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CAPITOLO 1

1.1 Generalit sullo sviluppo fetale dellapparato scheletrico

La formazione dell'apparato scheletrico uno dei caratteri salienti che distingue i vertebrati dagli invertebrati (Fig.1.1). Nei vertebrati superiori (uccelli, mammiferi), l'apparato scheletrico costituito principalmente dalla cartilagine e dall'osso che sono tessuti di derivazione mesodermica formati, durante l'embriogenesi, rispettivamente dai condrociti e dagli osteoblasti. Un progenitore mesenchimale comune, noto come progenitore osteocondrale, si differenzia e da' origine a entrambi questi tipi cellulari. Un altro principale tipo cellulare dell'apparato scheletrico l'osteoclasto, che riassorbe e degrada la matrice ossea e si differenzia sotto induzione degli osteoblasti da un precursore emopoietico monocitario, mentre avviene la vascolarizzazione dell'abbozzo osseo. Il suo ruolo rimodellare e adattare il tessuto osseo alle necessit fisiologiche e biomeccaniche. Lo sviluppo dello scheletro, nonostante che negli adulti sia un tessuto mineralizzato, come in ogni altro processo organogenetico controllato tramite basilari processi cellulari di proliferazione, differenziamento, apoptosi, e organizzazione. La morfogenesi dello scheletro inizia da condensazioni mesenchimali in cui i progenitori cellulari mesenchimali si aggregano e stabiliscono le future posizioni degli elementi scheletrici. Siccome le cellule mesenchimali provengono da differenti cellulari che derivano da diverse aree dell'embrione, la posizione delle formazioni scheletriche precoci determinata da quale delle tre linee Fig.1.1 Anatomia del Sistema Scheletrico Umano (Tortora, Derrickson 2009) linee

cellulari mesenchimali parteciper al processo di condensazione mesenchimale e quindi al futuro elemento dello scheletro. Le cellule della cresta neurale derivate dagli archi branchiali contribuiscono allo sviluppo del complesso scheletrico cranio-facciale, dal compartimento dello sclerotomo somitico si origina la maggior parte dello scheletro assiale, e dal mesoderma della placca laterale invece ha origine lo scheletro degli arti (Fig.1.2).
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L'osso un tessuto mineralizzato e la sua formazione un processo critico nello sviluppo embrionale dell'apparato scheletrico. Lossificazione, il processo di formazione delle ossa, avviene con due meccanismi diversi: lossificazione intramembranosa e lossificazione endocondrale. Questi meccanismi di ossificazione sono rispettivamente determinati dai diversi programmi di differenziamento messi in atto dai progenitori delle condensazioni mesenchimali. I progenitori osteocondrali si differenziano in osteoblasti per formare le Fig.1.2 L'origine delle cellule osteoprogenitrici provenienti da varie aree dell'embrione e segnali morfogenetici, sezione trasversale. (Yang 2009) ossa intramembranose, mentre nell'ossificazione endocondrale i progenitori osteocondrali si differenziano in condrociti che formeranno un modello cartilagineo per il futuro osso. In ogni caso il processo termina con la deposizione da parte degli osteoblasti di una specifica matrice extracellulare mineralizzata @(Olsen, Reginato et al 2000). La localizzazione di ogni elemento scheletrico determina il suo meccanismo di ossificazione e di conseguenza le sue caratteristiche anatomiche come forma e dimensioni. E' importante evidenziare che l'identit posizione di ogni elemento scheletrico acquisita durante lo sviluppo fetale, prima ancora della condensazione mesenchimale, tramite un processo denominato formazione del pattern che costituisce il prototipo di sviluppo dellelemento scheletrico. Alla base di questo processo fondamentale per la morfogenesi scheletrica ci sono i processi di migrazione e localizzazione dei progenitori mesenchimali in quelle che saranno le condensazioni mesenchimali.

I processi di differenziamento e migrazione cellulare sono messi in atto cellule tramite circuiti di segnalazione, alla base della comunicazione cellulare, variazione dellespressione genica, che permettono alle cellule di variare la loro funzionalit , anche nel rispondere ai in tempi e spazi diversi @(Olsen, Reginato et al 2000). La formazione del coinvolge anche i cluster di geni dagli Homeobox, dai Paired Box (Fig rimodellamenti del codice Istonico Fig.1.3 I Segnali Morfogenetici, I fattori di trascrizione, e le linee cellulari coinvolte nello sviluppo dell'apparato scheletrico (Olsen 2000) pattern costituiti 1.3) e da segnali, dalle che sono e

@(Gilbert 2010). Con questi processi le cellule acquisiscono la loro identit posizionale e temporale e innescano specifici circuiti di differenziamento che permettono i processi specifici dellorganogenesi. La comunicazione intercellulare coordina la proliferazione e il differenziamento assume un ruolo cruciale nella formazione del pattern. I circuiti di segnalazione regolano la formazione del pattern scheletrico embrionale e i programmi di sviluppo e differenziamento cellulare. Questi circuiti di segnalazione sono mediati da molecole che costituiscono i segnali autocrini, paracrini, di contatto cellula-cellula e cellula-matrice. Le molecole segnale principali Wingless (WNT), Hedgehog (Hh), Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), Fibroblast Growth Factors (FGFs) e Notch/Delta (Fig.1.3). Alla fine della formazione del pattern, in un differente contesto cellulare differente, questi segnali controllano anche il programma di proliferazione e differenziamento cellulare e lo sviluppo finale dello scheletro. Fig.1.4 La formazione delle strutture scheletriche craniofacciali a seguito della 1.2 Formazione del pattern durante lo sviluppo scheletrico precoce migrazione e dell'insediamento delle cellule provenienti dagli archi branchiali (Gilbert 2010) 1.2.1 Complesso scheletrico craniofacciale
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sono

Durante levoluzione dei vertebrati superiori la formazione di una struttura facciale distinta rappresenta un passo significativo che correlato con lacquisizione delle cellule della cresta neurale, le quali sono una delle principali sorgenti di cellule da cui trae origine il complesso scheletrico craniofacciale. Le caratteristiche facciali non solo permettono di distinguere una specie da una altra ma anche individui diversi allinterno della stessa specie come ad esempio gli esseri umani. La reciproca segnalazione spaziale e temporale allinterno delle cellule della cresta neurale e fra queste e le cellule epiteliali (ectoderma superficiale, ectoderma neurale o endoderma) permette di stabilire il modello di sviluppo craniofacciale (Fig.1.4). Ad esempio i segnali FGF dal prosencefalo ventrale e dallendoderma faringeo sono necessari per la scheletogenesi della faringe. In seguito, sempre tramite le FGF, dallectoderma superficiale avviene la crescita dello scheletro frontonasale @(Yang 2009). Negli uccelli, evidenze sperimentali suggeriscono che i livelli despressione delle BMP4 nel primordio mesenchimale del becco determinano la forma e le future dimensioni @(Yang 2009)

1.2.2 Scheletro assiale

La formazione del pattern dello sviluppo scheletrico inizia con la comparsa dei somiti, strutture mesodermiche segmentate poste ai lati del tubo neurale e della sottostante notocorda. Lo scheletro assiale, i muscoli striati e il derma dorsale hanno origine da questi. I somiti gemmano da unarea indicata come mesoderma presomitico (PSM) che fa del mesoderma parassiale. La gemmazione avviene tramite un processo sincronizzato periodico, direzionale, e asimmetrico, stabilisce il pattern ripetitivo destro-sinistro di vertebre, sterno e costole. E' ora chiaro che la formazione di questo pattern, subordinato alla Fig.1.5 Immagine al SEM del tubo neurale e dei somiti in via di formazione dal mesoderma parassiale (Gilbert 2010)

assiale

parte

che

somitogenesi, collegata a un oscillatore molecolare e a un gradiente di molecole segnale allinterno del PSM. Lorologio di segmentazione messo in funzione appunto da un oscillatore molecolare basato sullespressione ciclica di una serie di geni, molti dei quali fanno parte delle vie di segnalazione Notch e WNT @(Gilbert 2010) (Fig.1.5).
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La via di segnalazione Notch media la comunicazione a breve distanza tramite il contatto fisico intercellulare. Il recettore Notch e suoi ligandi Delta e Jagged sono entrambe proteine transmembrana a singolo passo. Il recettore Notch attivato dal legame con un ligando presentato da una cellula vicina e questo processo modulato dalla glicosilazione. Fringe una glicotransferasi in grado di modificare il recettore Notch modificandone laffinit per il ligando. Attivato il recettore Notch avvengono sequenziali eventi di proteolisi che generano il Dominio Intracellulare Notch (NICD), traslocato poi nel nucleo dove attiva lespressione a valle dei suoi geni target. La maggior parte dei geni ciclici sono bersagli della cascata della segnalazione Notch e codificano per Lunatic Fringe (Lfng), i membri della famiglia Hairy/Enhancer (HES). Questa via di segnalazione ha un cruciale nella somitogenesi poich le mutazioni che colpiscono le sue numerose parti causano difetti severi nei degli embrioni di topo e pesce zebra.Se lespressione ciclica di Lnfg o Hes7 disturbata da mutazioni attivanti o disattivanti, la somitogenesi gravemente alterata @(Yang 2009) (Fig1.6). La via di segnalazione WNT media la comunicazione fra cellule attraverso numerosi diametri cellulari. Con lattivazione di questa via, la -Catenina stabilizzata e traslocata nel nucleo dove si lega al fattori Lef/Tcf e attiva lespressione di geni a valle che include Axin2 e Nkd1. Lespressione di Axin2 e Nkd1 oscilla fuori fase con i componenti della segnalazione Notch nel PSM del topo. Loscillazione della via di segnalazione WNT attivata da WNT3 nel PSM essenziale per la somitogenesi poich permette la formazione di un orologio di segmentazione tramite circuiti a feedback negativo ciclici @(Aulehla, Herrmann 2004). Una mutazione ipomorfica di WNT3 denominata Vestigial tail (vt) porta alla formazione di un numero ridotto di vertebre caudali con una morfologia e un centro di ossificazione irregolare. La coda termina con un rudimento di vertebre irregolari e fuse insieme. Nellomozigote Vt per il gene WNT3 lespressione di Axin2 e Nkd1 persa. Lespressione dei geni target di WNT3 quali Axin2 e Ripply2 continua a oscillare nel PSM nei mutanti per Hes7. Comunque lespressione dinamica di
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Delta e of split ruolo

somiti

Fig1.6 Gli effetti sulla formazione dello scheletro assiale (a destra) dovuti a una mutazione nel gene del recettore Delta che fa parte della via di segnalazione Notch. A sinistra Scheletro assiale con somitogenesi normale. Modello murino (Gilbert 2010)

Nkd1 dipende dalla segnalazione Notch, poich non oscilla pi in assenza di Hes7. Quindi sia Notch che WNT interagiscono con lorologio di segmentazione @(Aulehla, Herrmann 2004). Diversamente dalle vie di segnalazione Notch e WNT, che regolano la somitogenesi tramite lespressione ciclica di geni, i segnali mediati dai FGF e dallAcido retinoico (RA) controllano la somitogenesi regolando la competenza di segmentazione cellule del PSM. FGF8 secondo un gradiente anteroposteriore crescente. Al contrario, lespressione del Raldh2, essenziale per la dellacido retinoico, segue un crescente dalla gemma caudale ai somiti. Il gradiente di FGF8 lo stato indifferenziato nelle del PSM cos da regolare il determinazione. Lespressione di FGF8 riduce la grandezza dei Fig.1.7 I gradienti (A) e le (B) oscillazioni dei segnali morfogenetici che permettono il funzionamento dell'orologio di segmentazione durante la somitogenesi (Yang 2009) gene sintesi gradiente del PSM mantiene cellule fronte di ectopica somiti delle espresso

senza alterare la periodicit dellorologio. Similmente gli embrioni di quaglia con una deficienza sintetica di RA mostrano somiti drammaticamente pi piccoli e un PSM pi lungo, come quanto osservato nel pollo e nel pesce zebra in cui indotta lespressione ectopica di FGF8. Inoltre nei somiti lespressione ectopica di FGF8 inibisce lespressione di Raldh2, quindi questi gradienti opposti agiscono anche come antagonisti funzionali luno dellaltro. La via di segnalazione dellacido retinoico mantiene la simmetria bilaterale nei somiti interagendo e coordinando le vie di segnalazione che stabiliscono lasimmetria destra-sinistra dellasse corporeo e dellorologio di segmentazione somitico. I mutanti Raldh2 hanno un numero asimmetrico di somiti ai lati del tubo neurale. La somitogenesi un processo altamente regolato e preciso e ci si aspetta quindi che le vie di segnalazione coinvolte siano coordinate fra loro e integrate in una rete. Nel topo lespressione di FGF8 sottoregolata dallassenza di WNTa3a, e nel pesce zebra lespressione di Her13.2, un gene target di Notch necessario per loscillatore genetico, regolata positivamente dalle FGF (Fig.1.7). Numerosi punti di comunicazione sembrano esistere nelle vie di Notch, WNT e FGF per la regolazione della somitogenesi @(Aulehla, Herrmann 2004).

Il ruolo funzionale dellorologio di segmentazione nello sviluppo uomo evidenziato da malformazioni congenite nello scheletro assiale. La Segmentazione Vertebrale Anomala (AVS) un difetto abbastanza comune. I fenotipi del AVS generalmente non seguono l ereditariet mendeliana, tuttavia mutazioni nelle componenti della via di segnalazione Notch sono note in almeno due osteopatologie congenite umane: la sindrome di Alagille e la disostosi spondilocostale (SCD), in entrambe sono presenti difetti della colonna vertebrale. Mutazioni in Jagged1(Jag1) e Notch2 sono responsabili rispettivamente responsabili della Sindrome di Alagille 1 e 2(AGS). AGS un disordine autosomico dominante caratterizzato da difetti di sviluppo di numerosi organi, in base alla sua penetranza, quali occhio, fegato, cuore, e scheletro. I difetti scheletrici di questa sindrome sono principalmente le vertebre a farfalla, sebbene nuovi fenotipi includano anche difetti facciali e delle dita. I somiti formati hanno un pattern dorso-ventrale che stabilito da segnali cellulari provenienti dallectoderma superficiale, il tubo neurale e la notocorda @(Yang 2009). I segnali ventralizzanti come Sonic Hedgehog (Shh) provenienti da notocorda e dal lato ventrale del tubo neurale sono necessari per indurre la formazione dello sclerotomo sul lato ventrale, mentre la segnalazione WNT dallectoderma e del lato dorsale del tubo neurale fondamentale per la formazione del dermomiotomo. Dallo sclerotomo hanno origine lo scheletro assiale e le costole. Nel topo i mutanti con Shh inattivato subiscono una fallimentare formazione della colonna vertebrale e delle costole. Pax1, un fattore di trascrizione Paired box ed espresso nello sclerotomo. Per la sua espressione necessario Shh. Comunque i mutanti Pax1 nel topo, hanno un fenotipo dello scheletro assiale meno anomalo rispetto ai mutanti Shh @(Yang 2009).

1.2.3 Scheletro degli arti

La formazione degli arti necessita di un pattern morfogenetico tridimensionale, il quale ottenuto tramite lintegrazione di tre modelli assiali di sviluppo: lasse prossimo-distale (PD), lasse anteroposteriore (AP) e lasse dorso-ventrale (DV). Lungo lasse PD, lo scheletro dellarto costituito da tre segmenti principali: Lo stilopodio il segmento prossimale che costituir lomero o il femore, lo zeugopodio il segmento mediano da cui si originano le coppie di ossa radio-ulna o tibia-fibula, e lautopodio il segmento distale da cui si originano le ossa del tarso-metatarso o carpo-metacarpo e le rispettive dita(Fig.1.8).

Lungo lasse AP lulna, il radio, e le dita hanno le loro distinte caratteristiche morfologiche. Lungo lasse DV possiamo notare le differenze morfo-funzionali nelle articolazioni del gomito, del polso, e della mano. Questo modello di sviluppo tridimensionale avviene lungo tutti gli assi tramite dei centri di segnalazione che forniscono linformazione posizionale alle cellule. Il segnale e linformazione posizionale sono trasmesse alle cellule mesenchimali durante lo sviluppo dellabbozzo dellarto e prima delle condensazioni mesenchimali. Lo sviluppo e il pattern PD sono ottenuti tramite il Fig.1.8I segmenti dell'arto e gli elementi ossei che si originano da questi. Disegno raffigurante l'arto di un volatile (Gilbert 2010) centro di segnalazione situato nel apical ectodermal ridge (AER) uno strato di cellule epiteliali la cui formazione operata dal

segnale WNT tramite WNT3. Le molecole segnale FGF4, FGF8, e FGF10 sono necessarie alla crescita dellarto e a mediare le funzioni dellAER. Lespressione di FGF10 nel mesoderma presuntivo dellarto controlla linizio della di questa struttura e mantiene lespressione di nellAER @(Sun, Mariani et al 2002). In passato si pensava che il pattern lungo lasse fosse determinato dal segnale FGF ricevuto dallAER in una sequenza spazio-temporale, ipotesi della zona di progressione era inconsistente con degli studi successivi dove era costruita una mappa dei destini cellulari (Fig.1.9). pattern lungo larto stabilito precocemente, ma il segnale delle FGF i differenti segmenti sono sviluppati in una sequenza temporale diversa, le anomalie dovute allinattivazione delle FGF sono dovute nella mancanza di un pattern quanto non espansione dei suoi segmenti @(Gilbert @(Sun, Mariani et al 2002). Queste molecole comunque rivestono un ruolo importante, dovuto Fig.1.9La formazione del pattern lungo l'asse prossimo distale nell'arto. L'induzione dell'AER mediata dal segnale Wnt e i segnali FGF nella formazione del pattern (Yang 2009) quindi non alla 2010); stata Il tramite questa PD crescita FGF8

allinterazione dei segnali proveniente dallAER e da fattori di trascrizione regione specifici


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(Fig.1.9). Lo sviluppo dellarto dipende dallespressione ristretta alla zona prossimale degli omeogeni Meis 1 e Meis 2. Se espressi ectopicamente nella zona distale alterano la crescita e la patternizzazione dellarto reprimendone i geni regio-specifici. Le FGF dellAER invece hanno un effetto distalizzante. Il pattern dunque ottenuto tramite linterazione dei segnali FGF e BMP e lespressione del cluster di geni HOXD per restringere lespressione di Meis 2 nella regione prossimale dellabbozzo dellarto @(Mercader, Leonardo et al 2000). Il secondo centro di segnalazione la Zona ad Attivit Polarizzante (ZPA) che costituita da un gruppo di cellule mesenchimali localizzate nel margine distale posteriore adiacente allAER. Quando la ZPA trapiantata nel margine anteriore dellarto sotto lAER, questa porta a una duplicazione speculare delle dita. La segnalazione Shh necessaria e sufficiente allattivit della ZPA @(Riddle, Johnson et al 1993) poich una sua mancanza porta alla perdita dellulna e delle dita posteriori, tuttavia da chiarire se il segnale Shh prodotto dalla ZPA sia un fattore secreto come riscontrato in altri studi. E pi probabile che lidentit delle dita sia determinata sia dal gradiente spaziale sia dallazione temporale delle Shh come morfogeni @(Yang 2009). Shh forma il pattern assiale AP ma espresso solo nella ZPA nella posteriore dellarto (Fig.1.10). Lasse AP dellarto stabilito prima della segnalazione Shh. Questo antecedente a Shh controllato dallattivit combinata di Gli3 Alx4 e da alcuni fattori di trascrizione elica-giro-elica (bHLH) denominati Twsit1. Sia Il repressore di Gli3 (Gli3R) e sia Alx4 stabiliscono il territorio anteriore dellarto restringendo lespressione di dHand, che attiva lespressione di Shh, al territorio posteriore. Inoltre di dHand inibita da Twist1 tramite le formazione Fig.1.10 La ZPA si trova nel eterodimero dHand-Twist1. I difetti dellarto, in margine posteriore dell'AER. Il mutazione non funzionale dHand, possono essere recuperati con una mutazione non funzionale di @(te Welscher, Fernanedz-Teran et al 2002). Mutazioni di Twist1 nelluomo sono alla base circuito molecolare della ZPA influenzato dai segnali dellAER. (Yang 2009) della Twist1 lattivit di un una dHand e parte quindi pattern

sindrome di Saetrhre-Chotzen, una delle pi comuni craniosinostosi ereditarie. Questa sindrome caratterizzata da fusione prematura delle ossa del calvario e anormalit dellarto quali brachidattilia, sindattilia cutanea, e duplicazione delle falangi distali. Mutazioni nel gene Gli3 causano la

cefalopolisindattilia di Greig e la sindrome di Pallister-Hall. Entrambe portano ad anormalit craniofacciali e alla formazione di dita ectopiche. Il terzo centro di segnalazione lectoderma non appartenete allAER, il quale stabilisce lasse dorso ventrale (DV) insieme al mesoderma dell'abbozzo dellarto. WNT e BMP sono i segnali necessari per il controllo della polarit DV del mesoderma e dellectoderma dellarto @(Gilbert 2010). WNT7a espressa specificamente nellectoderma dorsale e attiva lespressione di Lmx1b, che codifica per uno specifico fattore di trascrizione omeotico necessario a determinare lidentit dorsale. Mutazioni nonsenso in WNT7a impediscono lespressione di Lmx1b e portano allo sviluppo di un arto ventralizzato. Lespressione ectopica di WNT7a sul lato dorsale dellarto ha un effetto opposto. Nel normale sviluppo lespressione di WNT7a nella parte dorsale dellarto soppressa da En-1, che codifica per un fattore di trascrizione specifico dellectoderma ventrale. La perdita di funzione in En-1 porta alla dorsalizzazione dellarto e allespressione ectopica di WNT7a. La perdita di entrambi porta a una ventralizzazione dellarto simile a quella riscontrata nel singolo mutante WNT7a. Ci dimostra che il differenziamento ventrale il programma di default eseguito dalle cellule e che WNT7a ha la funzione di sopprimere attivamente un circuito regolativo ventralizzante @(Yang 2009). Sembra che questo percorso regolativo ventralizzante sia mediato dalla segnalazione BMP. Nellectoderma dellarto embrionale di pollo, le BMP2, BMP4, BMP7 sono espresse preferenzialmente nellectoderma ventrale, coincidentemente a En-1 e in un pattern complementare a quello di WNT7a nellectoderma dorsale, fornita linformazione DV al mesenchima sottostante (Fig.1.11). Nel topo si osservato BMP2 espressa precocemente nellectoderma del abbozzo dellarto. Quindi il mesoderma e lectoderma dell'arto rispondono a pi segnali Queste BMP, per stabilire il pattern DV nellectoderma, trasmettono il segnale tramite il IA (BMPR-IA) attivando l'espressione di En-1 nellectoderma ventrale. Sembra che la segnalazione BMP sia mediata da due fattori di trascrizione Msx1 e Msx2, la cui trascrizione dalle BMP stesse. La perdita di funzione, nellembrione di topo, sia in Msx1 sia Msx 2 Fig.1.11 La formazione del pattern DV mediata sia dai segnali WNT sia da BMP.Questi segnali sono antagonisti fra loro. (Yang 2009) porta regolata recettore BMP. che ventrale quando

alla perdita di En-1 e di conseguenza allespansione dellarea despressione di WNT7a, che


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comporta laumento despressione di Lmx1b nel mesenchima ventrale determinando una dorsalizzazione dellarto @(Lallemand, Nicola 2005). Quindi la funzione della segnalazione delle BMP nellectoderma dellarto precoce laumento despressione di En-1 per il controllo della polarit DV. Comunque linattivazione regione-specifica del recettore BMPRIA nel mesoderma dellabbozzo dellarto porta a una sua dorsalizzazione senza alterare lespressione di WNT7a e En-1 nellectoderma. Quindi le BMP hanno anche una capacit ventralizzante indipendente da En-1 tramite una segnalazione diretta nel mesenchima dellarto, che inibisce lespressione di Lmx1b @(Yang 2009) (Fig.1.11). Dal momento che lo sviluppo dellarto un evento coordinato tridimensionalmente. Ci si potrebbe aspettare che i tre centri di segnalazione che controllano la crescita e la formazione del pattern lungo i tre assi non siano funzionalmente indipendenti. Infatti i tre centri di segnalazione interagiscono luno con laltro tramite le interazioni fra le molecole delle vie di segnalazione. In primo luogo c un circuito di feedback positivo fra Shh e le FGF espresse nellAER, che quindi connette la formazione del pattern AP con la crescita PD. La segnalazione FGF dall AER necessaria per lespressione di Shh la quale utilizza la segnalazione Gremlin per mantenere costante lespressione delle FGF nellAER. In ultimo il segnale dorsalizzante WNT7a necessario per mantenere lespressione di Shh che forma il pattern lungo lasse AP @(Gilbert 2010) @(Yang

2009) (Fig.1.12). Fig.1.12 Le interazioni fra i segnali FGF,BMP,WNT e Shh coordinano la formazione del pattern lungo i tre assi. (Gilbert 2010) 1.3 Cartilagine Embrionale e Formazione dellosso

Gli eventi precoci di formazione del pattern determinano dove e quando le cellule mesenchimali si aggregano. I progenitori osteocondrali, che durante il processo di formazione del pattern si sono aggregati e stabiliti nelle condensazioni mesenchimali, si differenziano sia in condrociti sia in osteoblasti.

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Sox9 e Runx2 codificano per i principali fattori di trascrizione che sono in grado di determinare il differenziamento e la direzione verso una delle due linee cellulari dei progenitori osteocondrali mesenchimali in cui sono espressi. Sox9 espresso prima di Runx2 @(Otto, Thornell et al 1997); @(Ducy, Zhang et al 1997). La mappatura genetica di differenziamento mostra che dalle cellule che esprimono Sox9 si originano sia condrociti che osteoblasti, indipendentemente dal meccanismo di ossificazione. Se nellarto viene inattivato Sox9 non avviene la condensazione mesenchimale e lespressione di Runx2 inibita. La coespressione di Sox9 e Runx2 termina dopo il differenziamento di condrociti e osteoblasti. Lespressione cito-specifica di questi geni segregata velocemente ai condrociti e agli osteoblasti primordiali @(Akiyama, Kim et al 2005). Chiarire come questa segregazione sia ottenuta necessario a capire come avviene il differenziamento di condrociti e osteoblasti e di conseguenza il meccanismo di ossificazione che sar attuato. Lespressione di questi geni controllata dalle stesse vie di segnalazione che stabiliscono la formazione del pattern, cio Hedgehog, WNT, FGF e BMP. Il saggio dellattivit di WNT in vivo eseguito tramite i topi TOPGAL, in cui LacZ espresso sotto il controllo dei siti di legame Lef/Tcf. E stato osservato che LacZ espresso sia nellosso del calvario sia nel pericondrio dove avvengono rispettivamente lossificazione intramembranosa endocondrale, suggerendo che il segnale WNT sia sovraespresso durante il differenziamento degli osteoblasti (Fig.1.13). Questo segnale aumenta la formazione di tessuto osseo e lespressione di Runx2 ma inibisce quella di Sox9 differenziamento dei condrociti @(Yang 2009).Se nei progenitori osteocondrali si disattiva la trasduzione del segnale WNT tramite la rimozione di -catenina Fig1.13 Le Msc si differenziano in condrociti o osteoblasti in base all'intensit del segnale Wnt che ricevono. Wnt blocca il fattore di trascrizione Sox9 e attiva Runx2 determinando quindi la linea di differenziamento cellulare delle Msc. (Yang 2009) si e il ed

ottiene, in entrambi i meccanismi di ossificazione, il differenziamento ectopico dei condrociti a discapito degli osteoblasti. I progenitori staminali mesenchimali sono quindi bipotenti (Fig.1.13). Il segnale WNT presente e ricevuto nelle condensazioni mesenchimali indipendentemente dal meccanismo di ossificazione, la differenza nellintensit del segnale. Questo presente ad alti
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livelli nellossificazione intramembranosa cos da promuovere il differenziamento degli osteoblasti a scapito di quello dei condrociti. Nellossificazione endocondrale il segnale WNT dapprima basso e permette il differenziamento dei condrociti, in seguito sovraregolato nella cartilagine periferica e determina il differenziamento degli osteoblasti @(Yang 2009) (Fig1.13). La manipolazione di questo segnale nei progenitori mesenchimali e forse nelle cellule staminali mesenchimali potrebbe permettere di riparare i danni che subisce la cartilagine nelle osteoartrite, inducendo il differenziamento dei condrociti oppure di ricostituire limpalcatura ossea nellosteoporosi, inducendo il differenziamento degli osteoblasti. Unaltra potenziale applicazione potrebbe essere nel Tissue Engineering che tenta di ricostruire cartilagine e osso in vitro tramite luso di cellule staminali o progenitori mesenchimali. Il segnale Ihh espresso specificamente durante lossificazione endocondrale ed necessario per il differenziamento degli osteoblasti @(Chung, Schipani et al 2001). Questo segnale espresso dai condrociti neo-differenziati ma non ha nessun ruolo nel loro differenziamento dai progenitori mesenchimali. Lespressione di Runx2 e lossificazione endocondrale sono perdute negli embrioni omozigoti nulli per Ihh. Inoltre, quando il segnale Hh successivamente disattivato nelle cellule del pericondrio, queste si differenziano ectopicamente in condrociti che esprimono Sox9 a scapito di Runx2. Quanto osservato simile a quello che avviene nei mutanti omozigoti nulli per Osterix (Osx) tuttavia nei condrociti di questi mutanti sono espressi sia Runx2 che Sox9, giacch Osx un fattore di trascrizione che agisce a valle dei loro geni. Nei progenitori mesenchimali lespressione di Runx2 indipendente dal segnale Ihh ancora non stata ben chiarita. Sembrerebbe che Shh sostituisca Ihh durante lossificazione intramembranosa dellosso del calvario. Entrambi i segnali di WNT e Ihh sono necessari per la formazione dell'osso endoncondrale ed importante chiarire la loro epistasi. La trasduzione del segnale Hedgehog ottenuta tramite un circuito molecolare comune a tutti i vertebrati. Il segnale ricevuto sulla superficie cellulare tramite le due proteine transmembrana multipasso Patched1 (Ptch1) e Smoothend (Smo) (Fig.1.14). Smo costituisce l'interruttore intracellulare, che normalmente disattivato da Ptch1 in assenza del segnale Hh. Se Hh si lega a Ptch1, quest'ultimo attiva Smo, quindi Ptch1 il ricevitore/trasmettitore. In seguito una cascata di segnali intracellulari innescati da quest'evento porta a un aumento d'espressione di Gli1, Hip1 e Ptch1 che sono geni target di Hh. La rimozione di Ptch1 porta a un attivazione costitutiva di questa via di segnalazione mentre la rimozione di Smo la inattiva totalmente anche in presenza di Hh (Fig.1.14).

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E stata ottenuta una linea di topi mutanti condizionali usando allele Floxed per la -catenina e per Ptch1 cos da avere contemporaneamente nelle stesse cellule un segnale Hh attivato autonomamente e un segnale WNT disattivato autonomamente @(Yang 2009). Fu osservato che la catenina non era necessaria per il segnale Hh in s come indicato dallespressione di geni target del segnale WNT Gli1. La formazione dellosso era impedita come nel singolo mutante di -catenina, anche se il segnale Hh era sovraregolato e che questo causava la formazione ectopica dellosso nel singolo mutante Ptch1. Queste osservazioni evidenziano che il segnale mediato da WNT e trasdotto tramite -catenina agisce a valle del segnale Hh nel promuovere la formazione dellosso. La formazione dellosso e richiede il differenziamento degli osteoblasti che avviene in pi passaggi. Ulteriori analisi basate sui marker molecolari espressi nei differenti stadi di questo processo portarono alla conclusione che la -catenina agisce a valle anche di Osx oltre che di Ihh nel promuovere la Fig.1.14La trasduzione del segnale Ihh nei condrociti avvia il differenziamento verso gli osteoblasti tramite l'espressione in sequenza di una serie di fattori di trascrizione fra cui Runx2 (adattato da wikipedia)

un

quali

maturazione degli osteoblasti @(Rodda, McMahon et al 2006). Lazione sequenziale di Hh e WNT evidenzia come sia necessario manipolare questi segnali a stadi e tempi differenti nella applicazioni terapeutiche quali riparazione delle fratture e Tissue Engineering. Negli stadi precoci della riparazione delle fratture o del differenziamento dei progenitori mesenchimali, aumentare il segnale Hh potrebbe promuovere il differenziamento degli osteoblasti, laddove la sovraregolazione prematura del segnale WNT potrebbe inibirne la maturazione e il differenziamento in favore della proliferazione. Dopo la formazione degli osteoblasti lincremento del segnale WNT assicura una continua maturazione e differenziamento di questi @(Yang 2009). La famiglia delle BMP, che sono molecole secrete, appartiene alla super famiglia dei fattori di crescita trasformanti (Tgf- ). Come indicato dal nome queste proteine furono identificate in seguito alla loro capacit di promuovere la formazione ectopica di tessuto cartilagineo e osso. A differenza dei segnali Hh e WNT, le BMP sono in grado di promuovere il differenziamento di condrociti e osteoblasti. Il meccanismo alla base di queste peculiari attivit stato oggetto di studi intensi. Lo stabilirsi di unintelaiatura nella trasduzione di questo segnale ha portato a una profonda comprensione a livello molecolare del meccanismo con cui ottenuta la condrogenesi e
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losteogenesi. Il segnale trasdotto almeno tramite due vie distinte: la via Smad e la via MAPK. I recettori BMP sono di tipo I e di tipo II che sono delle serina/treonina chinasi. Quando le BMP si legano al recettore I o alleterodimero I e II, il recettore di tipo II fosforila e attiva uno dei tre sottotipi di recettore I: BMPRIA, BMPRIB, e Alk-2. Questi a loro volta fosforilano e attivano le Smad regolate da recettore (R-Smad): Smad 1,5 e 8. Le R-Smad reclutano e si legano al partner comune Smad4 cos da essere poi traslocate nel nucleo e regolare lespressione di geni target. Laltra via di trasduzione utilizza la kinasi attivata da Tgf (TAK1), che attiva le MAPK p38 @(Derynck, Zhang 2003) (Fig.1.15).

Fig.1.15 La trasduzione del segnale BMP tramite la via TAK1-MAPK p38 e la via Smad 1/5/8Smad4 nel controllo del differenziamento dei condrociti e degli osteoblasti. (Cell Signaling.com) Il segnale BMP modulato anche dai suoi inibitori solubili Noggin e Chordin. La perdita di Noggin porta a un aumento di formazione cartilaginea e a una fallimentare formazione dei giunti sinoviali dellaumento nel segnale BMP e nella condrogenesi. La sottoregolazione di Noggin nei progenitori mesenchimali porta a un maggiore differenziamento degli osteoblasti. Noggin quindi un eccellente candidato per inibire il segnale BMP. Inserendo una sfera ricoperta di Noggin nellabbozzo dellarto di pollo stato visto che le BMP sono necessarie per la formazione delle condensazioni mesenchimali condrogeniche e per il mantenimento del fenotipo condrocitario nei condrociti neoformati che ancora non esprimono Sox9. La rimozione dei recettori BMP invece

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impedisce il differenziamento di condrociti e osteoblasti. I doppi mutanti nulli per i recettori BMPRIA e BMPRIB hanno un ridotto differenziamento condrocitario. BMPRIA necessario negli osteoblasti neoformati per mantenerne la maturazione @(Mishina, Starbuck et al 2004). Le molecole FGF e i loro recettori (FGFr) sono espressi nelle cellule dello scheletro in via di sviluppo. Il loro ruolo nella condensazione mesenchimale e nel differenziamento dei condrociti ancora da chiarire. Una completa attivazione non ancora stata ottenuta e linattivazione di alcune FGF non mostrano effetti evidenti sulla condensazione mesenchimale e sul differenziamento dei condrociti prima dellossificazione endocondrale. E invece ben stabilito il loro ruolo nellossificazione intramembranosa data la loro capacit di controllare il differenziamento degli osteoblasti. Numerose mutazioni attivanti nei recettori FGFr1, FGFr2, FGFr3 sono alla base delle craniosinostosi (vedi dopo). Il segnale FGF pu promuovere o inibire il differenziamento degli osteoblasti in base al contesto cellulare (Fig.1.16).

Fig.1.16 Una visione integrata delle cellule, delle molecole e delle interazioni coinvolte nel processo di differenziamento dei progenitori osteocondrali in condrociti e osteoblasti durante la formazione dell'osso. (Gilbert 2010) Questo processo avviene sia tramite segnalazione diretta sia tramite linterazione con altre le vie di segnalazione BMP e WNT. La segnalazione costitutivamente attivata di FGF pu inibire il differenziamento degli osteoblasti attivando lespressione di Sox2, che in grado di inibire lattivit trascrizionale della -catenina. FGF pu anche promuovere il differenziamento degli osteoblasti regolando positivamente BMP-2 e negativamente Noggin @(Yang 2009).

1.4 Maturazione dei condrociti e controllo della vascolarizzazione della cartilagine.

L'ossificazione endocondrale il meccanismo col quale il prototipo cartilagine (anlagen) sostituito dall'osso. L'abbozzo cartilagineo accresce le sue dimensioni tramite la proliferazione dei condrociti, e con la deposizione della matrice cartilaginea da parte di questi. Poco dopo la loro
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formazione, i condrociti nella regione centrale della cartilagine vanno incontro a un successivo differenziamento e diventano condrociti ipertrofici, i quali diventano mitoticamente quiescenti e producono una matrice cartilaginea con una diversa composizione rispetto alla cartilagine della zona proliferativa. Il collagene X, che un marker tipico dei condrociti ipertrofici, un componente unico di questo tipo di matrice. Dai condrociti ipertrofici sono secreti fattori che stimolano la vascolarizzazione ramificata. Insieme ai vasi sanguigni, seguono anche osteoblasti, osteoclasti e cellule ematopoietiche. Questi avvenimenti determinano la formazione dei centri di ossificazione primaria (Fig.1.17). In questi centri, la matrice ipertrofica degradata e i condrociti ipertrofici vanno incontro ad apoptosi, gli osteoblasti sostituiscono la cartilagine in via di degradazione con l'osso trabecolare e si forma il midollo osseo dalle cellule ematopoietiche. Contemporaneamente gli osteoblasti del pericondrio formano un cilindro di osso compatto attorno alla porzione mediana (diafisi) della cartilagine, in questo modo il centro di ossificazione primaria si trova all'interno del cilindro osseo. A una o entrambe le estremit (epifisi) si formano invece i centri di ossificazione secondaria ma mantenuta una placca cartilaginea che separa diafisi ed epifisi: questa la placca di crescita (Fig.1.17). In questa zona tramite la coordinazione di proliferazione, differenziamento (ipertrofia condrocitaria), e apoptosi avviene la crescita longitudinale dell'osso. Contemporaneamente questo processo sincronizzato con la crescita radiale della diafisi e l'accrescimento dell'epifisi @(Hunziker 1994).

Fig.1.17 La condensazione mesenchimale, il processo di maturazione dei condrociti, la vascolarizzazione e la formazione dei centri di ossificazione e della placca di crescita durante lo sviluppo fetale dell'osso (Bronner 2010) La formazione di questi centri di ossificazione concomitante alla vascolarizzazione dell'osso mediata dai segnali delle VEFG (Vascular Endothelium Growth Factor), che sono prodotti e secreti dai condrociti ipertrofici del pericondrio. Esperimenti nei topi hanno evidenziato che iniettando nelle ossa lunghe in formazione una forma solubile e ingegnerizzata del recettore VEGFR1, questa
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legandosi a VEFG ne reprime il segnale e determina una serie di effetti sullo sviluppo quali l'annullamento della formazione dell'osso trabecolare, ridotta espansione della zona condrocitaria ipertrofica e una ridotta angiogenesi nella placca di crescita @(Gerber , Vu et al. 1999). Le proteasi, quali le metalloproteinasi di matrice (MMP) sono probabilmente coinvolte nel rilascio di VEFG e di altre molecole segnale angiogeniche che sono accumulate nella matrice extracellulare ipertrofica. La totale assenza della MMP9 causa nei topi un ritardo nell'ossificazione endocondrale e la presenza di una matrice cartilaginea ipertrofica abnorme a ridosso delle placche di crescita. Questo compatibile con un collegamento fra l'attivit delle metalloproteinsi e l'apoptosi dei condrociti ipertrofici @(Gerber , Vu et al. 1999). Ancora necessario chiarie il meccanismo molecolare che permette l'angiogenesi, tuttavia nei topi omozigoti nulli per Runx2, non avviene l'angiogenesi all'interno della cartilagine, neanche nelle zone dove avviene il differenziamento dei condrociti ipertrofici. Il fattore di trascrizione-inducente gli osteoblasti Runx2 controlla direttamente o indirettamente l'espressione di VEGF e l'angiogenesi nelle giunzioni fra la placca di crescita e l'osso trabecolare nelle ossa lunghe @(Otto, Thornell et al 1997) @(Olsen, Reginato et al 2000).

1.5 Placca di crescita e accrescimento dell'osso.

La placca di crescita dell'epifisi assume un ruolo cruciale nell'accrescimento dell'osso e i processi di differenziamento, ipertrofia, e apoptosi dei condrociti sono soggetti a una complessa regolazione. Inoltre questi processi devono essere sincronizzati con la formazione dell'osso nel pericondrio, che si trova sulla superficie dell'osso, e l'angiogenesi nella sottostante placca di crescita. Un esempio la precisa localizzazione del collare di osso compatto che ricopre l'asta delle ossa lunghe. Questo termina esattamente al livello interno in cui avviene la transizione fra condrociti proliferanti e ipertrofici nella placca di crescita (Fig1.18A). La crescita longitudinale risultante dall'attivit della placca di crescita sincrona allo spostamento della zona di transizione ipertrofica/proliferante verso l'epifisi. Il collare osseo pericondriale si accresce alla stessa velocit con cui avviene la transizione condrocitaria (Fig1.18A). Recentemente stato attribuito a Indian Hedgehog (Ihh) il ruolo di molecola chiave nel coordinare questi processi, poich in grado di stimolare la proliferazione dei condrociti nella placca di crescita, di prevenire l'ipertrofia in essi e di regolare la formazione dell'osso trabecolare sotto la placca di crescita e dell'osso compatto nel collare del pericondrio. La sua espressione rilevabile fin dal differenziamento dei precondrociti ma in seguito alla nascita localizzata specificamente nei condrociti preipertrofici della placca di crescita. L'omozigosi nulla per il gene di questa molecola comporta l'assenza di ossificazione endocondrale e un pronunciato nanismo negli elementi
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scheletrici assiali e dell'arto, inoltre la proliferazione rimarchevolmente ridotta e la maturazione in senso ipertrofico anormale nei condrociti di questi topi. Studi su modelli murini in cui erano presenti una serie di mutazioni hanno evidenziato che l'effetto sulla maturazione anomala dei condrociti in cui stato inattivato Ihh pu essere recuperato se espressa, sotto il controllo del promotore di COL2A1, una forma mutante costitutivamente attiva del recettore di PTHrP (PTHrPR). Le Ihh provenienti dalla zona dei condrociti preipertrofici stimolano l'espressione di PTHrP (Parathyroid Hormone relate Peptide) nelle cellule periarticolari del pericondrio. PTHrP sembra prevenire l'ipertrofia nei condrociti della placca di crescita in modo da mantenere una riserva di cellule proliferanti sopra la zona ipertrofica. Gli effetti di PTHrP sono mediati dal suo recettore, PTHrPR, che accoppiato a una proteina G ed espresso nei condrociti proliferanti e preipertrofici. Quindi Ihh e PTHrP sembrano far parte di un circuito retroattivo che regola le proporzioni relative fra condrociti proliferanti e ipertrofici nella placca di crescita @(Karp, Schipani et al 2000) (Fig1.18B). In accordo con questa ipotesi stato osservato che l'inattivazione di PTHrP o del suo recettore determina una diminuzione dei condrociti proliferanti e un aumento di quelli ipertrofici, mente una sovraespressione di PTHrP ha l'effetto opposto. In entrambi casi l'alterata proliferazione dei condrociti nella placca di crescita determina il nanismo. Questo probabilmente dovuto al ruolo cruciale dei condrociti ipertrofici nella crescita longitudinale. Se diminuisce il pool di proliferazione, si riduce anche il numero di condrociti ipertrofici, e nonostante la zona ipertrofica sia relativamente estesa, la crescita delle ossa ridotta. Al contrario un aumento relativo del pool di proliferazione determina una diminuzione del tasso dipertrofia, e di conseguenza una ridotta crescita delle ossa. E queste osservazioni sono in accordo con quanto riscontrato nella mutazione dei geni umani: La condrodisplasia metafisaria di Jansen dovuta a una mutazione attivante del recettore PTHrP che causa severe anomalie nelle metafisi delle ossa lunghe, mentre la condrodisplasia di Blomstrad dovuta a una perdita di funzione del suddetto recettore e ha come conseguenza un aumento della maturazione scheletrica @(Olsen, Reginato et al 2000) @(Hunziker 1994). L'inattivazione di Ihh comporta un nanismo pi severo rispetto a quella di PTHrP, suggerendo che Ihh abbia ulteriori ruoli nel controllare il funzionamento della placca di crescita, oltre a quello regolativo nell'espressione di PTHrP. Uno di questi ruoli sembra essere la stimolazione proliferativa diretta dei condrociti, l'altro stimolare il differenziamento degli osteoblasti nelle cellule degli strati pi profondi del pericondrio diafisale (Fig1.18B). Ihh ha un ruolo principale nel promuovere la proliferazione dei condrociti, ma come la sua attivit sia regolata e ristretta specificamente ai condrociti preipertrofici ancora non chiaro, sembra che ci siano numerosi fattori che abbiano un
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ruolo positivo e negativo. L'inibizione dell'espressione di Ihh potrebbe essere mediata sia da PTHrP sia da FGFR3 mentre BMP potrebbe essere invece un promotore della sua espressione oltre che un mediatore a valle. Anche la segnalazione tramite acido retinoico potrebbe avere un ruolo, poich Stra6 un gene la cui espressione indotta dall'acido retinoico, attivo in una regione circolare attorno alla placca di crescita e al livello dei condrociti preipertrofici producenti Ihh. Sembra inoltre che ci sia una proteina in grado di legarsi alle proteine Hedgehog, inibendone l'attivit nel caso delle Ihh @(Olsen, Reginato et al 2000) @(Hunziker 1994).

Fig.1.18 A) I condrociti con differenti propriet di proliferazione e differenziamento sono situati in zone diverse allinterno dellosso in via di sviluppo. B) I circuiti di segnalazione che regolano il differenziamento dei condrociti lungo allinterno della zona di riserva, della placca di crescita e della zona preipertrofica e ipertrofica. (Yang 2009) Il ruolo del recettore FGFR3 e della sua controparte solubile, nella velocit d'espansione della placca di crescita, messo in risalto dai numerosi disordini scheletrici che la sua mutazione causa nell'uomo. La forma di nanismo pi comune, l'acondroplasia, causata da un allele che codifica una forma iperattiva di questo recettore. Sembra che questo recettore quando attivo inibisca la proliferazione dei condrociti e l'espressione di Ihh, come osservato nelle mutazioni che ritardano la crescita, e da studi effettuati su colture cellulari e topi transgenici. La sua inattivazione, nel topo, determina una crescita scheletrica smoderata. FGFr3 regola quindi la proliferazione e lipertrofia nei condrociti differenziati. @(Olsen, Reginato et al 2000).

1.6 Sopravvivenza dei condrociti.

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La cartilagine tessuto non vascolare e si sviluppa in condizione di ipossia poich i condrociti, in particolare quelli della cartilagine tragedia, non hanno accesso a una sorgente di ossigeno vascolare. Come in altre condizioni dipossia, il mediatore della risposta ipossica nella cartilagine in via di sviluppo il fattore di trascrizione Hif1 e di un suo componente sensibile all'ossigeno Hif-1a. La rimozione di questa componente ha come risultato la morte di condrociti all'interno della placca di crescita @(Yang 2009). Un target a valle di Hif-1 nel regolare la risposta ipossica VEGF. L'estesa morte cellulare osservata nella cartilagine dei topi mutanti in VEGF ha una notevole somiglianza con quella osservata nella cartilagine in via di sviluppo dei topi mutanti per Hif-1a. Inoltre l'espressione di VEGF nella placca di crescita ridotta in assenza di Hif-1a. Comunque l'espressione di VEGF regolata anche da un meccanismo indipendente da Hif-1. E una possibile risposta alternativa specifica della cartilagine alle condizioni d'ipossia. In questi mutanti, la sua espressione di VEGF e langiogenesi ectopica sono indotte in una situazione indipendente da Hif-1a nei condrociti che circondano le aree di stessa morte cellulare @(Yang 2009).

1.7 Differenziamento e attivit degli osteoblasti.

Gli osteoblasti che si differenziano dai progenitori mesenchimali, depongono la matrice extracellulare dell'osso sia nell'ossificazione endocondrale sia intramembranosa. I condrociti ipertrofici vanno inconcotro ad apoptosi e gli osteoblasti si insediano allinterno delle nicchie occupate da questi, degradando la matrice cartilaginea e deponendo la matrice ossea (Fig.1.19). Runx2 necessario per il loro differenziamento: non avviene la formazione dell'osso nei topi omozigoti nulli per il suo gene, sebbene lo sviluppo cartilagine sia normale. Inoltre l'aploinsufficienza per Runx2 (Cbfa1) alla base della displasia cleidocraniale sia nell'uomo sia nel topo. Questo disordine autosomico dominante determina la non chiusura delle fontanelle, la formazione di clavicole ipoplastiche o aplastiche, ritardo dello sviluppo dentale sia deciduo sia permanente e dentizione sovranumeraria, oltra a numerosi altri difetti e anomali dello sviluppo scheletrico. Oltre al suo ruolo nel differenziamento degli osteoblasti, Runx2 necessario per la deposizione della matrice extracellulare una volta ultimato il differenziamento di questi. Runx2 promuove l'espressione di molte proteine dell'osso come l'osteocalcina, la sialoproteina, la fosfatasi alcalina e il collagene di tipo I @(Olsen, Reginato et al 2000).Gli osteoblasti degradano la matrice cartilaginea e tramite secrezione vescicolare depongono la matrice extracellulare tipica del tessuto osseo, costituita da una componente cristallina di Idrossiapatite (polifosfati di calcio) e da una componente organica di collagene I e proteoglicani (Fig.1.19).

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Sebbene la porzione endocondrale della clavicola in via di sviluppo sia molto sensibile alla riduzione del livello di Runx2, sia nell'uomo sia nel topo, la sua presenza non strettamente necessaria per la formazione dello scheletro cartilagineo che si sviluppa quasi normalmente nei topi in cui Runx2 stato inattivato. I condrociti ipertrofici all'interno di alcuni anlagen cartilaginei richiedono la sua espressione. Infatti non avviene ipetrofia nelle cartilagini dello scheletro assiale a prossimale dell'arto. Stranamente non cos per tutti gli elementi cartilagine dellarto distale quali, tibia/fibula, radio/ulna e gli elementi delle mani e dei piedi. Nell'arto distale l'ipertrofia nelle cartilagini, in topi omozigoti nulli per Runx2, ridotta ma presente ed iniziata nelle mani e nei piedi, ma non mantenuta. Runx2 identificabile a bassi livelli nei condrociti ipertrofici della placca di crescita. Oltre a essere necessario per il differenziamento degli osteoblasti necessario come fattore limitante dellipertrofia nei condrociti. Potrebbe essere inoltre Fig.1.19 Gli osteoblasti, che si differenziano dai condrociti preipertrofici del pericondrio, sostituiscono i condrociti ipertrofici nei centri di ossificazione, depongono la matrice ossea composta da collagene I e Idrossiapatite e

necessario per l'espressione di VEGF e la vascolarizzazione secernono i segnali che durante l'ossificazione endocondrale. Infine potrebbe controllare l'espressione della collagenasi 3 (MMP-13) nei condrociti ipertrofici @(Olsen, Reginato et al 2000).

1.8 La matrice extracellulare nello sviluppo scheletrico.

I componenti della matrice extracellulare della cartilagine e dellosso hanno un ruolo critico nello sviluppo, come evidenziato dal vasto numero di displasie secondarie dovute a mutazioni che coinvolgono le molecole della matrice extracellulare. L'osteogenesi imperfetta (OI) causata dall'eterozigosi nei due geni COL1A1 e COL1A2, che codificano per le catene 1 e 2 del collagene tipo I. L'osteogenesi imperfetta descrive un gruppo di patologie eterogenee caratterizzate da ossa fragili, sclere blue, dentinogenesi imperfetta. La maggior parte dei pazienti sembra avere un alle non funzionante o nullo per il collagene tipo1, con conseguente riduzione dell'impalcatura di collagene nell'osso. Le mutazioni che avvengono nella regione C-teminale del peptide procollagene tipo I, impediscono l'inserimento della catena nel trimero e determinano i fenotipi pi blandi. Nelle
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forme pi severe invece la mutazione determina nella catena 1 e 2 la sostituzione di una glicina con un altro aminoacido pi rigido. Questa mutazione permette l'inserzione della catena nel trimero ma destabilizza l'integrit complessiva della tripla elica. La severit in qualche modo dovuta al punto in cui avviene questa sostituzione. Gli effetti principali sono dovuti tuttavia alla quantit di catene mutanti che vengono secrete nella matrice extracellulare e incorporate nelle fibrille di collagene. Se le molecole di collagene mutante sono inserite nelle fibrille ne destabilizzano l'integrit strutturale, in caso contrario la matrice extracellulare sar affetta meno severamente. @(Olsen, Reginato et al 2000) Il collagene di tipo II, un omotrimero codificato da COL2A1, il maggior componente strutturale della cartilagine, del vitreo dell'occhio, del nucleo polposo nei dischi intervertebrali, e della membrana tettoria dell'orecchio. Mutazioni nel collagene di tipo II causano uno spettro di malattie conosciute come collagenopatie di tipo 2. La gamma di effetti varia dalla letalit, a un nanimso severo, fino una statura normale con una predisposizione all'osteoartrite precoce. I pazienti con mutazioni in COL2A1 possono avere distaccamento della retina e perdita dell'udito. Le mutazioni che causano fenotipo moderatamente severo generalmente sono dovute a una ridotta secrezione del collagene di tipo II nella cartilagine. I fenotipi pi blandi sono dovuti a un codone di stop prematuro presente in un allele nullo. Esistono numerosi modelli murini delle collagenopatie di tipo II. Anche queste possono variare dalla letalit fino a fenotipi blandi come quelli riscontrati negli umani, in base al tipo e alla posizione della mutazione del gene COL2A1 o all'et degli animali @(Olsen, Reginato et al 2000). Altri tipi (IX, X, XI, XII) di collagene fanno parte della cartilagine. Il tipo IX un eterotrimero non fibrillare costituito da tre differenti catene alfa 1(9), 2(9), 3(9), che vengono coespresse insieme al collagene di tipo II nella cartilagine. Questo collagene situato sulla superficie delle fibrille di collagene tipo II con le quali legato tramite legami incrociati a residui N e C-terminali. Le mutazioni che affliggono il collagene di tipo IX sono alla base della displasia epifisaria multipla (MED). Questo un disordine determina una statura ridotta e uninsorgenza precoce dell'oseoartrite. Sembra che le mutazioni siano dovute a un difetto di splicing del terzo esone. Nel topo, gli eterozigoti nulli per COL9A1 hanno un normale sviluppo scheletrico, ma presentano precocemente dei cambiamenti simili a quelli dell'osteoartrite @(Olsen,Reginato et al 2000). Il collagene di tipo X un omotrimero a catena corta espresso nei condrociti ipertofici durante l'ossificazione endocondrale. I topi transgenici con unestesa delezione nello schema di lettura aperto nel dominio centrale a tripla elica del collagene X, sviluppano la condrodisplasia spondilometafisaria. Nell'uomo alcune mutazioni in COL10A1 sono la causa della condrodisplasia metafisaria di Schmidt, che determina curvatura delle gambe, ritardo di crescita delle estremit
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inferiori e coxa vara. Tutte le mutazioni sono raggruppate nel dominio NC1 non tripla elica Cteminale della molecola, e impediscono la secrezione e lintegrazione delle catene nel trimero. La probabile origine della malattia dovuta all'aploinsufficienza per i geni del collagene X, sebbene possa essere anche un effetto dinterferenza dominante. L'analisi dei topi omozigoti nulli di COL10A1 suggerisce che questi abbiano solo una limitata placca di crescita @(Olsen, Reginato et al 2000). Il collagene di tipo XI, quantitativamente minore nella cartilagine, copolimerizza col collagene di tipo II e sembra regolarne il diametro. E' un eterotrimero composto dai prodotti di tre geni differenti: COL11A1, COL11A2, COL2A1. Mutazioni nel gene COL11A1 sembrano essere la causa de della sindrome di Marhall o di Stickler. L'esame delle correlazioni genotipiche e fenotipiche fra i malati di sindrome di Marshall, Stickler, e simil-Stickler ha evidenziato le cause genetiche di queste malattie: la sindrome di Marshall dovuta a mutazioni che alterano lo splicing di COL11A1 mentre la sindrome di Stickler dovuta a mutazioni nulle in COL2A1, mentre la simil-Stickler, che non ha effetti sull'occhio, sembra coinvolgere il gene COL11A2. Questo perch nell'occhio la catena 11(2) del collagene XI sostituita con la catena 2 del collagene V (COL5A2). I topi affetti da condrodisplasia recessiva (Cho) forniscono ulteriori chiarimenti sul ruolo del collagene XI nello sviluppo scheletrico, per via di una mutazione puntiforme nonsenso. In eterozigosi per questo allele, avviene uno sviluppo scheletrico normale ma con una prematura insorgenza osteoartritica, gli omozigoti mutanti invece muoiono alla nascita presentando muso e arti accorciati e fenditure nel palato. Anche nella placca di crescita sono presenti molte alterazioni dell'ossificazione endocondrale quali, alterazioni dell'organizzazione cartilaginea e della sua integrit strutturale e alterazioni dello sviluppo ipertrofico dei condrociti. E' ben chiaro che i collageni di tipo I e di tipo II abbiano un ruolo principalmente strutturale nella cartilagine ossea a differenza del collagene X e XI che sembrano avere anche ruoli regolativi. Il rapporto quantitativo fra i collageni XI e II sembra influenzare il diametro delle fibre di collagene, e l'effetto sull'ipertrofia dei condrociti sembra evidenziare un ruolo del collagene XI sulla loro maturazione. Alla luce delle sempre maggiori evidenze sul ruolo dei glicosamminoglicani nel modulare la comunicazione cellulare mediata da citochine, possibile che il network di collagene superficiale costituito dai tipi IX e XI sia in grado di interagire e legarsi con i proteoglicani e modulare tramite questi la segnalazione extracellulare, inoltre potrebbe esserci una segnalazione diretta fra le fibre di collagene della matrice extracellulare e dei recettori sulla membrana cellulare dei condrociti @(Olsen, Reginato et al 2000). Il proteoglicano principale nella cartilagine l'Aggrecano. E' costituito da un nucleo proteico modificato tramite una sostituzione di condroitina e della catena di keratan-solfato con altri
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oligosaccaridi. L'Aggrecano si lega all'acido ialuronico e forma larghi complessi stabilizzati da proteine di legame. Gli aggregati di proteoglicani legano l'acqua e danno alla cartilagine la resistenza alla compressione e le mutazioni che colpiscono sia l'Aggrecano che le proteine di legame causano un severo nanismo evidenziando probabili effetti sulla proliferazione cellulare nella placca di crescita. I topi recanti mutazioni dello schema di lettura nell'Aggrecano, sviluppano una deficienza della matrice cartilaginea, e presentano muso, arti e coda con difetti di sviluppo, fenestrazione del palato e anormalit dei dischi intervertebrali. I topi che hanno invece alleli nulli per le proteine di legame mostrano un ritardo nello sviluppo dell'osso con difetti di formazione nel cranio e negli arti. Nella placca di crescita la deposizione di Aggrecano nella zona ipertrofica ridotta e diminuisce il numero dei condrociti ipertrofici e preipertrofici @(Olsen, Reginato et al 2000). Infine il Perlecano, uno dei maggiori Eparan-solfato proteoglicani, costituito da numerosi moduli proteici distinti organizzati in cinque domini diversi capaci di legarsi ad altre piccole e grandi molecole, quali FGF2, FGF7, Fibronectina, Eparina, Laminina, PDGF-BB e Integrine. Questo complesso multiproteico promuove in vitro il differenziamento dei condrociti. I topi omozigoti nulli per alcuni dei suoi componenti mostrano severe alterazioni della placca di crescita. Si pensa che il Perlecano sia in grado di prevenire la degradazione della matrice extracellulare, operata dalle proteasi, mascherando e proteggendo i componenti proteici; comunque data la sua capacit di legare e trattenere i fattori di crescita quali le FGF, si pensa sia anche in grado di modulare la segnalazione mediata da citochine nella placca di crescita @(Olsen, Reginato et al 2000).

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Capitolo 2

2.1 Struttura dell'osso

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Losso un tessuto costituito otre che dai suoi specifici tipi cellulari da una matrice extracellulare con un profilo chimico e morfofunzionale caratteristico. Questo apparato serve a fornire sostegno meccanico, protezione e un sistema di giunture che permettono il movimento. La sua matrice costituita da principalmente da una componente proteica di collegene I e da cristalli di Idrossiapatite (Ca10(PO4)6(OH)2. La vascolarizzazione necessaria per la su vitalit e per le sue funzionalit fisiologiche. L'osso nei bambini e negli adulti di due tipi: compatto o osso corticale, che costituisce lo strato esterno della gran parte delle ossa (Fig.2.1) e ammonta all'80% del tessuto osseo nel corpo; e trabecolare o spongioso che si trova all'interno dell'osso corticale, e costituisce il rimanente 20% del tessuto osseo corporeo. Nell'osso compatto il rapporto superficie/volume basso e gli osteociti sono quiescenti. Essi giacciono nelle lacune e ricevono nutrienti dai canalicoli che si ramificano nell'osso compatto (Fig.2.1). L'osso trabecolare costituito da trabecole con un elevato rapporto superficie/volume e numerose cellule dislocate alla superficie delle trabecole. Esso ha una elevata attivit metabolica, ed i nutrienti diffondono dal liquido extracellulare nelle trabecole, mentre nell'osso compatto i nutrienti arrivano attraverso i canali di Havers (Fig.2.1) che contengono vasi sanguigni. Intorno a ciascun canale di Havers il collagene disposto in strati concentrici che formano cilindri chiamati osteoni o sistemi di Havers. La proteina della matrice ossea in massima parte collagene di tipo I. Questa proteina un trimero fibrillare costituito da tre catene codificate da due geni diversi, a parit di massa e dimensioni mostra propriet meccaniche paragonabili a una fune dacciaio @(Ganong 2007). Fig.2.1 Struttura istologica dellosso. (Ganong

2.2 Crescita postnatale dell'osso

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Durante la crescita postnatale, aree specializzate alle estremit delle ossa lunghe (epifisi) sono separate dal corpo dell'osso (diafisi) da uno strato di cartilagine attivamente proliferante (cartilagine di coniugazione o placca di crescita) (Fig.2.2). L'aumento in lunghezza delle ossa avviene per la neoformazione di osso alle estremit delle diafisi, nellinterfaccia fra queste e la placca di crescita. Lo spessore della cartilagine di coniugazione proporzionale alla velocit di crescita, ed influenzato da vari ormoni, ma specialmente dall'ormone della crescita ipofisario e da IGF-I. Le ossa lunghe possono crescere in lunghezza fin quando fra le epifisi e la diafisi presente la placca cartilaginea; una volta avvenuta la saldatura epifisaria, l'accrescimento cessa. Le cellule della cartilagine cessano di proliferare, diventano ipertrofiche e secernono VEGF, che porta a vascolarizzazione ed ossificazione. Le epifisi delle varie ossa si saldano alla diafisi in una sequenza temporale ordinata, le ultime solo dopo la pubert. Nell'uomo si conosce l'et alla quale avviene la saldatura delle varie epifisi, cosicch l'esame ai raggi X permette di riconoscere l "'et ossea" di un individuo, osservando quali epifisi sono aperte e quali chiuse @(Ganong 2007).

Fig.2.2 Crescita postnatale dellosso: Differenze fra Osso infantile e Osso Adulto (Ganong 2008)

2.3 Formazione e riassorbimento dell'osso

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Le cellule responsabili della formazione dell'osso sono gli osteoblasti mentre gli osteoclasti sono le cellule deputate al riassorbimento. Gli osteoblasti sono fibroblasti modificati. Il loro sviluppo iniziale dal mesenchima identico a quello dei fibroblasti e coinvolge lo stesso gran numero di fattori di crescita. Pi tardi iniziano a comparire fattori specifici per lossificazione, come Runx2. Gli osteoblasti normali sono le cellule osteodepositrici. Gli osteoclasti sono membri della famiglia dei monociti. Cellule stromali del midollo osseo, osteoblasti e linfociti T esprimono tutti, sulla loro superficie, una molecola chiamata RANKL (ligando RANK). E quando entrano in contatto con monociti appropriati, si legano a recettori RANKL sulla loro superficie. Essi, inoltre, secernono mCSF che lega un recettore, c-fins, dei monociti. Questo legame trasforma i monociti in osteoclasti. Le cellule progenitrici secernono anche osteoprotegrina (OPG) che controlla la trasformazione dei monociti entrando in competizione con RANK per il legame di RANKL. Gli osteoclasti erodono e assorbono losso precedentemente formato. Essi si attaccano Fig.2.3 Riassorbimento osseo ad opera di un Osteoclasto. (Ganong 2008) all'osso attraverso integrine in una zona della membrana chiamata zona di attacco. Questo

crea una area isolata tra osso e una porzione dell' osteoclasto. Pompe protoniche che sono ATPasi H+ dipendenti si spostano, quindi, dagli endosomi nella membrana cellulare opposta all'area isolata e acidificano quest'area fino a pH 4. Pompe protoniche simili si trovano negli endosomi e nei lisosomi di tutte le cellule eucariotiche, ma, soltanto poche si spostano all'interno della membrana cellulare. da notare, a questo riguardo, che lo spazio fuori da questi siti di attacco, formato dagli osteoclasti, rassomiglia ad un grande lisosoma. Il pH acido dissolve l'idrossiapatite e proteasi acide secrete dalla cellula rompono il collagene determinando una depressione superficiale nell' osso (Fig.2.3). I prodotti della digestione sono quindi fagocitati e si spostano attraverso gli osteoclasti per transcitosi, venendo rilasciati nel liquido interstiziale. Durante tutta la vita, l'osso viene costantemente riassorbito, e nuovo osso viene formato. Il rimodellamento dell'osso operato principalmente in piccole aree di popolazione cellulare, dette unit di rimodellamento dell'osso, in cui dapprima osteoclasti assorbono l'osso, e poi osteoblasti depositano nuovo osso nella stessa area, in un ciclo che dura circa 100 giorni. Tuttavia, si verifica anche un rimodellamento nel quale la forma dell'osso cambia, poich l'osso riassorbito in un punto ed aggiunto in un altro. Gli osteoclasti formano cavit nella parte corticale dell'osso seguiti dagli osteoblasti, mentre nell'osso
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spugnoso il rimodellamento si verifica sulla superficie delle trabecole. In ogni momento, nello scheletro di un uomo, circa il 5% della massa ossea in rimodellamento, in circa 2 milioni di unit di rimodellamento. La velocit di rimodellamento dell'osso di circa il 4% all'anno per l'osso compatto e il 20% per l'osso trabecolato. Il rimodellamento in parte dipendente da pressioni e trazioni esercitate sull'osso dalla gravit. Gli osteoblasti regolano la formazione di osteoclasti attraverso RANKL - RANK e attraverso il meccanismo M-CSF-OPG; ma non c' nessun feedback diretto tra osteoblasti e osteoclasti. Tuttavia l'intero processo di rimodellamento dell'osso sotto stretto controllo endocrino. L'ormone paratiroideo accelera il riassorbimento, mentre gli estrogeni lo rallentano, inibendo la produzione di citochine che erodono l'osso. Una osservazione interessante che la leptina intracerebroventricolare ma non quella endovenosa diminuisce la formazione di osso. Questo dato si correla con l'osservazione che l'obesit protegge la perdita di osso e che le persone molto obese resistono agli effetti della leptina sull'appetito. In questo modo si pu supporre un controllo neuroendocrino della massa ossea per mezzo della leptina. @(Ganong 2007)

2.4 Guarigione dalle fratture, una visione integrata.

In seguito a un urto o un trauma particolarmente violento, ma anche di modesta entit se esistono condizioni osteocompromettenti, losso pu rompersi. Questo tessuto possiede unintrinseca capacit rigenerativa che gli permette di riacquisire la sua struttura funzionale. La capacit rigenerativa dellosso deriva dalla capacit che possiede questo tessuto di ricapitolare la sua morfogenesi embrionale a seguito di un trauma. Il processo nella sua interezza pu essere considerato come lintegrazione di quattro distinte fasi rigenerative o di due processi di anabolismo e catabolismo, che possono essere specifici se caratterizzati da avvenimenti peculiari del tessuto osseo o non-specifici se implicano avvenimenti rigenerativi generali @(Schindeler, McDonald et al 2008). La prima fase la risposta infiammatoria con lattivazione delle vie di segnalazione non specifiche e comuni anche ai danni dei tessuti molli. Il trauma determina danni ai tessuti periostiali e midollari. Lemorragia dovuta alla rottura vascolare viene interrotta con la formazione di tessuto fibroso. Questa riposta innescata dal danno tissutale e dallintervento delle cellule immuni della risposta infiammatoria, granulociti, monociti, macrofagi, linfociti e piastrine. Questi degradano i frammenti dei tessuti danneggiati e ne cominciano la rigenerazione deponendo una matrice fibrosa (corpo calloso molle) oltre a attivare la risposta immune in caso dinfezione. Inoltre secernono numerosi segnali che attivano le vie di riparazione tessuto specifiche e non tessuto specifiche (Fig.2.4, Fig2.5). Questi segnali sono Fattori di crescita e citochine, quali TGF-, PDGF, VEGF, BMP C30

MSF, FGF, TNF- e IL-1, -6, -11. In seguito vengono reclutate le Msc che mediano la riparazione tessuto specifica. Il callo fibroso serve a unire i monconi ossei e viene sostituito gradualmente da un impalcatura cartilaginea secreta dai condrociti derivati dalle Msc. Si forma in seguito il tessuto osteoide (tessuto osseo con un organizzazione strutturale disorganizzata e diversa dallosso normale) che costituito da matrice ossea secreta dagli osteoblasti derivati sempre dalle Msc. Contemporaneamente a questi processi viene riattivata la vasculogenesi nel tessuto di riparazione. Il processo finale termina con la deposizione del tessuto osseo definitivo (osso compatto e trabecolare) e il suo rimodellamento fisiologico mediato dallattivit parallela di osteoblasti e osteoclasti @(Schindeler, McDonald et al 2008).

Fig.2.4 Sequenza spazio-temporale della rigenerazione ossea in seguito a una frattura (Haim Tal 2012)

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La riparazione un processo contemporaneamente diverso e simile alla morfogenesi embrionale. Viene ricostituito un modello scheletrico temporaneo che poi sostituito da quello definitivo ripercorrendo. Le fasi servono a Fig.2.5 Una visione integrata delle cellule e dei tessuti che tramite il rapporto fra anabolismo e catabolismo specifico e non- specifico, intervengono durante la guarigione dalle fratture (Schindeler et al ricongiungere le parti dellosso, innescare i meccanismi di

ossificazione, indurre 2008) lintervento cellulare di ossificazione, che per ripristinare la funzionalit strutturale e meccanica deve essere coadiuvata dalla presenza di un ambiente meccanico appropriato (sia stabile sia meccanoinduttivo, poich lo stimolo meccanico influenza il rimodellamento e la struttura dellosso secondo le linee di carico meccanico) @(Schindeler, McDonald et al 2008). Queste osservazioni hanno portato allo sviluppo di un approccio terapeutico nei casi in cui rigenerazione ossea compromessa da patologie secondarie oppure il trauma oltrepassa le capacit normali rigenerative fisiologiche @(Dimitriou, Jones et al 2011) @(Giannoudis, Einhorn et al 2007).

2.5 Terapie Osteorigenerative.

Lapproccio terapeutico nella medicina osteorigenerativa stato rivoluzionato da quando la terapia era basta principalmente sullapporto di stabilit meccanica e il riallineamento dei monconi fratturati. Per ottenere unefficace rigenerazione ossea, necessari quattro fattori che costituiscono il modello terapeutico del concetto a Fig.2.6 Il "modello a diamante".MS=Stimolo Meccanico, MSC= Cellule Staminali Mesenchimali,GF= Fattori di crescita,S=Implacatura (Giannoudis, Einhorn et al 2007).
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sono

diamante(Fig.2.6). Il primo losteoconduttivit, i segmenti ossei devono essere allineati e guidati in modo che la rigenerazione porti al loro ricongiungimento. Il secondo losteoinduzione, devono essere innescate le vie segnalazione specifiche dellosteogenesi. Il terzo fattore losteogeneticit, che richiede la mediazione delle cellule osteogenetiche affinch avvenga la rigenerazione e il rimodellamento dellosso. Il quarto e ultimo fattori e lambiente meccanico che deve fornire ladeguata stabilit e induzione meccanica ai processi osteogenetici. Questo ultimo fattore dipende da un equilibrio di stress e stimolo fisico che influenzano le capacit differenziative e proliferative delle cellule osteogenetiche @(Giannoudis, Einhorn et al 2007). Le principali complicazioni nella guarigione delle fratture sono rappresentate, oltre che dalle infezioni, da difetti della formazione dell'osso con persistenza del tessuto fibroso, che pur collegando i due monconi, manca di rigidit e pu dar luogo alla formazione di una pseudoarticolazione, se i fibroblasti si differenziano in cellule sinoviali (pseudoartrosi). La guarigione pu avvenire per prima o seconda intenzione a seconda che i due frammenti dell'osso spezzato siano ravvicinati oppure abbiano subito uno spostamento, che pu peraltro, essere corretto chirurgicamente. Inoltre esistono numerose altre condizioni in cui la rigenerazione e il rimodellamento osseo sono o compromessi o insufficienti al ripristino funzionale e strutturale. Queste situazioni comprendono anomalie e malformazioni scheletriche congenite e indotte, grossi traumi, e situazioni patologiche secondarie quali osteoporosi e necrosi avascolare, infezioni e asportazioni tumorali. In base a quale dei quattro fattori limitante per la cura dalle situazioni menzionante esistono tutta una serie di pratiche cliniche e chirurgiche che permettono di essere usate da sole o in combinazione per riparare con successo, nella maggior parte dei casi, le condizioni osteopatologiche quali losteoporosi @(Pontieri 2007).

2.6 Osteogenesi distrattiva e Trapianti.

Esistono una serie di procedure cliniche e chirurgiche che possono essere usate da sole o in combinazione per la gestione e il trattamento di quelle complesse condizioni cliniche in cui necessario ottenere la rigenerazione ossea in grandi quantit. La guarigione delle persone colpite da queste condizioni, oltre a rappresentare una sfida per la scienza e la tecnologia a disposizione, una necessit socio-economica:il fallimento terapeutico determina linstaurarsi di una situazione di handicap, con le dovute ripercussioni sulla qualit della vita che queste condizioni portano. Le pratiche terapeutiche pi comuni sono il trapianto osseo, nelle sue numerose varianti, losteogenesi distrattiva e il trasporto osseo, oltre a metodi non invasivi basati su stimolazione biofisica e che vengono utilizzati in complemento alle pratiche precedenti. Questi metodi sono gli
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ultrasuoni a bassa intensit o campi elettromagnetici pulsanti @(Dimitriou, Jones et al 2011).Losteogenesi distrattiva impiegata in un gran numero di situazioni cliniche. Questa tecnica combina la capacit osteorigenerativa intrinseca con lausilio di supporti meccanici per riparare fratture traumatiche con perdita di osso e malformazioni. Nel sito desiderato praticata unosteotomia e i segmenti ossei sono fissati tramite chiodi, viti e aste al supporto meccanico. Il supporto di fissaggio pu essere di vari tipi: esterno, intramidollare, monoguida, apparato di Ilizarov (Fig.2.7). Dopo losteotomia c la fase latente in cui si attivano le vie di rigenerazione ossea. A questo punto avviene la fase distrattiva in cui i segmenti vengono allontanati alla velocit di 1mm al giorno fino a Fig.2.7 Losteodistrazione di Ilizarov stata una delle prime terapie disponibili per il trattamento di fratture con perdita di tessuto osso. Oggi si usa anche per correggere le malformazioni ossee. (Haim Tal 2012 ) raggiungere la lunghezza desiderata, segue una fase di consolidamento in cui losso rigenerato diventa sufficientemente

resistente e si asporta il supporto meccanico. Questa pratica ha permesso di curare molte situazioni cliniche complesse, tuttavia una terapia molto stressante sia fisiologicamente che psicologicamente @(Dimitriou, Jones et al 2011). Inoltre non esente da complicazioni ed tecnicamente esigente. La sua efficacia pu essere aumentata se al suo utilizzo si combinano fattori di crescita e cellule staminali, storicamente questa pratica una tecnica di proto-Tissue Engineering @(Haim Tal 2012).Una procedura utilizzata comunemente in chirurgia ortopedica e maxillofacciale il trapianto di tessuto osseo. Un buon materiale da trapianto aumenta la rigenerazione ossea (osteogeneticit), attiva e aumenta i segnali induttivi dellosteogenesi (osteoinduttivit) quali fattori di crescita e BMP, e fornisce continuit strutturale (osteoconduttivit) su cui avviene la rigenerazione. Lautotrapianto costituisce lo stato dellarte nei trapianti ossei e nella terapia osteorigenerativa poich possiede tutti e quattro i fattori del concetto del diamante. I siti di raccolta del tessuto osseo sono principalmente la cresta dellilio, la fibula prossimale, e il radio distale. Da questi si pu ottenere tessuto osseo corticale, compatto e vascolarizzato.
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La vascolatura del trapianto anastomizzata con quella del sito ricevente in modo da ridurre il rischio necrotico e ripristinare la funzionalit ossea @(Brydone, Meek et al 2010). Lo sviluppo di un nuovo tipo di alesatore, il RIA, ha permesso di utilizzare losso intramidollare come materiale da trapianto. Lautotrapianto utilizza tessuti provenienti dallo stesso paziente bypassando i problemi distocompatibilit e immunogenicit. Inoltre la ripresa funzionale rapida @(Dimitriou, Jones et al 2011) (Fig.2.8). Comunque la raccolta di materiale per lautotrapianto necessita unulteriore operazione chirurgica, il che comporta ben documentate complicazioni e stress per il paziente, oltre al costo e alla limitata quantit di materiale. Lallotrapianto utilizza matrice ossea devitalizzata con le radiazioni o tramite congelamento/essicamento oppure matrice ossea demineralizzata (DBM). Trattandosi di un tessuto non vitale ha bassa osteogeneticit e osteoinduttivit. Inoltre ci sono Fig.2.8 Autotrapianto coaudiuvato da Bmp e fissazione intramidollare in una paziente con frattura non ricongiunta infetta (Dimitriou et al 2011) dibattiti sulle possibilit dinfezione rigetto e immunogenicit, oltre ai costi @(Dimitriou, Jones et al 2011). I sostituti del materiale da trapianto comprendono materiali sintetici e biomateriali e si presentano come unalternativa agli auto- e allotrapianti. Possono essere progettati in modo da promuovere i normali processi cellulari di rigenerazione ossea (migrazione, differenziamento e proliferazione). Possiedono generalmente una discreta osteoconduttivit. Le altre propriet sono assenti a meno che losso sintetico non sia usato in combinazione con altre metodologie terapeutiche. A volte sono utilizzati insieme alla matrice degli allotrapianti. I materiali utilizzati come impalcature sono Idrossiapatite (HA), collagene, -tricalciofosfato (-TCP), oppure ceramiche e cementi a base di fosfati e solfati di calcio @(Dimitriou, Jones et al 2011). I materiali sintetici si prestano sia come sostituti o coaudiuvanti dei materiali da trapianto tradizionali, sia come supporti per il Tissue Engineering che come protesi. In base a quale dei quattro fattori del concetto a diamante diventa pi critico nella situazione terapeutica, oppurtuno pianificare la terapia osteorigenerativa e di conseguenza il materiale da trapianto da utilizzare.

2.7 BMP e fattori di crescita.

Negli ultimi anni sono stati fatti molti passi avanti nella comprensione di ci che avviene al livello cellulare e molecolare durante losteorigenerazione, e questi hanno permesso di indentificare molte delle molecole che intervengono nelle fasi di questo processo. Alcune di queste sono gi un uso nella prassi clinica. Le BMP sono molecole fortemente osteoinduttive. Il loro ruolo fisiologico quello di stimolare la proliferazione delle cellule staminali mesenchimali e di altri osteoprogenitori e di indirizzare il loro differenziamento in osteoblasti. Le BMP2 e BMP7, ottenute in grande
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quantit tramite lingegneria genetica, sono in uso nella terapia corrente per il trattamento di fratture aperte, necrosi asettica, fusione delle giunture, fratture non saldate e altri difetti critici. Le ricerche attuali mirano allo sviluppo di vettori che siano capaci di rilascio prolungato e sito specifico. Si stanno sviluppando formule iniettabili per applicazioni meno invasive. Sono note anche altre molecole che sono coinvolte in vari processi dellosteorigenerazione, alcune delle quali sono i fattori di crescita derivati dalle piastrine (PDGF), Tgf-, IGF-1, VEGF. Il loro utilizzo nella rigenerazione dellosso stato sperimentato ed attualmente in prova nella pratica terapeutica, i risultati sulla loro efficacia sono per controversi. Un altro approccio terapeutico nella rigenerazione dei tessuti la somministrazione di plasma ricco di piastrine, che contiene tutti i fattori di crescita presi in esame @(Dimitriou, Jones et al 2011). La somministrazione dei fattori di crescita che stimolano la rigenerazione ossea potrebbe costituire un vantaggio nella rigenerazione ossea, e alcuni di questi fanno parte della prassi clinica. Tuttavia le dosi somministrate per ottenere leffetto desiderato sono sensibilmente soprafisiologiche, inoltre queste molecole hanno un costo di produzione elevato. Il limite maggiore consiste nel rischio di formazione ectopica dellosso, questo elemento considerevole nelle situazioni che richiedono unaltissima precisione e un minimo margine derrore, come la chirurgia del midollo spinale. Le BMP sono utilizzate anche nella pratica del Tissue Engineering, dove si sta cercando di valutare la concentrazione e la combinazione appropriata di questi fattori di crescita, oltre al loro rilascio sostenuto nel tempo. Nel Tissue Engineering questi gli elementi devono ancora essere migliorati poich rappresentano un limite considerevole. Le nanotecnologie sembrano in grado di mettere a disposizione le soluzioni necessarie per oltrepassare questi problemi (Chen, Ma et al 2009).

2.8 Msc

Le cellule staminali mesenchimali (Msc) sono cellule staminali stromatiche che esibiscono la capacit di auto-rinnovamento e multipotenza, data la loro capacit di differenziarsi in molti linee cellulari. Queste cellule sono presenti in discrete quantit anche negli adulti e in numerosi punti

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dellorganismo, il che le rende interessanti candidate per applicazioni terapeutiche (Fig.2.9)

Fig.2.9 Il profilo di differenziamento delle Msc (Caplan 2011)

2.8.1 Caratterizzazione, Isolamento ed espansione.

I marker di superficie sono utilizzati per caratterizzare le Msc dalle cellule ematopoietiche. Le Msc sono prive dei marker CD34, CD45, CD14 e HLA-DR. Stro-1 un marker specifico delle Msc clonogeniche. Queste cellule sono in grado di differenziarsi in cellule adipose, cartilaginee e ossee e sono in grado di formare tessuto osseo in vivo. Il loro profilo dadesione variabile e dipende dal donatore e dal mezzo di coltura utilizzato. Le Msc del midollo osseo sintetizzano proteine tipiche delle cellule ossee quali vimentina, laminina, osteopontina e fibronectina. Le Msc esprimono anche marche dei miofibroblasti (actina e miosina), dei neuroni (nestina e Tuj-1), delle cellule endoteliali (CD146 e CD105) oltre a TGF- e varie forme di integrine. Unit formanti colonie di fibroblasti sono state isolate del midollo osseo. La loro proliferazione pu essere regolata da PDGF, EGF, FGF, TGF-, IGF. Queste cellule sono capaci di aderire a un supporto plastico. Le colonie mostrano che la frazione cellulare eterogenea in termini di morfologia e capacit differenziativa @(Ding, Shyu et al 2011). Le Msc sono generalmente prelevate dalla cresta superiore dellilio, sebbene recentemente siano stati individuati altri siti di raccolta, fra cui la tibia e il femore sembrano rappresentare valide alternative. La loro raccolta viene

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effettuata tramite delle alesatrici chirurgiche (RIA) che sono inizialmente state sviluppate per le procedure di osteodistrazione (Fig.2.10).

Fig.2.10 Raccolta delle Msc:A) Alesatura Femorale B) Raccolta del Midollo (Arpornmaeklong et al 2012)

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Tuttavia necessario sviluppare un efficiente sistema disolamento, poich delle cellule mononucleate prelevate dal midollo osseo solo una piccola percentuale compresa fra lo 0,001% e lo 0,01% costituita da Msc. La procedura disolamento corrente prevede la centrifugazione in Ficoll o Percoll, in cui le cellule mononucleate sono separate in strati secondo gradiente di densit. Lo strato intermedio che contiene potenzialmente le Msc pu essere aspirato, purificato ed espanso in coltura in tempi brevi. In condizioni ottimali le Msc possono essere espanse in coltura fino a 30 passaggi, sebbene per effetto Heyflick, per invecchiamento e per laccorciamento dei telomeri, le loro capacit di differenziamento vengono notevolmente ridotte. Le cellule pi giovani sono quelle prelevate non oltre il 10 passaggio e la loro senescenza pu essere ridotta tramite luso di fattori di crescita o luso di bioreattori, che mimano lambiente in vivo. Le controversie sul loro impego nelle pratiche terapeutiche sono riguardano la possibilit di contaminazione da batteri e virus o la xenoimmunizazzione dovuta alluso di sieri animali come mezzo di coltura, limitazione aggirabile tramite limpiego di terreni di coltura senza siero animale. E bene notare che in base alluso per cui sono destinate, soprattuto nel caso del Tissue Engineering il processo despansione deve essere adattato alle esigenze finali. Una volta espanse le Msc possono essere modificate geneticamente, somministrate per via sistemica o direttamente in situ, possono essere fatte crescere su un impalcatura o materiale da trapianto e poi somministrate. Il processo despansione pu anche essere bypassato, le Msc appena prelevate si possono somministrare subito dopo il prelievo e lisolamento @(Griffin, Iqbal et al 2011) (Fig.2.11)

Fig.2.11 Protocollo terapeutico sull'impiego delle cellule staminali nell'osteorigenerazione. (Griffin, Iqbal et al 2011)

2.8.2 Differenziamento, Migrazione, insediamento e immunomodulazione delle Msc

Le Msc sono in gradi di differenziarsi in varie linee cellulari del mesoderma, dellectoderma e dellendoderma. Il loro differenziamento, in vitro e sotto specifiche condizioni, stato indotto in

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osteoblasti, adipociti, condrociti, mioblasti, neurociti, epatociti e cellule insulari. Il differenziamento coinvolge lattivazione di determinate vie di segnalazione, geni regolatori ed eventi trascrizionali specifici. Anche il microambiente, in base al biomateriale che lo compone regola la proliferazione e il differenziamento delle Msc verso linee cellulari specifiche. Il differenziamento osteogenetico pu essere indotto tramite dexametasone, 2-fosfoglicerato, e ascorbato come osservato dallaccumulo di calcio e dallattivit alcalina. Runx2 e PLZF inducono losteogenesi. Il differenziamento condrogenetico coinvolge TGF-, SOX9, e Smad3. La repressione un altro importante fattore da considerare PPAR-2 un gene che codifica i fattori adipogenetici e reprime lespressione di Runx2 @(Ding, Shyu et al 2011) (Fig.2.12).

Fig.2.12 I Segnali che controllano il differenziamento delle Msc in vivo e in vitro (Ding, Shyu et al 2011) Molti fattori di crescita, chemochine e citochine sembrano indurre la migrazione e lattrazione delle Msc. I principali sono VEGF,SDF-1, GCSF, GM-CSF, eritropoietina, angiopoietina-2, FGF,PDGF, SCF e numerose interleuchine (2,3,6,8, 1). Durante la vascolarizzazione dei tessuti le cellule staminali ematopoietiche ed endoteliali (HSC ed ESC) migrano nello stesso momento probabilmente per necessit sinergiche. Si pensa che VEGF, PlGF e SDF siano rilasciati dai monociti e dalle piastrine per attivare la metalloproteinasi-9. Queste interazioni possono essere implicate nella rivascolarizzazione e nella mobilitazione di HSC, EPC e MSC durante questo processo @(Ding, Shyu et al 2011).
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Studi recenti hanno evidenziato che le cellule staminali sono altamente mobili e migrano verso i siti dove i tessuti sono danneggiati come le regioni di ischemia cerebrale. Le ESC circolanti attraversano gli endoteli dei differenti organi e delle nicchie midollari. Le Msc possono migrare e stabilirsi nei tessuti e negli organi. Le chemochine e i loro recettori sono componenti essenziali per questo processo. CXCL12 e il suo recettore CXCR4 sono cruciali per la ritenzione del midollo osseo, la mobilitazione e linsediamento delle EPC. Le Msc esprimono diversi recettori per le chemochine e questo suggerisce che la loro affinit per linsediamento pu variare in base alla sede tissutale. Ad esempio GCSF determina unaumentata migrazione delle cellule staminali. Questo potrebbe essere un vantaggio nel direzionare e amplificare linsediamento delle cellule staminali endogene @(Ding, Shyu et al 2011). Le Msc hanno un potente effetto immunomodulatore. Le Msc non sono immunogeniche. Esse non esprimono lMHC II e le relative molecole co-stimolatorie, quali CD40, CD80, CD86. Sono capaci di inibire la proliferazione e la funzionalit dei linfociti T,B e NK e delle cellule dendritiche. Questo dovuto a uninibizione aspecifica della ciclina D2. Altre molecole che hanno un ruolo in questo meccanismo immunosoppressivo sono la prostaglandina E2, lossido nitrico, La proteina legante IGF, oltre alle cellule APC tollerogenetiche. La funzione stromatica potrebbe essere coinvolta in questo ancora non chiaro meccanismo immunosoppressivo. La comprensione di questo meccanismo di fondamentale importanza nello sviluppo di terapie cliniche e applicazioni sperimentali. @(Griffin, Iqbal et al 2011)

2.8.3 Msc Espanse somministrate per via sistemica

In modelli animali stato osservato che le Msc possono migrare e insediarsi per lunghi periodi allinterno del midollo osseo. Studi su esseri umani volontari hanno dimostrato la plausibilit e la tollerabilit riguardo uso delle Msc espanse in vitro ed iniettate per via sistemica. Questa pratica stata utilizzata per stimolare la rigenerazione ossea tramite Msc in pazienti affetti da osteogenesi imperfetta. Sei bambini sono stati trattati con infusioni di Msc allogene. In cinque di questi stato osservato linsediamento delle Msc in uno o pi siti quali osso, derma e midollo stromale. E stata anche osservata unaccelerazione della crescita ossea fra il 60% e il 94% rispetto ai gruppi di controllo composti da bambini non trattati @(Horowitz, Gordon et al 2002). Questa pratica terapeutica non stata tuttavia applicata alla rigenerazione dellosso per due motivi, il primo che preferibile iniettarle direttamente nel sito di interesse cos da rendere lutilizzo pi pratico, efficace e sicuro. Il secondo motivo che sembra che le Msc iniettate per via sistemica tendano e rimanere intrappolate nei polmoni. @(Griffin, Iqbal et al 2011)
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2.8.4 Msc transgeniche

In alcune situazioni necessaria un segnale osteoinduttivo prolungato, in un intervallo di tempo che le impalcature biodegradabili arricchite con fattori di crescita non riescono a coprire. La soluzione a questo limite potrebbe consistere nellimpego di Msc transgeniche (Fig.2.13).

Fig.2.13 L'impiego delle Msc Trangeniche che esprimono fattori di crescita potrebbe essere una soluzione nei casi in cui necessario un segnale osteoinduttivo prolungato nel tempo.(Sela, Bab 2012) E possibile usare vettori virali o non virali per far esprimere i fattori di crescita osteoinduttivi alle Msc. Tuttavia i vettori virali comportano il rischio di retromutazioni virulente e di pericolose reazioni immuni, inoltre mostrano unefficienza variabile nellinfettare cellule proliferanti e quiescenti. I vettori virali sono in grado di indurre una maggiore espressione del gene desiderato e hanno una maggiore capacit di transfezione rispetto ai vettori non virali. Sono stati testati numerosi fattori osteoinduttivi per modificare le Msc e gli studi in vivo sui modelli animali hanno portato risultati promettenti. In uno studio Le Msc transfettate con BMP-2 promuovevano laumento della rigenerazione ossea nei topi in cui erano stati creati difetti di dimensioni critiche nelle ossa radiali degli arti posteriori @(Griffin, Iqbal et al 2011). In un altro studio stata comparata la capacit di ricrescita nellosso del calvario in conigli trattati con BMsc e ADsc modificate per esprimere BMP4, senza tuttavia riscontrare differenze apprezzabili nel tasso di rigenerazione ossea. Negli
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studi in vitro il tasso di deposizione di matrice extracellulare risultava pi elevato nelle ADsc. Purtroppo allinterno del tessuto era accumulato anche grasso che comporta un indesiderato se non sfavorevole aumento di peso nel tessuto osseo Ad oggi non sono disponibili dati clinici su questo tipo di terapia. Prima di poter sperimentare questapproccio sugli esseri umani necessario trovare i fattori di crescita con il grado di osteoinduttivit ottimale, oltre al vettore pi efficiente e sicuro, ai fini di un trattamento terapeutico efficace e consistente. @(Griffin, Iqbal et al 2011)

2.8.5 Msc non espanse.

Le Msc possono essere applicate direttamente dopo il loro prelievo e senza subire la fase di espansione in vitro riducendo tempi e costi nel loro impiego, oltre a ridurre il pericolo di contaminazione. I primi studi fatti su questa tecnica davano buoni risultati. Una serie di studi evidenziavano le potenzialit delle Msc nel riparare i difetti delle ossa in fratture non saldate, difetti e malformazioni scheletriche e artrodosi, sebbene in questi studi, non essendo standardizzati i protocolli, il numero di cellule necessario per ottenere un risultato efficace e costante non era riportato @(Griffin, Iqbal et al 2011). Recentemente stato stabilito che il successo di questa pratica terapeutica dipende dal numero e dalla concentrazione di cellule ottenuta col prelievo midollare. In 60 pazienti in cui non si erano ottenuti i risultati attesi stato osservato che il numero di cellule trapiantate era inferiore a 30000 e che la concentrazione di queste era inferiore a 1000 cellule per cm^3. In questi pazienti il numero di cellule trapiantate era significativamente minore (p<0,01) rispetto a quelli in cui il trattamento era stato efficace. Da questi studi merso che per un trapianto la concentrazione minima di cellule 10^3 per cm^3 @(Hernigou, Poignard et al 2005). Questi risultati hanno spinto a perfezionare le tecniche di raccolta. La procedura corrente basata su prelievi separati allinterno del midollo, e costituiti da volumi compresi fra i 2 e i 4 ml, fino a ottenere la quantit richiesta. Dopo necessario centrifugare laspirato in modo da separare le cellule in base alla densit, cos da poter prelevare solamente le Msc. Con questi accorgimenti si riduce al minimo la diluizione dellaspirato con altri tessuto non desiderati e che rischiano di compromettere il successo della procedura, inoltre la centrifugazione per gradiente di densit praticata immediatamente dopo la raccolta, cos da ottenere in breve tempo le Msc necessarie al trattamento @(Griffin, Iqbal et al 2011).

2.9 Impalcature e protesi.

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Luso di protesi, impalcature o sostituti dei trapianti preferibile in tutte quelle situazioni in cui i fattori cruciali della rigenerazione ossea sono losteoconduttivit e lambiente meccanico oppure i casi in cui il materiale disponibile per il trapianto diventa un fattore limitante che deve essere complementato con altre tecniche terapeutiche. Data la diversit strutturale delle ossa allinterno dellorganismo, importante tenere in considerazione sia le propriet meccaniche nella macroarchtettura sia nella microarchitettura del materiale utilizzato nellimpalcatura e dellosso che si deve rigenerare. Inoltre le caratteristiche chimiche del materiale influenzare pesantemente il successo della terapia, sia Fig.2.14 Sviluppo e progettazione delle impalcature e degli nellimmediatezza che a lungo termine, per via del loro ruolo nelladesione, differenziamento cellulare e

riassorbimento @(Sun, Liu et al 2011). La porosit e la impianti.(Raghunath et al 2007) topografia superficiale influenzano la capacit delle Msc e delle altre componenti cellulari di aderire, proliferare e differenziarsi sui materiali e di conseguenza di poter integrare questi con losso circostante (Fig.2.14) . E opportuno sottolineare che anche il grado di virulenza degli agenti patogeni varia in base alle propriet chimiche e microstrutturali dei materiali da impalcatura. La composizione chimica, la micro- e la macrostruttura influenzano le propriet meccaniche totali del materiale da trapianto. Questo permette di costruire impalcature con grande plasticit anatomica, permettendo unampia variet nelle applicazioni cliniche di questa tecnica. In passato questi punti di forza erano comunque limitati dallosteogeneticit e dallosteinduttivit assenti, e in alcuni casi represse dai materiali a disposizione: le protesi metalliche troppo rigide promuovevano il riassorbimento osseo @(Brydone, Meek et al 2010). Oggi invece utilizzando una combinazione di tecniche, e avvalendosi dei progressi nelle conoscenze delle scienze dei materiali si possono progettare materiali e impalcature che integrano anche gli altri fattori del modello a diamante. Col progredire della conoscenza sulla biologia dellosso, i materiali sintetici hanno subito una loro evoluzione adattandosi alle nuove metodologie terapeutiche, soprattutto con lemergere del Tissue Engineering @(Brydone, Meek et al 2010). I materiali di prima generazione erano costituiti principalmente da protesi metalliche o di polimeri plastici e venivano impiegati nella chirurgia ortopedica e odontoiatrica. Questi materiali avevano diversi limiti. Le loro propriet chimiche e meccaniche erano profondamente diverse da quelle dellosso. Molto spesso avvenivano infezioni, non si adattavano ai cambiamenti fisiologici anzi li influenzavano negativamente. Allinterfaccia osso-protesi poteva avvenire un pericoloso riassorbimento osseo, in quanto la protesi metallica
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induceva il riassorbimento osseo e lattivit degli osteoclasti @(Brydone, Meek et al 2010). I pochi metalli che erano biocompatibili e che nonavevano effetti negativi erano il Titanio, Cobalto, Cromo e Molibdeno. Il problema dei materiali di prima generazione erano le insoddisfacenti propriet biologiche e il costo elevato. Gli impianti di seconda generazione sono oggi ancora in uso a differenza degli impianti precendenti questi sono progettati per integrarsi con losso circostante. Controllando la porosit a livello di fabbricazione possibile ridurre la quantit di materiale utilizzato e di diluirlo con altri materiali, La porosit un elemento importante per ladesione cellulare e la deposizione della matrice ossea. Gli impianti di metalli porosi permettono la crescita tessuto osseo allinterfaccia osso-protesi. E stato analizzata lattivit della fosfatasi alcalina allinterfaccia protesiosso e questa presente a livelli leggermente inferiori rispetto allosso sano @(Brydone, Meek et al 2010). Tuttavia questi materiali a livello Fig.2.15 Gli impianti e le impalcature di 3 generazione sono costituite da materiali bioattivi, biocompatibili e biodegradabili. (Sela Bab 2012) macroscopico sono comunque dei corpi estranei e con i recenti sviluppi delle tecnologia medica oggi si preferiscono materiali che oltre a essere bioattivi possano essere gradualmente riassorbiti e degradati dallorganismo, in modo da permettere la graduale sostituzione di questi con il tessuto osseo. Questi materiali rappresentano la terza generazione che attualmente impiegata come alternativa o complemento nei trapianti, o come struttura osteoconduttiva per il Tissue Engineering. I materiali possono essere costituiti da solfati e fosfati di calcio (-Tcp o Ha) che mimano la componente minerale dellosso, da biopolimeri che poi vengono degradati in monomeri presenti nel normale metabolismo biologico (poli-acido lattico, poli-acido glicolico, poli-caprolattone e i loro copolimeri), da macromolecole quali glicosamminoglicani e collagene che sono biopolimeri endogeni (Fig.2.15), oppure si pu optare per una combinazione di tutte queste categorie. Sebbene in alcuni casi il riassorbimento non completo, i materiali della terza generazione hanno il vantaggio di essere abbastanza economici, efficienti, disponibili in grandi quantit, e sono biocompatibili e metabolizzabili @(Sun, Liu et al 2011). Le impalcature possono essere ingegnerizzate con nanostrutture per contenere fattori osteoinduttivi @(Baker, Handorf et al 2009) e con i progressi del Tissue Engineering potranno anche contenere delle cellule ostogeniche @(Brydone, Meek et al 2010).
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2.10 Stabilit meccanica e il ruolo della stimolazione meccanica nella riparazione ossea.

La stabilit meccanica tramite luso di vari dispositivi bloccanti assume un ruolo cruciale nella terapia osteorigenerativa, specialmente nei casi complessi in cui sono presenti grossi danni scheletrici e la riduzione delle capacit osteorigenerative. Lambiente meccanico costituisce il quarto fattore del modello a diamante nella rigenerazione ossea, insieme allinterazione delle impalcature osteoconduttive, dei fattori di crescita osteoinduttivi, e delle cellule osteogenetiche. Prima della formazione del tessuto osseo definitivo nel sito di frattura si formano tessuti intermedi diversi. Lo stress meccanico promuove o inibisce la formazione dei tessuti di rigenerazione @(Dimitriou, Jones et al 2011). Per ogni tessuto intermedio, la sollecitazione che causa il fallimento nella guarigione il limite del carico meccanico tollerabile da quel tessuto. Differenti tipi di carico meccanico promuovono o inibiscono la formazione dei tessuti che si intercambiano durante la rigenerazione ossea. Laspetto meccanico nella riparazione delle ossa stato ulteriormente approfondito a livello cellulare @(Dimitriou, Jones et al 2011) Sono stati compiuti numerosi studi per capire gli effetti della sollecitazione meccanica nelle varie fasi della rigenerazione ossea. Allinizio della frattura lo stimolo meccanico promuove la formazione di tessuto calloso, ad ogni modo la quantit di tessuto calloso formato non sinonimo di stabilit. Nella fase successiva un ambiente meccanico meno rigido dava come risultato un prolungamento della fase di rigenerazione cartilaginea, comunque lossificazione intramembranosa sembrava poco dipendente dalla stabilit meccanica. Al contrario un ambiente pi rigido diminuisce la formazione del corpo calloso e del tessuto fibroso. Negli stadi avanzati della rigenerazione una minore stabilit meccanica inibisce la formazione del callo e compromette la rigidit. E stato inoltre dimostrato che le risposte cellulari in termini di proliferazione e differenziamento variano in base allintensit della sollecitazione e al fenotipo cellulare. I micromovimenti determinano stimolano una maggiore vascolarizzazione del corpo calloso, soprattutto vicino al periostio. Movimenti pi ampi diminuiscono sia il tasso di vascolarizzazione che il tasso di mineralizzazione e aumentano la quantit di tessuto fibroso nelle fasi rigenerative precoci @(Dimitriou, Jones et al 2011). La presenza di un ambiente meccanico stabile attraverso tutto il processo rigenerativo necessaria quando si usano metodi addizionali nella riparazione delle ossa. Una strumentazione ottimale e la preservazione del flusso sanguigno locale sono necessarie per supplementare e proteggere le impalcature o il materiale trapiantato permettendo una migliore incorporazione, vascolarizzazione e successivo rimodellamento @(Dimitriou, Jones et al 2011).
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2.11 Stimolazione sistemica della rigenerazione ossea.

E attualmente in fase valutazione una procedura terapeutica osteoinduttrice che prevede luso di fattori sistemici come lormone della crescita (GH) e lormone paratiroideo (PTH). Osservazioni correnti suggeriscono un ruolo positivo dellormone della crescita (GH) nella guarigione dalle fratture, tuttavia ci sono controversie sulla sicurezza e sulla dose ottimale quando somministrato per via sistemica. Luso di PTH tramite somministrazione intermittente, in trials clinici e su modelli animali, induce la formazione di osso trabecolare e compatto, aumentandone massa, resistenza meccanica e densit minerale, con un profilo di sicurezza abbastanza soddisfacente @(Dimitriou, Jones et al 2011). Due analoghi sintetici, PTH 1-83 e PTH1-84, sono gi in uso nella prassi clinica per il trattamento dellosteoporosi, ed attualmente in fase di valutazione la loro applicabilit anche come adiuvanti osteorigenerativi nei casi di fratture complicati e non-unioni @(Dimitriou, Jones et al 2011) Unanaloga valutazione in corso per le correnti terapie anti-riassorbimento che sono in uso nel trattamento dellosteoporosi per aumentare la densit minerale. I bifosfonati inibiscono il reclutamento, lattivit degli osteoclasti e ne inducono lapoptosi, mentre il ranelato di stronzio inibisce il riassorbimento osseo e ne promuove la deposizione. Il Denumusab un anticorpo monoclonale diretto contro il recettore RANKL, che inibisce losteoclastogenesi, e potrebbe avere effetti positivi sulla rigenerazione ossea oltre che sullosteoporosi @(Dimitriou, Jones et al 2011). E stato scoperto che la via di segnalazione WNT, oltre che nello sviluppo fetale, ha un ruolo positivo anche sulla rigenerazione ossea. Infatti le disfunzioni di questa via sono associate alle patologie osteogenetiche come losteoporosi e losteopenia. La stimolazione del segnale WNT o linibizione del suo antagonista, la sclerotina, potrebbe aumentare la rigenerazione ossea. Ci sono tuttavia dubbi sulle possibilit di carcinogenesi. Un altro approccio per la stimolazione sistemica della rigenerazione ossea avviene tramite luso degli agonisti dei recettori prostaglandinici EP2 ed EP4, che sono stati identificati come induttori dellanabolismo scheletrico nelle ossa. Nei modelli animali sono stati osservati risultati promettenti senza effetti collaterali. Questi recettori, dato il loro ruolo positivo nello stimolo dellanabolismo osseo, sono eccellenti candidati per le terapie dellosteoporosi e osteorigenerative. Nuovi trattamenti potrebbero emergere dallo studio delle malattie genetiche che comportano un incremento nel processo fisiologico dellossificazione. La fibrodisplasia ossificante progressiva una prova di come le alterazioni nelle vie di segnalazione osteogenetiche, quali le vie BMP, portino a un incremento sistemico della rigenerazione ossea @(Dimitriou, Jones et al 2011).
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2.12 Tissue Engineering.

Il Tissue Engineering un campo di ricerca interdisciplinare che mira a combinare i principi della biologia, dellingegneria, della fisica, e della medicina verso lo sviluppo in vitro di sostituti biologici in grado di ripristinare mantenere o migliorare le funzioni tissutali. Il settore si pone lobbiettivo di superare tutti i limiti delle terapie attuali, integrandole, e la sua applicazione di enorme potenziale. La strategia adottata per la creazione di nuovi tessuti si basa su tre punti chiave: 1) Cellule isolate o sostituti cellulari. Lobbiettivo manipolare solo quelle cellule che hanno la funzione desiderata, cos da poterle ingegnerizzare e manipolare in vitro prima della loro introduzione. Questo evita le complicazioni delle operazioni chirurgiche sebbene le cellule potrebbero perdere la loro funzione e scatenare reazioni immuni. 2) Sostanze tessuto inducenti. Questa strategia mira a utilizzare le vie di segnalazione per manipolare e riprogrammare le funzioni cellulari e tissutali. Il successo dipende dalla comprensione delle suddette vie e dallefficienza delle metodologie utilizzate per manipolarle. Nel dettaglio questo dipende dalla purificazione delle molecole segnale, dalla loro produzione su vasta scala e dalla progettazione dei vettori utilizzati per somministrare tali molecole nel posto e nel momento giusto @(Baker, Handorf et al 2009). 3) Impalcatura (cellule inserite superficialmente o internamente a delle matrici). Le matrici isolano le cellule dei sistemi chiusi permettendo le funzioni trofiche ma proteggendole dal sistema immune e mantenendo il trapianto. Nei sistemi aperti queste invece sono incorporate nel corpo. Le matrici devono essere designate in modo da essere biocompatibili. Inoltre devono permettere e promuovere eventuali funzioni cellulari dipendenti dal microambiente. Le reazioni immuni possono essere evitate ingegnerizzando e manipolando cellule autologhe @(Langer & Vacanti 1993) (Fig.2.16). E su questo protocollo che stato proposto lattuale approccio terapeutico nella rigenerazione ossea, al quale stato aggiunto il quarto fattore, lambiente meccanico, data la sua importanza nella biologia dellosso. Il Tissue Engineering del tessuto osseo basato sul paradigma che il differenziamento e le funzioni cellulari possano essere modulate dagli stessi fattori che operano durante la morfogenesi embriologica di questo tessuto. Per progettare un ambiente capace di supportare losteogenesi, le cellule osteoprogenitrici devono ricevere gli Fig.2.16 Approccio metodologico al Tissue Engineering nella terapia osteorigenerativa. (NUHS Tissue Engineering Research Programme Pagina Web)

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stimoli biofisici e biochimici con unimpostazione tridimensionale che permette e promuove le interazioni cellulari juxtacrine e cellula-matrice. La comprensione della complessit dei segnali fisici e molecolari osteomorfogenetici, determinati dai loro gradienti spaziali e temporali, rappresenta la sfida che il Tissue Engineering deve vincere per entrare nelle tecniche applicative cliniche e sperimentali. Oltre ai segnali molecolari e alla componente cellulare, limpalcatura un componente chiave del modello osseo in vitro. Questa fornisce una sagoma, un calco per il tessuto in via di sviluppo e influenza marcatamente il comportamento cellulare. Le propriet fondamentali dellimpalcatura ossea sono la forma e la distribuzione dei pori, la ruvidit superficiale, la presenza di siti dadesione cellulare, e la biomeccanica sia del materiale sia dellimpalcatura intera. La tecnologia permette lo sviluppo dimpalcature con pori larghi e interconnessi che permettono linsediamento cellulare e la deposizione della matrice ossea, con una superficie ruvida che promuove ladesione cellulare, costituite da materiali composti bioattivi e biocompatibili (collagene, glicosamminoglicani, HA e -TCP) che possiedono propriet meccaniche paragonabili a quelle dellosso. Altre caratteristiche importanti sono la struttura anisotropica, che permette e promuove la vascolarizzazione, e la modellabilit anatomica dellimpalcatura @(Marolt, Knezevic et al 2010). Laltro fattore chiave il sistema di coltura o il bioreattore. I bioreattori sono sviluppati per controllare il trasporto di ossigeno e nutrienti e per fornire stimoli biologici precisi nei vari punti dellimpalcatura. Inoltre la stimolazione biofisica applicata per ottenere la competenza meccanica sia nelle regioni ossee sia cartilaginee. I bioreattori possono fornire un ambiente fisiologico stabile tramite il ricambio e il controllo del mezzo di coltura. I Bioreattori possono fornire segnali biofisici rilevanti nello sviluppo in una condizione controllata nel tempo, come dimostrato dalleffetto delle correnti dei fluidi e dalle forze meccaniche sullosteogenesi in vitro. Alcuni degli stimoli biofisici dei bioreattori comprendono ad esempio pareti rotanti campi elettromagnetici pulsanti, costrutti vascolari artificiali che formano delle micro- e macrocorrenti allinterno dello impalcatura. Un bioreattore dovrebbe essere in gradi di coordinare stimoli biologici, fisiologici e meccanici in maniera controllata nello spazio e nel tempo per fornire uno stimolo preciso verso una determinata line cellulare allinterno dellimpalcatura @(Marolt, Knezevic et al 2010). Lutilit clinica e scientifica del Tissue Engineering dipende dalla capacit di dirigere il differenziamento cellulare verso il fenotipo desiderato con modalit definite e controllate nel tempo e nello spazio. Il controllo delle condizioni ambientali ottenuto tramite la progettazione dei bioreattori e delle impalcature pu guidare a nuove scoperte che delucidano linterazione fisica e molecolare nello sviluppo dellosso a partire dai vari tipi di cellule osteogenetiche. La comprensione dei processi di sviluppo potrebbe servire da feedback nellottimizzazione dei
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parametri necessari alla progettazione del trapianto e tramite luso dei trapianti ingegnerizzati si potrebbero testare modelli di sviluppo e di patologia @(Marolt, Knezevic et al 2010) (Fig2.17).

Fig.20 I bioreattori forniscono un ambiente simile a quello interno dellorganismo. Gli stimoli che possono essere trasmessi alle cellule tramite i bioreattori permettono di testare e simulare le funzioni e i processi di sviluppo dei tessuti. (Marolt, Knezevic et al 2010) Ad ogni modo questa tecnologia ha gi dato buoni risultati in numerosi test basati su modelli in vitro e in vivo sia su animali che umani. In uno studio stato testato il Tissue Engineering come procedura di rigenerazione delle ossa portanti. E stata creata una distrazione femorale di 25mm in un modello caprino. Gli esemplari divisi in due gruppi veninavano rispettivamente trattati con BMsc espanse su un impalcatura corallina o solo semplicemente con limpalcatura. Nel gruppo di controllo limpalcatura corallina mostrava segni di riassorbimento e di formazione fibrosa rispettivamente a 2 e a 4 mesi. Nel gruppo trattato con BMsc indotte al differenziamento in cellule osteogenetiche e espanse sullimpalcatura a 4 mesi i due monconi ossei erano riuniti e a 8 mesi il tessuto osseo era riformato. Il risultato pi interessante era la resistenza al carico e alla torsione del femore ingegnerizzato (1380 183N e 6.13 0.45 N*M/) con quello normale (1452 102N e 6.89 0.69 N*M/ @(Sun, Liu et al 2011). In un modello canino stato creato un difetto di 30mm in un segmento della mandibola. Nei due gruppi le terapie terapeutiche erano basate sullimpiego di Bmsc espanse su unimpalcatura di Tcp nel gruppo sperimentale e nel gruppo di controllo la terapia era basata solo sulluso di -Tcp. A 32 settimane dopo limpianto dellimpalcatura, analisi radiologiche e istologiche nel gruppo di controllo rivelavano la presenza prevalente di tessuto fibroso e di una minima quantit di tessuto osseo. Nel gruppo sperimentale invece dopo 32 settimane losso riformato nellimpianto era stato riformato con propriet biomeccaniche vicine a quelle dellosso sano, utilizzato come campione di controllo. Tuttavia limpalcatura non era stata completamente riassorbita, una percentuale compresa fra il 30% e il 40% era ancora presente nonostante la riformazione di tessuto osseo. In un trattamento terapeutico ideale si dovrebbe ottenere una velocit di riassorbimento dellimpalcatura uguale o prossima alla velocit di formazione ossea @(Sun, Liu et al 2011).
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Msc espanse su impalcature di HA sono state utilizzate con risultati soddisfacenti su tre persone. Il pazienti avevano difetti fra i 4 e i 7 cm e nelle ossa lunghe degli arti. Limpalcatura fu applicata dopo la fissazione meccanica dellosso da curare. In un primo controllo a 7 mesi di distanza dallimpianto fu osservata una buona integrazione, dopo i 13 e i 15 mesi era stata ottenuta sufficiente stabilit meccanica da poter rimuovere il supporto meccanico (Fig.2.18). I controlli effettuati fino a 7 anni dopo mostravano vascolarizzazione e integrazione dellimpianto. Tuttavia luso di HA rende difficile il rilevamento dellosso rigenerato, quindi deve essere sostituito o integrato con altri materiali prima che le impalcature possano entrare nella pratica clinica @(Quarto, Mastrogiacomo et al 2001). Anche in un'altra serie di trials clinici la stessa procedura aveva dato gli stesi risultati quando applicata in combinazione con lapparecchio di Ilizarov nella terapia osteorigenerativa di grossi difetti nella diafisi (Marcacci, Kon et al 2007) .

Fig.2.18 Uno studio pionieristico sullapplicazione del bone tissue enginnering nelluomo. Le immagini evidenziano le dimensioni del difetto osseo da recuperare, le condizioni post-chirurgiche, e lo stato dellosso dopo la rimozione del supporto meccanico. (Quarto, Mastrogiacomo et al 2001)

2.13Conclusioni:

I progressi metodologici e concettuali della biologia molecolare, cellulare e dei sistemi hanno permesso enormi progressi nella comprensione dei processi biologici complessi quali la rigenerazione ossea e la sua morfogenesi fetale. Questi progressi influenzano anche le nostre conoscenze sulla fisiologia e sulla biologia dello sviluppo, e di conseguenza ci permettono di sviluppare modelli sperimentali sulla patologia dellosso negli adulti e delle malformazioni congenite quali losteogenesi imperfetta e lacondroplasia, tanto per citare le pi comuni.

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Inoltre la formulazione o la revisione dei modelli patologici, fisiologici ed embriologici di cruciale importanza nella pratica terapeutica che cerca ove possibile di trovare delle cure definitive, oppure di migliorare la qualit della vita di chi affetto da condizioni di handicap che insorgono quando la funzione biologica del sistema scheletrico o dei suoi singoli componenti cruciali compromessa. Nonostante le nostre conoscenze attuali sulla terapia rigenerativa dellosso, manca una pratica terapeutica che sia in grado di sostituire completamente un elemento scheletrico difettoso. Allo stato attuale delle metodologie terapeutiche lunico approccio terapeutico dato dal recupero e dal ripristino degli elementi scheletrici gi esistenti. Lemergere del Tissue Engineering come nuovo settore di ricerca e i suoi primi promettenti risultati, sia sugli esseri umani sia sui modelli animali, fanno sperare che in un futuro prossimo questo limite terapeutico sia presto superato. Inoltre il Tissue Engineering potrebbe essere di enorme aiuto anche nella ricerca di base. Lo studio degli esseri viventi necessita di essere fatto percorrendo in entrambe le direzioni tutti i livelli strutturali che sono presenti in questi: dalle molecole agli organismi e dagli organismi alle molecole. Il Tissue Engineering potrebbe permettere di testare la formazione e la funzione di un tessuto, un organo e di un sistema a partire dai suoi sottocomponenti, oppure di scomporre i primi nel tentativo di cercare quei fattori sfuggevoli che compongono sistemi, organi, e tessuti ne determinano caratteristiche e propriet. La conferma di quanto ancora necessario comprendere ci data dalle differenze, spiegabili o ipotizzabili sulla base della teoria delle propriet emergenti, che mostrano le cellule isolate in un terreno di coltura rispetto alle cellule inserite in un contesto vivente. Inoltre lo studio dei modelli sperimentali in vivo, animali o esseri umani, ha delle difficolt tecniche e delle considerazioni etiche. A livello tecnico, sia nella ricerca di base sia nella ricerca biomedica, i miglioramenti che sono necessari derivano dalla necessit di approfondire ulteriormente le componenti molecolari, cellulari, strutturali e ambientali che operano nello sviluppo e nel funzionamento di un sistema. Nella ricerca biomedica inoltre necessario sviluppare un protocollo di controllo qualit in modo da sviluppare una pratica terapeutica sicura ed efficace, e in seguito cominciare ad effettuare trials clinici standardizzati per testare lapplicabilit del Tissue Engineering. Le ultime difficolt derivano in larga parte dalla coscienza e dalla conoscenza che si hanno nelle omologie e nelle differenze presenti a tutti i livelli organizzativi degli organismi viventi, e di come queste differenze analogie siano influenti sulla diversit fra individui diversi e specie diverse. Lo studio dei modelli animali e umani deve proseguire per verificare le eventuali omologie o differenze presenti allinterno dei livelli organizzativi degli esseri viventi. Il sistema di controllo qualit che si applica per verificare lefficacia e la pericolosit di un farmaco o un prodotto chimico deve tener conto di queste differenze. Non si pu trascurare questo aspetto alla luce delle responsabilit che ha la ricerca, di base o applicata, nel dare garanzie sulla salute delle
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persone e su un uso etico, lecito ed efficace dei modelli animali, soprattutto alla luce dei dubbi e delle recenti e polemiche riguardo allefficacia della sperimentazione animale come modello nei test di tossicit. La reale conclusione che emerge da quello che abbiamo chiaro e da quello che ancora non comprendiamo, che sebbene se non possibile subordinare il progresso della coscienza a quello della conoscenza, se si ferma il progresso di una si ferma o si rallenta il progresso dellaltra.

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