace covalente entre el transductor y la enzima se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte (membrana o reactor) para que reaccionen con ncleofilos de las enzimas (grupos amina, carboxilicos, alcoholes, tioles o imidazol). Precisan del control del pH y la fuerza inica. La ventaja de este mtodo es que se consiguen tiempos de vida muy largos.

Cabe mencionar que dentro de cada una de estas tcnicas de inmovilizacin existen muchas variantes dependiendo del mtodo de inmovilizacin utilizado y los materiales utilizados para inmovilizar la enzima. Adems, es posible combinar diferentes tcnicas de inmovilizacin.

1.4.3.1.1. Materiales soporte para la inmovilizacin de la enzima. La seleccin del material soporte para la inmovilizacin de la enzima es un parmetro a tomar en consideracin para un adecuado funcionamiento del sensor enzimtico. Entre los materiales ms comnmente utilizados se encuentran los siguientes:

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Introduccin

a.

Polmeros electropolimerizados o preformados. Los polmeros electropolimerizados permiten la incorporacin de la enzima en disolucin con un monmero (polipirrol, polianilina y politiofeno) que se deposita en la superficie del electrodo y mediante electropolimerizacin se forma una pelcula polimrica que se adhiere firmemente sobre el electrodo proporcionando una matriz tridimensional que atrapa la enzima (Ghosh et al., 1998). Los polmeros perfomados son pelculas delgadas de materiales como el nafion, acetato de celulosa, policarbonato, nylon o poliuretano, que se colocan directamente sobre la superficie del electrodo para despus inmovilizar la enzima sobre ellos. Algunas de estas membranas, adems de ser un material de soporte para la inmovilizacin, son selectivas y evitan interferencias electroqumicas. Por otro lado, debido a sus caractersticas conductoras, los polmeros pueden ser utilizados directamente como electrodos o bien para modificar qumicamente a otro tipo de electrodos como es el caso de los de pasta de carbono.

b. Materiales conductores, se utilizan principalmente para la fabricacin de electrodos composite. El material composite es una dispersin de un material slido conductor oro, platino, tefln, polvo de grafito, carbono vitrificado o grafito piroltico en una matriz polimrica de caractersticas aislantes dadas por el agente aglutinante (aceite de parafina o de silicona), al cual se le puede aadir la enzima o los mediadores electroqumicos. Con este procedimiento se obtienen biosensores con un depsito tridimensional de la enzima, que permite mediante un simple pulido la renovacin de la superficie del biosensor (Reviejo y Pingarrn, 2000). c. Sistemas sol-gel. Sales inorgnicas de metales o compuestos organometlicos que se someten a reacciones de hidrlisis y polimerizacin hasta formar una suspensin coloidal o sol, que mediante diversos procesos de pulverizacin o centrifugado, las partculas condesan en una nueva fase (gel). La enzima se aade durante esta transicin y queda retenida en las cavidades de la matriz (Prodomidis y Karayannis, 2002). d. Electrodos modificados: Modificacin del electrodo, principalmente los de pasta de carbono, con polmeros conductores, partculas coloidales u otro tipo de nanomateriales (nanotubos, nanocables de carbono y nanopartculas de oro). La utilizacin de estos ltimos materiales, an cuando se caracterizan por su simplicidad y proporcionan alta sensibilidad, la aplicacin al anlisis de muestras reales es mnimo (Agi et al., 2006).

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Introduccin

1.4.3.1.2. Materiales de construccin del transductor Los materiales de construccin del transductor ms utilizados en la construccin de los biosensores electroqumicos son: los metales nobles (oro, platino), carbono (pasta o varillas), conductores composite (polvo de grafito dispersado sobre polmeros de resina epoxi, silicona, metacrilato o poliuretano), sales y polmeros orgnicos conductores o metales sintticos con cualidades elctricas y pticas (polipirrol, polifuranos, poliindoles, policarbazoles y polianilinas) (Gerard et al., 2002). 1.4.3.2. Principio de operacin La representacin tpica del sensor enzimtico se muestra en la figura 9 y, opera en varias etapas: el sustrato en disolucin se transporta a la superficie del electrodo y se difunde a travs de la membrana al punto activo de la enzima. En este punto ocurre la reaccin entre el sustrato y la enzima y como consecuencia de sta, el sustrato se consume y el producto se forma, generando una seal elctrica (corriente) que es detectada y mostrada en un procesador. As, la cintica de la reaccin enzimtica utilizando una enzima oxido-reductora en el sensor enzimtico, es controlada por la disminucin del contenido del oxgeno o por la reduccin del H2O2 (Figura 12). Como estos compuestos son electro-activos, el progreso de la reaccin enzimtica puede medirse a travs de amperometra, lo que hace que la mayora de los sensores enzimticos sean amperomtricos (Terry et al., 2005). En estos casos donde la enzima se inmoviliza en una membrana y a su vez se fija en la superficie del transductor y dependen de la concentracin del oxgeno ambiental, son denominados biosensores de primera generacin.

El ms simple de los sensores enzimticos amperomtricos se basa en un electrodo de oxgeno Clark (Chaubey y Malhotra, 2002). Este electrodo consiste de un ctodo de platino (donde el oxgeno se reduce) y un electrodo de referencia

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Introduccin

Ag/AgCl. Cuando un potencial de - 0.60 V es aplicado al electrodo de platino respecto al electrodo Ag/AgCl, se produce una corriente que es proporcional a la concentracin de oxgeno consumido, de acuerdo con el siguiente mecanismo (12),
Ctodo de platino: nodo de plata:

O2 + 4H + + 4e 2H2O
4 Ag + 4Cl 4 AgCl + 4e
(12)

Sin embargo, en estas condiciones se generan corrientes de fondo elevadas (Reviejo y Pingarrn, 2000), cuyo efecto puede verse neutralizado con el uso de membranas permeables al oxgeno y utilizando cantidades mnimas de electrolito (Falck, 1997). Mientras que la reduccin del H2O2 (13) ocurre al aplicar altos potenciales sobre electrodos metlicos como el platino (0.65 V vs. Ag/AgCl) (Prodomidis y Karayannis, 2002) y a potenciales an mayores (0.9 1.15 V) sobre electrodos de carbono (Reviejo y Pingarrn, 2000) lo que conlleva reacciones interferentes de compuestos orgnicos electroactivos (ascorbato, urato, acido rico, paracetamol).
nodo Platino: Ctodo Ag:

H2O2 O 2 + 2H + + 2e 2 AgCl + 2e 2 Ag + 2Cl

.

(13)

En este caso, la situacin se ha podido solventar mediante la utilizacin de mediadores electroqumicos (aceptadores artificiales de electrones que se encargan de la transferencia electrnica entre el centro activo de la enzima y la superficie del electrodo), sin necesidad de reducir el oxgeno como co-sustrato de la reaccin (Chaubey y Malhotra, 2002), aun as, la reaccin sigue dependiendo de la concentracin de oxgeno. El mediador debe tener buenas propiedades electroqumicas para actuar a potenciales redox prximo a cero, a fin de eliminar las reacciones redox de posibles interferencias. Los ferrocenos y derivados son los mediadores ms utilizados en la fabricacin de los sensores enzimticos (Turner et

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Introduccin

al., 1897; Chaubey y Malhotra, 2002). Este tipo de biosensores son denominados de segunda generacin. En los ltimos aos, se han diseado algunos otros biosensores, denominados de tercera generacin, en stos se busca que la transferencia electrnica entre el centro activo de la enzima y la superficie de electrodo se efecte de manera directa, para ello se ha utilizando la enzima peroxidasa (HRP) a fin de oxidar directamente el H2O2 generado (Reviejo y Pingarrn, 2000) o bien la utilizacin de sales conductoras las cuales pueden oxidar directamente la enzima reducida y no requiere de mediadores (Chaubey y Malhotra, 2002). Este tipo de biosensores muestra la mayor selectividad, puesto que trabaja a potenciales muy prximos a los intrnsecos de la enzima, quedando menos expuestos a posibles interferencias.

1.4.4. Aplicacin de los sensores enzimticos en el sector crnico. La mayora de los sensores enzimticos desarrollados en el mbito agroalimentario se han destinado principalmente al control de calidad de los productos y procesos y a la seguridad alimentaria. Un gran nmero de aplicaciones se han desarrollado, como as se ha resumido en varias revisiones al respecto (Mello y Kubota, 2002; Venugopal, 2002, Terry et al., 2005), entre ellas cabe destacar la determinacin de la glucosa, fructosa, galactosa, lactosa, almidn, glicerol, cidos (rico, ctrico, ascrbico, flico), alcoholes (metanol, etanol), colesterol, perxido de hidrgeno, microorganismos, patgenos y toxinas, as como parmetros de frescura (nucletidos y aminas) en zumos de frutas, vino, cerveza, sidra, leche, pescado, carne, frutas y verduras. La aplicacin de biosensores en este campo es relativamente reciente, por lo que existen muy pocos equipos comerciales.

En la industria de la carne, el uso de los sensores enzimticos se ha centrado en la determinacin de diferentes ndices para la determinacin de la frescura, maduracin de la carne y/o seguridad alimentaria. En las tablas siguientes se

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Introduccin

resumen las caractersticas de algunos sensores enzimticos encontrados en la bibliografa aplicados a pescado y a matrices crnicas y mediante el uso de una diversidad de tcnicas electroqumicas y de inmovilizacin. La aplicacin de muchos de ellos se basa en la determinacin de ndices de frescura (valor K, K1 y valor H) (apartado 1.2.4.) para pescado y en algunos casos se han utilizado para detectar la maduracin de la carne (Tabla 5). En estos casos se requiere el uso de sensores multienzimticos que permiten el anlisis de varios compuestos para el clculo de los ndices. Uno de los aspectos ms crticos en el desarrollo de los sensores multienzimticos es el diseo de complejos sistemas de reactores en serie para inmovilizar las enzimas. En algunos casos es necesaria la co-inmovilizacin de varias enzimas y/o la utilizacin de sistemas complementarios como el FIA (del ingls: Flow Inyection Analysis) para su operacin. Todo esto complica el posterior tratamiento de los datos para obtener una respuesta coherente y til.

Con miras a simplificar los controles, diversas investigaciones han propuesto la determinacin de Hx como ndice de frescura y/o maduracin. As, diversos sensores enzimticos han sido diseados para la determinacin especfica de la Hx (Tabla 6). Estos sensores se basan en la reaccin de oxidacin de la Hx catalizada por la enzima xantina oxidasa (XO), midiendo el consumo de oxgeno o la generacin de perxido de hidrgeno durante la reaccin. Como anteriormente se ha mencionado, cada uno de los sistemas propuestos conlleva ciertas ventajas y desventajas, debida a la gran diversidad de materiales, mtodos de inmovilizacin y deteccin utilizados. La mayora de estos sensores se han diseado para pescado y en menor medida para pollo y ternera, pero no hay evidencia de la aplicacin de estos sensores a productos crnicos curados.

54

Introduccin

Tabla 5. Sensores enzimticos utilizados para evaluar los ndices de frescura y/o maduracin de pescado y carne.
Enzima XO, NP, NT Transductor Amperomtrico. oxgeno Sensor de Parmetro Valor K1 Inmovilizacin Sobre membrana de triacetato del celulosa conteniendo 1,8 amino-4aminometiloctano activada con glutaraldehdo En perlas porosas de quitosano activadas con glutaraldehdo En membrana "Immunodyne Immunoaffinity" (XO) y en solucin (NP y NT) Sobre vidrio de poro controlado (CPG), aminopropil Matriz Lubina, Caballa, Platija, Lubina Referencia Karube et al ., 1984

XO, NP, NT

XO, NP, NT

Amperomtrico. Doble reactor multienzimtico y sensor de oxgeno Amperomtrico. Electrodo de platino vs Ag/AgCl, 0.650 V Amperomtrico. Reactor multienzimtico y sensor de oxgeno Amperomtrico. Electrodo de platino vs. Ag/AgCl, 0.7 V

Valor K1

Pescado

Okuma et al ., 1992

Valor K1

Carpa

Volpe y Mascini, 1996

XO, NP, NT

Valor K1

Pescado

Nanjyo y Yao, 2002

XO, NP, NT

Valor K

Sobre una membrana de nylon Trucha, carpa, Mulchandani et al ., 1990 preactivada (XO y NP) y sobre la pared merluza, lenguado de un tubo de poliestireno (NT) activado con glutaraldehdo En perlas de quitosano y perlas Pescado y mariscos Okuma y Watanabe, 2002 porosas de vidrio activadas con glutaraldehdo En doble reactor en serie con perlas Dorada Carsol y Mascini, 1998 porosas de vidrio activadas con glutaraldehdo.

XO, NP, ALF, Amperomtrico. Doble reactor AD multienzimtico y sensor de oxgeno ALF, NP, XO Amperomtrico. Electrodo de platino serigrafiado de tres electrodos (carbono, Ag y Ag/AgCl) unidos con una pelcula de polister XO, NP, ALF, Amperomtrico. Electrodo de AD, U oxgeno

Valor K

Valor K

Valor Ko

Ensayos enzimticos sobre membrana en el Freshness meter KV-101

Cerdo y pollo

Fujita et al ., 1988

XO, NP y NT Amperomtrico. Electrodo de Valor K, En membrana preactivada de nylon Platino vs. Ag/AgCl, 0.7 V valor H, Hx (XO y NP) y sobre la pared de un tubo de poliestireno (NT) activado con glutaraldehdo XO, NP, NT Amperomtrico. Electrodo de polipirrol con mediador Amperomtrico. Sistema de tres reactores y electrodo de oxgeno Amperomtrico. Sistema de tres reactores y electrodo de oxgeno Valor K1, valor H Valor K1, valor H Valor K1, valor H Sobre un electrodo recubierto de polmero (polipirrol) y glutaraldehdo, mediador y BSA En perlas porosas de quitosano activadas con glutaraldehdo

Trucha y bacalao

Loung y Male, 1992

Pescado de agua dulce Pescado

Ghosh et al ., 1998

XO, NP, NT

Park y Kim, 1999

XO, NP, NT

En perlas porosas de quitosano Lomo de ternera y Park et al ., 2000 activadas con glutaraldehdo pollo

Nota: XO - Xantina oxidasa, NP - Nucleosida fosforilasa, NT - 5'-nucleotidasa, ALF - Fosfatasa alcalina, AD - Adenosina deaminasa, U - Uricasa

55

Introduccin

Tabla 6. Sensores enzimticos utilizados para determinar hipoxantina en pescado y carne.

Rango de Referencia deteccin 0.06 -1.5 mM Watanabe et al ., 1983

Enzima XO

Transductor

Inmovilizacin

Pescado

XO

XO NP, XO

Amperomtrico. Electrodo de En membrana de triacetato Atn, dorada, oxgeno del celulosa con 1,8 amino-4- cola amarilla aminometiloctano activada con glutaraldehdo Amperomtrico. Electrodo de En membrana de nylon Trucha, carpa, platino vs. Ag/AgCl, 0.7 V preactivada y glutaraldehdo merluza, lenguado Amperomtrico. Electrodo de En membrana de seda y Pescado platino vs. Ag/AgCl, 0.65 V glutaraldehdo Amperomtrico. Electrodo qumico modificado (carbono vitrificado con Nafion), ciclo 0.05 a - 0.8V Amperomtrico. Electrodo qumico modificado (membrana de fibrona de seda y acetato de celulosa) Amperomtrico. Electrodo composite bioenzimtico (grafito-Tefln) con mediador ferroceno, 0.00 V Amperomtrico. Electrodo qumico modificado (pasta de carbono vitrificado con polianilina), ciclo 0.05 a -0.9 V Amperomtrico, electrodo de platino con pelcula de nafion vs. Ag/AgCl, 0.6 V En electrodo de carbono vitrificado modificado con pelcula de Nafion Pescado

3.6 - 107 M Mulchandani et al. , 1989

0 - 100 M 1 - 200 M

Shen et al. , 1996 Hu y Liu, 1997

XO

En membrana de fibrona de Pescado de ro seda activada con glutaraldehdo En la matriz del electrodo composite con mediador ferroceno Sobre el electrodo qumico modificado con pelcula de polianilina por electropolimerizacin Sobre un electrodo de platino cubierto con una pelcula nafion y cross-linking con glutaraldehdo y BSA Sardina

0.1 - 10 M

Quiong et al. , 1998

XO-HRP

0.5 - 10 M

Cayuela et al. , 1998

XO

Pescado

1 - 400 M

Hu et al ., 2000

XO

Pescado

2 - 185 M

Nakatani et al ., 2005

XO XO, NP, NT XO

Amperomtrico. Electrodo de En membrana polimrica oxgeno activada con glutaraldehdo

Ternera

0.1 - 1.2 mM Yano et al ., 1995a

Amperomtrico. Electrodo de En columna con perlas de Ternera 0.03 - 1.8 mM Numata et al ., 1996 oxgeno silica activadas con glutaraldehdo Amperomtrico. Electrodo En electrodo de pasta de Sardina y pollo ----Agi et al ., 2006 pasta de carbono vs. Ag/AgCl carbn con nanocristales de oro

Nota: XO-Xantina oxidasa, NP-Nucleosida fosforilasa, HRP - Peroxidasa

En el mismo contexto, se han desarrollado diversos sensores enzimticos para la determinacin de diferentes aminas bigenas. En la tabla 7 se recogen los sensores enzimticos encontrados en la bibliografa que han sido aplicados a muestras reales de pescado y carne, describiendo de manera general el tipo de transductor, el procedimiento de inmovilizacin empleado, as como algunas caractersticas

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Introduccin

analticas obtenidas. Estos sensores se basan en la reaccin de oxidacin de las AB catalizada por diversas enzimas tales como la amina oxidasa, diamina oxidasa, putrescina oxidasa, tiramina oxidasa, utilizando una diversidad de mtodos de inmovilizacin. La importancia de estos sensores radica en el tipo de enzima utilizada, ya que estas no son especficas para un solo analito. Algunas investigaciones han mostrado que dependiendo de la fuente de extraccin (semillas de guisantes, garbanzo o de origen microbiano) y de la metodologa de purificacin, la enzima presentar mayor o menor actividad por algunas de las aminas bigenas como se muestra en la tabla 8 (Draici et al., 1998; Carsol y Mascini, 1999; Lange et al., 2002; Frebort et al., 2000, Niculescu et al., 2000), siendo esto una caracterstica importante en la eleccin de la enzima para la construccin de dichos sensores. Finalmente, cabe destacar que en los ltimos aos se han realizado grandes progresos en el desarrollo de biosensores, especialmente en la microelectrnica, la micro fabricacin y el desarrollo de nuevos materiales para miniaturizar los sensores enzimticos. Sin embargo, su aplicacin al campo de la industria alimentaria as como su comercializacin a gran escala es un reto an pendiente. La industria alimentaria presenta una serie de caractersticas entre ellas la diversa composicin qumica de los alimentos as como los diversos procesos y variaciones fsicas a las que son sometidos, todas estas caractersticas suponen un reto a la hora de desarrollar biosensores.

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Introduccin

Tabla 7. Sensores enzimticos para la determinacin de aminas bigenas en pescado y carne.

Enzima PUO (Microccccus rubens ) Transductor Inmovilizacin Parmetro Matriz Abadejo Rango de deteccin Referencia Electrodo serigrafiado de Directamente sobre el PU, CA, SD, platino vs Ag/AgCl, 0.6 V electrodo co-inmovilizando AG, TY HRP y mediador 0.06 -200 M (PU), Chemnitius, 1992 0.1 a 14 M (CA), 0.1 a 20 M (SD), 1.5 a 40 M(AG), 0.1 a 6 M (TY) 10 - 70 M Todoriki et al ., 1988

PUO (Microccccus rubens) MAO (Aspergillus niger ), PUO (Microccccus rubens )

Freshness meter KV-101, Enzima libre en disolucin PU, CA, SD sensor de oxgeno Electrodo serigrafiado de Electrodos silanizados por PU, CA, SD, platino vs Ag/AgCl, 0.6 V cross-linking con AG, TY glutaraldehdo

Caballa

Bacalao, Caballa 0.06 -200 M (PU), Chemnitius y Bilitewski, 1996 0.1 a 14 M (CA), 0.1 a 20 M (SD), 1.5 a 40 M(AG), 0.1 a 6 M (TY)

DAO (Cicer arietinum y rin Amperomtrico. Sensor 1. En membrana de acetato de de cerdo) de platino vs Ag/AgCl, celulosa y glutaraldehdo sobre 0.70 V el electrodo de platino, 2. en un reactor con perlas de vidrio activadas con glutaraldehdo, 3. en un reactor coinmovilizando DAO-HRP y un mediador DAO (Rin de cerdo) Electrodo de platino vs En una membrana preactivada Ag/AgCl, 0.70 V de nylon por cross-linking con glutaraldehdo

CA, PU. HI

Pescado

0 - 100 M

Tombelli y Mascini., 1998

CA, PU. HI

Bacalao, Caballa

25 M - 6.0 mM

Bouvrette et al ., 1997

DAO (Plntula de garbanzo) Amperomtrico. En membranas de nylon PU, CA, HI, Electrodo de platino vs activadas con glutaraldehdo SM, TY, SD, Ag/AgCl, 650 mV TRY PYO-OD Amperometrico. de oxgeno Sensor En membrana de triacetato del celulosa con 1,8 amino-4aminometiloctano activadas con glutaraldehdo OC

Anchoas saladas

1 - 50 M

Draisci et al ., 1998

Mariscos

0 -40 mM

Shin et al ., 1998

DAO (rinon de porcino), PUO Electrodo de platino vs Perlas de vidrio poroso HI, AG, PU, (Microccccus roseus ), DAO Ag/AgCl en un reactor activadas con glutaraldehdo CA, TY, SM, (lentejas) acoplado a FIA TRY,SD

Caballa, salmon, atun, salami, embutidos, queso parmesano, queso pecorino Pescado

0.5 - 60 M Carsol y Mascini, 1999 (DAO);0.07 - 500 M (PU)

AO-HRP

Electrodo de grafito con En la matriz del electrodo de HI, PU, CA, TY, CY, AG, SD AO y HRP a -50 mV vs. grafito Ag/AgCl entrecruzado con polmero hidrogel reductor Amperomtrico. Sensor En membrana de colgeno Monoaminas de oxgeno Amperomtrico. En perlas porosas de vidrio TI Electrodo de oxgeno en activadas con glutaraldehdo reactor de columna Amperometrico. Electrodo de oxgeno Hx, PU

-----

Niculescu et al. , 2000

MAO (Aspergillus niger) TAO

Pasta de carne de cerdo Solomillo de ternera Solomillo de ternera Productos crnicos, cerveza, lcteos, vino y alimentos fermentados

----10 - 800 M

Karube et al ., 1980 Yano et al ., 1995b

Sobre una membrana polimrica activada con glutaraldehdo DAO (Cicer arietinum y rin Electrodo serigrafiados de En el electrodo serigrafiados de de cerdo), TAO platino vs Ag/AgCl, 0.7 V pelcula gruesa con (Arthrobacter spp ), AO transglutaminasa y glutaraldehdo

XO, PUO

Yano et al ., 1996

HI, TY, PU

-----

Lange y Wittmann, 2002

AO - Amina oxidasa, DAO - Diamina oxidasa, PUO - Putresina oxidasa, TAO - Tiramina oxidasa,HRP - Peroxidasa PYO - Piruvato oxidasa, OD - Octamina deshidrogenasa, MAO- Monoamina oxidasa HI - histamina, PU - putrescina, CA - cadaverina, TY - tiramina, CY - cistamina, AG - agmatina, SD - spermidina, OC - octopina

58

Introduccin

Tabla 8. Selectividad de la enzima diamina oxidasa segn su fuente de extraccin.

Aminas Bigenas/ Porcentaje de selectividad (%) Enzima HI DAO (Rin de cerdo)1 DAO (Lentejas)1 PUO (Micrococus roseus) 1 DAO (Plntulas de garbanzo)2 DAO (Cicer arietinum )
3 3

PU 28

CA 14 100

TY 1

TR

AG 37

SD <1

SM <1

100 91

100 98 2 <1 100 100 100 <1 <5

12 100 2 <1 <5

10 73 8 100 90

8 30

10

9 71 91 8 <1 <5

<1 <1 <1

50 <1 13

TAO (Arthrobacter spp) AO3

DAO - Diamina oxidasa, PUO - Putresina oxidasa, TAO - Tiramina oxidasa, AO - Amina oxidasa HI - Histamina, PU - Putresina, CA - Cadaverina, TY - Tiramina, SM - Espermina, TR - Triptamina, SD - Espermidina, AG - Agmatina 1. Carsol y Mascini, 1999 2. Draici et al ., 1998 3. Lange et al ., 2002

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2. Objetivos

Objetivos

3. Objetivos
Los parmetros de calidad y seguridad alimentaria en la carne y los productos crnicos curados son de gran importancia para los consumidores, por lo que la industria de la carne demanda mtodos de anlisis viables, rpidos, precisos, de bajo coste y lo ms sencillos posibles. En este contexto, en la presente Tesis Doctoral se plantean dos objetivos principales: 1. Determinar la calidad y seguridad de la carne y productos crnicos curados mediante cromatografa lquida de alta resolucin.

Para la realizacin de este objetivo general se plantean los siguientes objetivos especficos: Evaluar la frescura de la carne durante el proceso de maduracin mediante el anlisis de nucletidos y sus derivados por tcnicas de IP-RPHPLC e HILIC. Evaluar el efecto de las sales de curado (nitrito y nitrato) sobre el contenido de nucletidos y sus derivados y de aminas bigenas durante la fabricacin de un embutido fermentado. Evaluar el efecto de tres formulaciones de salado sobre el contenido de nucletidos y sus derivados y de aminas bigenas durante el proceso de curado del jamn.

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Objetivos

2. Desarrollar sensores enzimticos de tipo amperomtrico como tcnicas rpidas de control de la calidad y seguridad de la carne y productos crnicos curados.

Para la realizacin de este objetivo general se plantean los siguientes objetivos especficos: Desarrollar sensores enzimticos para el anlisis de la hipoxantina y aminas bigenas como indicadores de calidad y seguridad y la mejora de la inmovilizacin de las enzimas implicadas. Optimizar las condiciones de operacin de los sensores enzimticos para el anlisis de hipoxantina y aminas bigenas. Correlacionar los resultados obtenidos con el sensor enzimtico de hipoxantina y aminas bigenas y el mtodo de referencia de cromatografa lquida. Aplicar el uso del sensor enzimtico de hipoxantina como mtodo de control de la maduracin de la carne y de curado en embutidos fermentados y jamn. Aplicar el uso del sensor enzimtico de aminas bigenas en productos curados (embutido fermentado y jamn) como mtodo de control de seguridad.

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3. Plan de Trabajo

Plan de Trabajo

3. Plan de Trabajo
Para cumplir con los objetivos propuestos en esta Tesis Doctoral se plante la realizacin de las siguientes actividades:

1) Obtencin de las muestras crnicas bajo el siguiente esquema de control, en el que se muestran los productos objeto de estudio y las respectivas etapas de muestreo:

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Plan de Trabajo

2) Puesta a punto del sensor enzimtico con la enzima xantina oxidasa (XO) para la determinacin de hipoxantina (Hx). Examinar el comportamiento electroqumico del oxmetro en combinacin con la enzima XO utilizando un sistema con la enzima libre y/o un sistema con la enzima inmovilizada. Optimizacin del mtodo de inmovilizacin de la enzima XO. Optimizacin de las condiciones de operacin del sensor (pH, temperatura) y su comprobacin en trminos de sensibilidad, repetibilidad, reproducibilidad recuperacin y estabilidad. Evaluacin del desarrollo de la reaccin enzimtica (XO-Hx) con la enzima libre en el sensor enzimtico y analizado por HPLC.

3) Puesta a punto del sensor enzimtico con la enzima diamina oxidasa (DAO) para la determinacin de aminas bigenas (AB). Examinar el comportamiento electroqumico del oxmetro en combinacin con la enzima DAO utilizando un sistema con la enzima inmovilizada. Optimizacin del mtodo de inmovilizacin de la enzima DAO. Optimizacin de las condiciones de operacin del sensor pH, selectividad, reproducibilidad y estabilidad.

4) Estudio de la evolucin de los nucletidos y sus derivados analizados por HPLC en la carne y productos crnicos. Anlisis en la carne fresca por cromatografa lquida de alta resolucin con par inico (IP-RP-HPLC) y puesta a punto del mtodo por cromatografa lquida de interaccin hidroflica (HILIC). Puesta a punta del mtodo cromatogrfico para productos crnicos curados por cromatografa lquida en fase reversa (RP-HPLC).

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Plan de Trabajo

5) Estudio de la evolucin de las aminas bigenas analizadas por cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa con par inico (IP-RP-HPLC) y derivatizacin post-columna en los productos crnicos curados (embutido fermentado y jamn). 6) Aplicacin del sensor enzimtico para la determinacin de Hx en la carne y los productos crnicos curados y su correlacin con los mtodos cromatogrficos. 7) Aplicacin del sensor enzimtico para la determinacin de AB en los productos crnicos curados y su correlacin con los mtodos cromatogrficos.

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4. Materiales y Mtodos

Materiales y Mtodos

4. Materiales y Mtodos
Para desarrollar los experimentos derivados del presente trabajo de investigacin se utilizaron muestras de carne fresca de cerdo y de productos crnicos curados (embutido fermentado y jamn curado). Los mtodos de fabricacin y/o la obtencin de las muestras se llevaron acabo en la Planta Piloto del laboratorio de Ciencia de la Carne del Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (I.A.T.A.). Asimismo, la materia prima seleccionada para ello se adquiri de una empresa crnica de la zona de Valencia.

4.1. Materiales
4.1.1. Materias Prima. Para la experiencia con carne fresca se seleccion el msculo Longissimus dorsi de lomos de cerdo procedentes del cruce Landrance x Duroc de cuatro meses de edad. Inmediatamente despus del sacrificio de los animales se seleccionaron cinco lomos normales a fin de evitar la variabilidad en el contenido de nucletidos y sus derivados de los msculos plidos, blandos y exudativos (PSE) y oscuros, firmes y secos (DFD) (Batlle et al., 2000 y 2001). Cada lomo se cubri con film de plstico para evitar su deshidratacin y se colocaron en una cmara de refrigeracin a 4 C para su maduracin y posterior muestreo.

En la fabricacin del embutido fermentado curado se utiliz carne magra y grasa dorsal (tocino) de cerdo, las cuales se trocearon y se congelaron a - 20 C hasta su utilizacin.

Para la fabricacin de jamn curado se seleccionaron cincuenta y cuatro jamones de cerdo del cruce Landrance x Large White de seis meses de edad, con un peso medio de 10 1 Kg y un pH comprendido entre 5.5 y 6.0. Al igual que en la carne

73

Materiales y Mtodos

fresca se eligieron jamones normales para reducir la variabilidad en el contenido de nucletidos y sus derivados. Los jamones se congelaron en un tnel industrial a - 40 C y se almacenaron a - 20 C hasta su utilizacin. Para el proceso de salado de los jamones se adquirieron diferentes tipos de sal tales como el cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), cloruro de calcio (CaCl2) y cloruro de magnesio (MgCl2), de Quality Chemicals (Quality Chemicals S. L., Esparraguera, Barcelona, Espaa).

Adicionalmente se adquirieron en el supermercado cuatro jamones curados comerciales, con tiempos de curado entre 12 y 18 meses. 4.1.2. Reactivos qumicos. a). Determinacin de hipoxantina (Hx) con el sensor enzimtico. Para desarrollar y operar el sensor enzimtico se utiliz la enzima xantina oxidasa (XO, EC.1.2.3.2.) de leche de bovino con una actividad enzimtica de 1.3 U/mg de protena, glutaraldehdo (50 %), cistena, acetato de celulosa, patrones de hipoxantina (Hx), xantina (X) y cido rico (AU) que fueron adquiridos de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA), y cido perclrico, carbonato de potasio y acetona de Scharlau (Scharlau Chemie, S.A., Barcelona, Espaa). Las sales para preparar la disolucin de trabajo, tampn fosfato sdico (NaH2PO4 y Na2HPO4), fueron adquiridas de Panreac (Panreac Qumica, S.A, Barcelona, Espaa).

Otros materiales requeridos en la preparacin de este sensor fue la membrana preactivada Immunodyne ABC (Nylon 66, con un tamao de poro de 0.45 m) que se suministr de Pall Europe (Porsmounth, United Kingdom) y la membrana de Tefln (12.7 m) permeable al oxgeno de Thermo Fisher Scientific Inc. (Madrid, Espaa).

74

Materiales y Mtodos

b). Determinacin de aminas bigenas con el sensor enzimtico. Para desarrollar y operar este sensor se utiliz la enzima comercial diamina oxidasa (DAO, EC.1.4.3.6.) de rin de cerdo con una actividad enzimtica de 0.18 U/mg de slido, glutaraldehdo (50 %), glicina y patrones de histamina (HI), cadaverina (CA), putrescina (PU) tiramina (TY), espermina (SM) y espermidina (SD), los cuales se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, U.S.A.). Las membranas y las sales para preparar las disoluciones de trabajo fueron las mismas a las utilizadas en el sensor de xantina oxidasa. Adicionalmente, se requiri de filtros de corte molecular de 100,000 Da con membrana de polietersulfona (Biomax-PB) y dispositivo para centrifugacin (Ultrafree-CL) adquiridos de Millipore Corporation (Bedford, MA, U.S.A).

c). Determinacin de nucletidos y sus derivados por cromatografa. Los reactivos qumicos utilizados en la preparacin de la fase mvil de las distintas tcnicas cromatogrficas fueron los disolventes acetonitrilo y metanol, supergradiente de grado HPLC, acetato de amonio, cido actico glacial, cido perclrico y carbonato de potasio que fueron adquiridos de Scharlau (Sharlau Chemie, S.A., Barcelona, Espaa). Las sales para el tampn fosfato potsico (KH2PO4 y K2HPO4) y el hidrxido de potasio de Panreac (Panreac Qumica, S.A, Barcelona, Espaa). El par inico PICA (Bisulfato de tetrabutilamonio) se suministr de Waters (Water Corporation, Milford, MA, USA) y los patrones de adenosn trifosfato (ATP), adenosn difosfato (ADP), adenosn monofosfato (AMP), inosina 5 monofosfato (IMP), inosina (Ino), Hx, X, AU, dinucletido de nicotinamida adenina (NAD+), guanosina (G) y uridina (U), creatinina (Cn), guanosn monofosfato (GMP), guanosn difosfato (GDP) y guanosn trifosfato (GTP) se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).

75

Materiales y Mtodos

d). Determinacin de aminas bigenas por cromatografa. En el anlisis de las aminas bigenas por cromatografa se utilizaron los mismos disolventes del apartado anterior y adems, cido perclrico, 2-mercaptoetanol y carbonato de potasio que se adquirieron en Scharlau (Sharlau Chemie, S.A., Barcelona, Espaa). El acetato de sodio, el cido brico, el cido actico glacial, el hidrxido de potasio, el detergente Brij-35 (ter polioxietilenlaurilico) al 30 % en Panreac (Panreac Qumica, S.A, Barcelona, Espaa) y los patrones HI, CA, PU, TR, SD, SM, serotonina (SE), octopamina (OC), dopamina (DO), agmatina (AG), feniletilamina (PHE), triptamina (TR), el orto-ftalaldehdo (OPA) y el par inico (octanosulfonato sdico) se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).

El agua empleada en todos los anlisis fue bidestilada calidad Milli-Q (Millipore, Milli-Q Plus, Billerica MA, U.S.A). 4.1.3. Instrumentacin. Para la construccin del sensor enzimtico, se utiliz un Oxmetro Modelo 20 de Rank Brothers Ltd (Bottisham, Cambridge, England) equipado con un registrador ADC-16 conectado a un ordenador provisto con el programa Pico Log (Pico Technology Limited, St. Netos, Cambridgeshire, United Kingdom). El oxmetro consta de un electrodo de oxgeno constituido a su vez de un disco central de platino (ctodo) de 2 mm de dimetro y un anillo de plata (nodo), una cmara de incubacin que puede ser acoplada a un bao mara para controlar la temperatura de reaccin, una celda de reaccin con una capacidad de 2.5 mL, un sistema de agitacin y un controlador que exhibe la corriente en porcentaje de saturacin de oxgeno (% saturacin) y/o en mg de oxgeno/L (Figura 13).

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Materiales y Mtodos

Embolo Anillo de cierre Junta de silicona Cmara de incubacin Conexin a la toma de agua Conexin a la toma de agua

Anillo de cierre Junta de silicona Membrana de Teflon Base del electrodo Cable de conexin

Controlador

Electrodo de trabajo Tornillo de fijacin

Figura 13. Esquema del Oximetro Mod. 20 Rank Brothers Ltd (Bottisham, Cambridge, England)

Como mtodo de referencia y validacin del sensor enzimtico, se recurri a la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), utilizando un cromatgrafo Agilent modelo 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), equipado con un autoinyector, un sistema de bombeo cuaternario, un compartimiento de columna termostatizado, un sistema de desgasificado a vaco y un detector de diodos en un intervalo de 195 - 300 nm para la deteccin ultravioleta de los nucletidos y sus derivados. Para la deteccin de aminas bigenas, al sistema HPLC se le acopl un detector de fluorescencia de alta sensibilidad en un intervalo de longitud de onda de excitacin de 200 - 700 nm y de emisin de 280 - 900 nm, una bomba extra cuaternaria y un sistema de derivatizacin post-columna, equipado con un colector mezclador T seguido de un espiral de reaccin (de 0.16 mm de dimetro interno y 20 cm de longitud).

4.2. Mtodos de fabricacin, seguimiento y obtencin de muestras.

4.2.1. Maduracin de la carne. La carne fresca (Longissimus dorsi) que se almacen en refrigeracin a 4 C (ver apartado 4.1.1.) para su maduracin, se muestre a las 5, 7, 9, 11, 27, 51 y 171

77

Materiales y Mtodos

horas post mortem. En cada muestreo se extrajeron pequeas virutas de lomo que se congelaron inmediatamente por inmersin en nitrgeno lquido y se envasaron a vaco, a fin de evitar la degradacin de los nucletidos, sobretodo en las primeras horas post-mortem (Batlle et al., 2000 y 2001). Finalmente, las muestras se almacenaron a - 80 C, hasta su anlisis.

A fin de caracterizar que los lomos de cerdo elegidos en efecto era msculos normales, se determin el pH y las prdidas por goteo (Drip loss) a las 24 horas postmortem (n=5) por duplicado, siguiendo el criterio adaptado por Flores et al., 1999. La medida de pH se realiz con un pH-metro Hamilton (Bonaduz AG, Switzerland) en una disolucin de 5 g de muestra triturada y homogenizada con 15 mL de agua bidestilada en un Polytron PT2100 (Kinematica, Inc., Switzerland). En tanto que las drip loss se determinaron cortando tres lonchas, aproximadamente 100 g de cada lomo, se pesaron en una balanza analtica, se introdujeron en una bolsa de polietileno y se mantuvieron suspendidas en una cmara a 4 C durante 72 horas, cuidando que la bolsa permaneciera bien cerrada para evitar prdidas de agua por evaporacin, y/o que no ejerciera presin sobre la loncha para evitar un exudado extra. Las prdidas por goteo se expresaron como el porcentaje de prdida de peso de la muestra con respecto a su peso a las 24 horas post-mortem. 4.2.2. Fabricacin del embutido fermentado curado. El proceso de fabricacin del embutido fermentado curado se llev a cabo bajo un proceso de fermentacin lenta, segn lo descrito por Marco et al., (2006). La carne magra y la grasa dorsal congelada (ver seccin 4.1.1.) fueron trituradas por separado en una mquina picadora con una placa de 10 mm de dimetro; posteriormente se mezclaron en una proporcin 80/20, respectivamente, para formar una masa crnica. Para fines de esta investigacin la masa crnica se dividi en dos lotes. Uno de ellos se destin para la fabricacin del embutido utilizando

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nitrito de sodio (NaNO2), en la sal de curado, mientras que en el otro lote solo se utiliz nitrato de potasio (KNO3). Cada lote se paso a una amasadora al vaco y se aadieron los ingredientes y aditivos en la fabricacin, en la proporcin mostrada en la Tabla 9.
Tabla 9. Ingredientes y aditivos usados en la fabricacin del embutido fermentado curado.
Ingredientes y aditivos Cloruro de sodio Lactosa Dextrina Caseinato de sodio Glucosa Ascorbato Nitrito de sodio Nitrato de potasio Cultivo iniciador g/Kg de mezcla cnica* 27.00 20.00 20.00 20.00 7.00 0.50 0.15 (Lote 1) 0.30 (Lote 2) 0.10

* Carne magra (80 %) y grasa de cerdo (20 %)

El amasado se realiz mediante dos ciclos alternativos de 2 min cada uno, inoculndose a continuacin con el cultivo comercial SP-318 (Danisco, Cultor, Madrid, Espaa), previamente diluido en agua estril, que contena Lactobacillus sakei, Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus xylosus y Staphylococcus carnosus, y repitindose la operacin de amasado. La mezcla crnica se embuti en tripas de colgeno (Fibra, S.A. Girona, Espaa) de 75-80 mm de dimetro, formando piezas de embutido de 500 g aproximadamente. Los embutidos se dejaron reposar en una cmara de refrigeracin a 3 - 5 C durante 24 horas, a fin de que los ingredientes y aditivos agregados se distribuyeran uniformemente. Posteriormente se colgaron en una cmara de maduracin donde se llev a cabo el proceso de secado a una temperatura de 10 C y una humedad relativa (H.R.) entre 75-85 % durante 42 das con prdidas de peso de alrededor del 40 %. Finalmente, los embutidos fueron envasados a vaco y se almacenaron a 4 C hasta alcanzar 91 das.

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A lo largo del proceso de curado se extrajo muestra del centro de tres embutidos en las siguientes etapas: etapa inicial (0 das), etapa de fermentacin (11 das), etapa de maduracin (21 das), etapa final de curado (42 das), etapa de envasado (91 das), las cuales fueron definidas por su evolucin del pH durante el proceso de curado. El pH se midi introduciendo un electrodo de puncin FC200B (Hanna Instruments Inc., Hoonsocket, USA) en el centro del embutido.

El contenido de humedad de las muestras obtenidas se determin segn el mtodo recomendado por la norma ISO (ISO R-1442, 1973), por deshidratacin de las muestras a 110 C en una estufa a presin atmosfrica hasta peso constante.

As mismo, a lo largo del proceso se realiz el anlisis microbiolgico de las muestras obtenidas. 20 g de la muestra fue homogenizada con 180 ml de agua de peptona (15g/litro) en un Masticador Lab-Blender 400 (Seward Medical, Londres, reino Unido) durante 1 min, de la suspensin resultante se realizaron diluciones decimales sucesivas en agua de peptona. La poblacin de bacterias lcticas (BAL) se determin sembrando 1 mL de cada dilucin en MSR Agar (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Espaa) (66 g/L de agua) empleando la tcnica de la doble capa para favorecer el crecimiento anaerobio. El recuento de estafilococos se realiz sembrando una alcuota de 0.1 mL de la dilucin respectiva en Manitol Sal Agar (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Espaa) en una proporcin de 111 g/L de agua por la tcnica de siembra en superficie. Todas las placas se sembraron por duplicado y se incubaron a 30 C durante 3 das.

4.2.3. Fabricacin del jamn curado. El proceso de fabricacin del jamn curado se realiz tal y como se lleva a cabo en la industria crnica. Los jamones seleccionados (ver seccin 4.1.1.) se descongelaron en una cmara de refrigeracin a 3 C durante 5 das.

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Posteriormente, se masajearon manualmente para eliminar los restos de sangre y los lquidos exudados durante la descongelacin. Tres de los jamones se utilizaron para caracterizar la materia prima y los 51 jamones restantes se dividieron en tres lotes, uno de 15 y dos de 18. Antes del salado, la superficie magra de cada jamn se frot con una mezcla de sales nitrificantes (100 ppm de nitrito de sodio y 200 ppm de nitrato de potsio) para el curado. A continuacin cada lote fue salado con diferentes mezclas de sal tal como aparece en la Tabla 10. El primer lote con 100 % de NaCl se utiliz como control.
Tabla 10. Tratamientos de salado propuestos en el estudio de nucletidos y sus derivados y aminas bigenas en jamn curado.
Sal (%) Cloruro de sodio (NaCl) Cloruro de Potasio (KCl) Cloruro de Calcio (CaCl2) Cloruro de Magnesio (MgCl2) Formulacin I 100 II 50 50 III 55 25 15 5

Los jamones se colocaron de manera individual en bandejas de plstico, mantenindose en la cmara de salado durante 11-12 das a 4 C y una humedad relativa entre 85 y 90 %. Transcurrido ese tiempo las piezas se cepillaron para quitar la sal restante de la superficie y se trasfirieron a la cmara de post-salado donde se llev a cabo la homogeneizacin y penetracin completa de la sal. La temperatura se mantuvo en un intervalo de 4 - 5 C y una H.R. entre 75 y 85 %. Los jamones de la formulacin I se mantuvieron en estas condiciones durante 50 das, tiempo normalmente empleado en la industria crnica, mientras que los de las formulaciones II y III se mantuvieron durante 80 das. El incremento en el tiempo de post-salado en estas formulaciones se aplic debido a la menor velocidad de penetracin de las sales divalentes (Blesa et al., 2008). Despus del post-salado, los jamones se trasladaron a una cmara de maduracin mantenindose durante un

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periodo de 11 meses hasta una prdida de peso del 34 %. Para ello, durante esta etapa, la temperatura se incremento paulatinamente de 14 a 20C y la H.R. se disminuy hasta un 70 %.

Con el fin de observar la evolucin en el contenido de nucletidos y sus derivados y de las aminas bigenas a lo largo del proceso de curado en las diversas formulaciones de salado, se tomaron muestras a diferentes tiempos de maduracin. Para ello, de las respectivas cmaras se extrajeron tres jamones de cada formulacin a los 20, 50 y 80 das de post-salado (este ltimo muestreo solo para las formulaciones II y III) y a los 7, 9 y 11 meses de curado. En cada uno de estos jamones se cort una loncha central y se extrajo el msculo semimembranosus, el cual se almacen a - 20 C hasta su anlisis. El msculo semimembranosus se eligi debido a que es el primer msculo que entra en contacto con la mezcla de sales y el efecto podra verse rpidamente.

Por otro lado, a fin de estudiar el efecto de la temperatura y tiempo sobre el contenido de Hx en la etapa final de curado se tomaron muestras del msculo semimembranosus del los jamones de 11 meses de curado de la formulacin I. La muestra se cort en lonchas de 4 mm de grosor, aproximadamente, que se envasaron al vaco y se sometieron a diferentes temperaturas (20 30, 40 y 70 C) y tiempos (0, 20, 40 y 60 min) en un bao de agua. Luego, las muestras se enfriaron en bao con hielo y se colocaron en refrigeracin a 4 C hasta su anlisis.

El contenido de humedad en cada caso se determin mediante la deshidratacin de la muestra a peso constante en un analizador de humedad de calefaccin halgena HB-43 (Mettler Toledo AG, Switzerland) a 175 C. En tanto que el pH se evalo directamente en una disolucin de 2 g de muestra triturada y homogenizada con 5 mL de agua bi-destilada en un Polytron PT2100 (Kinematica, Inc., Switzerland).

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4.3. Mtodos analticos.

4.3.1. Extraccin de nucletidos y sus derivados. La extraccin de nucletidos y sus derivados se realiz conforme al mtodo descrito por Burns y Ke, (1985) con algunos cambios. Durante el proceso de extraccin fue esencial mantener la cadena de fro (4 C), a fin de detener las reacciones de degradacin de los nucletidos, sobretodo en las primeras horas postmortem. Las muestras congeladas de la carne fresca y de los productos curados (ver apartado 4.2.) se trituraron y 5 g de cada muestra se homogenizaron con 15 mL de cido perclrico 0.6 M (enfriado a 4 C) en un masticador (IUL Stomaker, Barcelona, Espaa) en fro durante 4 min en el caso de la carne fresca y 10 min con los productos curados. El extracto se centrfug durante 20 min a 10,000 x g en una centrfuga refrigerada Sorvall RC-SB (Du Pont Instruments). El sobrenadante se filtr a travs de lana de vidrio y 12 mL de esta disolucin se neutralizaron con carbonato potsico (450 mg), hasta alcanzar un intervalo de pH de 6.5 - 7.0. El extracto neutralizado se mantuvo en un bao con hielo durante 20-30 min para terminar de precipitar todo el carbonato potsico. El sobrenadante se almacen a 20 C hasta su anlisis.

Previo a su anlisis por HPLC y por el sensor enzimtico, los extractos crnicos se descongelaron y se centrifugaron en una microcentrfuga Microfuge 22R (Beckman Coulter, Fullerton, CA U.S.A.) a 10,000 r.p.m. durante 5 min a 4 C. A los extractos crnicos que se analizaron por cromatografa HILIC se les adicion tres volmenes de ACN y se centrifugaron durante 10 min a 4 C antes de inyectar. Este proceso permiti desproteizar an ms el extracto y acondicionarlo a la fase mvil cromatogrfica, mejorando con ello la forma de los picos.

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4.3.2. Determinacin de nucletidos y sus derivados por HPLC. 4.3.2.1. Anlisis en carne. 4.3.2.1.1. Cromatografa en fase reversa con par inico (IP-RP-HPLC). Los nucletidos y sus derivados en carne fresca se analizaron por HPLC segn la metodologa propuesta por Veciana-Nogus et al., (1997) y Batlle et al., (2001). El extracto crnico (10 L) (ver seccin 4.3.1) se inyect en una columna Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4.6 mm, 5 m) (Agilent Technologies, USA), acondicionada a una temperatura de 30 C. La separacin cromatogrfica se realiz utilizando los disolventes y el gradiente que se detalla en la Tabla 11, a un flujo de 1.0 ml/min. Despus de cada anlisis, la columna se lav con 100 % de la fase B y se estabiliz durante 15 min en las condiciones iniciales antes de volver a inyectar. La deteccin de los compuestos se realiz a 254 nm obtenindose a su vez los espectros entre 190 y 350 de cada uno de ellos para su identificacin. La cuantificacin se realiz mediante una recta de calibrado obtenida con patrones en las mismas condiciones de anlisis, tal como se detalla ms adelante.
Tabla 11. Condiciones de fase mvil y gradiente en el anlisis de nucletidos y sus derivados en carne fresca por IP-RP-HPLC.
Tiempo (min) 0 5 25 Fase mvil (%) A 100 100 0 B 0 0 100

A: PIC A 5 mM en tampn fosfato de potasio 100 mM pH 6.0 ajustado con KOH B: 75 % fase A: 25 % metanol

4.3.2.1.2. Cromatografa de interaccin hidroflica (HILIC). La separacin de los nucletidos y sus derivados en carne fresca y productos crnicos por cromatografa HILIC se realiz utilizando una columna ZIC-pHILIC (4.6 x 150 mm, 5 m) junto con una precolumna ZIC-pHILIC (2.1 x 20 mm, 5 m), ambas

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obtenidas de SeQuant (Sweden). El extracto crnico (20 L) se inyect en el sistema y se utilizaron los disolventes y las condiciones de separacin que se muestran en la Tabla 12, a un flujo de 0.5 mL/min y una temperatura de 28 C. La columna se equilibr por 15 min en las condiciones iniciales antes de cada inyeccin. Todos los extractos crnicos se filtraron previamente a travs de filtros de nylon de 0.22 m (Millipore) de tamao de poro. La deteccin de los compuestos se realiz a 254 nm y su identificacin se llev a cabo por comparacin del tiempo de retencin y del espectro con sus respectivos patrones. La cuantificacin se realiz mediante una recta de calibrado como se detallar mas delante.
Tabla 12. Condicin de fase mvil y gradiente en el anlisis de nucletidos y sus derivados en carne fresca por HILIC.
Tiempo (min) 0 3 15 25 35 Fase mvil (%) A 15 0 0 0 0 B 0 25 25 50 50 C 80 70 70 40 40 D 5 5 5 10 10

A: Acetato de amonio 150 mM, pH 3.5 B: Acetato de amonio 100 mM, pH 7.0 C: Acetonitrilo D: Agua bidestilada

Ensayos de validacin del mtodo a. Linealidad. La linealidad del mtodo HILIC se evalo obteniendo la recta de calibrado (por triplicado) resultante de correlacionar el rea del pico cromatogrfico (mAU*s) con la correspondiente concentracin de cada analito. La recta de calibrado se calcul utilizando las reas de los picos de seis concentraciones patrn en un intervalo de concertacin previsto en las muestras de la carne de cerdo.

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b. Lmite de deteccin (LD). El LD para cada uno de los analitos analizados en HILIC se baso en la relacin seal/ruido de 3:1. La desviacin estndar de la seal en la zona de tiempo en la que eluyen el analito se calcul tomando la seal media de 20 inyecciones de blanco (reactivos sin extracto crnico) y los valores del LD obtenidos fueron confirmados analizando varias diluciones de un extracto crnico de 5 horas post-mortem.

c. Repetibilidad. En el estudio de repetibilidad se inyectaron sucesivamente ocho extractos de carne de 5 horas post-morten, en las mismas condiciones y por el mismo analista para estimar la concentracin media de cada analito y su desviacin estndar. d. Reproducibilidad. La reproductibilidad del mtodo HILIC se prob en un mismo extracto de carne (5 horas post-mortem), el cual se dividi en ocho alcuota y se almaceno a - 20 C para su anlisis en seis diversos das. As, cada anlisis se realiz por distintos operadores y sistemas HPLC. e. Recuperacin. La recuperacin de todos los compuestos obtenidos se determin adicionando cantidades conocidas de su patrn respectivo a un extracto crnico de 5 horas post-mortem. As, el extracto crnico se enriqueci hasta alcanzar concentraciones equivalentes de 0.5, 1.0 y 1.5 veces los valores obtenidos en el estudio de reproducibilidad. En cada nivel de enriquecimiento, los anlisis se realizaron por duplicado y la recuperacin se calcul por comparacin con una muestra no enriquecida. 4.3.2.2. Anlisis en productos curados. 4.3.2.2.1. Cromatografa en fase reversa (RP-HPLC). La determinacin de nucletidos y sus derivados en el caso de los productos curados se realiz por cromatografa en fase reversa utilizando una columna Synergi

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C18 MAX-RP 80A (150 x 4.6 mm, 5 m) (Phenomenex, Torrance, CA, USA). El extracto crnico (10 L) se inyect en el sistema a un flujo de 0.8 mL/min a 30 C. La composicin de la fase mvil y el gradiente empleado en la separacin se muestra en la Tabla 13. Despus de cada inyeccin la columna se lav con 60 % de metanol durante 5 min y se equilibr 10 min bajo condiciones iniciales antes de la siguiente inyeccin. La deteccin de los compuestos se realiz a una longitud de onda de 270 nm para la xantina, 295 para el cido rico y 254 nm para el resto de los compuestos, su identificacin se llev a cabo por comparacin del tiempo de retencin y del espectro entre 190 y 350 nm con los de sus respectivos patrones. La cuantificacin se realiz mediante una recta de calibrado.
Tabla 13. Condiciones de fase mvil y gradiente en el anlisis de nucletidos y sus derivados en productos curados por RP-HPLC.
Tiempo (min) 0 12 25 Fase mvil (%) A 100 100 80 B 0 0 20

A: Tampn fosfato potsico 50 mM pH 4.0 ajustado con H3PO4 B: Metanol

4.3.2.3. Rectas de calibrado. Para construir las rectas de calibrado en cada una de las tcnicas cromatogrficas, se prepar una disolucin stock de los patrones de calibracin (1 mM) con el disolvente de la muestra (cido perclrico 0.6 M neutralizado con carbonato potsico a pH 6.5-7.0). Las disoluciones de trabajo se prepararon en un intervalo apropiado de concentraciones por dilucin de la disolucin stock con el mismo disolvente. En el caso de la cromatografa HILIC la disolucin stock se prepar diluyendo el disolvente de la muestra con un volumen de ACN (50:50) y las

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subsecuentes diluciones con una disolucin cido perclrico 0.6 M neutralizado:ACN (50:50 v/v). Todas las disoluciones patrn se almacenaron a -20 C.

Finalmente, la fase mvil utilizada en cada una de las tcnicas cromatogrficas en el sistema HPLC, se filtr al vaco a travs de un filtro de tamao de poro de 45 m (Milllipore) y se desgasific en el ultrasonidos.

4.3.3. Determinacin de hipoxantina con el sensor enzimtico. La medida amperomtrica de la hipoxantina se llev a cabo con un oxmetro, descrito en el apartado 4.1.3. y la enzima xantina oxidasa (libre o inmovilizada) lo que denominaremos, respectivamente, sistema enzimtico con la enzima libre o un sistema enzimtico con la enzima inmovilizada.

La calibracin inicial del oxmetro se consigui dejndolo estabilizar la corriente de entrada al controlador, conectndolo a la fuente de electricidad durante 15 min y ajustando posteriormente a cero. Sobre el electrodo de oxgeno, ctodo de platino y nodo de plata, se coloc un pauelo de papel (1.5 cm2 con un hueco de 2 mm en el centro) humedecido con un electrlito alcalino (cloruro de potasio 3 M) a fin de conseguir el puente elctrico entre ellos y cerrar el circuito. Sobre este se coloc una membrana de Tefln (1.5 cm2) asegurando que el electrodo de platino estuviese en el centro y que no hubiese burbujas de aire atrapadas (Figura 14). Al sistema se le acopl la cmara de incubacin y mediante una junta de silicona se sujetaron las membranas, como puede apreciarse en la figura 13. La cmara se conect a un bao de agua y con recirculacin forzada se control la temperatura de reaccin. Finalmente, el electrodo de oxgeno se conect al controlador y el potencial de polarizacin se fij a - 600 mV con respecto al electrodo de referencia de Ag/AgCl.

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Sensor de oxgeno
Membrana enzima inmovilizada Membrana de Tefln Membrana de Papel Ctodo de platino nodo de plata

Figura 14. Esquema del montaje de las membranas en el sensor de oxgeno

La sensibilidad del equipo se ajust llenado la celda de reaccin con agua bidestilada saturada de oxgeno (1 mL) en condiciones de agitacin hasta conseguir una lectura del 100 % de saturacin. As, el potencial aplicado al oxmetro, especficamente al sensor de platino (ctodo), es un voltaje lo suficientemente negativo respecto al electrodo de plata (nodo) para que todo el oxgeno que haya en la disolucin en la celda de reaccin difunda a travs de la membrana de tefln, alcance el electrodo de platino y se reduzca (ecuacin 13a y 13b), de modo que la corriente resultante que fluye entre los electrodos es proporcional a la presin parcial de oxgeno en el sistema, relacin establecida por la Ley de difusin de Fick, (ecuacin 13c). El controlador a su vez convierte ese voltaje directamente en una corriente que se exhibe en unidades de porcentaje de saturacin y/o en mg de oxgeno/L, cuya transformacin se realiz con antelacin en el programa de registro de datos a la temperatura de anlisis, utilizando las tablas de Colt J., (1984).

A continuacin se establecieron las condiciones iniciales de funcionamiento para ambos sistemas enzimticos. La diferencia en el sistema inmovilizado fue situar la membrana con la enzima inmovilizada sobre las membranas de papel y tefln, ya colocadas (Figura 14).

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(13)
Reaccin en el ctodo
O + 2H O + 4e 4OH 2 2 (a)

Reaccin en el nodo
4 Ag + 4Cl 4 AgCl + 4e (b)

I = 4 F Pm A

pO 2 b

(c)

Ctodo

donde: I, corriente del elctrodo; F, constante de Faraday; Pm, permeabilidad del O2 en la membrana de Tefln; A, rea del ctodo; b, grosor de la membrana de Tefln; pO2, presin parcial del oxgeno en la disolucin.

XO

nodo

Hipoxantina

4.3.3.1. Sistema enzimtico con la enzima libre. Para determinar el contenido de hipoxantina en el sistema con la enzima libre, la celda de reaccin (termostatizada a 30 C) se llen con 900 L de la disolucin de reaccin (tampn fosfato sdico 50 mM, pH 7.6) y se agit suavemente con una varilla magntica hasta que la seal de oxgeno se mantuvo constante. Inmediatamente, se inyect 10 L de una disolucin enzimtica, conteniendo 0.0169 U de la enzima disuelta en tampn fosfato sdico 50 mM, pH 7.6, y se mantuvo en agitacin durante 45 s ms a fin de homogenizar la enzima en la disolucin de reaccin. Posteriormente, se inyect 100 L del extracto crnico o del patrn de Hx (0 - 1 mM) y se registr el cambio del consumo de oxgeno durante la reaccin enzimtica hasta que la seal de respuesta se mantuvo constante. La acumulacin del oxgeno (mg/L) a 190 s se extrapol en una recta de calibrado de patrn de Hx obtenida en las mismas condiciones a diferentes concentraciones. La disolucin patrn y las diluciones requeridas para la recta de calibrado se prepararon como se describi en el apartado 4.3.2.3.

Con este sistema se evalu y se optimiz la operacin del sensor enzimtico. Para ello se realizaron algunas pruebas de reconocimiento del sistema, tales como: la monitorizacin del consumo de oxgeno durante la reaccin enzimtica a diferentes condiciones de pH (5.6, 6.6, 7.6 y 8.6), temperatura (25, 30, 35 y 40 C),

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concentracin de sustrato y de enzima. Asimismo, debido a que la seal detectada en el sensor enzimtico, corresponde al oxgeno consumido resultado del efecto cataltico de la xantina oxidasa sobre la hipoxantina y la xantina se determin la cintica enzimtica de la enzima, como se muestra a continuacin.

4.3.3.1.1. Evolucin de la reaccin enzimtica. Veinte microlitros de una disolucin patrn de hipoxantina (1 mM) se inyect en el sistema a diferentes temperaturas (25, 30, 35 y 40 C). Durante la reaccin enzimtica se extrajo una alcuota de 30 L cada 10 s y se mezcl inmediatamente con un volumen igual de cido perclrico (1 M) para detener la reaccin. Posteriormente, la mezcla se neutraliz adicionando 2.25 mg de carbonato potsico. El extracto neutralizado se centrifug en una micro centrifuga a 10,000 r.p.m. durante 5 min a 4 C y 30 L de las muestras obtenidas se inyectaron en el cromatgrafo por triplicado como se describe en el apartado 4.3.2.2.1 .

4.3.3.2. Sistema enzimtico con la enzima inmovilizada. 4.3.3.2.1. Inmovilizacin de la enzima xantina oxidasa. La inmovilizacin de la enzima xantina oxidasa se desarroll con base en lo descrito por Watanabe et al., (1983), Mulchandani et al., (1990) y Luong y Male, (1992) con algunos cambios. La membrana de xantina oxidasa se prepar por entrecruzamiento o cross-linking de la enzima con glutaraldehdo y su posterior unin covalente con la membrana preactivada Immunodyne ABC. De esta manera, una mezcla de 50 L, conteniendo 15 L de la disolucin enzimtica con 0.50 U de la enzima, 27 L del tampn fosfato sdico (50 mM, pH 7.6) y 8 L de una disolucin de glutaraldehdo al 12.5 %, se deposit gota a gota sobre la membrana preactivada (1 cm2). La membrana se sec al aire durante una 1 hora para iniciar el entrecruzamiento; posteriormente, se sumergi en una disolucin de la cistena 0.10 mM durante 20 min a fin de estabilizar el proceso de inmovilizacin. Para

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eliminar el exceso de glutaraldehdo, la membrana se lav exhaustivamente con el tampn fosfato. Una vez escurrida y seca se aadi 5 L de una disolucin de acetato de celulosa al 2 % diluida en acetona, para evitar la contaminacin de algunas formas de inclusin y de adsorcin de protenas del extracto de carne en la membrana (Qiong et al., 1998). Finalmente, la membrana se dej secar al aire durante 5 min para evaporar el disolvente y se almacen en el tampn fosfato sdico a 4 C hasta su utilizacin.

Una vez se obtuvo la membrana con la enzima inmovilizada, 40 L del patrn de Hx a diferentes concentraciones o del extracto crnico debidamente diluido en el disolvente de extraccin se inyect directamente sobre la membrana con una microjeringa de cristal Hamilton (Anlisis Vinicos, Tomelloso, Espaa). As, el contenido de Hx en las muestras de carne y los productos crnicos, se calcul a partir del consumo acumulado de oxgeno obteniendo la velocidad de reaccin (mg O2/Ls-1) y extrapolando el valor en una recta de calibrado de Hx obtenida en las mismas condiciones. Despus de cada inyeccin, la membrana de XO se lav tres veces con el tampn fosfato, se sec con un pauelo de papel y se restaur el equilibrio del sistema con el oxgeno atmosfrico durante 3 min antes de una nueva inyeccin. Cada tres inyecciones consecutivas de extracto de carne en ambos sistemas enzimticos se utiliz una disolucin del cloruro de sodio (NaCl) 125 mM para el lavado del sistema y as, evitar futuros problemas de contaminacin proteica (Luong y Male, 1992). 4.3.3.3. Ensayos de validacin del sensor enzimtico. a. Linealidad. La linealidad en ambos sistemas enzimticos, libre e inmovilizado, se obtuvo del anlisis por triplicado de su respectiva recta de calibrado. As, un intervalo de concentracin (0 - 1 mM) del patrn de Hx se correlacion con la seal

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obtenida en cada sensor. El ajuste de la recta se realiz utilizando el mtodo de los mnimos cuadrados. b. Repetibilidad. La medida de repetibilidad se determin por inyeccin repetida de una misma concentracin de Hx (1mM) o de un extracto de carne de 7 horas post-mortem, los cuales se analizaron en el mismo da, con el mismo equipo y bajo las mismas condiciones de operacin de cada sensor enzimtico. La medida de la repetibilidad se calcul obteniendo el coeficiente de variacin (%). c. Recuperacin. Dos muestras de carne fresca de cerdo de 7 horas post-mortem se enriquecieron con 0.5, 1.0 y 1.5 veces la concentracin natural de Hx respectivamente y se analiz en el sistema enzimtico con la enzima inmovilizada, por cuadruplicado. El porcentaje de recuperacin se calcul comparando la seal obtenida en la muestra no enriquecida con la obtenida para cada nivel de enriquecimiento. d. Estabilidad. La estabilidad de la enzima xantina oxidasa se evalo en ambos sensores enzimticos. En el sistema con la enzima libre, cinco disoluciones enzimticas conteniendo 0.0169 U de la enzima en tampn fosfato sdico (50 mM, pH 7.4) se prepararon y se almacenaron a 4 C. Cada disolucin enzimtica se utiliz una semana, inyectando de manera sucesiva cuatro inyecciones de 20 L de Hx (1 mM) por da durante tres das para su evaluacin. En el sistema con la enzima inmovilizada, se evalo la estabilidad operacional de la membrana de XO y su estabilidad durante el almacenamiento a 4 C. En el primer de los casos se realizaron inyecciones sucesivas sobre la membrana con disoluciones patrn de Hx a lo largo del da (aproximadamente 30 inyecciones/da) durante tres das seguidos, almacenndose a 4 C cuando no se utilizaba. En el segundo de los casos, seis membranas de XO se almacenaron en tampn fosfato sdico (50 mM, pH 7.4) a 4 C

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Materiales y Mtodos

y su estabilidad se evalu cada quince das, obteniendo su respectiva curva de calibracin por duplicado.

Finalmente, el contenido de Hx obtenido en la carne y los productos crnicos en ambos sistemas enzimticos se correlacionaron con aquellos obtenidos por HPLC. 4.3.4. Extraccin de aminas bigenas. El proceso de extraccin de la aminas bigenas (AB) en las muestras de los productos crnicos curados (embutido fermentado y jamn), fue similar al empleado para los nucletidos y descrito en el apartado 4.3.1.

4.3.5. Determinacin de aminas bigenas en productos crnicos curados por IPRP-HPLC y derivatizacin post-columna. Las aminas bigenas se analizaron por cromatografa en fase reversa con par inico y derivatizacin post-columna con orto-ftalaldehdo (OPA) segn el mtodo propuesto por Hernndez-Jover et al., (1996), utilizando una columna Nova Pak C18 (3.9 x 150 mm, 4 m) (Waters Cromatografa). La separacin cromatogrfica se llev a cabo en gradiente entre dos disolventes tal como se muestra en la tabla 14 a un flujo de 1 mL/min. El eluyente de la columna se mezcl a travs de una conexin en T y una espiral de reaccin (de 0.16 mm de dimetro interno y 20 cm de longitud) con el reactivo de derivatizacin que consisti en una disolucin de cido brico (31.0 g/L) e hidrxido de potasio (26.0 g/L) en agua bidestilada, aadiendo 3 mL/L de Brij-35 al 30 %, 3 mL/L de 2-mercaptoetanol y 200 mg/L de orto-ftalaldehdo (OPA, previa disolucin en 5 mL de metanol). Dicho reactivo se impuls a 0.5 mL/min por medio de una bomba de HPLC Agilent modelo 1050 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) hasta la conexin en T antes mencionada. La deteccin de las AB se realiz con un detector de fluorescencia a una longitud de onda de excitacin 340 nm y emisin 445 nm y su identificacin se llev a cabo por

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Materiales y Mtodos

comparacin del tiempo de retencin con sus respectivos patrones. Tras el anlisis, la columna se equilibr en condiciones iniciales durante 10 min antes de la siguiente inyeccin.
Tabla 14. Gradiente de fase mvil para el anlisis de aminas biognas por IP-RP-HPLC y derivatizacin post-columna.
Tiempo (min) 0 45 Fase mvil* (%) A 80 20 B 20 80

Fase A: Octanosulfonato sdico 10 mM en tampn acetato sdico 100 mM, pH 5.20 ajustado con cido actico glacial. Fase B: 66% de octanosulfonato sdico 10 mM en tampn acetato sdico 200 mM, pH 4.20 ajustado con cido actico glacial, y 34% acetonitrilo

La cuantificacin de las AB se realiz empleando el rea de los picos cromatogrficos por interpolacin en las correspondientes rectas de calibrado obtenidas con patrones de AB en las mismas condiciones de anlisis. Para construir las rectas de calibrado, se prepar una disolucin madre (1 mg/mL) de cada uno de los patrones de las aminas ensayadas en el disolvente de extraccin de las muestras (cido perclrico 0.6 M neutralizado con carbonato potsico a pH 6.5-7) a partir de la cual se prepararon las disoluciones de trabajo en el intervalo apropiado de concentraciones por dilucin con el mismo disolvente. La dilucin madre se conserv durante una semana a -20 C y protegida de la luz. 4.3.6. Determinacin de aminas bigenas con el sensor enzimtico. La determinacin de las aminas bigenas se llev acabo tambin en un sensor enzimtico construido con un oxmetro (descrito en el apartado 4.1.3.) y la enzima comercial diamina oxidasa de rin de cerdo (DAO, EC 1.4.3.6) inmovilizada en una membrana preactivada Immunodyne ABC (1 cm2). La calibracin inicial del oxmetro

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Materiales y Mtodos

y el ensamble de la membrana enzimtica se realiz en condiciones similares a las descritas en el apartado 4.3.3. 4.3.6.1. Inmovilizacin de la enzima diamina oxidasa. El proceso de inmovilizacin de la DAO se llev a cabo mediante unin covalente de la enzima y entrecruzamiento con glutaraldehdo a una membrana de nylon preactivada. Previo a la inmovilizacin, a fin de concentrar la enzima y limpiarla de impurezas, 1 mL de una disolucin enzimtica que contiene 110 mg de DAO (0.18 U/mg de slido) en tampn fosfato sdico (100 mM, pH 7.2) se concentr dos veces, por centrifugacin a 4470 r.p.m. durante 40 min a travs de un filtro de corte molecular de 100,000 Da utilizando una centrifuga Medifringer BL-S (J. P. Selecta, Barcelona, Espaa). As, 5 L de la disolucin enzimtica concentrada se deposit sobre la membrana y se dej secar durante 15 min al aire. A continuacin, la membrana se sumergi cuidadosamente, del lado opuesto a donde se deposit la enzima, en una disolucin de glutaraldehdo al 1 % durante 30 s e inmediatamente se lav cinco veces con una disolucin de glicina 100 mM (diluida en tampn fosfato sdico 100 mM, pH 7.2.) para estabilizar la inmovilizacin. La membrana se lav exhaustivamente con el tampn fosfato sdico (100 mM, pH 7.2) antes de almacenarla en el mismo tampn a 4 C hasta su utilizacin.

Obtenida la membrana enzimtica, se mont en el sistema, como se observa en la figura 14, y se le aplic un voltaje de -600 mV vs. Ag/Agul. Tras su estabilizacin a 30 C, 40 L del patrn de las AB o del extracto crnico debidamente diluido en el disolvente de extraccin (cido perclrico 0.6 M neutralizado con carbonato potsico) se inyectaron directamente sobre la membrana. El cambio de corriente (C) producido desde el momento de la inyeccin hasta los 50 s se utiliz como seal de medida, siendo sta proporcional al oxgeno consumido (mg 02/L) durante la reaccin enzimtica. Debido a que la enzima DAO no es especfica para un solo

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Materiales y Mtodos

sustrato, pues oxida una variedad de monoaminas, diaminas la seal de respuesta del sensor enzimtico al inyectar una muestra crnica se utiliz como indicador del contenido total de AB presentes. Despus de cada inyeccin, la membrana DAO se lav tres veces con el tampn fosfato (atemperado a 30 C), se sec con un pauelo de papel y se restaur el equilibrio del sistema con el oxgeno atmosfrico durante 3 min antes de una nueva inyeccin.

En estas condiciones de operacin se evalu y optimiz el sensor enzimtico. Se verific la selectividad de la DAO inmovilizada inyectado una concentracin fija de 0.01 mg/mL de cada una de las aminas comnmente encontradas en los productos crnicos curados (HI, PU, CA, TY, SM y SM). Adems, se estudio el desarrollo de la reaccin enzimtica a 30 C, por triplicado, con patrones de HI y PU (0.02 mg/mL) diluidos en tampn fosfato 100 mM, a diferentes condiciones de pH (6.2, 7.2, 8.2 y 9.2).

4.3.6.2. Ensayos de validacin del sensor enzimtico a. Linealidad. La linealidad del sistema enzimtico se obtuvo tras el anlisis por triplicado de la recta de calibrado de histamina. As, un intervalo de concentracin de 0 a 0.2 mg/mL del patrn se correlacion con la seal obtenida y el ajuste de la recta se realiz utilizando el mtodo de mnimos cuadrados. b. Repetibilidad. La medida de repetibilidad se determin por inyeccin repetida de tres muestras: un patrn de histamina (0.01 mg/mL), un extracto crnico de un embutido fermentado de 42 das de curado y un jamn curado de 11 meses de maduracin. Las mediciones se realizaron en el mismo da, con el mismo equipo y bajo las mismas condiciones de operacin. La medida de la repetibilidad se calcul obteniendo el coeficiente de variacin (%).

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Materiales y Mtodos

d. Estabilidad. La estabilidad de la enzima DAO inmovilizada, se evalo midiendo: 1) la estabilidad operacional; realizando inyecciones sucesivas sobre la membrana de una disolucin patrn de histamina (0.01 mg/mL) a lo largo del da durante dos das seguidos y, 2) su estabilidad durante el almacenamiento a 4 C; para ello diez membranas de DAO se almacenaron en tampn fosfato sdico (100 mM, pH 7.2) a 4C y se evalu una cada semana, obteniendo la respuesta por triplicado de un patrn de histamina (0.01 mg/mL).

4.4. Anlisis estadstico de resultados. El anlisis estadstico de los datos se realiz mediante el paquete Statgraphics Plus (v 5.1) bajo el procedimiento ANOVA (anlisis de varianza mltiple o simple). En el caso en que el efecto de los factores o de la interaccin fuera significativas, las medias fueron comparadas utilizando el mtodo de la diferencia minima significativa de Fishers (LSD) (p <0,05 o p<0,001). Previamente, se verific la normalidad de la distribucin de los datos y la homogeneidad de las varianzas. Para correlacionar y validar los valores de Hx y aminas bigenas obtenidos en el sistema enzimtico, libre o inmovilizado, respecto a aquellos obtenidos en el HPLC se realiz un anlisis de correlacin lineal y se obtuvo el coeficiente de correlacin.

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5. Resultados y Discusin

Resultados y Discusin

5. Resultados y Discusin
El creciente inters de la industria, especialmente en el sector alimentario por realizar un control de calidad ms rpido y econmico justifica la demanda de mtodos analticos que cubran sus necesidades y que puedan ser usados en lnea. La tecnologa de biosensores ha experimentado un notable avance en los ltimos aos (Luong et al., 1997; Dornelles y Tatsuo, 2002; Dzyadevych et al., 2008), principalmente en el desarrollo de dispositivos aplicados al rea de biomedicina; sin embargo, esta tecnologa se ha ido transfiriendo paulatinamente de forma horizontal a otros sectores como el medioambiental, y de forma ms incipiente al agroalimentario. En este contexto, los biosensores juegan un papel importante para la industria y suponen un avance para el control y estimacin de la calidad de los alimentos. Las caractersticas ms destacables de estos dispositivos son su especificidad, su alta sensibilidad, su corto tiempo de anlisis, su capacidad de inclusin en sistemas integrados y su capacidad de trabajar en tiempo real (Yano et al., 1995; Dzyadevych et al., 2008). De este modo, se han desarrollado diferentes tipos de biosensores, siendo los sensores amperomtricos enzimticos los que ms se han utilizado en el anlisis de alimentos (Terry et al., 2005). La principal dificultad para la aplicacin de estos dispositivos es la amplia variedad de posibles productos que se pueden encontrar en la industria, con la consiguiente dificultad en adaptarlos a cada una de las matrices e intervalos de concentracin de los analitos en stos (Prodromidis y Karayannis, 2002). En el presente trabajo de investigacin se ha desarrollado un sensor enzimtico, utilizando principios simples de construccin, para su aplicacin en la deteccin de marcadores de calidad de la carne y productos crnicos (embutido fermentado y jamn curado). En particular, se ha puesto a punto para la determinacin de hipoxantina (Hx) y aminas bigenas (AB), como indicadores de frescura, maduracin y seguridad, as como la validacin y correlacin de los resultados con los obtenidos por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC),

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Resultados y Discusin

como mtodo de referencia. A lo largo de este trabajo se irn describiendo cada uno de los puntos planteados. En principio se estableci la puesta a punto y la optimizacin de las condiciones de operacin del sensor enzimtico para la medida de cada uno de los compuestos propuestos.

5.1. Puesta a punto y optimizacin del sensor enzimtico.

El sensor enzimtico es un dispositivo analtico que incorpora un enzima, como elemento de reconocimiento biolgico, asociado a un sistema de transduccin que permite procesar de manera rpida la seal bioqumica generada en presencia de un sustrato especifico. Los enzimas oxido-reductasas son de particular inters en la construccin de este tipo de biosensores, sobre todo en los de carcter amperomtrico. Estos enzimas, durante la reaccin con el sustrato, catalizan la transferencia de electrones mediante la reduccin de oxgeno (principal co-sustrato de la reaccin) u oxidacin del agua, a perxido de hidrgeno (H2O2) para generar una seal elctrica cuantificable. De manera general, se puede decir que la enzima le confiere la selectividad al sistema mientras que la sensibilidad se la otorga el sistema de transduccin y las tcnicas electroqumicas empleadas, aunque estas ltimas tambin pueden influir en la selectividad. Tomando en cuenta esas consideraciones y las caractersticas del equipo utilizado (ver apartado 4.1.3.), se eligieron por su importancia en la calidad de la carne y sus productos crnicos, las enzimas xantina oxidasa (XO), en la determinacin de hipoxantina, y la diamina oxidasa (DAO) en la deteccin de aminas bigenas. An cuando la utilizacin de enzimas en este tipo de sensores es de gran ventaja, por su alta selectividad, la actividad de las mismas es regulada por diferentes factores como el pH, la temperatura, la fuerza inica, su especificidad, la forma de actuacin (libre o inmovilizada), entre otros. Es por ello que la puesta a punto de cada uno de los sensores enzimticos consisti en primer lugar en examinar el comportamiento electroqumico del oxmetro con base en su

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Resultados y Discusin

principio de operacin (ver apartado 4.3.3.), utilizando un sistema con la enzima libre o un sistema con la enzima inmovilizada, como se describe a continuacin. 5.1.1. Sensor enzimtico con la enzima xantina oxidasa. La construccin del sensor enzimtico con la enzima XO se desarroll de acuerdo a lo descrito en el apartado 4.3.3. Una vez que el patrn Hx o el extracto crnico se inyect en la celda de reaccin ocurre la reaccin representada por la ecuacin (14). La enzima XO cataliza la oxidacin de la Hx a xantina (X) y luego cataliza la oxidacin de sta en cido rico (AU). La corriente resultante de la reduccin del oxgeno (mg O2/L) (durante la oxidacin de la Hx) en el sensor enzimtico reduce la presin parcial de oxgeno de manera proporcional, permitiendo el clculo del contenido de Hx presente en la muestra (Volpe y Mascini, 1996). (14)

En la figura 15 se representa el oxgeno consumido en funcin del tiempo de reaccin durante la oxidacin de un patrn de Hx en el sistema con la enzima libre. En la curva de evolucin se aprecia un primer tramo lineal, til desde el punto de vista analtico (definido como la velocidad de reaccin en funcin del tiempo), y a medida que avanza la reaccin la curva se va haciendo asinttica, ya que se va agotando el contenido de Hx y, por tanto, disminuyendo la velocidad de la reaccin. Escribano et al., (1988) mencionan que debido al hecho que la oxidacin de la Hx y de la X son secuenciales (ecuacin 14), el estudio cintico de la reaccin de oxidacin de la Hx por s sola es complicada ya que la actividad secundaria de la XO

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Resultados y Discusin

sobre la X ocurre simultneamente con la formacin de sta como producto de la primera reaccin de oxidacin. As pues, el consumo de oxgeno, como seal de respuesta del sensor enzimtico se debe tanto a la oxidacin de la Hx como a la de la X formada de esta reaccin, reflejndose pues como la suma de Hx+X (Figura 15).

1.20

1.00

Consumo 0 2 (mg/L)

0.80

Velocidad de reaccin

0.60

Hx + X
0.40

Hx + 02 X + H2O2 X + 02 H2O2 + AU

0.20

0.00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 Tiempo (seg)

Figura 15. Respuesta del sensor enzimtico en el sistema con la enzima libre representada como oxgeno consumido en funcin del tiempo de reaccin. 18.72 M de Hx en tampn fosfato 50 mM, pH 7.6 a 30 C y 0.0169 U de xantina oxidasa.

En este contexto, la optimizacin del sensor con la enzima XO se desarroll con la enzima libre y posteriormente se retomaron estos resultados para optimizar el sensor con la enzima inmovilizada. La seal del sensor enzimtico (Hx+X) se transform en velocidad de reaccin de la enzima XO (mg/L de O2 s-1) para la cuantificacin de la Hx, como se describir mas adelante.

104

Resultados y Discusin

5.1.1.1. Sistema enzimtico con la enzima libre. El potencial elctrico para la deteccin amperomtrica de hipoxantina se eligi lo suficientemente negativo (- 600 mV) como para reducir el oxgeno en el electrodo de platino. Este potencial se eligi para evitar reacciones interferentes por parte de otros compuestos, fcilmente oxidables a potenciales positivos (cido ascrbico, glutatin, cido rico, perxido de hidrgeno) aunque puede dar lugar a una corriente de fondo elevada (Reviejo y Pingarrn, 2000). Sin embargo, operando el sensor con una cantidad mnima de electrolito (membrana de papel hmedo con KCl 3M) y utilizando una membrana de Tefln permeable al oxgeno se reduce la corriente residual y se incrementa la selectividad del sensor (Falck, 1997).

La cantidad de enzima utilizada en este sistema se optimiz adicionando diferentes concentraciones de enzima hasta obtener una intensidad de corriente suficientemente detectable, manteniendo constante el contenido de Hx, de forma que a mayor cantidad de enzima la velocidad de conversin del sustrato es mayor hasta un punto que es tan rpida que no se detecta. La concentracin de enzima 0.0169 U de XO a 30 C fue la que present mejores resultados de sensibilidad y permiti obtener un mayor intervalo de linealidad.

El pH de la disolucin de reaccin, evaluado en un intervalo de pH de 5.6 a 8.6, frente a la velocidad cataltica de la enzima XO, se muestra en la figura 16, observndose que ste afecta la estabilidad de la enzima y por ende la sensibilidad del sensor enzimtico. La mxima respuesta se obtuvo a un pH de 7.6, valores superiores e inferiores disminuyen la seal de respuesta para una misma concentracin de Hx. Resultados similares fueron observados por Gonzlez et al., (1991); Luong y Male, (1992) que encontraron que el intervalo de pH ptimo para la mxima actividad de la enzima XO se encuentra entre 7.0 - 8.0 con un mximo a 7.5. Nakatani et al., (2005) mencionan que la dependencia del pH se debe al nivel de

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Resultados y Discusin

protonacin, alterando la velocidad de formacin o rotura del complejo enzimasustrato. Como resultado de este estudio, la disolucin de reaccin a pH 7.6 se utiliz para las subsecuentes experiencias.
Velocidad enzimtica (mg O2/ L s )
-1

0.016 0.014 0.012 0.010 0.008 0.006 4.6 5.6 6.6 pH 7.6 8.6 9.6

Figura 16. Efecto del pH sobre la velocidad de reaccin de la enzima xantina oxidasa determinado en el sensor enzimtico con la enzima libre. 20 L de patrn de Hx (1 mM), en tampn fosfato sdico a diferente pH, 0.0169 U de XO a 30 C.

El efecto de la temperatura del medio de reaccin sobre la velocidad cataltica de la enzima XO se investig por dos vas: Evaluando la desaparicin de Hx durante su oxidacin (apartado 4.3.3.1.1.) por HPLC (Figura 17) y midiendo el consumo de oxgeno en el sensor enzimtico a diferentes temperaturas (25, 30, 35 y 40 C) (Figura 18). La tendencia general indica que a temperaturas altas la velocidad de reaccin de una enzima es mayor. En el primer caso se comprueba esa teora, en general se observaron diferencia significativas (p < 0.05) en la oxidacin de Hx a diferentes temperaturas, sobretodo al final del proceso, y as por ejemplo, a temperaturas de 40 C la oxidacin total de la Hx ocurre a los 40 s respecto a 80 s a 25 C. La oxidacin de Hx a 30 C fue la que mostr la mejor estabilidad en cuanto a dispersin de resultados.

106

Resultados y Discusin

1.0

Oxidacin de la hipoxantina (mol)

0.8 Hx 25 C Hx 30 C Hx 35 C Hx 40 C

0.6

0.4

0.2

0.0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Tiempo de reaccin (s)

Figura 17. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reaccin de la enzima xantina oxidasa determinada por HPLC con la enzima libre.

Cuando se realiz el estudio empleando el sensor enzimtico se observ que la velocidad de reaccin aument con la temperatura del medio de reaccin hasta alcanzar un mximo a 35 C (Figura 18) y por encima de esta temperatura la sensibilidad de sensor disminuy ligeramente. Esta disminucin puede atribuirse a la reduccin en los niveles de oxgeno en la disolucin de reaccin. Por otro lado, se ha descrito que a temperaturas ms altas la desactivacin trmica de la enzima puede ocurrir, reduciendo su estabilidad (Karube et al., 1984; Rahman et al., 2007). Por consiguiente y en base en estos resultados, se eligi la temperatura de 30 C para los sucesivos anlisis.

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Resultados y Discusin

0.018 Velocidad enzimtica (mg O2/ L s )

-1

0.016

0.014

0.012

0.010 20 25 30 35 40 45

Temperatura (C)

Figura 18. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reaccin de la xantina oxidasa determinado en el sensor enzimtico con la enzima libre. 20 L de patron de Hx (1mM), en tampn fosfato pH 7.6, 0.0169 U de XO a diferentes temperaturas.

Ensayos de validacin Empleando las condiciones experimentales anteriores, se evalo la linealidad del sensor enzimtico y para ello se construy una recta de calibrado con patrones de Hx, en un intervalo de concentraciones seleccionadas. Sin embargo, cuando se inyectaron las muestras de carne, el tramo lineal a partir del cual se obtiene la velocidad de reaccin no fue muy estable en alguno de sus puntos, haciendo difcil su obtencin. La acumulacin del oxgeno consumido durante 190 s, tiempo al cual se asegura por exceso la oxidacin total de la Hx y la X formada en las muestras de carne, mostr una excelente correlacin para cuantificar la seal de dichas muestras. Bajo estas condiciones se obtuvo la curva tpica de saturacin de la enzima en funcin de la concentracin de Hx y con el mtodo de mnimos cuadrados se calcul la linealidad, por triplicado (Figura 19), obteniendo un intervalo lineal de 8.68 a 26.05 M de Hx.

108

Resultados y Discusin

1.00

Consumo de oxgeno (mg O2/L)

0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03

y = 43.181x - 0.165 R2 = 0.995

Concentracin de hipoxantina (mM)

Figura 19. Curva de calibrado de hipoxantina en el sensor enzimtico con la enzima libre. (Consumo de oxgeno (mg 02/L) a 190 s frente a la concentracin de Hx (mM)). Las barras de error indican la desviacin estndar de la medida de tres mediciones.

La sensibilidad de deteccin en el sensor enzimtico como se ha visto, puede verse afectada por la propia concentracin de Hx, inhibiendo a la enzima por exceso de sustrato o producto formado (H202 y AU) o por la competencia que existe entre la Hx y la X por los sitios activos de la enzima (Jezewska, 1973) o bien por la limitacin de oxgeno en el medio (Hu y Liu, 1997). Lecturas superiores a 1 mg/L de oxgeno consumido o velocidades de reaccin mayores de 0.064 mg/L s-1 sugieren un exceso de Hx y la muestra de carne deber ser diluida para adecuarse al intervalo lineal de deteccin y obtener una buena cuantificacin.

La repetibilidad se calcul inyectando sucesivamente un patrn de Hx y/o un extracto de carne de 7 horas post-mortem (n=7), los resultados obtenidos se muestran en la tabla 15. Una prdida gradual de sensibilidad se observ cuando se inyectaron las muestras de carne, posiblemente debido a problemas de interferencia por protenas u otros compuestos presentes en el extracto crnico (Qiong et al.,

109

Resultados y Discusin

1998). A fin de minimizar este efecto, el sistema se lav despus de tres inyecciones con una disolucin de cloruro de sodio (NaCl) 125 mM (Luong y Male, 1992), ya que la solubilidad de la mayora de las protenas disminuye a concentraciones altas de sal.

Por otro lado, por cada molcula de Hx que se oxida en presencia de la enzima XO se producen dos molculas de perxido de hidrgeno (H2O2) y una de cido rico (AU) (Volpe y Mascini, 1996). Aunque estos compuestos no se encuentran usualmente en la carne fresca y no interfieren con la seal del sensor enzimtico a los potenciales elctricos usados, podran inhibir a la enzima XO por exceso de producto. Para observar este efecto, una disolucin patrn de Hx se enriqueci con diferentes concentraciones de H2O2 o AU y se inyect en el sistema. La adicin de H2O2 tuvo mayor efecto en reducir la seal detectada que la de AU cuando se comparaba con la del patrn de Hx no enriquecido. Se observ una disminucin del 5.80 % de la seal amperomtrica a concentraciones altas de H2O2 (1 Hx: 10 H2O2, considerando en sta la concentracin de H2O2 adicionada y la formada durante la oxidacin de la Hx). Mientras que a esos mismos niveles de concentracin de AU, la seal disminuy 3.0 % respecto la seal del patrn sin enriquecimiento.

La estabilidad de la disolucin enzimtica de XO durante el almacenamiento (ver apartado 4.3.1.) fue muy buena ya que no se detectaron diferencias significativas (p<0.05) entre las disoluciones almacenadas a 4 C y usadas durante cinco semanas consecutivas a una misma concentracin de Hx (Figura 20). Estos resultados, sugieren la buena estabilidad de la enzima en dichas condiciones de almacenamiento y otorgan fiabilidad a la determinacin de Hx en este sensor enzimtico.

110

Resultados y Discusin

1.00

Consumo de oxigeno (mg O 2/L)

0.75

0.50

0.25

0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 Almacenamiento (Semanas)

Figura 20. Estabilidad de la xantina oxidasa en disolucin en almacenamiento a 4 C. Las barras de error indican la desviacin estndar de la medida de cuatro mediciones/da durante tres das consecutivos.

5.1.1.2. Sistema enzimtico con la enzima inmovilizada. Un paso importante en la construccin del sensor enzimtico con la enzima inmovilizada, es precisamente el proceso de inmovilizacin, a fin de retener la mxima actividad de la enzima para que pueda ser utilizada de forma repetida y asegurar el mximo contacto de enzima con el sustrato. Tomando en cuenta las condiciones de optimizacin del sistema con la enzima libre, se procedi a la inmovilizacin de la enzima y an cuando existen distintas tcnicas de inmovilizacin, la enzima XO se inmoviliz segn el protocolo descrito en el apartado 4.3.3.2.1. por entrecruzamiento con glutaraldehdo, sobre una membrana preactivada Immunodyne ABC (Nylon 66, con un tamao de poro de 0.45 m), la cual ayud a mejorar la retencin y estabilidad de la enzima mediante la unin covalente en su superficie.

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Resultados y Discusin

La cantidad de enzima inmovilizada se optimiz y se evalu hasta obtener una intensidad de consumo de oxgeno y/o velocidad de reaccin lo suficientemente sensible en el oxmetro manteniendo constante la concentracin de Hx y la cantidad de glutaraldehdo (2 %). As, se aadi a la disolucin de inmovilizacin 7, 15 o 20 L de enzima, con una actividad de 1.3 U/mg de protena, siendo la cantidad de 15 L (0.50 U) de XO a 30 C la que present mejores resultados de sensibilidad y mayor intervalo de linealidad. A mayores concentraciones de enzima se observ mayor seal de respuesta hasta un punto que no se detect la velocidad de reaccin por ser muy rpida. Mientras que a bajas concentraciones de enzima, an cuando la respuesta fue buena el nmero de inyecciones que se podan realizar disminuy considerablemente.

La cantidad de glutaraldehdo (2 %) utilizada en la disolucin de inmovilizacin de la enzima XO se seleccion tras minuciosos ensayos y comparaciones con trabajos previos (Mulchandani et al., 1990; Hu y Liu, 1997; Nakatani et al., 2005). En efecto, se observ que la capa de enzima sobre la membrana cuando se utilizaba menor cantidad de glutaraldehdo (1 %) se perda fcilmente debido a un escaso entrecruzamiento entre la enzima y el glutaraldehdo, en tanto que a mayores cantidades de glutaraldehdo (3 %) la polimerizacin de la enzima ocurra muy rpido y se formaba una pelcula irregular de enzima con caractersticas de un gel, que obstaculizaba la difusin del oxgeno hacia el electrodo de platino disminuyendo la sensibilidad de deteccin. Adems, para evitar la rpida polimerizacin de la enzima an con el 2 % de glutaraldehdo, fue necesario adicionar ste en disolucin (8 L de una disolucin al 12.5%) de manera muy rpida con el resto de la disolucin de inmovilizacin.

El acetato de celulosa se utiliza principalmente para proteger al electrodo de platino, a potenciales positivos, de interferencias electroqumicas (Volpe y Mascini,

112

Resultados y Discusin

1996; Nakatani et al., 2005). An as, en las condiciones de inmovilizacin ensayadas en este trabajo (potenciales negativos), el acetato de celulosa limit la contaminacin de la membrana de xantina oxidasa de algunos otros componentes del extracto de carne, protegiendo de la prdida de sensibilidad (Qiong et al., 1998). Incluso, se form una pelcula barrera de proteccin para la enzima durante el lavado y secado con el pauelo de papel que se realiza antes de cada inyeccin, si la comparamos con una membrana que no tena dicha pelcula, en la que se observ una prdida de actividad considerable, medida por la reduccin del nmero de determinaciones viables, posiblemente debida a la prdida de la enzima y no a la prdida de su actividad.

A fin de comprobar la unin covalente de la enzima a la membrana, una vez fue elegido el mtodo de inmovilizacin, se realiz una exploracin rpida (screening) del contenido de protena de la disolucin de lavado de la membrana durante el proceso de inmovilizacin con y sin la adicin de cistena, segn el mtodo propuesto por Smith et al., (1985). En el cual se utiliz el cido binciconnico-BCA, como agente reactivo y la albmina de suero bovino-BSA, como protena patrn a una lectura de absorbancia de 565 nm. Los resultados mostraron la ausencia de protena en la disolucin de lavado sin cistena, lo que supone que toda la enzima aadida se quedo unida a la membrana.

Ensayos de validacin La reproducibilidad en la inmovilizacin de la enzima XO se evalo construyendo la recta de calibrado utilizando membranas inmovilizadas en diferentes das, las cuales fueron evaluadas en distintos tiempos y con dos oxmetros diferentes. En la figura 21 se muestra la recta de calibrado promedio de seis membranas evaluadas por duplicado. Los resultados indican que el procedimiento de inmovilizacin de las membranas es perfectamente reproducible. Sin embargo, para asegurar la fiabilidad

113

Resultados y Discusin

de los resultados cuando se utiliza una membrana nueva para el anlisis de Hx en muestras crnicas es conveniente hacer una recta de calibrado a las condiciones ambientales existentes o estar monitorizando un punto especifico de referencia durante los anlisis.
Velocidad enzimtica (mg O2/L *s-1)
0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 0.03 0.05 0.08 0.10 0.13 0.15 y = 0.4939x + 0.0099 R2 = 0.9974

Concentracin de hipoxantina (mM)

Figura 21. Curva de calibracin de hipoxantina en el sensor enzimtico con la enzima xantina oxidasa inmovilizada. (Consumo de oxgeno (mg 02/L s-1) a 10 s frente a la concentracin de Hx (mM)). Las barras de error indican la desviacin estndar de la medida de seis membranas.

La relacin lineal entre la concentracin de Hx en el intervalo seleccionado (0 - 1 mM) y la respuesta del sensor enzimtico, como velocidad de reaccin de la enzima XO a los 10 s se muestra en la Figura 21. El intervalo lineal (15.63 - 127.00 M) en este sistema fue ms amplio que en el sistema con la enzima libre (Tabla 15); aunque el lmite inferior de deteccin fue ms bajo en este ltimo (apartado 5.1.1.1. y Figura 7). En el sistema inmovilizado, el patrn de hipoxantina o la muestra crnica se inyect directamente sobre la membrana XO, y el disolvente de extraccin de la muestra (cido perclrico neutralizado) gener una seal elctrica incluso en la ausencia de la enzima, lo cual explica la respuesta residual en este sistema que interfiere con los bajos niveles de Hx. Sin embargo, el intervalo de deteccin se encuentra dentro de los intervalos detectados con otros sistemas enzimticos

114

Resultados y Discusin

(Watanabe et al., 1983; Carsol y Mascini, 1998; Hu et al., 2000; Shizuko et al., 2005). Con la enzima libre la seal del disolvente de extraccin posiblemente se reduce al mnimo al diluirse en la disolucin de la reaccin (tampn fosfato 50 mM, pH 7.6), y la sensibilidad es por lo tanto mayor.

La repetibilidad obtenida con los patrones de Hx y las muestras de carne fue muy buena en ambos casos (Tabla 15). Los resultados al analizar el extracto de carne mostraron mayor variabilidad al igual que con la enzima libre posiblemente debido a la contaminacin de la membrana por los propios componentes de la muestra. De este modo, la precisin de la medida en este sistema dependi ms de la suciedad de la membrana en el momento de la medida que de la concentracin de oxgeno atmosfrico presente, cuya concentracin puede reducir o aumentar la exactitud del sensor (Prodromidis y Karayannis, 2002).
Tabla 15. Resultados de validacin del sensor enzimtico en ambos sistemas, libre e inmovilizada.
Parmetro * Rango lineal (M) Repetibilidad (n=7, CV (%)) Patrn Muestra de carne Estabilidad Correlacin con HPLC (r) Sistema con enzima libre 8.6826.05 (R2 =0.992) 2.29 4.81 Sensor enzimtico Sistema con enzima inmovilizada 15.63-127.00 (R2 =0.995) 2.24 5.04 hasta 30 inyecciones sucesivas a 30 C y hasta 2 meses a 4 C 0.9621

0.9517

* Todos los parmetro se determinaron usando la solucin enzimtica de xantina oxidasa recin preparada y la membrana enzimtica en condiciones iniciales.

La eficacia del anlisis se determin calculando la recuperacin despus de adicionar tres niveles diferentes de concentracin de Hx (0.5, 1.0 y 1.5) a un extracto de carne de 7 horas post-mortem. Los datos de recuperacin se presentan en la tabla 16 y se encontraron en un intervalo de 99.5 a 105.2 %.

115

Resultados y Discusin

Tabla 16. Recuperacin de la hipoxantina en muestras de lomo de cerdo (Longissimus dorsi) de 7 horas post-mortem en el sensor enzimtico con la enzima inmovilizada.
Hipoxantina ( mol/L )a Valor Valor tericob aadido 23.41 70.39 46.81 71.23 93.79 118.22

Nivel agregado 0.50 1.00 1.50

a c

Muestra 46.98 46.98 46.98

Valor recuperado 74.04 97.86 117.65

Recuperacin (%) 105.2% 104.3% 99.5%

Cada valor se corresponde con cuatro repeticiones en cada nivel de concentracin El valor terico contempla el valor aadido mas el intrnseco de la muestra

Por otro lado, la membrana de XO se mantuvo estable durante las primeras 30 inyecciones, como se comprob por inyecciones repetidas de patrones de Hx (apartado 4.3.3.3.). Posteriormente, la sensibilidad disminuy entre las 50 y 70 inyecciones con prdidas de actividad del 27.97 % y del 55.44 %, respectivamente (Figura 22). Incluso en estas condiciones, la membrana de XO an poda ser utilizada realizando una nueva calibracin, con buenos resultados. Cabe mencionar que la estabilidad de la membrana usando tampn fosfato (50 mM, pH 7.6), como disolvente de inyeccin de los patrones de Hx, se increment considerablemente (60 inyecciones durante tres das, almacenando la membrana a 4 C cuando sta no era utilizada).

La estabilidad de la membrana de XO durante el almacenamiento a 4 C se evalu cada quince das, obteniendo para cada membrana su curva de calibracin respectiva por duplicado (Figura 23). La seal en el sensor enzimtico fue estable durante dos meses, con un coeficiente de variacin entre las membranas del 13.39%, entonces comenz a disminuir la actividad de la membrana en aproximadamente 38.17 % despus de tres meses, manteniendo an muy buena linealidad. Sin embargo, la condicin de operacin de esa membrana se redujo casi en un 50 %.

116

Resultados y Discusin

0.10 Velocidad enzimtica (mg O2/L *s-1)

y = 0.5455x + 0.0111

0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12

R = 0.9898 y = 0.3919x + 0.0163 R = 0.9874 y = 0.2475x + 0.0146 R = 0.9738

2 2

0.14

Concentracin de Hipoxantina (mM)

Figura 22. Estabilidad de operacin de la membrana de xantina oxidasa () 0-30 inyecciones () 31-50 y ( ) 51-70 inyecciones. Las barras de error indican la desviacin estndar de la media de tres determinaciones.

0.10 Velocidad enzimtica (mg O2/L *s-1) y = 0.4311x + 0.0156 R2 = 0.9976 0.08 0.06 0.04 y = 0.2675x + 0.0172 0.02 0.00 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 R2 = 0.9828

Concentracin de Hipoxantina (mM)

Figura 23. Estabilidad de la membrana de xantina oxidasa almacenada a 4 C. () Curva de calibracin de hipoxantina durante dos meses (n=5 membranas) () Curva de calibracin de hipoxantina despus de tres meses. Las barras de error indican la desviacin estndar.

117

Resultados y Discusin

5.1.1.3. Estudio de la oxidacin de la hipoxantina Con base en los estudios anteriores y conociendo que la respuesta del sensor enzimtico se debe a la accin cataltica de la enzima XO sobre la Hx y la X, se evalu por HPLC el desarrollo de la reaccin enzimtica con la enzima libre (apartado 4.3.3.1.1.). As, la desaparicin de la Hx, la formacin y acumulacin de la X y la acumulacin de AU como productos de la reaccin oxidativa de Hx fueron analizados. Los resultados obtenidos a 30 C se muestran en la figura 24. La mxima formacin de X se alcanz justo a la mitad del perodo total de oxidacin de la Hx (a los 30 s de un perodo total de 60 s requeridos para oxidar totalmente la Hx a 30 C) cuando hay an 33.11 % de Hx con respecto a su concentracin inicial. Este porcentaje fue similar en todas las temperaturas ensayadas (25, 30, 35 y 40 C) con un coeficiente de variacin entre ellas del 8.48 %. As pues, la acumulacin de la X durante la reaccin enzimtica es un indicador fiable de la mayor afinidad cataltica de la enzima XO sobre la Hx, como ya ha observado Jezewska, (1973). De este modo, la afinidad de la XO por la xantina es la mitad que la afinidad por la Hx, y puede representarse como (Hx + X), como plante Yano et al., (1995).

Por lo tanto, derivado de este anlisis, en el cual se conoce la proporcin mxima de xantina formada, se pueden ajustar los resultados de la seal del sensor (Hx+X) detectados en las muestras de carne obtenidos en cada uno de los sistemas enzimticos, a fin de comparar ms exactamente la seal obtenida en el sensor con los valores de Hx obtenidos por HPLC (ver apartado 5.2). En cada uno de los productos analizados con el sensor enzimtico (ver apartado 5.3) se describir la forma en que se realiz dicho ajuste.

118

Resultados y Discusin

1.2

1.0

Concentracin (mol)

0.8

0.6

0.4 Hipoxantina Xantina cido rico

0.2

0.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160

Tiempo de reaccin (seg)

Figura 24. Evolucin de la reaccin de oxidacin de hipoxantina en presencia de la enzima xantina oxidasa a 30 C y medida por HPLC. Las barras de error indican la desviacin estndar de la media de cuatro muestras.

5.1.2. Sensor enzimtico con la enzima diamina oxidasa.

La construccin del sensor enzimtico para aminas bigenas se desarroll con base en lo descrito en el apartado 4.3.6.1., utilizando como elemento de reconocimiento biolgico la enzima comercial diamina oxidasa (DAO, EC. 1.4.3.6.) inmovilizada en una membrana. Se decidi utilizar la enzima inmovilizada debido a que en estas condiciones la enzima es ms estable y puede ser reutilizada mltiples veces. En presencia de oxgeno, la DAO cataliza la deaminacin oxidativa de las mono y di aminas para producir aldehdos, amonaco y perxido de hidrgeno (Mondovi et al., 1971), como se muestra en la siguiente ecuacin (15),
Diamina oxidasa

RCH 2 NH 2 + 0 2 + H 2 0

RCHO + H 2 0 2 + NH 3

(15)

119

Resultados y Discusin

La seal de respuesta del sensor durante la reaccin enzimtica exhibe una evolucin cintica caracterstica de las enzimas oxido-reductasas. La curva del progreso de la reaccin (Figura 25) pone de manifiesto que la reaccin puede seguirse por varias vas: determinando la velocidad de reaccin (mg/L de O2 s-1) a los 30 s, midiendo el consumo acumulado de oxgeno (mg/L de O2) a los 50 s o detectando el cambio de corriente (C) derivado de ese consumo. Cabe destacar que estas medidas son proporcionales a la concentracin de amina de la muestra siempre y cuando esta contenga un nico patrn de una amina especfica. En cambio cuando se analiz una muestra crnica, que contiene una diversa combinacin y concentracin de AB, la seal de respuesta y la velocidad de reaccin se deben a la combinacin de todas ellas. Esto se complica debido a que la selectividad de la enzima DAO es diferente para las distintas aminas (condicin que se abordar ms adelante). Para obtener la medida amperomtrica de dichas muestras, el cambio de corriente a los 50 s fue la mejor opcin y se utiliz como un indicador del contenido total de AB.
35.00 30.00
C

0.90 0.80 0.70 0.60

25.00

20.00 15.00 10.00 5.00 0 10 20 30 40 50

Velocidad de reaccin

Oxgeno acumulado

0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 -

60

70

80

90

100 110 120 130 140

Tiempo (seg)

Figura 25. Respuesta del sensor enzimtico representado por el consumo de oxgeno acumulado () y el cambio de corriente () en funcin del tiempo de reaccin en un patrn de histamina (0.02 mg/mL) en tampn fosfato 100 mM, pH 7.4 a 30 C.

120

Consumo acumulado de O2 (mg/L)

Corriente

Resultados y Discusin

5.1.2.1. Inmovilizacin de la enzima diamina oxidasa. El mtodo de inmovilizacin es uno de los parmetros ms importante en el desarrollo del sensor enzimtico. La DAO comercial exhibe baja actividad enzimtica (0.18 U/mg de slido). El mtodo de inmovilizacin por entrecruzamiento con glutaraldehdo permite obtener alta carga de enzima sobre la membrana y por tanto mejorar la operacin del sensor (Carelli et al., 2007); sin embargo, Karube et al., (1980) mencionan que la DAO puede ser desnaturalizada con facilidad en presencia de glutaraldehdo. En este contexto, varias metodologas de inmovilizacin se ensayaron antes de elegir como ptimo el mtodo descrito en el apartado 4.3.6.1. Las condiciones iniciales de inmovilizacin de la DAO se definieron tomando en cuenta lo descrito por varios autores (Male et al., 1996; Bouvrette et al., 1997; Carelli et al., 2007) y las sugerencias especificadas por la casa comercial en el manejo de la enzima (tampn fosfato 100 mM, pH 7.2). Para este fin, se ensayaron las siguientes experiencias, utilizando la HI (0.01 mg/mL) como patrn de referencia.

Experiencia 1. Mezclar de 5 L de DAO (60, 110, 120 mg de DAO/mL de tampn fosfato 100mM, pH 7.2) con 5 L de glutaraldehdo (2 y 2.5%). Secar al aire durante 45 min. Lavar con glicina (100 mM) y tampn fosfato (100mM, pH 7.2).
a

Resultados A altas concentraciones de enzima y glutaraldehdo. La polimerizacin ocurre muy rpido, es imposible pipetearla mezcla sobre la membrana, ya que se forma un gel consistente. A bajas concentraciones de enzima y glutaraldehdo. Se obtienen mezclas homogneas si estas se realizan muy rpido. La mezcla se puede depositar sobre la membrana; sin embargo, despus del secado se forma una pelcula muy fina que impide la difusin total del oxgeno a travs de ella, obteniendo seales de corriente muy bajas. La reproducibilidad de inyeccin y entre membranas es mnima.

121

Resultados y Discusin

2. Depositar 5 L de DAO (110, 120 mg/mL) sobre la membrana, secar al aire durante 15 min y posteriormente adicionar 5 L de glutaraldehdo (1 y 2 %). Secar al aire durante 30 min. Lavar con glicina (100 mM) y tampn fosfato (100mM, pH 7.2).

Altas y bajas concentraciones de enzima y glutaraldehdo. Al momento de aadir el glutaraldehdo sobre la gota de enzima, sta emigr hacia los bordes. La medicin se realiz con la enzima remanente del centro de la membrana. Se detect buena seal, pero la reproducibilidad entre las membranas fue mnima y la operacin fue muy baja (6-10 inyecciones). La mejor respuesta se obtuvo a una concentracin de enzima de 110 mg/mL y 2 % de glutaraldehdo. Incrementos mnimos de enzima disminuyen la seal de respuesta.

Notas: a) 5 L de enzima DAO de 110 mg/mL equivalen a 0.10 U/mL

Los resultados obtenidos tras el desarrollo de estas experiencias, revelan el desgaste rpido de la DAO, posiblemente a causa de su baja actividad enzimtica y/o que se haya desnaturalizado al momento de aadir el glutaraldehdo. A fin de obtener mayor disponibilidad de enzima, la disolucin enzimtica (110 mg de DAO/mL de tampn fosfato 100mM, pH 7.2) se pas a travs en un filtro de corte molecular de 100,000 Da en las condiciones descritas en el apartado 4.3.6.1. La DAO posee un peso molecular de 170,000 Da por lo que qued retenida en el filtro y la disolucin enzimtica se concentr dos veces. La filtracin adems permiti limpiar la disolucin enzimtica, eliminando los compuestos (sales) o protenas con pesos moleculares menores de 100,000 Da. En efecto, se detect un 1.61 % de protena en el filtrado (segn mtodo descrito por Smith et al., 1985) y sulfato y amonio (deteccin rpida por cromatografa inica). Adems, para reducir la posible desnaturalizacin de la enzima por el glutaraldehdo, el contacto de ste con la DAO se hizo de manera gradual sumergiendo la membrana enzimtica durante 30 s en una disolucin de glutaraldehdo al 1 % por el lado opuesto a donde se deposit la enzima. As, con la enzima concentrada y libre de gran cantidad de impurezas se

122

Resultados y Discusin

mejor sustancialmente el proceso de inmovilizacin, se obtuvo ms enzima disponible en el mismo volumen (5 L, 0.2 U/mL) y la seal de respuesta del sensor se increment.

Una vez se precis el mtodo de inmovilizacin se prosigui a evaluar la operacin de la membrana enzimtica en el sensor. Como anteriormente se ha descrito, la enzima DAO exhibe mayor o menor actividad por algunas de las aminas bigenas, dependiendo de la fuente de extraccin y/o la metodologa de purificacin (Tombelli y Mascini, 1998; Niculescu et al., 2001; Wimmerov y Macholn, 1999 y Frbort et al., 2000). En este sistema, la selectividad de la DAO comercial de rin de cerdo (EC 1.4.3.6.) sobre las AB se evalu, inyectando directamente sobre la membrana enzimtica 40 L del patrn de cada una de las aminas detectadas en los productos crnicos, histamina (HI), putrescina (PU), cadaverina (CA), tiramina (TY), espermina (SM) y espermidina (SD), a una concentracin de 0.01 mg/mL en tampn fostafo 100 mM, pH 7.2. La DAO mostr tener mayor afinidad por la HI al obtener la ms alta seal de respuesta (Figura 26), seguida de la PU y la CA en un 39,7 % y 18.5 %, respectivamente, si se considera del 100 % la afinidad de la HI. Resultados similares fueron observados por Tombelli y Mascini, (1998). La TY, SM y SD no fueron sustrato de la DAO en estas condiciones, ya que produjeron una seal inferior a la corriente de fondo (lnea recta mostrada en la Figura 26) generada en el sistema cuando se inyecta el tampn fosfato sin la adicin de aminas. Sin embargo, la TY fue detectada a concentraciones mayores de 0.02 mg/mL, no siendo as para la SM y SD.

123

Resultados y Discusin

7.5

6.0

Corriente

4.5

3.0

1.5

HI PU CA TY SD SM

Aminas Bigenas
HI Selectividad de la DAOb (%)
Notas: a. Se inyect 40 L de cada una de las disoluciones de AB a 0.01 mg/mL b. DAO, diamina oxidasa (5 L, 0.2 U/mL) ND, no detectada

PU 39.7

CA 18.5

TY ND

SM ND

SD ND

100.0

Figura 26. Evaluacin de la selectividad de la diamina oxidasa (DAO) en el sensor enzimtico con patrones de histamina (HI), putrescina (PU), cadaverina (CA), tiramina (TY), SD espermidina (SD), espermina (SM).

La actividad enzimtica de la DAO es muy dependiente del pH como as lo han mencionado varios autores (Karube et al., 1980, Keow et al., 2007), siendo el pH ptimo diferente para las distintas AB. En este sentido, se evalu el efecto del pH (entre 6.2 y 9.2) en la actividad cataltica de la enzima inmovilizada sobre HI y PU. El pH optim para la HI fue de 7.2 mientras que para la PU fue de 9.2 (Figura 27). Estos resultados coinciden con lo descrito por Karube et al., (1980), Yano et al., (1996), Bouvrette et al., (1997) y Keow et al., (2007), al encontrar que los cambios mximos de corriente para la mayora de la aminas se encuentra en un intervalo de pH de 7.0 a 8.0. Para fines de este estudio se eligi el pH de 7.2 para las subsecuentes

124

Resultados y Discusin

experiencias debido a que es el pH que se ha descrito como ptimo para la actividad cataltica de la DAO y a que los extractos crnicos estn en un intervalo entre 6.5 y 7.0.
10.0

8.5 corriente

7.0

5.5

Putrescina Histamina

4.0 6.2 7.2 pH 8.2 9.2

Figura 27. Efecto del pH sobre la seal de respuesta de la enzima diamina oxidasa inmovilizada en el sensor sobre la histamina y putrescina a una concentracin de 0.02 mg/mL utilizando un tampn fosfato 100 mM, pH 7.2 a 30C.

Ensayos de validacin En las condiciones experimentales elegidas anteriormente, se evalo la linealidad de respuesta del sensor enzimtico mediante la construccin de la recta de calibrado para HI (amina con mayor afinidad a la DAO) en tampn fosfato 100 mM, pH 7.2. a 30 C. El rango lineal fue de 0.005 a 0.04 mg/mL. A fin de establecer las condiciones de medida similares a las del extracto crnico de los productos curados, el patrn de HI se prepar con la disolucin de extraccin (cido perclrico neutralizado). El intervalo de concentracin en estas condiciones se mantiene, pero el cambio de corriente se incrementa, manteniendo la proporcionalidad de la recta. Sin embargo, cuando se analizaron los extractos crnicos, los cambios de corriente no se ajustaron a ninguna de las rectas de calibrado, generando seales ms altas, lo

125

Resultados y Discusin

que indica que el efecto matriz influye drsticamente en la seal de medida. La composicin de la matriz cambia a lo largo del proceso de curado en el sentido que, se van acumulando compuestos nitrogenados no proteicos o cidos grasos libres que pueden interferir con la seal de medida. Adems, la presencia simultnea de diversas aminas y su variada concentracin contribuye tambin con esta desviacin de medida, como as lo menciona Kivirand and Rinken, (2010). Esto, dificulta mucho la construccin de una recta de calibrado con adiciones sucesivas de patrn en una matriz especifica. Al intentar realizar una recta de calibrado para HI empleando extractos carnicos en estas condiciones los cambios de seal en el sensor fueron muy estrechos. En comparacin con una curva de calibrado con matriz de carne fresca o pescado, donde las interferencias son menores y puede evaluarse la concentracin de aminas totales o en miliequivalentes de HI como se ha mostrado en otros estudios (Karube et al., 1980; Carsol y Mascini, 1999) y puede observarse en la figura 28.

An as, el sensor enzimtico fue capaz detectar diferentes niveles de concentracin de aminas totales en los productos curados, como se describir en el apartado 5.5., lo que permite que el sensor enzimtico puede ser utilizado como una herramienta de exploracin rpida o screening. A concentraciones iguales o por debajo de 0.01 mg/mL de AB, la seal de respuesta se manifiesta con un pico al inicio de la inyeccin (Figura 28), indicando la ausencia de aminas bigenas detectables en la muestra. Por el contrario, un nivel alto de AB totales (> 0.06 mg/mL) se manifiesta con una ligera disminucin de la corriente seguida de un pico al final del tiempo de medida; lo que indica, que la muestra debe ser diluida para obtener una seal satisfactoria dentro del intervalo lineal.

126

Resultados y Discusin

50 Seal sensor enzimtico (Corriente)

40

30

20
Extracto jamon curado 0.01 mg/mL HI 0.03 mg/mL HI 0.16 mg/mL HI > 0.20 mg/mL HI

10

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Tiempo de reaccion (seg)

Figura 28. Respuesta del sensor enzimtico de un extracto crnico del msculo Semimembranosus de jamn (O das) enriquecido con patrn de histamina en cido perclrico neutralizado a diferentes concentraciones a 30 C.

La repetibilidad (n=4), se calcul inyectando sucesivamente un patrn de histamina (0.01 mg/mL), un extract crnico de un embutido fermentado de 42 das de curado y un jamn de 11 meses de maduracin, obteniendo un coeficiente de variacin de 3.51, 5.39 y 4.01 %, respectivamente. Como es de esperarse, los productos curados presentan mayor variabilidad, debido a la propia composicin de la matriz a esos niveles de curado.

Por otro lado, la membrana DAO se mantuvo estable durante las primeras 30 inyecciones realizadas a lo largo del da. Terminados los anlisis del da, la membrana se almacen a 4 C en tampn fosfato 100 mM, pH 7.2. Al da siguiente de anlisis, la sensibilidad disminuy drsticamente y no fue posible reutilizar la membrana. Mientras, la estabilidad de membranas nuevas durante el

127

Resultados y Discusin

almacenamiento a 4 C result ser de 6 semanas sin observar disminucin en la respuesta (Figura 29), con un coeficiente de variacin entre las membranas del 1.73%. Esta experiencia nos permiti ratificar la reproducibilidad de la inmovilizacin. A partir de la sptima semana la actividad de la membrana comenz a disminuir en un 5.30 % hasta alcanzar una prdida de actividad del 10.89 % en promedio a la octava semana; adems, la variabilidad entre las mediciones en esa membrana fue muy alta y, ya no resultaba confiable su utilizacin.

7.00 6.50 Corriente 6.00 5.50 5.00 4.50 4.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Almacenamiento (semanas)

Figura 29. Estabilidad de la diamina oxidasa inmovilizada en almacenamiento a 4 C en tampn fosfato 100 mM, pH 7.2. Las barras de error indican la desviacin estndar de la medida de tres mediciones.

5.2. Evolucin de los nucletidos y sus derivados analizados por HPLC en la carne y productos crnicos.
La calidad es un trmino descriptivo de gran importancia en la industria de la carne. Desde que el animal vivo es sacrificado, se transforma en carne y llega al consumidor, el factor calidad es cada vez ms importante. A esto se le une el hecho de la extrema variabilidad que existe en la calidad de la carne de cerdo (PSE, RSE, RFN, DFD) y las considerables prdidas econmicas que esto conlleva (Scheffler y

128

Resultados y Discusin

Gerrard, 2007). Ciertamente, inmediatamente despus del sacrificio del animal, se inician en el msculo un gran nmero de cambios post-mortem que son crticos para definir el desarrollo de la calidad de la carne. El anlisis de algunos metabolitos relacionados con la velocidad de gluclisis del msculo, ha sido propuesto como mtodo rpido y simple para determinar la calidad de la carne. De estos, el anlisis de nucletidos a tiempos especficos post mortem ha sido uno de los mtodos ms exitosos (Batlle et al., 2001; Scheffler y Gerrard, 2007). Muchos autores han observado una correlacin entre varios de estos metabolitos y la frescura en algunas especies de pecado (Jones et al., 1964; Luong y Male, 1992; Hattula y Kiesvaara, 1996), y la maduracin y la calidad de la carne (Fujita et al., 1988; Yano et al., 1995; Batlle et al., 2001). Sin embargo, la evolucin de estos compuestos y su correlacin con la calidad en los productos crnicos, no ha sido estudiada. En este contexto, se plante el anlisis de los nucletidos y sus derivados durante la maduracin de la carne y durante el proceso de curado del jamn y de un embutido fermentado, como a continuacin se describe. 5.2.1. Maduracin de la carne. La conversin del msculo en carne, tras la muerte del animal, se produce en un periodo de varias horas y se caracteriza por la disminucin de la temperatura del msculo, disminucin del pH, agotamiento del ATP, establecimiento de la rigidez cadavrica o rigor mortis y finalmente de la resolucin del rigor, denominada maduracin. En esta ltima etapa, la carne experimenta un notable ablandamiento y las propiedades organolpticas se mejoran sustancialmente. El agotamiento del ATP, fuente principal de energa para mantener el msculo en un estado de relajacin, es la causa principal del comienzo del rigor mortis. En ausencia de oxgeno el nivel de ATP depende de las reservas energticas del msculo como la fosfocreatina (CP) y el glucgeno para regenerarse por vas metablicas alternativas. Sin embargo, el saldo de estas reacciones finalmente resulta en una disminucin gradual de ATP, que se

129

Resultados y Discusin

degrada rpidamente a ADP, AMP e IMP, y ste ltimo a su vez se degrada a inosina y posteriormente a hipoxantina (Saito et al., 1959).

En vista de la importancia de los nucletidos en el metabolismo energtico y el inters de estos y de sus productos de degradacin en la evaluacin de la calidad, muchos estudios se han centrado durante las ltimas dcadas en el desarrollo de diferentes tcnicas para separar, caracterizar y cuantificar estos compuestos (Aristoy y Toldr, 2009). La cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), debido a su versatilidad, tiempo de anlisis y alta resolucin es la tcnica ms utilizada para el anlisis de nucletidos y nuclesidos en muestras biolgicas. Mas concretamente, la cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa (RP-HPLC) (Veciana Nogus et al., 1997; Kuda et al., 2007), en RP-HPLC con par inico (IP-RP-HPLC) (Murray y Thomson, 1983; Meynial et al., 1995; Veciana-Nogus et al., 1997) y HPLC de intercambio inico (Lamb y Ye, 1992; Gao et al., 2006) han sido los mtodos de eleccin para el anlisis de estos compuestos durante dcadas.

A pesar de que estas tcnicas son muy poderosas, la cromatografa de interaccin hidroflica (HILIC) podra constituir una alternativa interesante para la separacin de dichos compuestos (Alpert, 1990; Yoshida, 2004), dado el carcter inico y polar de stos. Esta tcnica utiliza composiciones de fase mvil comparables a las empleadas en RP-HPLC con la consecuente ventaja sobre la solubilidad del analito y sin la necesidad de utilizar par inico y/o reactivo de derivatizacin, lo que complica y aumenta el coste de los anlisis. La tecnologa, HILIC es un mtodo interesante compatible con una posterior espectrometra de masas, ya que las fases mviles que se utilizan (disolventes orgnicos, agua y sales voltiles) son compatibles con sta y se evitan pasos previos de desalinizacin cuando se utiliza otra tcnica cromatogrfica.

130

Resultados y Discusin

En el presente trabajo, se ha utilizado la RP-HPLC con par inico (IP-RP-HPLC) para la determinacin de los nucletidos y sus derivados y adems se ha desarrollado un mtodo alternativo basado en cromatografa lquida de interaccin hidroflica (HILIC). El mtodo HILIC se ha optimizado y se han determinado los niveles de estos compuestos en muestras de lomo de cerdo en funcin del tiempo post-mortem (5, 7, 9, 11, 27, 51 y 171 horas). Ambos mtodos han sido comparados.

De esta manera, tras el anlisis de pH a las 24 horas y la medida de drip loss en el msculo Longissimus dorsi de los lomos de cerdo seleccionados, se caracterizaron como msculos normales siguiendo el criterio adaptado por Flores et al., (1999 y 2000) ya que se obtuvieron valores dentro de los intervalos establecidos para este tipo de msculos (pH24 = 5.63 0.03 y drip loss = 3.5 0.04 %). Las carnes PSE se caracterizan por un descenso rpido del pH2h (< 5.6) y prdidas por goteo mayores del 6 %, mientras que las carnes DFD mantienen su valor de pH inicial alto hasta las 24 horas post-mortem (> 6.0) con prdidas por goteo menores del 3.0 %. Las carnes RFN presentan valores de pH intermedios entre 5.6 y 6.0 y prdidas por goteo menores del 6 %.

5.2.1.1. Evolucin de nucletidos y sus derivados por IP-RP-HPLC. Como mtodo de referencia para la separacin e identificacin de los compuestos producto de la degradacin del ATP durante la maduracin de la carne cerdo se utiliz la IP-RP-HPLC en una columna Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4.6 mm, 5 m) empleando como par inico el PIC A. El uso del par inico incrementa la retencin de los nucletidos y mejora su resolucin (Murray y Thomson, 1983), en efecto, permite la rpida deteccin de hipoxantina (Figura 30).

La figura 31 muestra la evolucin de ATP y sus productos de degradacin en el msculo (Longissimus dorsi) durante el proceso de maduracin de la carne a 4 C. La

131

Resultados y Discusin

concentracin de ATP (Figura 31a) a las 5 horas post-mortem (1.43 0.74 mol/g) coincide con los niveles detectados por Batlle et al., (2001), en este tipo de msculo y a ese tiempo post-mortem. En la misma figura puede observarse la degradacin rpida del ATP, ya que a las 9 horas ha desaparecido casi en su totalidad. Este proceso coincide con lo mencionado por Batlle et al., (2001), indicando que la desaparicin del ATP en msculos normales se llev a cabo durante las primeras 8 horas mientras que en msculos exudativos fue a las 6 horas debido al metabolismo acelerado que presentan este tipo de carnes.

Figura 30. Cromatograma de IP-RP-HPLC correspondiente al anlisis de muestras de carne de cerdo (Longissimus dorsi) a 5 (lnea contina) y 9 (lnea quebrada) horas postmortem. Hipoxantina (Hx), inosina (Ino), inosina 5 monofosfato (IMP), + dinucletido de nicotinamida adenina (NAD ), adenosn monofosfato (AMP), adenosn difosfato (ADP) y adenosn trifosfato (ATP). En todos los casos la deteccin se realiz a 254 nm.

132

Resultados y Discusin

Como consecuencia del proceso anterior, el contenido de ADP (0.86 0.21 mol/g), disminuye durante las 24 horas post-mortem sin llegar a su total desaparicin, mantenindose en un valor constante de 0.22 0.01 mol/g a lo largo de la maduracin (Figura 31b). El AMP (0.33 0.10 mol/g) aumenta ligeramente en las primeras horas (de 5 a 7 horas) para luego comportarse de igual manera que el ADP hasta alcanzar valores de 0.24 0.01 mol/g a las 24 horas (Figura 31c). Los niveles de AMP prcticamente se mantuvieron constantes durante todo el periodo evaluado debido posiblemente a que es un compuesto intermedio de la degradacin.

El IMP, como producto de la degradacin del ATP tiende a acumularse en las primeras horas hasta alcanzar un valor mximo de 7.30 0.45 mol/g a las 24 horas, para despus disminuir ligeramente (Figura 31d). Finalmente, los niveles de Ino e Hx aumentan con el tiempo (Figura 31e y 31f), alcanzando niveles de 2.10 0.49 mol/g y 0.6179 0.13 mol/g, respectivamente, a los 171 horas post-mortem.

Asimismo, con este mtodo cromatogrfico se detect el dinucletido de nicotinamida adenina (NAD+), el cual tiene una funcin vital en el metabolismo como coenzima que interviene en mltiples reacciones metablicas de oxido-reduccin (Figura 31g) y su concentracin a las 5 horas post-mortem (0.69 0.14 mol/g) va disminuyendo durante el proceso de maduracin de la carne. Incluso, cantidades muy pequeas de IMP y ribosa pueden generarse derivado del agotamiento del NAD+ (Kassemsarn et al., 1963).

Cabe mencionar que los resultados obtenidos tras el anlisis post-mortem en las muestras de carne de cerdo fueron muy similares a los publicados por otros autores en este tipo de muestras (Batlle et al., 2000 y 2001) lo que evidenci el comportamiento normal de los lomos elegidos para esta experiencia.

133

Resultados y Discusin

a) ATP (mol/g)

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

e) Ino (mol/g) f) Hipoxantina (mol/g) g) NAD + (mol/g)

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

b) ADP (mol/g)

1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2

0.8

0.6

0.4

0.2

c) AMP (mol/g)

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2

d) IMP (mol/g)

10 0 8 6 4 2 5 10 15 20 25 30 50 75 100 125 150 175

Proceso de maduracin (horas)

5 10 15 20 25 30 50 75 100 125 150 175

Proceso de maduracin (horas)

Figura 31. Evolucin de nucletidos y sus derivados en el msculo Longissimus dorsi durante el proceso de maduracin. Las barras de error indican la desviacin estndar de la medida de cinco lomos.

134

Resultados y Discusin

5.2.1.2. Optimizacin del mtodo cromatogrfico HILIC. 5.2.1.2.1. Carne Fresca. Para establecer las condiciones ptimas de separacin de ATP, ADP, AMP, IMP, Ino, Hx y NAD+ por HILIC, se evalo el efecto del disolvente orgnico, la concentracin de sal y el pH en la fase mvil. En la cromatografa de tipo HILIC una cantidad elevada de disolvente orgnico en la fase mvil aumenta la retencin de los analitos. Se eligi el acetonitrilo como disolvente orgnico por sus buenas caractersticas cromatogrficas y su miscibilidad con agua, adems, el ACN proporcion buena solubilidad a los compuestos estudiados permitiendo la separacin rpida de Hx e Ino (Figuras 32 y 33). El anlisis cromatogrfico se desarrollo utilizando una columna polimrica zwitterinico ZIC-pHILIC (4.6 x 150 mm, 5 m) junto con una precolumna ZIC-pHILIC (2.1 x 20 mm, 5 m) y la separacin se realiz empleando el gradiente que se muestra en la tabla 4.

Adems, se ensayaron varios tipos de sales voltiles para determinar la ms adecuada en cuanto a su solubilidad en el disolvente orgnico y su interaccin con los compuestos estudiados. El acetato de amonio fue la sal de eleccin, ya que proporcion los mejores resultados de selectividad y reproducibilidad, present excelente solubilidad, incluso a alta proporcin de disolvente orgnico y es muy voltil, por lo que sera un tampn adecuado para un futuro anlisis en espectrometra de masas. La concentracin de sal y pH tienen un efecto importante en la retencin y selectividad en cromatografa HILIC, influyendo en la ionizacin del analito. Ambos parmetros se optimizaron en la fase mvil.

135

Resultados y Discusin

A)

350 Absorbancia (mAU) a 254 nm 300 250 200 150

NAD Ino IMP

100 50
Hx AMP

-50 0 5 10 15 Tiempo (min) 20 25 30

Figura 32. Cromatogramas correspondiente al anlisis de muestras de carne de cerdo (Longissimus dorsi) a 5 horas (A) y a 27 horas (B) post mortem. Hipoxantina (Hx), inosina (Ino), adenosn monofosfato (AMP), dinucletido de nicotinamida adenina + (NAD ), inosina 5 monofosfato (IMP), adenosn difosfato (ADP) y el adenosn trifosfato (ATP). En todos los casos se detectaron a 254 nm.

Una buena separacin de los patrones de los analitos estudiados se obtuvo con acetato de amonio 83.3 mM a pH 7.0, aun as, en muestras de carne de cerdo, el pico de Hx coeluye con el pico identificado como creatinina (Cn). Para mejorar la separacin de ambos compuestos se ensayaron diferentes pH y concentraciones de sal, obteniendo una separacin aceptable empleando acetato amonio 112.5 mM a pH 3.5. Por lo tanto, un acondicionamiento inicial de la columna a esa concentracin y ph para luego realizar un gradiente como se refleja en la tabla 4 permiti la separacin de la Cn y la Hx, sin afectar a la selectividad y la resolucin del resto de los picos como se muestra en la figura 33.

136

ADP

ATP

Resultados y Discusin

Ino

900 Absorbancia (mAU*s) 700 500

Cn

1100

AMP

Hx

ATP

ADP

300 100 -100 0 5 10

AU

NAD IMP

GMP

15

20

GDP

25

GTP

30

35

Tiempo (min)

Figura 33. Cromatograma correspondiente a la separacin de los patrones de los analitos estudiados junto con la creatinina (Cn), cido rico (AU), guanosina (G), guanosn monofosfato (GMP), guanosn difosfato (GDP) y guanosn trifosfato (GTP).

El disolvente de inyeccin tambin es un parmetro muy importante a considerar porque influye en la forma del pico. Una alta proporcin de agua en el disolvente de inyeccin podra resultar en una menor retencin, poca eficiencia y una peor separacin de los compuestos pero, por otra parte, los nucletidos no pueden ser fcilmente disueltos en disoluciones altamente orgnicas. As que los compuestos estudiados se lograron solubilizar utilizando una disolucin al 50 % de ACN y cido perclrico 0.6 M neutralizado con carbonato potsico (ver apartado 4.3.2.3) como disolvente de inyeccin. Con proporciones mayores de ACN el NAD+, el ADP y el ATP presentaron baja estabilidad.

Las condiciones cromatogrficas descritas en la Tabla 4 dieron lugar a una buena separacin de los siete compuestos estudiados como se puede observar en las

137

Resultados y Discusin

figuras 32a y 32b. Otros metabolitos que participan en el metabolismo energtico de la carne como la Cn (creatinina), AU, G (guanosina), GMP (guanosn monofosfato), GDP (guanosn difosfato) y GTP (guanosn trifosfato) se inyectaron junto con los compuestos estudiados obteniendo tambin una buena separacin para todos ellos (Figura 33). El mtodo cromatogrfico desarrollado en este estudio no se valid para estos ltimos compuestos porque su presencia en carne fresca es casi nula (Batlle et al., 2000). Sin embargo, la cantidad de Cn, AU, G, GMP, GDP y GTP en productos crnicos curados, fermentados y cocidos es mayor y la importancia de algunos de stos compuestos como la Cn o el GTP en la percepcin del sabor de la carne ha sido estudiado (Macy et al., 1970; Cambero et al., 2000). Ensayos de validacin del mtodo cromatogrfico HILIC Las rectas de calibracin se construyeron mediante la utilizacin de diferentes intervalos de acuerdo a la concentracin de cada analito en las muestras de carne. Las ecuaciones y los coeficientes de regresin de las rectas correspondientes a los respectivos analitos se muestran en la Tabla 17. La respuesta fue lineal en el intervalo de concentracin estudiado en todos los analitos con coeficientes de regresin superiores a 0.99. La linealidad del mtodo para todos los compuestos es tan buena como la obtenida con otros mtodos.
Tabla 17. Tiempos de retencin y rectas de calibracin obtenidos en el anlisis de los patrones de hipoxantina (Hx), inosina (Ino), adenosn monofosfato (AMP), + dinucletido de nicotinamida adenina (NAD ), inosina 5 monofosfato (IMP), adenosn difosfato (ADP) y adenosn trifosfato (ATP).

138

Resultados y Discusin

Tiempo de Pendiente Ordenada en el origen Intervalo retencin (g/mL) Media* SD Media* SD R2 (min) Hx 6.5 0.5-100 158488.8 2711.1 38.6 7.5 0.999 INO 7.3 1-150 80276.5 337.8 49.0 47.2 0.998 AMP 11.9 2-250 67105.7 125.9 50.2 4.9 0.999 14.4 3-350 31569.2 220.5 71.8 3.3 0.997 NAD+ IMP 15.8 2-250 40889.2 251.9 51.0 10.9 0.999 ADP 18.6 2-300 45553.9 1002.9 394.0 210.0 0.998 ATP 22.5 3-400 47802.5 740.5 558.6 138.1 0.999 * Calculado a partir de tres rectas de calibrado representadas por la concentracin (mg/mL) frente el rea (mAU*s). Para cada analito se tomaron ocho puntos de referencia Analito

El lmite de deteccin (LD), obtenido a partir de enriquecimientos decrecientes de muestras de carne de 5 horas post-mortem y comparado con la seal ruido de una disolucin blanco, (ver apartado 4.3.2.1.2.) fue de 1,72, 0,16, 0,05, 0,15, 0,16, 0,15 y 0,10 g/mL para Hx, Ino, AMP, NAD+, IMP, ADP y ATP, respectivamente (Tabla 18). Como puede observarse, el lmite de deteccin de la hipoxantina fue considerablemente ms alto que el del resto de los analitos debido al incremento de la absorcin a 254 nm en esa zona (~ 6.5 min) causadas por el gradiente de sal que provoca alteraciones de la lnea base del cromatograma. Los datos de repetibilidad y reproducibilidad, que se muestran en la tabla 18, demostraron muy poca variabilidad de un anlisis a otro. Los resultados coinciden con los publicados por otros autores para msculos de cerdo de 5 horas post-mortem que se haban analizado utilizando otros mtodos (Tsai et al., 1972; Batlle et al., 2000 y 2001).
Tabla 18. Limite de deteccin (LD), repetibilidad y reproducibilidad calculados en muestras de lomo de cerdo de 5 horas post-mortem.

139

Resultados y Discusin

Analito Hx Ino AMP NAD IMP ADP ATP

LD (n=20 ) Media (g/mL) 1.72 0.16 0.05 0.15 0.16 0.15 0.10 DS 0.10 0.03 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

Repetibilidad (n=8 ) Media (mg/100g) 3.04 24.19 10.22 59.85 130.79 42.17 104.10 DS 0.03 0.13 0.10 0.73 0.77 0.37 0.40 CV 1.00 0.55 0.98 1.22 0.59 0.88 0.39

Reproducibilidad (n=6 ) Media (mg/100g) 3.04 24.31 10.09 55.88 128.69 39.15 104.26 DS 0.02 0.32 0.23 5.31 2.10 3.00 0.75 CV 0.77 1.33 2.32 9.50 1.64 7.66 0.72

El porcentaje de recuperacin determinado despus de la adicin de cantidades conocidas de patrn de los analitos a muestras de carne de 5 horas post- mortem, se muestran en la tabla 19 y oscil entre el 94.8 y el 121.6 %.

Comparacin entre el mtodo IP-RP-HPLC e HILIC. Las muestras de carne de cerdo a diferentes tiempos post-mortem se analizaron simultneamente tanto por HILIC como por IP-RP-HPLC utilizando las columnas descritas en el apartado 4.3.2. para determinar la concentracin ATP, ADP, AMP, IMP, Ino, Hx y NAD+. El anlisis de varianza no revel diferencias significativas entre los datos obtenidos en ambas columnas para casi todos los compuestos y tiempos post-mortem, aunque a las 171 horas en NAD+ y a 27, 51 y 171 horas en ADP se observaron diferencias significativas (p<0.01).

Tabla 19. Recuperacin de los analitos estudiados en muestras de lomo de cerdo de 5 horas post-mortem.

140

Resultados y Discusin

Analitoa

Muestrab

Hx

3.23

Ino

24.66

AMP

10.66

NAD+

43.94

IMP

133.65

ADP

50.07

ATP
a

103.89

Valor Valor tericoc aadido (mg/100 g) 2.85 6.08 5.70 8.93 11.40 14.63 11.25 35.91 22.50 47.16 45.00 69.66 5.21 15.83 10.42 21.04 20.85 31.46 10.80 54.55 21.60 65.35 43.20 86.95 58.50 192.15 117.00 250.65 234.00 367.65 22.50 72.57 45.00 95.07 90.00 140.07 62.55 166.44 125.10 228.99 250.20 354.09

Valor recuperado 6.07 8.67 14.19 35.23 46.30 69.52 17.60 24.36 38.26 61.98 69.20 84.49 189.81 248.36 371.58 70.79 97.83 145.01 158.58 217.09 341.43

Recuperacin (%) 99.71 97.05 96.98 98.11 98.16 99.80 111.20 115.79 121.60 113.62 105.88 97.16 98.78 99.09 101.07 97.54 102.89 103.52 95.28 94.80 96.43

Hipoxantina (Hx), inosina (Ino), adenosn monofosfato (AMP), dinucletido de nicotinamida

+

adenina (NAD ), inosina 5 monofosfato (IMP), adenosn difosfato (ADP) y adenosn trifosfato (ATP)
b c

Cada valor corresponde con tres repeticiones en cada nivel de concentracin. El valor terico contempla el valor aadido mas el intrnseco de la muestra

Por otro lado, en la figura 34 se ilustra la correlacin entre los datos obtenidos por HILIC y el mtodo IP-RP-HPLC. Se encontr una buena correlacin entre los dos conjuntos de datos con coeficientes de correlacin de 0.99 para el ATP, ADP, AMP, Hx y NAD+ y 0.94 para IMP e Ino. Estos resultados demuestran la precisin y fiabilidad de ambos mtodos utilizando estas columnas.
100 50

a) ATP (mg/100g) RP

y = 0,9636x - 0,9539
80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100

b) ADP (mg/100g) RP

y = 1,1709x - 5,2734
40 30 20 10 0

r = 0,997

r = 0,994

141
d) 350

10

20

30

40

50

ATP (mg/100g) HILIC c) AMP (mg/100g) RP

15 12 9 6 3 0 70 60 3 6 9 12 15

ADP (mg/100g) HILIC y = 1,0229x + 1,7462 r = 0,939

2

y = 0,9131x + 0,1703 IMP (mg/100g) RP r = 0,991

2

300 250 200 150 100 50 0 0 10

50 100 150 200 250 300 350

AMP (mg/100g) HILIC e) g/100g) RP y = 1,0746x - 4,2517 r2 = 0,940 f) /100g) RP

IMP (mg/100g) HILIC y = 1,1866x - 0,6935

8 6 4

50 40 30

r = 0,996

Resultados y Discusin

Figura 34. Correlacin entre el mtodo HILIC y el mtodo IP-PR-HPLC con respecto a las concentraciones de los analitos estudiados. La lnea continua indica la correspondencia perfecta (x=y) y la lnea quebrada las correlaciones obtenidos tras el anlisis.

5.2.1.2.2. Productos crnicos.

142

Resultados y Discusin

En el caso de los productos crnicos como el jamn curado, la accin de las enzimas es bastante ms pronunciada que en otros productos debido al largo tiempo de elaboracin y maduracin, dando lugar a una gran la cantidad de pptidos y aminocidos libres (Toldr, 1998; Bolumar et al., 2001) que generan interferencias con los analitos de estudio cuando se analizan por IP-PR-HPLC.

Como se ha mencionado en al apartado anterior, HILIC constituye un mtodo vlido y fiable para analizar el ATP y sus metabolitos. La fase estacionaria elegida en este mtodo contiene grupos funcionales zwitteriones altamente polarizados que resultan muy adecuados para la separacin y cuantificacin de estos compuestos en matrices complejas como la carne fresca. En general la metodologa de anlisis HILIC result ser una tcnica simple en comparacin con otros mtodos convencionales, ya que evita limpiezas complejas o procedimientos de derivatizacin de la muestra y, adems, es compatible con el anlisis de espectrometra de masas en caso que se necesitara.

En este contexto, se inyect un extracto de un jamn curado de 11 meses de maduracin en las condiciones cromatogrficas HILIC propuestas. En la figura 35 se muestra la separacin de los compuestos de inters. An cuando se observa una excelente separacin de algunos de ellos, la Hx y la X coeluye. Razn por la cual, se propuso la utilizacin de la RP-HPLC descrita en el apartado 4.3.2.2.1., cuyos resultados se muestran y discuten en el apartado 5.2.3. Cabe mencionar que los resultados obtenidos, derivados del anlisis cromatogrfico de la carne fresca, jamn curado, formaron parte de una revisin sobre las aplicaciones recientes de la metodologa HILIC en el anlisis de compuestos bioqumicos relacionados con la calidad y seguridad en la carne, pollo y productos procesados (Anexo 3).
1700 1400 Absorbancia (254 nm) 1100
143

800 500 200 -100 0 2 4 6 8 Tiempo (min) 10 12 14 16

G INO Cn

Hx + X

Resultados y Discusin

Figura 35. Cromatograma correspondiente al anlisis de jamn curado de 11 meses por HILIC usando una columna ZIC-pHILIC (Sequant, 4.6 x 150 mm, 5m). Cn (creatinina), Hx+X (hipoxantina+xantina), Ino (inopina), G (guanosina).

5.2.2. Proceso de curado de un embutido fermentado. Los embutidos fermentados curados constituyen un grupo de productos tradicionales del rea mediterrnea muy apreciados por los consumidores europeos. La tecnologa de fabricacin de estos productos ofrece una multitud de posibilidades y variantes en cuanto a ingredientes y procesos de elaboracin, lo que ha dado lugar a la aparicin de gran nmero de variedades nacionales, regionales e incluso locales. En general, las caractersticas de la materia prima, las condiciones en las que se lleva acabo el proceso, el efecto de las especias, los agentes de curado y la adicin de cultivos iniciadores aunado a complejas transformaciones qumicas y enzimticas (autoltica y/o microbianas) definen las caractersticas organolpticas del producto final as como su conservacin y seguridad.

En particular, los microorganismos desempean un papel importante en estos productos, ya que estn directamente implicados en la reduccin de nitratos a

144

Resultados y Discusin

nitritos, el descenso de pH, la formacin del aroma, la estabilidad del color y la capacidad de conservacin. La inoculacin con cultivos iniciadores mejora la calidad y la seguridad del producto final al inhibir y/o controlar el crecimiento de poblaciones dainas, adems de permitir la estandarizacin del los procesos de produccin. La combinacin de condiciones controladas de secado y del uso de cultivos iniciadores ha permitido de cierta manera remplazar la lenta tecnologa tradicional de fabricacin por maduraciones rpidas aunque, generalmente, de menor calidad sensorial (Sanz et al., 1998)

El efecto del nitrito sobre los productos curados que ha sido ampliamente estudiado, se resume en que contribuye en la formacin del color rojo tpico de la carne curada, en la inhibicin del crecimiento del Clostridium botulinum, en el desarrollo del aroma a curado adems de ejercer un efecto antioxidante retrasando el enranciamiento por oxidacin (Flores y Toldr, 1993). Sin embargo, el uso de nitrato como sal de curado ofrece ciertas ventajas tecnolgicas sobre todo cuando se emplea en procesos tradicionales de curado con bajas temperaturas y tiempos de secado largos, actuando como reservorio y reducindose lentamente a nitrito (Toldr, 2005); incluso, el uso de nitrato mejora el sabor y aroma de los embutidos (Sanz et al., 1998; Olivares et al., 2009).

En aos recientes, a fin de facilitar la distribucin, aumentar la vida til y la venta al por menor de productos crnicos fermentados curados en formatos atractivos para el consumidor (lonchas), varios autores (Fernndez et al., 2001) han estudiado el efecto del envasado sobre la calidad y variedad de embutidos. El envasado en atmsferas modificadas (al vaco o con gases) detiene la desecacin ulterior y reacciones de oxidacin intensas, y por ello es muy beneficioso cuando se quiere alargar la vida del embutido (Rncales., 1994).

145

Resultados y Discusin

En este trabajo se estudi el efecto que tiene la fabricacin de embutidos fermentados curados con nitrito o nitrato, como agentes de curado, sin la adicin de especias en un proceso de fermentacin lenta sobre los cambios de nucletidos y sus derivados. Los resultados obtenidos se describen a continuacin. 5.2.2.1. Evolucin de los parmetros fisicoqumicos Las condiciones de temperatura durante el proceso, prdidas de peso y humedad se muestran en las figura 36. La evolucin de estos parmetros podra considerarse como normales para este tipo de productos y proceso (fermentacin lenta) al coincidir con los datos obtenidos por otros autores (Marco et al., 2006; Olivares et al., 2009). La prdida de peso se determin a lo largo del proceso de curado (42 das) en ambos lotes, alcanzado en promedio una prdida del 40.29 % sin encontrar diferencia importantes entre ellos y coincidiendo con la prdida de humedad de las muestras desde 62.26 % hasta 38.39 y 40.22 % para los lotes de nitrito y nitrato, respectivamente, mantenindose prcticamente constante hasta el final de la etapa de envasado al vaco.

Con el fin de controlar el proceso de fermentacin y obtener un producto homogneo, durante el proceso de fabricacin se adicion el cultivo comercial SP318 (Ver apartado 4.2.2), que contena una mezcla homognea de Lactobacillus sakei, Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus xylosus y Staphylococcus carnosus.

146

Resultados y Discusin

70

12 10 8 6

Prdidas de peso y humedad (%)

60 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

4 2 -

Proceso de curado (das)

Figura 36. Evolucin de las prdidas de peso (nitrito () nitrato ()) contenido de humedad (nitrito ( ) nitrato ( )) y temperatura (lnea continua) durante el proceso de curado de los embutidos fermentados.

De esta manera, la evolucin de la poblacin de bacterias lcticas (BAL) y estafilococos durante el proceso de curado se muestra en la figura 37. Los resultados se encontraron dentro de los intervalos esperados en este tipo de productos (Marco et al., 2006). Se observ un crecimiento rpido de las BAL durante los primeros 11 das correspondientes a la etapa de fermentacin, en ambos lotes, ratificado por la disminucin rpida del pH (Figura 37) debida a la produccin de cido lctico como producto final de la fermentacin de carbohidratos. No se mostraron diferencias significativas (p<0.05) en relacin al pH entre ambos lotes. Durante la etapa de maduracin se observa un ligero aumento de la poblacin en ambos lotes, que es ligeramente superior en el lote de nitritos encontrando diferencia significativas (p<0.05) con el lote de nitratos. A partir de aqu la poblacin de BAL se mantuvo constante hasta el final del envasado en ambos lotes mientras que el pH aument ligeramente.

147

Temperatura (C)

Resultados y Discusin

Figura 37. Poblacin de estafilococos (nitrito () nitrato ()), bacterias cido lcticas (nitrito ( ) nitrato ( )) y evolucin del pH ( nitrito y nitrato) durante el proceso de curado de los embutidos fermentados. Las barras de error indican la desviacin estndar de la media de tres embutidos.

La poblacin de estafilococos tanto en el lote de nitrito como en el de nitrato mostr tasas de crecimiento muy similares, mantenindose constantes a lo largo del proceso de curado y envasado. Aunque, no se muestran diferencias significativas (p<0.05) entre los lotes, se observa un ligero incremento en el lote de nitrito. El crecimiento de estos microorganismos se ve inhibido por la reduccin de pH (Hammes et al., 2003). La adicin de estos microorganismos es importante por su actividad nitrato reductasa que es la responsable de la reduccin del nitrato a nitrito, estabilizacin del color tpico del embutido, actividad catalasa y prevencin de la rancidez y por su implicacin en la hidrlisis proteica para producir compuestos aromticos que mejoran las propiedades sensoriales del producto (Montel et al., 1998).

148

Resultados y Discusin

5.2.2.2. Determinacin de nucletidos y sus derivados por RP-HPLC En este caso al igual que en jamn curado, la determinacin de nucletidos y sus derivados se realiz por cromatografa lquida en fase reversa (RP-HPLC) como se describe en el apartado 4.3.2.2. Esta tcnica se eligi debido a la composicin de la matriz crnica, puesto que la cantidad de pptidos y aminocidos libres aumentan a lo largo del proceso de curado (Toldr, 1998; Bolumar et al., 2001), ocasionando interferencia con algunos de los compuestos de inters si fuesen analizados por IPPR-HPLC o HILIC , como se describe en apartado 5.2.1.1. y 5.2.1.2.2 respectivamente. En los productos curados puede aparecer xantina, producto de la oxidacin de la Hx por va autoltica en funcin del tiempo de curado o asociada a la presencia de flora microbiana (Urich, 1990), logrando una buena separacin y cuantificacin por RPHPLC (Figura 38). La determinacin correcta de la hipoxantina y xantina ser importante para su correlacin con la obtenida mediante los sistemas enzimticos propuestos en este trabajo (ver apartado 5.3.).

En los embutidos crudos fermentados se hizo el seguimiento de tres compuestos derivados de la degradacin del ATP (IMP, Ino, Hx) y la creatinina (Cn), compuesto derivado de la conversin no enzimtica de la creatina que constituye a su vez la fuente inmediata y directa para regenerar el ATP y proveer de energa a las clulas musculares.

149

Resultados y Discusin

900 Hx

700 Absorbancia (mAU) 236, 254 y 270 nm

500

300

X 100 Cn

-100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Tiempo (min)

Figura 38. Cromatograma de RP-HPLC correspondiente al anlisis de una muestra de un embutido fermentado de 24 das de curado (lnea continua) y la separacin del patrn de xantina (X) (lnea quebrada). Creatinina (Cn), hipoxantina (Hx) y xantina (X). La deteccin se realiz a 236 nm, 254 nm y 270 nm, respectivamente.

En la figura 39 se muestra la evolucin de stos durante el proceso de curado del embutido fermentado fabricado solo con nitrito o solo con nitrato. En general, a lo largo del proceso de curado (42 das) y envasado al vaco hasta los 91 das, no se detectaron diferencias significativas (p<0.05) entre el lote de embutidos fabricado con nitrito o el fabricado con nitrato. Sin embargo, el contenido de IMP e Ino al final de la etapa de fermentacin (11 das) mostr diferencias significativas (p<0.05) entre ambos lotes. Los valores mas altos fueron detectados en las muestras con nitrito, dejando ver una ralentizacin en la degradacin de dichos compuestos.

La concentracin inicial de todos los compuestos detectados en ambos lotes muestra la utilizacin de una masa crnica en una fase de maduracin superior a las

150

Resultados y Discusin

24 horas post-mortem segn lo determinado en el anlisis de carne fresca del apartado anterior; sin embargo, estos valores pueden estar influenciados en parte por la adicin de la materia grasa (20 %). An as, el AMP en la masa crnica al inicio del proceso se detect a muy bajas concentraciones (0.21 0.06 mol/g, b.s) en ambos lotes desapareciendo casi en su totalidad al final de la etapa de maduracin (24 das) (Figura 39a).
0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
b

6.0
c

Ino (mol/g, b.s.)

AMP (mol/g, b.s.)

4.5

3.0

1.5

0.0
d

6.0 4.5 3.0 1.5 0.0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Hipoxantina (mol/g, b.s.)

7.5 IMP (mol/g, b.s.)

12.0 9.0 6.0 3.0 0.0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Proceso de curado (das)

Figura 39. Evolucin de nucletidos y sus derivados durante el proceso de fermentacin, maduracin, secado y almacenamiento envasado al vaco de embutidos fabricados con nitrito () o nitrato (). Las barras de error indican la desviacin estndar de la media de tres embutidos.

151

Resultados y Discusin

El IMP en la masa crnica (6.40 0.35 mol/g, b.s) disminuy rpidamente en ambos lotes de manera que al final de la etapa de fermentacin (11 das) haba desaparecido casi en su totalidad (Figura 39b). Estudios relacionados con la degradacin del IMP en funcin del pH y temperatura en medios acuosos y en sistemas modelo de carne de pollo indican que la degradacin del IMP se vi influido significativamente por el pH y el tratamiento trmico. Temperaturas altas y pH cidos causan un mayor grado de degradacin del IMP que a un pH neutro o alcalino (Vani et al., 2006). De este modo, las condiciones de pH (4.8) y temperatura (9 C) en la etapa de fermentacin pudieron influir en la rpida degradacin del precursor principal del sabor en la carne (IMP) en mayor medida en el lote de embutidos fabricados con nitratos. Por otro lado, transformaciones rpidas de IMP a Ino en menos de 24 horas fueron observadas durante la fabricacin de chorizo, presuntamente debido a la adicin de sal y/o especias (Mateo et al., 1996). No obstante, el sabor de los embutidos fermentados es el resultado de la interaccin de una serie de factores, como son la formulacin utilizada (condimentos, aditivos, cultivos iniciadores), modificaciones fisicoqumicas y bioqumicas de la masa del embutido (acidificacin, desecacin, proteolisis, liplisis), condiciones tecnolgicas del proceso (H.R., temperatura, intensidad de estufajes) y envasado (al vaco o con gases) (Rncales, 1994). En este contexto, parece ser que el IMP en general tiene poca relevancia en el sabor de los embutidos al igual que los sugiere Mateo et al., (1996) en chorizo; sin embargo se han observado efectos positivos sobre el aroma en los embutidos fermentados con la adicin de nitratos (Olivares et al., 2009).

Debido a la degradacin del IMP se esperara que los niveles de Ino se incrementasen con el tiempo, segn lo observado en el msculo post-mortem de la seccin anterior (5.2.1). Sin embargo, en los embutidos fermentados curados la Ino (4.78 0.22 mol/g, b.s) al inicio del proceso tiende a desaparecer en su totalidad hasta el final de la etapa de maduracin (24 das), dando lugar a la acumulacin de

152

Resultados y Discusin

Hx (Figura 39c). De este modo, los niveles ms altos de Hx (10.83 0.47 mol/g, b.s) en ambos lotes, sin mostrar diferencias significativas (p<0.05) entre ellos, se alcanzaron al final de la etapa de maduracin (24 das), mantenindose constantes hasta el final del proceso de curado y secado (42 das), incluso durante su almacenamiento envasados al vaco (Figura 39d).

La acumulacin de Hx en el tiempo ha sido relacionada tanto con cambios autolticos durante el almacenamiento como con la accin microbiana. Estudios en bacalao refrigerado sugieren que la nuclesido fosforilasa bacteriana desempea un papel principal en la produccin post-mortem de la hipoxantina (Surette et al., 1988). Sin embargo, aunque el envasado a vaco no detiene las reacciones bioqumicas ni el crecimiento de microorganismos que puedan vivir en ausencia de oxigeno (Rncales, 1994), la baja temperatura (4 C) a la que fueron almacenados los embutidos as como la presencia de nitrito y otros factores como la desecacin del producto hacen que no exista riesgo de crecimiento microbiano patgenos y se muestran como limitantes para que no se siga acumulando y/o produciendo ms Hx. De echo, algunos estudios relacionados con el envasado de pescado en atmsferas modificadas con dixido de carbono (CO2) y N2 (Warthesen et at., 1980; Boyle et al., 1991; Dhananjaya y Stroud 1994; zogul et al., 2000), ponen de manifiesto que la presencia de CO2, compuesto utilizado para extender el tiempo de almacenamiento de pescado fresco en atmsferas modificadas, afecta la acumulacin de Hx. El incremento de Hx es ms bajo en atmsferas modificadas con CO2 que en atmsferas normales. Tomando en consideracin esta apreciacin, es conocido que ciertas bacterias no crecen en estas atmsferas y en este caso no se produce ms Hx.

En relacin con la creatinina se detect un incremento de sta desde el inicio del proceso (1.05 0.04 mol/g, b.s) hasta el final del curado (9.98 0.48 mol/g b.s en

153

Resultados y Discusin

promedio), para ambos lotes (nitrito y nitrato) sin mostrar diferencias significativas (p<0.05) entre ellos. Incluso durante el envasado al vaco se sigui observando una tendencia a la alza y, aun cuando no se observaron diferencias significativas entre lotes (p<0.05), los valores mayores fueron detectados en el lote con nitrato (12.91 0.44 mol/g, b.s) respecto al de nitrito (11.79 0.95 mol/g b.s). Incremento en la concentracin de creatinina durante el proceso de curado de jamn tambin ha sido recientemente observada (Mora et al., 2009). La creatina y creatinina han sido considerados precursores de aminas heterocclicas en carnes cocinadas, sobretodo en la superficie de la carne, cuando sta se somete a procesos que requieren altas temperaturas como el asado, frito o a la plancha). 5.2.3. Proceso de curado de jamn. El jamn curado constituye uno de los productos tradicionales ms importantes de la carne de cerdo en el rea del Mediterrneo, adems de ser altamente apreciado por los consumidores. La sal (NaCl), un ingrediente esencial en la elaboracin de este producto tiene una funcin importante en trminos de calidad, por afectar al desarrollo del sabor, a la textura, al color, a la unin de protenas y a la capacidad de retencin de agua (Toldr, 2002). Adems acta como conservante reduciendo la actividad de agua y/o inhibiendo la presencia de algunos microorganismos. Sin embargo, la ingesta excesiva de sal, ms de 6 g/da/persona, est estrechamente asociada con la hipertensin y, en consecuencia con un mayor riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares (Ruusunen y Puolane, 2005). Algunos estudios encaminados a reducir el contenido en sal (Andrs et al., 2004), el tiempo de salado (Arnau et al, 1997) o la substitucin del NaCl por otras sales (Blesa et al, 2008) han sido desarrollados, sin embargo, la principal dificultad surge porque estas acciones pueden alterar la bioqumica de proceso que es muy importante para el desarrollo de la textura y el sabor.

154

Resultados y Discusin

Como anteriormente se ha mencionado, durante el proceso de curado del jamn ocurren muchos cambios bioqumicos como consecuencia de las reacciones enzimticas que tienen lugar y esto tiene un alto impacto en la calidad del producto final (Toldr, 2006). Entre ellas, podemos distinguir la protelisis, la liplisis y algunas reacciones enzimticas del metabolismo muscular post-mortem que continan en etapas iniciales del proceso de curado. Este es el caso de la degradacin del ATP con la generacin de sus productos derivados y de la gluclisis con la generacin de cido lctico como producto final (Toldr, 2002). Por lo tanto, la actividad enzimtica y la dependencia del tiempo en la degradacin de los nucletidos y sus derivados hacen interesante su estudio a lo largo del proceso de curado. As, uno de los propsitos de este trabajo fue estudiar cmo el proceso de curado de jamn empleando tres diferentes formulaciones de sal afecta a la degradacin de los nucletidos y sus derivados. Los resultados obtenidos se describen a continuacin. 5.2.3.1. Evolucin de los parmetros fisicoqumicos El jamn, durante su proceso de transformacin a jamn curado experimenta diferentes ciclos de temperatura y humedad relativa (H.R.), cuyo control previene posibles alteraciones en el producto final. En este caso, a lo largo del proceso de curado se realiz el seguimiento de las prdidas de peso, lo que permiti controlar el proceso de deshidratacin del jamn, hasta alcanzar una merma del 34 % respecto al peso inicial del jamn en fresco. Adems, se determin el porcentaje de humedad de cada una de las muestras obtenidas. De manera general, se observ un descenso significativo de la humedad en las tres formulaciones a lo largo del proceso de curado (Figura 40). Las prdidas de humedad se hacen evidentes desde el salado hasta los 20 das de post-salado en las tres formulaciones (p<0.001), debido a la accin higroscpica de la sal, que favorece la evaporacin mas rpida del agua superficial. A partir de aqu, la humedad de las muestras se mantuvo constante durante el resto del post-salado con excepcin de la formulacin II que de los 50 a

155

Resultados y Discusin

los 80 das disminuy (p<0.001). El aumento paulatino de la temperatura y la disminucin de la humedad relativa de la cmara desde el final de la etapa de postsalado, result en una gradual prdida de humedad hasta llegar a estabilizarse en la etapa de maduracin (7, 9 y 11 meses) en las tres formulaciones observndose diferencias significativas (p<0.001) entre estas etapas.
85

75

Humedad (%)

65

55

45 0 50 100 150 200 250 300 350

Proceso de curado (das)

Figura 40. Evolucin de la humedad en el msculo semimembranosus durante el proceso de curado de jamn con tres diversas formulaciones de la sal. 100 % del NaCl, FI (), 50 % NaCl y 50 % KCl, FII () y 55 % NaCl, 25 % KCl, 15 % CaCl2 y 5 % MgCl2, FIII ( ). Las barras de error indican la desviacin estndar de la media de tres jamones.

La evolucin del pH durante el proceso de curado del jamn con las tres formulaciones de sal se muestra en la figura 41. Es conocido que el pH disminuye en el msculo post-mortem por efecto de la acumulacin de acido lctico; sin embargo, se observa un ligero incremento de pH durante el proceso de curado. En especial en las formulaciones I y II este incremento se ve mas acusado desde la etapa de salado hasta los 50 das de post-salado respecto a la formulacin III (p<0.001), para luego disminuir y estabilizarse hasta el final del proceso en las tres formulaciones. Las fluctuaciones de pH en los msculos de jamn situados cerca de la superficie se ven

156

Resultados y Discusin

afectadas por varios factores, entre ellos, la rpida absorcin de la sal, un secado mas rpido e intenso y finamente el crecimiento microbiano (Arnau et al., 2003).
7.5 7.0 6.5

pH

6.0 5.5 5.0 4.5 0 50 100 150 200 250 300 350

Proceso de curado (das)

Figura 41. Evolucin del pH en el msculo semimembranosus durante el proceso de curado de jamn con tres diversas formulaciones de la sal. 100 % del NaCl, FI (), 50% NaCl y 50 % KCl, FII () y 55 % NaCl, 25 % KCl, 15 % CaCl2 y 5 % MgCl2, FIII ( ). Las barras de error indican la desviacin estndar de la media de tres jamones.

5.2.3.2. Evolucin de nucletidos y sus derivados por RP-HPLC. Los nucletidos y sus derivados se determinaron por RP-HPLC (como se describe en el apartado 4.3.2.2.) a lo largo del proceso de curado. De este modo, se detectaron y cuantificaron (en todas las formulaciones) el AMP, el IMP, Ino, Hx, X, GUA y U como se muestra en la figura 42.

El contenido de AMP en el jamn fresco (0.79 0.08 mol/g, b.s) disminuy (p<0.001) inicialmente en el salado y durante el secado en las tres formulaciones hasta su desaparicin total despus de siete meses (Figura 42a). El IMP en el jamn fresco (8.87 0.29 mol/g, b.s) tambin disminuy en las tres formulaciones (p<0.001) de manera que al final de la etapa de post-salado (50 o 80 das) haba desaparecido casi totalmente (Figura 42b). La estabilidad del IMP es superior en este

157

Resultados y Discusin

producto que en embutidos fermentados, en los que su desaparicin se da en los primeros 11 das de proceso (ver apartado 5.2.2.). La velocidad de degradacin del IMP en los jamones de la formulacin III (55 % NaCl, 25 % KCl, 15 % CaCl2 y 5 % MgCl2) fue algo ms lenta en comparacin con las otras dos formulaciones, observando diferencias significativas (p<0.001) a los 20 das de post-salado. Estudios previos han demostrado que la adicin del cloruro de sodio (2 - 4 %) a carne molida de ternera acelera la descomposicin del ATP a IMP (Hamm, 1977), mientras que la degradacin trmica del IMP y/o del GMP en una disolucin acuosa se retras en presencia de CaCl2, MgCl2 y MnCl2, pero no en presencia de NaCl y KCl, debido a que los iones divalentes aumentan la resistencia del enlace ster fosfato de los nucletidos (Kuchiba et al., 1990). El agotamiento del IMP, un conocido potenciador de sabor, despus de la etapa post-salado podra suponer la reduccin de la intensidad del sabor de la carne; sin embargo, el efecto potenciador es sustituido por otras sustancias como la sal agregada en el proceso y/o el cido glutmico y asprtico que se generan por protelisis y se acumulan a lo largo del proceso de curado (Toldr et al., 2000).

La figura 42c muestra la evolucin de la inosina. Las diferencias (p<0.001) entre formulaciones fueron ms evidentes en la etapa de post-salado. En esta etapa, la acumulacin de la inosina por accin de la enzima 5nucleotidasa sobre el IMP y la lenta conversin de Ino a Hx por la nucleosidasa fosforilasa (NP), segn lo describe Tsai et al., (1972) en el msculo post-mortem, se observ nicamente en la formulacin III. La hidrlisis de la inosina a Hx en esta formulacin fue ms lenta que en las formulaciones I y II desde el inicio del proceso de curado hasta el final de la etapa de post-salado. En las formulaciones I y II ocurri una degradacin acelerada de la inosina, encontrndose diferencias significativas (p<0.001) en su contenido al inicio del salado (despus de 20 das) en relacin a la formulacin III. Este comportamiento muestra que las reacciones enzimticas implicadas en este proceso

158

Resultados y Discusin

fueron afectadas probablemente por el tipo de mezcla de sal utilizada. La inosina tiende a desaparecer con el tiempo de maduracin, dando lugar a una acumulacin de la hipoxantina, producto derivado de su degradacin, hasta 15.88 el 0.77 mol/g, b.s en la etapa de maduracin (7, 9 y 11 meses) para las tres formulaciones (Figura 42d). Sin embargo, como en el caso de la inosina, se observaron diferencias significativas en el contenido de Hx en la formulacin III en relacin a las otras formulaciones, en la etapa de post-salado. Si bien, la acumulacin de Hx resulta de la actividad de las enzimas endgenas en el msculo, algunos estudios en pescado han demostrado que bacterias responsables del deterioro, que contienen la enzima de NP pueden influir en su formacin (Surette et al., 1988). Estas mismas bacterias pueden ser las responsables de la aparicin de xantina por oxidacin de Hx en algunas especies de pescados (Kassemsarn et al., 1963). En este estudio, la xantina se detect a partir de la etapa de post-salado hasta alcanzar un valor mximo (0.32 0.11 mol/g, b.s) a los 7 meses y no se observaron diferencias significativas (p<0.001) entre formulaciones (Figura 42e). Al final de la maduracin (9 a 11 meses) se observ una disminucin en el contenido de X en la formulacin III.

Otros nuclesidos como la guanosina y uridina que se encuentran en la carne fresca en bajas concentraciones (Flores et al., 1999; Batlle et al., 2000) tambin se detectaron a lo largo del proceso de curado del jamn. La guanosina es un metabolito de la degradacin del GMP (guanosina monofosfato) y contribuye a la formacin de la xantina en presencia de flora microbiana (Urich, 1990). Adems, la guanosina es un substrato alternativo de la NP para generar ribosa 1-fosfato y guanina, compuestos que son inhibidores de la enzima de NP (Luong y Male, 1992). El contenido de guanosina (Figura 42f) se mantuvo constante a lo largo del proceso, con un promedio de 0.30 0.02 mol/g, b.s Sin embargo, a los 7 y 11 meses de proceso la guanosina en la formulacin III se distingui (p<0.001) de los otras formulaciones.

159

Resultados y Discusin

2.0

a) AMP (mol/g, b.s.) Hx (mol/g, b.s.)

1.5

20

d)

15

1.0

10

0.5

0.0 20

0 2.0

b) IMP (mol/g, b.s.)

15

e)

X (mol/g, b.s.) c)

1.5

10

1.0

0.5

0 20

0.0 2.0

f) G (mol/g, b.s.)
1.5

Ino (mol/g, b.s.)

15

10

1.0

0.5

0 0 50 100 150 200 250 300 350

0.0 0 50 100 150 200 250 300 350

Proceso de curado (dias)

Figura 42. Evolucin de nucletidos y sus derivados en el msculo semimembranosus durante el proceso de curado de jamn usando tres diversas formulaciones de la sal. 100 % del NaCl, FI (), 50 % NaCl y 50 % KCl, FII () y 55 % NaCl, 25 % KCl, 15 % CaCl2 y 5 % MgCl2, FIII (). a) AMP, b) IMP, c) Ino, d) Hx e) X y f) G. Las barras de error indican la desviacin estndar de la medida de tres jamones.

160

Resultados y Discusin

La temperatura y el NaCl generalmente se han asociado con la regulacin de los procesos enzimticos. En el jamn curado, la reduccin del NaCl (Arnau et al., 1998; Toldr y Flores, 1998) o el incremento de la temperatura (Arnau et al., 1997) incrementan la actividad proteoltica, lo cual puede provocar una excesiva blandura y afectar al sabor del producto final. El proceso de curado del jamn se realiza a travs de sucesivos cambios de temperatura y en algunos casos, durante la maduracin, se incrementa la temperatura en etapas especficas del proceso para acelerar la accin enzimtica (Arnau et al., 1997). A raz de esto es interesante conocer si la temperatura podra afectar a la concentracin final de Hx. Algunos estudios sobre la degradacin trmica de nucletidos durante el enlatado de carne (Nguyen y Sporns, 1985) y otros sobre el efecto del pH y la temperatura en la degradacin del IMP en un sistema modelo (Vani et al., 2006) han sido publicados con anterioridad.

La estabilidad de la Hx con el tiempo de maduracin (7 a 11 meses) en las tres formulaciones se muestra en la Figura 42d. Es claro que la composicin de la sal no afect el contenido de Hx a este nivel de procesamiento. El efecto del tiempo de curado sobre la estabilidad de Hx tambin se analiz en jamones comerciales de 12 y 18 meses de curado que mostraron que el contenido de Hx no difera (p<0.001) entre ambos grupos ni entre aquellos observados en la experiencia de maduracin de 7, 9 y 11 meses descrita previamente.

La influencia del tiempo/temperatura sobre el contenido de Hx se estudi en el jamn curado de 11 meses de salado con la formulacin I (formulacin estndar) sometido a condiciones controladas de temperatura (20, 30, 40 y 70 C) durante diversos tiempos (20, 40 y 60 min). No se observaron diferencias significativas (p<0.001) en relacin al control (jamn curado de 11 meses sin tratamiento trmico), confirmando que la temperatura durante el proceso de curado no tiene

161

Resultados y Discusin

efecto sobre el contenido de Hx, incluso a temperatura extrema (70 C) aplicada durante 1 h. As pues, los resultados obtenidos sugieren que el contenido de la hipoxantina en jamn curado podra utilizarse como un marcador del tiempo mnimo de curado.

5.3. Determinacin de hipoxantina con el sensor enzimtico y su correlacin con los valores obtenidos por anlisis cromatogrfico.
Como se ha visto anteriormente, la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) es la tcnica ms usada para la deteccin de nucletidos y sus derivados; sin embargo, se han adaptando otros mtodos analticos, como es el uso de biosensores para la cuantificacin enzimtica de nucletidos (Luong et al., 1997; Venugopal, 2002). Muchos de ellos se han centrado en la determinacin de diferentes ndices para el control de la frescura y maduracin de distintas especies de pescado, aunque se han encontrado algunos otras aplicaciones en carne de pollo y ternera y en menor medida en carne de cerdo. La determinacin conjunta o individualizada de varios nucletidos de una muestra crnica puede hacerse multienzimticamente, tras la accin de sus respectivas enzimas selectivas (Karube et al., 1984; Mulchandani et al., 1990), libres y/o inmovilizadas en diversos soportes. El problema que suele plantearse cuando se determina ms de un nucletido a la vez, es poder discriminar qu proporcin de la seal corresponde a cada uno de ellos, para lo que suelen emplearse clculos matemticos que complican demasiado el anlisis cuando lo ms sencillo sera aplicar un anlisis cromatogrfico. De esta manera, la determinacin de un compuesto simple es una buena opcin para utilizar los sensores enzimticos ya que combinan la simplicidad de la operacin y la selectividad del sustrato con la enzima (Yano et al., 1995 y Shizuko et al., 2005).

162

Resultados y Discusin

Varios autores (Watanabe et al., 1983; Mulchandani et al., 1990; Luong y Male 1992; Yao T., 1993; Volpe y Mascini 1996; Batlle et al., 2001; Shizuko et al., 2005; Scheffler y Gerrard, 2007) han prestado considerable atencin a la degradacin de los nucletidos en relacin a la calidad y particularmente a la cuantificacin de Hx. Este compuesto ha sido propuesto como indicador de frescura o maduracin, ya que el ATP, por s solo, no se puede usar como ndice de frescura porque se degrada rpidamente a otros compuestos. Es as como el contenido de Hx resulta muy importante ya que se va acumulando durante un almacenamiento prolongado (Tsai et al., 1972; Yao T., 1993; zogul et al., 2000; Batlle et al., 2000 y 2001).

En este contexto, una vez se ha puesto a punto y optimizado el sensor enzimtico para la enzima XO (apartado 5.1) y partiendo del conocimiento de la evolucin de los nucletidos y sus derivados en la carne y productos crnicos (embutido fermentado y jamn curado) determinados por HPLC (apartado 5.2.), se propone el anlisis y la cuantificacin de la Hx en la carne y productos crnicos utilizando el sensor enzimtico. 5.3.1. Maduracin de la carne. La aplicacin del sensor enzimtico al anlisis de muestras de carne de cerdo (Longissimus dorsi), se evalu determinando el contenido de Hx a diferentes tiempos post-mortem (5, 7, 9, 11, 27, 51 y 171 horas), tanto en un sistema con la enzima libre como inmovilizada, segn el procedimiento descrito en el apartado 4.3.3. Adems, el mtodo fue validado comparando los resultados con los obtenidos en las mismas muestras por HPLC (apartado 5.2.1). En base a los resultados obtenidos de optimizacin del sensor enzimtico (apartado 5.1), la seal amperomtrica (Hx + X) obtenida al inyectar las muestras de carne en el sistema con la enzima libre, se transform en concentracin de Hx por extrapolacin en la recta de calibrado obtenida a partir del consumo de oxgeno acumulado a los 190 s (mg 02/L) frente a

163

Resultados y Discusin

diferentes concentraciones de Hx, mientras que en el sistema con la enzima inmovilizada, la concentracin de Hx se determin a partir de la velocidad de reaccin (mg 02/L s-1) a los 10 s durante la oxidacin de la Hx en presencia de la enzima XO. A fin de comparar esta seal, que incluye la Hx + X formada, con los valores de Hx obtenidos por HPLC fue necesario ajustar los datos.

A partir del estudio de oxidacin de la hipoxantina (apartado 5.1.1.3.), se determin que la mxima formacin de X se alcanz justo cuando haba un 33.11% de la Hx inicial, y as, el 33.11 % el consumo de oxgeno (como seal amperomtrica detectada en el sistema con la enzima soluble) se debe a la X y por diferencia le correspondera el 66.89 % a la Hx. Por otro lado, se sabe tambin que la actividad del XO por la X es la mitad de lo que es para la Hx. Retomando la ecuacin (Hx + X) propuesta por Yano et al, (1995), la seal detectada en trminos de velocidad de reaccin en el sistema con la enzima inmovilizada se relaciona entonces con la siguiente igualdad,
donde:

X = 33.11%; Hx = 66.89% ; sustituyendo en la ecuacin (Hx + X)

entonces:

Hx +

1 1 X = 66.89%Hx + (33.11%) 2 2 Hx = 83.44%

concluyendo que de esa seal, a la Hx le correspondera el 83.44 %. Por lo tanto, el contenido de Hx + X detectado en las muestras de carne se ajust eliminado la parte que corresponde a la X con su respectivo factor de ajuste para cada uno de los sistemas enzimticos.

Los resultados ajustados (Hx) y sin ajuste (Hx + X) en ambos sistemas enzimticos y los obtenidos por HPLC se muestran en la figura 43. Los contenidos de Hx+X determinados en ambos sistemas enzimticos muestran una tendencia muy similar a

164

Resultados y Discusin

la encontrada por HPLC (Hx), detectando un aumento en el contenido de Hx con el tiempo de maduracin de la carne como ya se ha visto en el anlisis cromatogrfico (apartado 5.2.1.).
Sistema enzima libre

1.0

0.8

0.6

0.4

Hipoxantina (mol/g de carne)

0.2

0.0 1.0 Sistema enzima inmovilizada

0.8

0.6

0.4

0.2

Sensor enzimtico (Hx+X) Sensor enzimtico (Hx) HPLC

0.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Proceso de maduracin (horas)

Figura 43. Evolucin del contenido de hipoxantina durante el proceso de maduracin en carne de cerdo (Longissimus dorsi) obtenida por HPLC y el sensor enzimtico en el sistema con la enzima libre e inmovilizada. Las barras de error indican la desviacin estndar de la media de cinco muestras de carne.

165

Resultados y Discusin

Esto demuestra la sensibilidad del sensor enzimtico en la deteccin de Hx + X en las muestras de carne. La deteccin en el sistema con la enzima libre (Hx + X) fue mayor que con el sistema inmovilizado; no obstante, el contenido de Hx calculado en ambos sistemas enzimticos despus de aplicar su respectivo factor de ajuste prcticamente se superponen con los valores detectados por HPLC, sin mostrar diferencias significativas (p<0.05).

La correlacin entre el contenido de Hx calculado con ambos sensores enzimticos, soluble e inmovilizado, y los obtenidos por HPLC en las muestras de carne se muestran en la figura 44. En ambos casos se detect un excelente coeficiente de correlacin (r=0.9517 y r=0.9620, respectivamente). Esto sugiere que el factor de ajuste propuesto aplicado en cada sistema enzimtico fue correcto para calcular el contenido de Hx en muestras de carne.
1.0 1.0

Sistema enzima libre

Sistema enzima inmovilizado

HPLC (mol Hx/g de carne)

HPLC (mol Hx/g de carne)

0.8

0.8

0.6

0.6

0.4
y=1.0408x (R =0.905) r=0.9517
2

0.4
y=0.9848x (R =0.925) r=0.9620
2

0.2

0.2

0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Sensor enzimtico (mol Hx/g de carne)

Figura 44. Correlacin entre el contenido de hipoxantina obtenida por HPLC y el sensor enzimtico en el sistema con la enzima libre e inmovilizada en muestras de carne de cerdo (Longissimus dorsi) a distintos tiempos post-mortem.

166

Resultados y Discusin

Los resultados obtenidos han demostrado que el sensor enzimtico propuesto, con la enzima libre o inmovilizada, constituye una excelente alternativa para la determinacin de hipoxantina en muestras de carne de cerdo. Adems, su fcil preparacin y operacin lo convierten en una herramienta fiable, rpida y econmica para simples o mltiples mediciones de Hx, en comparacin con otros sensores que basan su deteccin principalmente en la medida del perxido de hidrgeno. En estos sensores se requiere la utilizacin de potenciales positivos de operacin, al que numerosos compuestos orgnicos presentes en las muestras (H2O2, cido rico, ascorbato) son oxidables electroqumicamente y provocan interferencias en la seal. De hecho, a fin de evitar estas interferencias se hace uso de tcnicas complejas para disminuir dicho potencial, como es el uso de mediadores, acoplamiento de otras enzimas (como la peroxidasa), entre otras. Por lo tanto, la utilizacin de un oxmetro acoplado a una enzima, mediante la deteccin del oxgeno consumido, es una tcnica til y ms sencilla para evaluar la evolucin de la maduracin en la carne de cerdo como control de calidad de la frescura de la carne. 5.3.2. Proceso de curado de un embutido fermentado. Los embutidos fermentados curados, deben su gran importancia a que poseen caractersticas organolpticas distintivas (sabor y textura) muy valoradas por el consumidor. La presencia del ATP y sus derivados en los productos curados durante su maduracin estn relacionados principalmente con el sabor, actuando como potenciadores de mismo (Mateo et al., 1996). Es el caso del IMP, conocido potenciador del sabor. El IMP, puede tambin contribuir indirectamente al sabor a travs de su producto de degradacin, la hipoxantina, que junto con algunos aminocidos y diptidos dan lugar al sabor amargo (Tikk et al., 2006). De esta manera, se plante determinar el contenido de Hx en funcin del tiempo de proceso de curado utilizando el sensor enzimtico y compararlo con el ya obtenido por HPLC (apartado 5.2.2).

167

Resultados y Discusin

Como se observ en el apartado 5.2.2., no se mostraron diferencias significativas en el contenido de Hx detectado por HPLC entre los lotes fabricados con nitrito y con nitrato. Tampoco se observaron efectos interferentes en el sensor a causa de la utilizacin de las diferentes sales de curado. Por esto, la aplicacin del sensor enzimtico, con la enzima libre o inmovilizada, para este tipo de productos se llev acabo nicamente en el lote fabricado con nitrito, sin la adicin de especias y en un proceso de fermentacin lenta, como lote control de produccin. La determinacin y cuantificacin de Hx en ambos sistemas enzimticos se realiz de igual manera que con las muestras de carne de cerdo, utilizando los factores de ajuste propuestos para cada sistema. Las muestras fueron diluidas para adecuarse al intervalo lineal de deteccin de la recta de calibrado y obtener una respuesta fiable. En el sistema con la enzima libre se inyectaron 40 L de una dilucin 1:6 del extracto original; mientras que en el sistema con la enzima inmovilizada la muestra se diluy en un intervalo de 3 a 14 veces en las dos primeras etapas del proceso y 25 veces a partir de la etapa de maduracin.

El anlisis de la evolucin de hipoxantina durante el proceso de curado en los embutidos fabricados solo con nitrito por HPLC (apartado 5.2.2.) (Figura 45) mostr un incremento rpido en el contenido de Hx desde el inicio del proceso hasta el final de la etapa de maduracin (21 das), siendo ms evidente ese incremento durante los primeros 11 das (final de la etapa de fermentacin), mostrando diferencias significativas (p<0.05) entre estas etapas. A partir de la etapa de maduracin el contenido de Hx se mantuvo constante sin mostrar cambios significativos durante la etapa de secado (42 das) ni durante el almacenamiento al vaci (91 das). Esta tendencia, analizada por HPLC, fue muy similar a la detectada en ambos sistemas enzimticos lo que sugiere tambin la buena sensibilidad del sensor para este tipo de muestras crnicas. Sin embargo, al igual que en la carne fresca, el sensor con la enzima libre mostr las seales ms altas de deteccin (Hx+X); incluso, se detectaron

168

Resultados y Discusin

diferencias significativas (p<0.05) con respecto al contenido de Hx obtenido por HPLC (Figura 45).

La respuesta de sensor enzimtico en ambos sistemas, una vez realizado el ajuste correspondiente para descartar la parte proporcional de la xantina formada durante la oxidacin de la Hx, mostr estar ligeramente por debajo de la obtenida por HPLC (Figura 45), perdindose la relacin de ajuste propuesta para la carne fresca (apartado 5.3.1.). Esta desviacin puede ser debida a la complejidad de la muestra en s. El proceso de curado de los productos crnicos fermentados es complejo; diferentes reacciones bioqumicas se desarrollan sucesiva y paralelamente (Fadda et al, 2002), y podran interferir en la respuesta del sensor. Durante la maduracin se acumula cido lctico debido a la fermentacin de carbohidratos, la degradacin proteica genera un incremento de compuestos nitrogenados no proteicos (pptidos de bajo peso molecular y aminocidos libres), y las reacciones lipolticas generan cidos grasos libres que pueden generar a su vez steres, aldehdos y cetonas. Muchos de estos compuestos son extrados con el mtodo de extraccin utilizado y pueden detectarse en el extracto crnico.

169

Resultados y Discusin

18
Sistema enzima libre

16 14 12 10 8

Hipoxantina (mol/g, b.s.)

6 4 2 14
Sistema enzima inmovilizado

12 10 8 6 4 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
HPLC Sensor enzimtico (Hx+ X) Sensor enzimtico (Hx)

Proceso de curado (dias)

Figura 45. Evolucin del contenido de hipoxantina durante el proceso de curado de un embutido fermentado obtenido por HPLC y el sensor enzimtico en el sistema con la enzima libre e inmovilizada. Las barras de error indican la desviacin estndar de la media de tres embutidos.

Por otro lado, la actividad proteoltica en estos productos tambin se ve afectada por las enzimas microbianas de las bacterias lcticas (BAL). Estas bacterias producen perxido de hidrgeno (H2O2) en presencia de oxgeno cuya acumulacin tambin puede provocar reacciones de enranciamiento lipdico que ocasiona defectos en las caractersticas organolpticas del embutido (olores desagradables y reacciones de

170

Resultados y Discusin

decoloracin). A la par de estas reacciones, algunas especies de estafilococos a travs de su actividad catalasa reaccionan con el H2O2 que se degrada en agua y oxgeno. Si se considera que en la reaccin enzimtica de oxidacin de Hx se genera H2O2 como producto de la misma, existe la posibilidad de que la actividad enzimtica de la enzima XO haya sido afectada por efecto de una inhibicin por producto debida al H2O2 generada por las BAL, lo que justificara una actividad menor y, por tanto una sub-estimacin de la cantidad de Hx, desvindose as del ajuste propuesto.

A fin de comprobar la presencia de H2O2 en las muestras analizadas, se realiz una exploracin rpida de este compuesto por espectrofotometra, mediante una reaccin enzimtica indicadora (Bouvrette et al., 1997). El H2O2 presente en la muestra reacciona con un cromgeno (fenol/4-aminoantipirina) en presencia de la enzima peroxidasa (por la reaccin de Trinder), para formar un colorante con estructura de quinonaimina que absorbe a 505 nm. As, la intensidad de color producido (correlacionado, por medio de su respectiva recta de calibrado, con patrn de H2O2) fue directamente proporcional a la concentracin de H2O2 presente en las muestras. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 20. La mayor concentracin de H2O2 se detect al inicio de la etapa de maduracin justo en el momento en que la determinacin de Hx por el sensor se desvi del valor real (obtenido por HPLC), lo que confirma el posible efecto inhibidor del H2O2 sobre la actividad de la enzima XO.
Tabla 20. Concentracin de perxido de hidrgeno (H2O2) en muestras de embutido fermentado curado, fabricados solo con nitrito sin la adicin de especias y en un proceso de fermentacin lenta.
Intervalo de concentracion de H202 (mol/L) 0.87 - 4.0 10.0 - 18.0 1.47 - 5.0

Etapa de curado Inicial/Fermentacin Maduracin Secado/Envasado

171

Resultados y Discusin

En vista de los resultados, que se muestran en la figura 45, el sistema con la enzima inmovilizada parece ser la mejor opcin para detectar Hx en embutidos curados; especialmente, si se utiliza la respuesta del sensor directamente (Hx+X, expresada en concentracin), aunque la respuesta del sensor enzimtico con ajuste tampoco mostr diferencias significativas (p<0.05) con los resultados de Hx obtenidos por HPLC y muestran una excelente correlacin (r=0.9725) (Figura 46).

14

12

Hx
y=1.1176x (R =0.95) r=0.9725
2

HPLC (m Hx/g, b.s) ol

10

Hx+X
y=0.9324x (R =0.95) r=0.9725
2

0 0 2 4 6 8 10 12 14

Sensor enzimtico (mol Hx+X o Hx/g, b.s.)

Figura 46. Correlacin entre el contenido de hipoxantina obtenida por HPLC y el sensor enzimtico en el sistema con la enzima inmovilizada durante el proceso de curado de un embutido fermentado. () seal directa del sensor (Hx+X) y () seal ajusta da (Hx).

En general, los resultados sugieren que el sensor enzimtico con la enzima inmovilizada puede ser un mtodo viable para detectar el contenido de Hx en embutidos fermentados curados. Adems, el contenido de Hx detectado puede usarse para evaluar el progreso de maduracin durante el curado.

172

Resultados y Discusin

5.3.3. Proceso de curado de jamn. La aplicacin del sensor enzimtico al anlisis de muestras de jamn curado se evalu en las muestras con la formulacin I (100 % NaCl) y II (50 % NaCl y 50 % KCl) durante el proceso de curado, siguiendo el procedimiento experimental descrito en el apartado 4.3.6.

Los estudios preliminares con el sensor enzimtico en la carne fresca y en el embutido curado fermentado sugirieron condiciones de trabajo y estabilidad muy buenas. Sin embargo, en este caso se decidi tan solo usar el sistema con la enzima inmovilizada para la deteccin de Hx, debido a que la enzima es ms estable en este sistema y puede ser reutilizada mltiples veces. En este caso, los extractos del jamn curado de ambas formulaciones (I y II) se diluyeron entre 5 y 25 veces en la etapa de post-salado y 50 veces en la etapa de maduracin para se inyeccin en el sensor y adecuarse al intervalo lineal de deteccin. La velocidad de reaccin detectada a los 10 s fue utilizada para cuantificar la concentracin de Hx.

Los resultados de la evolucin de los nucletidos y sus derivados en el jamn curado con diversos niveles de sustitucin de NaCl por otras sales analizado por HPLC (apartado 5.3.2.) hacen evidente la acumulacin de la Hx y la presencia de xantina en las etapas finales de proceso de curado (Figura 42). La composicin de la muestra del jamn curado, derivado de los procesos bioqumicos que ocurren durante el proceso de curado (proteolisis y liplisis) (Toldr, 2006), podra suponer interferencias en la seal de deteccin del sensor enzimtico, como se ha visto en las muestras del embutido curado fermentado. En particular, la presencia de X supone una interferencia directa con la enzima XO, debido a que sta compite por los sitios activos de la enzima (Jezewska, 1973) con la Hx y la X formada por la oxidacin de Hx pudiendo causar algunos problemas de selectividad (Hu et al., 2000).

173

Resultados y Discusin

A fin de minimizar esta situacin, la seal amperomtrica del sensor enzimtico expresada en concentracin, que incluye tanto la Hx como la X formada de la oxidacin de la Hx y la X propia de la muestra (Hx+X), se compar con la suma del contenido de Hx y X obtenido por HPLC como se muestra en la figura 47.

20

Formulacin I

16

Hipoxantina + Xantina (mol/g, b.s.)

12

20

Formulacin II

16

12

HPLC Sensor enzimtico

0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360

Proceso de curado (dias)

Figura 47. Evolucin del contenido de hipoxantina + xantina en el jamn curado (100 % del NaCl, FI (), 50 % NaCl y 50 % KCl, FII ()) durante el proceso de curado obtenido por HPLC y el sensor enzimtico con la enzima inmovilizada. Formulacin I (100 % del NaCl) y formulacin II (50 % NaCl y 50 % KCl). Las barras de error indican la desviacin estndar de la media de tres jamones.

174

Resultados y Discusin

Los resultados muestran una tendencia muy similar en las dos formulaciones ensayadas en la evolucin de la hipoxantina-xantina durante el proceso de curado en ambos mtodos, aunque se observ una dispersin importante en las muestras analizadas en el sensor enzimtico desde la etapa de maduracin, en la cual la X est presente, en comparacin con las etapas iniciales donde no hay X. Sin embargo, los resultados en general ponen de manifiesto la excelente correspondencia del sensor enzimtico con el HPLC, obteniendo un coeficiente de correlacin de 0.974 para ambas formulaciones (Figura 48). Por lo tanto, la determinacin de Hx+X en jamn curado en el sensor enzimtico constituye una alternativa vlida a mtodos cromatogrficos debido su simplicidad y respuesta rpida. Adems la deteccin de la Hx o Hx+X en el jamn curado puede ser utilizado como ndice de tiempo mnimo de curado.

20

HPLC (mol Hx+X/g, b.s.)

FI 2 y=0.990x (R =0.949) r=0.974

16

12

8
F II 2 y=0.953x (R =0.951) r=0.975

0 0 4 8 12 16 20

Sensor enzimtico (mol Hx+X/g, b.s.)

Figura 48. Correlacin entre el contenido de hipoxantina + xantina durante el proceso de curado del jamn obtenida por HPLC y el sensor enzimtico con la enzima inmovilizada en jamn curado. () 100 % NaCl, FI y () 50 % NaCl y 50 % KCl, FII.

175

Resultados y Discusin

5.4. Determinacin de la generacin de aminas bigenas en los productos crnicos por HPLC.
Como anteriormente se ha descrito, la formacin de las aminas bigenas en los productos crnicos curados es debido a la descarboxilacin enzimtica de sus aminocidos precursores (Figura 8), fundamentalmente por accin de enzimas descarboxilasas de origen microbiano. De esta manera, el contenido y el tipo de amina formada dependern en gran medida de la composicin del alimento, flora microbiana y de algunos otros parmetros que permitan el crecimiento bacteriano tales como tratamiento del alimento, aditivos, temperatura, humedad, maduracin, envasado y almacenamiento (Halsz et al., 1994). La presencia de aminas como la cadaverina (CA), putrescina (PU) e histamina (HI) en la carne y sus productos crnicos ha sido un indicativo til para valorar su estado higinico o de alteracin (zogul et al., 2006), debido a que estas aminas se produce generalmente por accin de enterobacterias y pseudomonas, principales microorganismos causantes del deterioro de la carne (Hernndez-Jover et al., 1996). Es as que su determinacin ha sido utilizada como un parmetro para evaluar la calidad en los alimentos (Yano et al., 1996). Todo esto, unido a que el consumo en exceso de estas aminas puede causar efectos toxicolgicos suponiendo un riesgo para el consumidor; incluso se han propuesto diferentes estrategias tecnolgicas para la reduccin de aminas bigenas (Latorre-Moratalla et al., 2010a). An as, en los productos crnicos fermentados, se favorece la formacin de AB como consecuencia de la proteolisis (mayor disponibilidad de aminocidos precursores) y del desarrollo de una gran variedad de microorganismos (Bover-Cid et al., 2001b), nativos o adicionados como cultivo iniciador. Mientras que en el jamn, la intensa proteolisis que se lleva a cabo durante el proceso de curado genera una gran cantidad de aminocidos libres (Aristoy y Toldr, 1991) que del mismo modo con el tiempo pueden transformarse en aminas bigenas. En este sentido, se plante el anlisis de AB por HPLC de un embutido fermentado con nitrito o nitrato y de un jamn empleando tres diferentes

176

Resultados y Discusin

formulaciones de sal. Adems se comparan estos resultados con los valores obtenidos mediante el sensor de enzimtico descrito en el apartado 5.5. 5.4.1. Embutidos fermentados curados. El crecimiento rpido de las BAL al inicio del proceso de curado de un embutido fermentado es importante para inducir la rpida acidificacin y asegurar su calidad higinica (Lcke, 1994). Sin embargo, el pH cido estimula la sntesis y actividad aminocido descarboxilasa, tanto de la microbiota responsable de la fermentacin, como de los microorganismos contaminantes de las materias primas (Halsz et al., 1994; Maijala et al., 1995). Valores bajos de pH se correlacionan con un mayor contenido de AB (Parente et al., 2001). Esta condicin coincide con lo detectado en este estudio en el que la mxima acumulacin de AB totales (Figura 49) y de BAL (Figura 37) se observa entre los 20 y 40 das de curado cuando los valores de pH (4.7 en promedio) son los ms bajos (Figura 37) en ambos lotes de fabricacin. Sin embargo, la produccin de AB fue mayor en el lote fabricado con nitrato, tanto en el total de aminas (Figura 49) como en algunas de ellas (Figura 50). Esto confirma el efecto conservante del nitrito que acta inhibiendo el crecimiento de microorganismos indeseables y se refleja en una menor concentracin de AB totales en este lote. El nitrato permite una liberacin lenta de nitrito durante el proceso, cuyo efecto se ha hecho notar en la etapa de envasado al vaco en el que se aprecia una ligera disminucin en el contenido de las AB. Como se observa en la figura 49, se alcanza una produccin total de 22.44 mg/100 g, b.s. al final del proceso de curado (42 das) en relacin a los 48.27 mg/100 g, b.s. en el lote con nitrato. Cabe sealar que la presencia y el incremento en el contenido de AB se ve favorecido por las condiciones tecnolgicas de procesamiento a altas temperaturas y humedad relativa, caractersticas tpicas de una produccin industrial (Latorre-Moratalla et al., 2010b). Adems, entre los microorganismo capaces de formar AB estn los del

177

Resultados y Discusin

gnero Enterobacteriaceae que se asocian a la produccin de cadaverina y/o histamina, y las BAL a la produccin de tiramina (Bover-Cid et al., 2006).
60

50

Aminas Totales (mg/100g, b.s.)

40

30

20

10

Nitrito Nitrato

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Tiempo de curado (das)

Figura 49. Evolucin del contenido total de aminas bigenas durante el proceso de curado de un embutido fermentado fabricado con adicin de nitrito () o nitrato (). Las barras de error indican la desviacin estndar de la medida en tres embutidos.

Individualmente, la tiramina (TY), putrescina (PU), cadaverina (CA), histamina (HI) agmatina (AG), triptamina (TR), espermina (SM) y espermidina (SD) fueron las AB detectadas, coincidiendo con lo que se ha encontrado en otros productos similares (Shalaby, 1996; Bover-Cid et al., 2006). El tiempo de curado tuvo un efecto significativo (p<0.05) en la formacin de la mayora de las aminas detectadas, al aumentar paulatinamente su contenido hasta el final del proceso de curado a los 42 das. Adems, el efecto de las sales de curado (nitrato o nitrito) sobre las aminas individuales fue significativo (p<0.05) tan solo para la TY y CA, como se muestra en la figura 50.

La TY se detect en ambos lotes (nitrito o nitrato) mostrando diferencias significativas entre ellos (p<0.05) (figura 50a), siendo la amina mayoritaria, como ha

178

Resultados y Discusin

sido reportado en otros estudios para este tipo de productos (Eerola et al., 1997; Bover Cid et al., 2006). La mxima formacin de TY se dio al final del proceso de curado (42 das) y fue de 31.30 1.27 mg/100 g, b.s. en el lote de embutidos fabricados con nitrato y de 9.08 1.09 mg/100 g, b.s. con nitrito. An cuando el lote de nitrato excede los valores reportados en otras publicaciones (Eerola et al., 1997; Bover-Cid et al., 2001a), estos estn dentro de los niveles mximos tolerables (100800 mg/Kg) para alimentos (Shalaby, 1996). La produccin de TY ha sido relacionada con la actividad tirosina descarboxilasa de las BAL (Bover-Cid et al., 2006). Sin embargo, en este estudio la produccin de BAL no difiere entre lotes (Figura 37) lo que nos permite sealar que sta sea la causa de la diferencia en la produccin de la TY en embutidos con nitrito o nitrato. Al respecto, Gencelep et al., (2007) mencionan que en productos como el sucuk (embutido seco fermentado turco), la concentracin de AB incrementa en ausencia de las sales de nitrito y, en particular, la concentracin de tiramina disminuye a medida que se van incrementando los niveles de nitrito en la mezcla crnica, se adicionan cultivos iniciadores o hay una combinacin de ambos. Sin embargo, algunos estudios han demostrado que no siempre la utilizacin de cultivos iniciadores beneficia la disminucin de AB. Ayhan et al., (1999) demuestran que una mezcla de cultivos iniciadores con microorganismos como L. sakei, Pediococcus pentosaceus, S. xylosus y S. carnosus evitan la formacin de putrescina pero no de tiramina. De igual manera otras mezclas de microorganismos como Pediococcus pentosaceus y S. xylosus o L. sakei y S. xylosus no previenen la formacin de AB e incluso se pueden obtener niveles de AB similares a los productos manufacturados con prcticas tradicionales sin la adicin de cultivos iniciadores (Parente et al., 2001). En este caso, la interaccin nitrato (disminucin del nivel de nitrito al inicio del proceso) y cultivo iniciador no mostraron ningn efecto en la disminucin de tiramina, coincidiendo esto con lo anteriormente mencionado.

179

Resultados y Discusin

La CA se detect en todas las muestra analizadas y al igual que la TY se encontraron diferencias significativas (p<0.05) entre ambos lotes de fabricacin (figura 50b). En el lote con nitrato, aument su concentracin a lo largo del proceso hasta valores de 3.65 0.35 mg/100 g, b.s. mientras que en el lote con nitrito los niveles de CA detectados son prcticamente nulos. Esto confirma el efecto bacteriosttico del nitrito, ya que la CA esta ampliamente relacionada con la presencia de microorganismos responsables del deterioro (enterobacterias y pseudomonas) de la carne (Vidal-Carou et al., 1990) y de echo, altas concentraciones de CA en la materia prima indicaran una baja calidad de sta (Bover-Cid et al., 2001b).

La PU en general esta relacionada con la actividad ornitina descaboxilasa presente en un amplio espectro de microorganismos, desde las bacterias del deterioro hasta las bacterias tecnolgicas utilizadas en el proceso de fermentacin (BAL y Staphylococcus) (Bover-Cid et al., 2001a). De ah su tendencia a incrementar durante el proceso de curado como se observa en la figura 50c. No se detectan diferencias significativas entre los lotes (p<0.05) y en promedio se alcanzaron concentraciones de 1.18 0.25 mg/100 g, b.s al final del proceso de curado. Adems, existe otra va de sntesis de putrescina que implica la descaboxilacin de la arginina por la arginina descarboxilasa para producir AG, precursor de la PU (Figura 8).

En este caso, la presencia de AG se hizo evidente desde los primeros das de curado hasta alcanzar un mximo al final de la etapa de fermentacin de 2.45 0.30 mg/100 g, b.s en el lote con nitrito y de 1.72 0.14 mg/100 g, b.s en el lote de nitrato que posteriormente disminuy paulatinamente hasta el final del proceso figura 50d.

180

Resultados y Discusin

Las poliaminas fisiolgicas, SD y SM, son las nicas aminas presentes de manera natural en la materia prima y permanecieron constantes durante todo el proceso de curado, con una concentracin promedio de 0.90 0.10 mg/100 g, b.s. y 8.42 1.03 mg/100 g, b.s., respectivamente, sin observar diferencias (p<0.05) entre los lotes de fabricacin (Figura 50e y f).

La concertacin de TR no mostr diferencias significativas entre los lotes de fabricacin (p<0.05) durante el proceso de curado. La tiramina se produce por descarboxilacin del triptfano va la enzima triptfano descarboxilasa y fue detectada al nivel mximo en las etapas finales del proceso a muy bajas concentraciones (0.49 0.07 mg/100 g, b.s.) en ambos lotes de fabricacin (Figura 50g).

La HI fue detectada tan solo en el lote con nitrito en muy bajas concentraciones, alcanzando 0.20 mg/100 g, b. s. al final del proceso de curado (Figura 50h). La presencia de HI se debe posiblemente al efecto residual de las enzimas que descarboxilan la histidina, su aminocido precursor, durante el periodo de maduracin y almacenamiento, como as lo menciona Shalaby, (1996). La ausencia de HI en los productos fermentados en general es atribuida a bajos pH y humedad relativa, condiciones desfavorables para el crecimiento de enterobacterias (Suzzi y Gardini, 2003).

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Resultados y Discusin

35 Cadaverina (mg/100g, b.s.) Tiramina (mg/100g, b.s.) 30 25 20 15 10 5 0 Putrescina (mg/100g, b.s.) Agmatina (mg/100g, b.s.) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Espermidina (mg/100g, b.s.) Espermina (mg/100g, b.s.) e 1.2 0.9 0.6 0.3 0.0 Triptamina (mg/100g, b.s.) Histamina (mg/100g, b.s.) 0.6 g c a

5.0 b 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 d 3.0

2.0

1.0

0.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0

h 0.30

0.4

0.15

0.2

0.0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Tiempo de curado (das)

Figura 50. Evolucin de aminas bigenas en el embutido fermentado durante el proceso de curado en presencia de nitrito () o nitrato (). Las barras de error indican la desviacin estndar de la medida en tres embutidos.

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Resultados y Discusin

5.4.2. Jamn curado. En el jamn curado, los aminocidos libres son el producto principal de la proteolisis, resultando en un aumento de stos durante el proceso de maduracin (Aristoy y Toldr, 1991; Crdoba et al., 1994). La intensa liberacin de los aminocidos en el jamn constituye una fuente proteica de gran importancia debido a que estos compuestos son ms fcilmente asimilables por el organismo (Ventanas et al., 1992). Sin embargo, la ruta principal de formacin de las aminas bigenas es la descarboxilacin de esos aminocidos y el incremento de stos durante el procesado puede relacionarse con la actividad microbiana (Shalaby, 1996). Como se ha comentado anteriormente, las altas concentraciones de ciertas aminas bigenas en los productos crnicos son consecuencia de la utilizacin de materias primas de mala calidad, pero tambin de la contaminacin microbiana debida a condiciones inadecuadas durante el procesamiento y almacenamiento (Ruiz-Capillas y JimnezColmenero, 2004). An as, la formacin de AB en jamn curado generalmente es escasa, aunque, algunas de ellas como la putrescina, histamina, tiramina y espermina pueden detectarse en altas concentraciones en el msculo Semimembranosus, lo que podran estar relacionado con la presencia de microorganismos en la superficie del jamn (Cordoba et al., 1994).

En la figura 51 se muestra la evolucin de las AB detectadas en el msculo Semimembranosus durante el proceso de curado del jamn, en las tres diferentes formulaciones de salado (FI, 100 % del NaCl; FII, 50 % NaCl y 50 % KCl y FIII, 55 % NaCl, 25 % KCl, 15 % CaCl2 y 5 % MgCl2). La determinacin se llev acabo por IP-RPHPLC y derivatizacin postcolumna como se describe en el apartado 4.3.5. La TY, PU, CA, SM y SD fueron las AB detectadas en este estudio. Aunque la HI y la AG se detectaron en un par de jamones al final del proceso de curado, en muy bajas concentraciones.

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Resultados y Discusin

El tiempo de curado tuvo un efecto leve en la formacin de la mayora de las aminas en las tres formulaciones, aumentando su contenido a partir de los 7 meses de curado, con excepcin de la espermidina que tiende a disminuir (Figura 51). Adems, el efecto de las diferentes formulaciones de sal sobre las aminas individuales al final del proceso de curado (7-11 meses) se observa tan solo en la TY, PU, CA, siendo ms evidente en las muestras fabricadas con la formulacin III y en menor medida en la formulacin II. Al respecto, Arnau et al., (1998) mencionan que la sal, ingrediente multifuncional en la elaboracin del jamn curado, afecta la calidad y la seguridad. As, una reduccin de NaCl permite una mayor actividad proteoltica, que da como resultado una mayor generacin de aminocidos libres disponible para su descarboxilacin y posible formacin a aminas. La sustitucin parcial del 50 % NaCl por KCl en lomos curados no tiene un efecto significativo en los fenmenos de proteolisis y liplisis (Armenteros et al., 2009), lo que sugiere que la formulacin II se asemeje algo mas en cuanto a la produccin de aminas a las muestras de jamn curado de la formulacin I (100 % NaCl).

El contenido de TI, PU, CA en las primeras etapas de proceso (hasta 80 das), no mostr diferencias significativas (p<0.05) entre formulaciones, obteniendo niveles mximos de 1.14 0.30, 1.61 0.2.04 y 0.43 0.25 mg/100g, b.s, respectivamente, y coincidiendo estos valores con los detectados en otras investigaciones (Crdoba et al., 1994). En las etapas posteriores de maduracin (7-11 meses), se observ un incremento en el contenido de estas aminas, excepto en la formulacin I, que mantuvo una concentracin estable hasta el final del proceso de curado. La formulacin III exhibi las ms altas concentraciones de TY (31.39944 7.66 mg/100g, b.s), PU (12.43 15.027004 mg/100g) y CA (105 0.204 mg/100g 105.61 115.611 mg/100g, b.s., confirmando con esto la importancia de la sal en los productos curados.

184

Resultados y Discusin

La SM y SD fueron detectadas en todos los jamones analizados, no se observaron diferencias significativas (p<0.05) entre formulaciones de sal (Figura 51), y siguieron el comportamiento que Hernndez-Jover, (1997) describe como tpico de estas aminas.
70 250

a
60 200 50 40 30 20 10 0 0 Cadaverina (mg/100g, b.s.) Tiramina (mg/100g, b.s.)

150

100

50

c
30 Espermidina (mg/100g, b.s.) Putrescina (mg/100g, b.s.) 2.0

1.5

20

1.0

10

0.5

0 8 Espermina (mg/100g, b.s.)

0.0

20

50

80

219

270

330

Proceso de curado (dias) 6

0 0 20 50 80 219 270 330

Proceso de curado (dias)

Figura 51. Evolucin de aminas bigenas en el msculo Semimembranosus durante el proceso de curado de jamn con tres formulaciones de sal. 100 % del NaCl, FI ( ), 50 % NaCl y 50 % KCl, FII ( ) y 55 % NaCl, 25 % KCl, 15 % CaCl2 y 5 % MgCl2, FIII ( ).

185

Resultados y Discusin

5.5. Determinacin de aminas bigenas en los productos crnicos analizados con el sensor enzimtico y su correlacin con HPLC.
5.5.1. Proceso de curado de un embutido fermentado. Como anteriormente se ha mencionado, varios factores tales como; la selectividad de DAO, el pH, la combinacin de diversas aminas, la composicin de la matriz crnica en las diversas etapas del proceso de curado, impidieron la construccin de una curva de calibrado para cuantificar el contenido de aminas totales. Sin embargo, el sensor enzimtico pudo detectar los diferentes niveles de AB totales en las muestra analizadas. El intervalo de deteccin del sensor DAO en muestras reales fue de 0.01 a 0.07 mg/mL (Figura 52).

0.08 0.07 Aminas Totales HPLC (mg/mL) 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 4 6 8 10 12 14 16 18 Sensor enzimtico (Cambio de corriente)
y=0.0058-0.0263 2 R =0.9121 r=0.9553

Figura 52. Correlacin entre el contenido de aminas bigenas obtenida por HPLC y el sensor enzimtico DAO durante el proceso de curado de un embutido fermentado con nitrito () o nitrato (). Cada punto corresponde a la media de tres inyecciones.

A concentraciones mayores o menores de ese intervalo se obtuvieron seales anmalas de respuesta tal como se mostr en la figura 28, por lo que al final del proceso las muestras tuvieron que ser diluidas para adecuarse al intervalo lineal de

186

Resultados y Discusin

concentracin. Los resultados en general ponen de manifiesto la excelente correspondencia del sensor enzimtico con los datos de AB totales obtenidas por HPLC con un coeficiente de correlacin de 0.9553 (Figura 52). Estos resultados sugieren que el sensor enzimtico con la enzima DAO comercial inmovilizada puede ser un mtodo viable para realizar una exploracin rpida o screening del contenido de aminas bigenas totales en embutidos fermentados curados.

5.5.2. Jamn curado. El anlisis de las AB totales del jamn curado con las diferentes formulaciones de sal durante el proceso de curado, utilizando el sensor enzimtico DAO se evalu siguiendo el procedimiento experimental descrito en el apartado 4.3.3. Los niveles de AB detectados por HPLC (apartado 5.4.2.), al inicio del proceso de curado presentaron una concentracin < 0.01 mg/mL, motivo por el cual no pudieron ser detectadas en el sensor enzimtico. La correlacin entre los mtodos se realiz con los extractos crnicos del final del proceso de curado (11 meses), obteniendo un coeficiente de correlacin de 0.9330 (Figura 53). El sensor DAO con estas muestras fue sensible en un intervalo de 0.01 a 0.06 mg/mL. Como puede observarse el jamn curado mostr una respuesta menor que los embutidos fermentados, debido quiz a un efecto matriz menos intenso a ese tiempo de curado. Una vez mas, los resultados sugieren que el sensor enzimtico aplicado a las muestras de jamn curado al igual que en el caso de los embutidos fermentados permite realizar tan solo una exploracin rpida del contenido de aminas bigenas con buenos resultados, siendo una herramienta til para el control de la calidad y seguridad de estos productos.

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Resultados y Discusin

0.07 Aminas Totales HPLC (mg/mL) 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 6 7 8 9 10 11 12 13 Sensor enzimtico (Cambio de corriente)
y=0.0107-0.0678 R2=0.8705 r=0.9330

Figura 53. Correlacin entre el contenido de aminas bigenas totales en jamones curados de 11 meses obtenida por HPLC y el sensor enzimtico DAO. Cada punto representa la media de tres inyecciones.

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6. Conclusiones

Conclusiones

6. Conclusiones
La cromatografa lquida de interaccin hidroflica (HILIC) en HPLC constituye un mtodo vlido, fiable y alternativo al IP-RP-HPLC para evaluar la frescura de la carne mediante el anlisis de los nucletidos y sus derivados. La evolucin de los nucletidos para el estudio de la calidad en los embutidos fermentados curados no se vio afectada por el uso de nitrito o nitrato. Sin embargo, se observ mayor presencia de tiramina y cadaverina en el lote tratado exclusivamente con nitrato. En los jamones curados que haban sido salados con la sustitucin parcial de NaCl por sales divalentes, se detect una mayor concentracin de aminas bigenas. La velocidad de degradacin de los nucletidos en estos jamones fue menor al inicio del proceso, aunque la acumulacin de Hx y X a los 7 meses alcanz los mismos contenidos independientemente de la composicin de la mezcla de sales. El sensor enzimtico basado en la enzima xantina oxidasa result ser un mtodo, viable, rpido y econmico para la determinacin de hipoxantina tanto para evaluacin de la frescura de la carne de cerdo como para la evaluacin de la maduracin en las primeras etapas del proceso de curado de embutidos y/o ser usado como indicador del tiempo mnimo de curado en jamn. El sensor enzimtico basado en la enzima comercial diamino oxidasa para la deteccin de aminas bigenas fue selectiva a HI, PU y CA. El sensor desarrollado result ser una herramienta valida de exploracin o screening para detectar la presencia de dichas aminas en productos crnicos y los valores obtenidos se correlacionan bien con los obtenidos por tcnicas cromatogrficas.

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Anexos

Anexo A
HypoxanthineHypoxanthine-based enzymatic for determination of pork meat
Aleida S. Hernndez-Czares, Mara-Concepcin Aristoy, Fidel Toldr
Food Chemistry, 123 (2010) 949-954

221

Anexo A

223

224

Anexo A

225

226

Anexo A

227

228

Anexo B
Hydrophilic Hy drophilic interaction chromatographic determination of adenosine triphosphate and its metabolites
Leticia Mora, Aleida S. Hernndez-Czares, Mara-Concepcin Aristoy, Fidel Toldr
Food Chemistry, 123 (2010) 1282-1288

229

Anexo B

231

Anexo B

232

Anexo B

233

Anexo B

234

Anexo B

235

Anexo B

236

Anexo B

237

Anexo C
Hydrophilic Hy drophilic Interaction Chromatographic (HILIC) in the Analysis of Relevant Quality and Safety Biochemical Compounds in Meat, Poultry and Processed Meats
Leticia Mora, Aleida S. Hernndez-Czares, M-Concepcin Aristoy, Fidel Toldr, Milagro Reig
Food Analytical Methods. DOI 10.1007/s12161-010-9149-1 Published online: 22 May 2010

239

Anexo C

241

Anexo C

242

Anexo C

243

Anexo C

244

Anexo C

245

Anexo C

246

Anexo C

247

Anexo C

248

Anexo C

249

Anexo C

Anexo D
Nucleotides and their degradation products dryduring processing of dry -cured ham, measured by HPLC and an enzyme sensor
Aleida S. Hernndez-Czares, Mara-Concepcin Aristoy, Fidel Toldr
Aceptado, en pruebas de imprenta

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Anexo D

Meat Science xxx (2010) xxx-xxx. Aceptado

Contents lists available at ScienceDirect

Meat Science
journal homepage: www.elsevier.com/locate/meatsci

Original article

Nucleotides and their degradation products during processing of dry-cured ham, measured by HPLC and an enzyme sensor
Aleida S. Hernndez-Czares, Mara-Concepcin Aristoy, Fidel Toldr *
Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos CSIC, Av. Agustn Escardino 7, P.O. Box 73, 46980 Paterna, Valencia, Spain

Abstract
During the dry cured ham processing many biochemical reactions take place and have a high impact on final product quality. The aim of this work was to study in which way the nucleotide degradation during processing of dry-cured ham is affected when using three types of salting (100% NaCl; 50% NaCl and 50% KCl; 55% NaCl, 25% KCl, 15% CaCl2 and 5% MgCl2). Divalent salts in the salting mixture depressed the breakdown rate from the beginning of the process (salting and post-salting) up to the ripening stage (7 months) when nucleosides inosine (Ino), hypoxanthine (Hx) and xanthine (X) concentrations matched for the three treatments. The evolution of Hx and Hx+X analysed by high performance liquid chromatography (HPLC) and an enzyme sensor, respectively, was determined for considering them as potential biochemical marker. The length and temperature conditions along the curing time did not affect the Hx stability. The usefulness of enzyme sensor was confirmed and constitutes a practical tool to determine Hx+X in dry-cured ham, as an index of minimum curing time. A good agreement between enzyme sensor and HPLC data was observed with a correlation coefficient of 0.9744 and a regression equation of y = 1.0152x 0.3556.

Keywords: Dry-cured ham, nucleotides, enzyme sensor, xathine oxidase, hypoxanthine, salt.

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