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Nefelometria La nefelometria una metodica ottica di analisi che permette di ricavare la quantit di sostanza oggetto di analisi misurando la radiazione

e diffusa per effetto Tyndall. Viene applicata per fasi disperse estremamente fini, di diametro dell'ordine di decine o centinaia di nanometri e presenta elevati livelli di sensibilit e, opportunamente standardizzata, pu essere anche molto precisa. Le misure nefelometriche necessitano che il raggio luminoso in uscita dalla soluzione in esame sia convogliato su un rivelatore posto ad angolo retto rispetto alla direzione del raggio incidente, in modo da raccogliere il massimo livello di energia. Da notare come invece nella metodica turbidimetrica, utilizzata per fasi disperse aventi maggior diametro e che quindi danno luogo a minore diffusione Tyndall, rispetto al predominante fenomeno di assorbimento della luce, la misurazione venga effettuata lungo la stessa direzione del raggio incidente. Gli strumenti comunemente utilizzati sono gli spettrofotometri equipaggiati anche per misure nefelometriche o appositi nefelometri. L'effetto Tyndall consiste essenzialmente nella diffusione di un'onda elettromagnetica a seguito di fenomeni di riflessione e rifrazione generati per interazione con sistemi colloidali costituiti da particelle aventi dimensione dell'ordine della lunghezza d'onda del raggio incidente. La diffusione di radiazione avviene lungo tutte le possibili direzioni spaziali, ma con differente livello di intensit. I principali fattori che influenzano l'effetto Tyndall sono:

la lunghezza d'onda del raggio di luce incidente, con l'intensit della luce diffusa che risulta inversamente proporzionale al quadrato della ; la dimensione media delle particelle disperse, con l'intensit della luce diffusa che cresce al crescere della dimensione media; la differenza fra gli indici di rifrazione della fase dispersa e di quella disperdente, con aumento di intensit di luce diffusa all'aumentare di tale differenza; la stabilit temporale del sistema colloidale.

Per intervalli di concentrazioni minori a 10-4 M la concentrazione della fase dispersa risulta proporzionale all'intensit della luce diffusa, mentre concentrazioni maggiori sono legate ad un aumento del fenomeno di assorbimento delle particelle disperse con conseguente perdita di linearit e sensibilit.

La legge di Raylegh lega l'intensit della luce diffusa al numero di particelle presenti in sospensione:

dove

I = intensit della luce diffusa; K = costante di proporzionalit; N = numero di particelle per unit di volume; V = volume delle particelle; d = distanza del rivelatore dalla cella contenente l'analita; = lunghezza d'onda del raggio di luce incidente; I0 = intensit del raggio di luce incidente.

Lavorando con un determinato strumento e in condizioni sperimentali tali da mantenere costante il volume V delle particelle e l'intensit I0 del raggio incidente, il secondo membro dell'equazione precedente permette di raggruppare tutti i termini considerabili costanti, introducendo un nuova costante globale K:

Le misure nefelometriche, a fronte della loro elevata sensibilit, sono condizionate da diversi fattori. I principali sono i seguenti: 1. dimensione delle particelle; 2. stabilit del sol; 3. forza ionica; 4. pH del mezzo; 5. presenza di sostanze interferenti (polimeri, colloidi, coloranti, ecc.). Il campo di applicazione della nefelometria spazia da determinazioni aspecifiche, come peraltro considerato a riguardo della turbidimetria, del parametro torbidit delle acque ovvero in biologia per lo studio di colture batteriche, a determinazione specifiche di tracce di ioni quali il cloruro e il solfato. Una determinazione ufficiale della SO3 contenuta nei cementi sfrutta una metodica nefelometrica. In ambito chimico clinico trova applicazione nella determinazione delle lipoproteine, delle immunoglobuline plasmatiche e di enzimi come amilasi e lipasi.

Scattering In fisica lo scattering (o diffusione) si riferisce ad un'ampia classe di fenomeni dove una o pi particelle vengono deflesse (ovvero cambiano traiettoria) per via della collisione con altre particelle. In ottica ed in astrofisica di solito il fenomeno dello scattering riferito alla dispersione della luce da parte di oggetti macroscopici (come gli asteroidi) o microscopici come il pulviscolo o gli atomi che formano un gas. Un esempio molto comune di scattering della luce dato dal colore blu del cielo: la luce (bianca) del sole incide sull'atmosfera terrestre la quale diffonde con pi facilit le frequenze pi alte (ovvero pi vicine all'ultravioletto); di conseguenza, mentre la luce bianca ci arriva direttamente se guardiamo dritti nel sole, la luce blu diffusa ci sembra provenire da tutte le direzioni. Un altro esempio tipico il colore bianco del latte o delle nuvole: in questo caso tutte le frequenze vengono diffuse uniformemente e, siccome il processo si ripete moltissime volte all'interno del mezzo, non pi riconoscibile la direzione di provenienza della luce ed il mezzo assume un colore bianco opaco. Il processo di scattering non include alcun tipo di assorbimento o emissione. Lo scattering Rayleigh Le equazioni che descrivono lo scattering sono molto complesse e, specialmente quando questo fenomeno si ripete molte volte, impossibili da risolvere esattamente nel caso generale. Una soluzione approssimata molto usata quella detta di Rayleigh: nel caso in cui le particelle responsabili dello scattering abbiano dimensioni molto minori della lunghezza d'onda della luce incidente la dispersione della luce isotropa ed il coefficiente di scattering dato dalla formula:

dove n il numero di centri di scattering presenti, d il loro diametro, m il loro indice di rifrazione e la lunghezza d'onda della luce incidente. Lo scattering di Mie Nel caso in cui le particelle responsabili dello scattering della luce siano sfere perfette esiste una soluzione matematicamente rigorosa per le equazioni che regolano lo scattering singolo detta soluzione di Mie dal nome dello scopritore Gustav Mie, che spieg anche l'effetto Tyndall

Effetto Tyndall L'effetto Tyndall un fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle, di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze d'onda della luce incidente, presenti in sistemi colloidali, nelle sospensioni o nelle emulsioni. Il nome proviene dallo scienziato irlandese John Tyndall (1820 - 1893) che per primo lo descrisse nel XIX secolo, senza per darne una trattazione completa. Fu il fisico Gustav Mie (1868 - 1957) che lo studi in maniera rigorosa nel 1908 (scattering di Mie). Questo effetto utilizzato per distinguere la dispersione della luce operata da sistemi di diversa natura, ovvero soluzioni, colloidi e sospensioni; lo studio dell'effetto Tyndall consente anche di elaborare dei metodi per determinare la massa e la dimensione di macromolecole o di fumo. Il fenomeno facilmente rilevabile nella vita di tutti i giorni: ad esempio, osservando dei raggi di luce quando attraversano sistemi in cui sono sospese o disperse delle particelle solide o liquide (ad esempio della polvere o delle gocce d'acqua). L'effetto Tyndall rilevabile anche in oftalmologia a seguito della comparsa patologica di corpuscolatura (cellule infiammatorie) dell'umore acqueo presente nella camera anteriore dell'occhio. L'intensit del fenomeno linearmente proporzionale alla concentrazione delle particelle sospese ed al cubo delle loro dimensioni. Pertanto l'effetto Tyndall di una sospensione colloidale di 1 ppm di particelle di 10 m di diametro sar 100 volte pi intenso di una sospensione con la medesima concentrazione di particelle grandi 1 m. Turbidimetria La turbidimetria una metodica ottica di analisi che permette di determinare, in qualit di parametro sia aspecifico che specifico, il livello di torbidit di un liquido sfruttando l'assorbimento e la riflessione di raggi luminosi di determinata lunghezza d'onda. La turbidimetria viene proficuamente applicata quando la dimensione delle particelle che provocano torbidit dell'ordine o superiore al micrometro, condizione nella quale l'assorbimento prevale sulla diffusione. Nel caso si abbia a che fare con particelle di pi piccole dimensioni, dell'ordine di decine o centinaia di nanometri, prevale l'effetto diffusivo e viene pertanto utilizzata una metodica differente chiamata nefelometria. Per descrivere esaurientemente la composizione di un liquido, non si pu prescindere dalle sostanze sospese, di cui si cerca di sapere la concentrazione e la natura.

Tali sostanze, che si trovano in sospensione, sono essenzialmente sostanze solide non solubili, come ossidi metallici, grassi, alghe e microrganismi. Si tratta in generale di particelle dell'ordine di 10-6 ... 10-7 m che, non essendo dissociate in ioni, non influenzano le caratteristiche chimiche del liquido, ma modificano anche notevolmente le sue caratteristiche fisiche. Quella pi appariscente, anche ad un semplice esame visivo, la torbidit. Si tratta di una caratteristica ottica, cio basata sulla propagazione della luce. Misure turbidimetriche Un raggio luminoso che attraversa un fluido subisce degli effetti dovuti all'interazione tra il raggio stesso e le sostanze disciolte. Tale interazione si traduce per una piccolissima parte in cessione di energia da parte della luce alla materia disciolta, con conseguente riscaldamento di questa, e per la maggior parte in una deviazione del raggio luminoso, ossia una modifica della sua traiettoria. La deviazione causata non solo dalla presenza di particelle opache, cio non trasparenti alla luce, ma anche dall' inomogeneit ottica provocata da particelle che, pur essendo trasparenti, hanno un indice di rifrazione diverso da quello del liquido in cui sono sospese. Per un complesso di fenomeni di rifrazione, riflessione e diffrazione, una parte dell'energia luminosa viene diffusa in direzioni differenti da quella del raggio incidente. Questa diffusione della luce (in lingua inglese light scattering) definita come un processo a causa del quale un raggio di luce, collidendo con una particella, modifica la propria direzione (ma non la sua lunghezza d'onda). Di conseguenza risulta attenuata l'intensit del raggio che procede nella direzione originaria. In definitiva la torbidit, ossia la presenza di particelle sospese, produce due effetti: 1. assorbimento di energia luminosa, 2. diffusione di energia luminosa. L'intensit luminosa di un raggio che attraversa un fluido torbido (senza deviare dalla sua direzione) subisce un progressivo indebolimento, che pu essere espresso mediante una funzione esponenziale:

dove Iu l'intensit luminosa uscente dal fluido, Ii l'intensit luminosa entrante nel fluido, d la distanza percorsa dal raggio luminoso e a il coefficiente di assorbimento.

Come si vede quando la torbidit nulla o quando il percorso del raggio luminoso nel fluido molto breve, risulta Iu = Ii. Data una determinata distanza d (prefissata costruttivamente nel turbidimetro), con la massima torbidit, cio con il massimo valore di a, si ottiene la minima intensit Iu in uscita. Graficamente, l'equazione esponenziale precedentemente vista si esprime con una retta se tracciata in scala logaritmica. chiaro che, se si presuppone, come logico, che il coefficiente di assorbimento sia proporzionale alla torbidit, occorrono particolari accorgimenti nella parte elettronica dell'apparecchiatura di misura, per ottenere un segnale lineare, ossia un'indicazione proporzionale alla torbidit stessa. Se si misura l'intensit luminosa del raggio emesso in direzione trasversale rispetto alla direzione di incidenza, si nota che essa aumenta con la torbidit del fluido, mentre uguale a zero con torbidit nulla. Per piccole torbidit, l'intensit della luce diffusa praticamente proporzionale alla torbidit stessa. Aumentando la torbidit, si manifesta un fenomeno di assorbimento dello stesso raggio diffuso, per cui, dopo aver raggiunto il valore massimo M, l'intensit comincia a diminuire progressivamente. Tuttavia, scegliendo adeguatamente la lunghezza del percorso del raggio diffuso nel liquido in esame, si pu far si che il massimo della curva corrisponda ad un valore di torbidit maggiore del valore di fondo scala desiderato. Che la torbidit cresca con l'aumentare della concentrazione delle sostanze sospese un dato evidente, che per tra le due grandezze sussista una relazione di proporzionalit andrebbe dimostrato. Anzitutto possiamo fare una considerazione preliminare, ed quella che, in base alla teoria ondulatoria della luce, su cui sono fondate le leggi che descrivono sia l'assorbimento che la diffusione, tali fenomeni assumono un grado particolarmente rilevante quando le dimensioni delle particelle che si trovano in sospensione hanno lo stesso ordine di grandezza della lunghezza d'onda del raggio luminoso usato nel turbidimetro Fattori influenzanti la misura turbidimetrica Da quanto detto, si deduce che le misure di torbidit sono influenzate, oltre che dalla concentrazione (espressa in mg/litro) delle sostanze sospese, da vari fattori, come: 1. la granulometria, ossia la grandezza delle particelle; 2. la lunghezza d'onda della luce incidente; 3. il colore e la forma delle particelle; 4. il colore del liquido;

5. l'indice di rifrazione delle particelle e del liquido; 6. il peso specifico delle particelle; nonch da caratteristiche strumentali, come: 1. la lunghezza del percorso del raggio luminoso nel liquido in esame; 2. la caratteristica spettrale di emissione della sorgente luminosa; 3. la caratteristica spettrale di sensibilit del fotodiodo; 4. l'ampiezza angolare del raggio, ossia il grado di focalizzazione dell'eventuale sistema ottico. Tutte queste variabili rendono impossibile correlare in modo univoco la concentrazione di sostanze sospese con la torbidit misurata Determinazione turbidimetrica di parametri specifici L'assorbimento di radiazione dovuto a torbidit, per concentrazioni minori a 10-5 M, segue la legge di Lambert-Beer. Il classico coefficiente di estinzione viene in questo caso sostituito da un altro coefficiente che tiene conto dei fattori che influenzano la misura turbidimetrica, legati al liquido alle particelle sospese, precedentemente elencati. Inoltre bisogna tenere conto che gi al valore di concentrazione 10-5 M possono cominciarsi ad avere perdite di sensibilit e linearit. Oltre che per la determinazione dei parametri aspecifici gi considerati, la turbidimetria viene sfruttata in ambito chimico per effettuare determinazioni di anioni quali Cl-, SO42- e PO43- dopo avere sfruttato la formazione del loro composto insolubile con il bario, cationi quali Ni2+ (con dimetilgliossima), Cu2+ (con ferrocianuro di potassio) e Cd2+ come solfuro. In chimica clinica determinazioni turbidimetriche riguardano il fibrinogeno, le proteine sieriche ed urinarie, enzimi quali l'amilasi e il lisozima. Dal punto di vista strumentale le misurazioni turbidimetriche vengono comunemente condotte tramite l'utilizzo di normali colorimetri e spettrofotometri. Per garantire elevata riproducibilit necessario stabilizzare la sospensione mediante l'aggiunta di colloidi protettori o sostanze quali la glicerina o il glicol etilenico, che agiscono sia aumentando la densit e viscosit della fase liquida sia influenzando le interazioni elettrostatiche. Fonti di rumore Ci sono molte sorgenti di "rumore" che possono disturbare le misure del sensore di torbidit. Queste includono bolle di gas, esposizione diretta alla

luce del sole, riflessi dalla superficie, rumore idrodinamico e interferenze elettriche. Eventuali bolle di gas nella colonna d'acqua, avendo un indice di rifrazione differente da quello del mezzo, possono riflettere la luce emessa dalla sonda comportandosi come particelle in sospensione, determinando un incremento del dato in uscita del sensore. Le azioni da compiere per minimizzarne l'influenza includono incrementare la profondit del sensore, dato che la presenza di bolle superiore in superficie e posizionare la sonda lontana da ostacoli che possono causarne la formazione. La luce del sole diretta pu causare un incremento dell'uscita del foto ricettore: ci viene detto picco da luce diretta ed massimo intorno a mezzogiorno. Al fine di ridurre l'impatto della luce del sole bene non posizionare lo strumento direttamente esposto al sole e rispettare una certa profondit minima. La luce emessa dal turbidimetro pu essere riflessa dalla superficie dell'acqua e ci pu determinare un incremento del dato in uscita dello strumento. Ancora una volta un buon metodo per ridurre questo effetto posizionare la sonda al di sotto di una profondit minima. Il rumore idrodinamico il risultato del moto turbolento dei sedimenti intorno al sensore che pu causare una concentrazione di particolato superiore a quella effettiva del liquido. Dato che il volume campionato dal sensore dipende da quanto a fondo il fascio di luce penetra nell'acqua, incrementi e fluttuazioni della concentrazione dei sedimenti causano variazioni del volume campionato e ci porta ad errori nella misura. Per compensare questo effetto il segnale di torbidit deve essere riportato come valore medio, segnalando poi un valore stimato della variazione.