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Corso di Fisica Medica

Appunti sul metabolismo cerebrale


Federico Giove

Anno accademico 2009/2010

Indice
1 Il metabolismo cerebrale 1.1 Uno sguardo allanatomia del cervello . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1 I neuroni e le cellule gliali . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2 La produzione cellulare di energia . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1 La glicolisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.2 Il ciclo di Krebs e la catena respiratoria . . . . . . . . . . 1.3 Le problematiche sul metabolismo in fase dattivazione neuronale 1.3.1 Il consumo denergia nella conduzione nervosa . . . . . . 1.3.2 I modelli proposti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliograa 5 5 9 12 14 18 22 22 26 49

. . . . . . . .

Capitolo 1 Il metabolismo cerebrale


caratterizzazione anatomica del cervello, con particolare attenzione alle implicazioni funzionali delle strutture legate alla percezione visiva; in seguito esamineremo le popolazioni cellulari, specicamente neuroni e cellule gliali, direttamente o indirettamente coinvolte nei meccanismi di attivazione nervosa e sede dei fenomeni metabolici che abbiamo cercato di chiarire col nostro esperimento. Nella parte centrale del capitolo descriveremo ad un livello sufcientemente approfondito i meccanismi di base tramite cui le cellule si procurano lenergia necessaria al sostentamento delle loro funzioni, ed in particolare approfondiremo il metabolismo aerobico ed anaerobico del glucosio e la relativa regolazione. Si tratta di una parte di non semplice lettura per chi non dotato di speciche conoscenze biochimiche, ma indispensabile per la reale comprensione della tematica cui abbiamo cercato di contribuire con lesperimento allorigine di questa tesi. Inne riassumeremo lo stato delle conoscenze odierne sul consumo denergia durante lattivazione nervosa e le problematiche di base sul tipo di metabolismo sfruttato, descrivendone le caratteristiche (note e ipotizzate) ed i tentativi di modellizzazione compiuti negli ultimi ventanni, con particolare riguardo al modello proposto da P. J. Magistretti e L. Pellerin (la cosiddetta navetta del lattato), cui ci riferiremo ampiamente nellambito delle discussioni sui nostri risultati.

1.1

Uno sguardo allanatomia del cervello

Fino al XVIII secolo si riteneva che il cervello avesse unicamente funzioni ghiandolari; solo in seguito allo sviluppo delle moderne tecniche dindagine si riusciti a valutarne la complessit morfologica e di conseguenza la funzione. Il cervello costituisce, assieme al midollo spinale, il sistema nervoso centrale, ed diviso in cinque parti principali (g. 1.1) [1]:

bulbo: responsabile di funzioni come digestione, respirazione ecc.;


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ponte e cervelletto: il primo trasmette informazioni sul movimento dagli


emisferi al cervelletto, il secondo modula i movimenti ed implicato nellabilit manuale;

mesencefalo: controlla funzioni sensitive e motorie, fra cui la coordinazione


e i movimenti oculari;

diencefalo: composto da talamo e ipotalamo, analizza preliminarmente


molte informazioni che raggiungono la corteccia e regola il sistema endocrino;

emisferi cerebrali: comprendono la corteccia (divisa in lobi da profonde fessurazioni e responsabile delle maggiori attivit mentali, cognitive e sensoriali) e tre strutture profonde: gangli basali, ippocampo e amigdala, responsabili rispettivamente di regolazione motoria, di alcuni aspetti della memoria e della regolazione del sistema endocrino in relazione agli stati emotivi.

Figura 1.1: il sistema nervoso centrale (da [1]). Una variet di metodi sperimentali ha permesso nel corso del tempo di assegnare compiti specici alle diverse zone del cervello1: la specializzazione funzionale delle regioni cerebrali viene oggi accettata come un punto fermo delle neuroscienze.
La prima scoperta risale al 1861, quando P. P. Broca descrisse un paziente incapace di parlare, ma privo di qualsiasi altro handicap; lautopsia rivelo un danno nella parte posteriore sinistra del lobo frontale, oggi detta area di Broca, grazie alla quale venne localizzato il centro del linguaggio.
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Di seguito ci occuperemo specicamente soltanto della corteccia visiva primaria2 , in quanto questa larea stimolata nel corso del nostro esperimento. La corteccia visiva La corteccia visiva primaria situata nel lobo occipitale del cervello, attorno alla scissura calcarina (g. 1.2). Il resto del lobo occipitale comprende la corteccia visiva associativa, responsabile dellelaborazione a pi alto livello delle informazioni visive.

Figura 1.2: localizzazione della corteccia visiva primaria (da [1]). La corteccia visiva primaria nelluomo spessa circa 2 mm ed formata da sei strati sovrapposti di cellule (identicati con i numeri romani da I a VI) chiaramente distinguibili per la diversa tipologia e densit cellulare, e funzionalmente interconnessi in modo molto complesso nella trasmissione e nellelaborazione seriale dellinformazione visiva. Oltre a questa organizzazione per strati, si possono identicare tre tipi di sottili strutture verticali che risultano funzionalmente distinte, in quanto elaborano in parallelo diverse categorie dinformazione [1, 2]: 1) Colonne di dominanza oculare: hanno un lato che pu raggiungere gli 0.5 mm, sono disposte in modo alternato ed elaborano separatamente le immagini provenienti dalluno o dallaltro occhio. Sono importanti nella visione binoculare.
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Nota anche come area 17, secondo la classicazione di Broadmann, o corteccia V1.

Figura 1.3: schema dunipercolonna; sono presenti colonne dorientamento specializzate in ogni direzione (indicata in gura dal trattino sulla parte superiore della colonna) per ciascuno dei due occhi (colonne di dominanza oculare controlaterale e ipsilaterale), intervallate da alcuni blob, sensibili ai colori (da [1]). 2) Colonne di orientamento: hanno lato compreso fra i 30 e 100 m e si estendono per tutto lo spessore della corteccia visiva; riconoscono la direzione di linee rette e sono disposte ordinatamente secondo la direzione riconosciuta; sono implicate nella prima fase delanalisi cerebrale della visione, che si pensa consista nella scomposizione delle forme degli oggetti e in particolare dei loro bordi in brevi tratti rettilinei di uguale orientamento. Queste colonne intersecano quelle di dominanza oculare (vedi g. 1.3). 3) Blob: sono cilindri di diametro no a 0.5 mm che attraversano trasversalmente soprattutto gli strati II e III e non presentano alcuna sensibilit alle forme, ma viceversa riconoscono i colori. Studi istochimici hanno dimostrato che i blob sono particolarmente ricchi dellenzima citocromo ossidasi, quindi si ipotizza che abbiano un metabolismo aerobico particolarmente attivo3 (vedi par. 1.2.2) [4, 3]. Si pensa che un gruppo di strutture adiacenti dei tre tipi costituisca una macrostruttura funzionale denominata ipercolonna (g. 1.3), dedicata allanalisi di forme e colori provenienti da singole zone del campo visivo di ambedue gli occhi; ogni ipercolonna si estende per circa 1 mm2 , e questo schema si ripete regolarmente sulla corteccia V1 no a garantire la copertura dellintero campo visivo.

Va tuttavia notato che anche il IV strato di V1, in cui non sono presenti blob, ricco di citocromo ossidasi in alcune sue sottoregioni [3], dunque non appare corretto identicare le zone di alta attivit metabolica aerobica esclusivamente con i blob.

1.1.1 I neuroni e le cellule gliali


In tutto il sistema nervoso sono presenti due tipi principali di cellule: i neuroni, che costituiscono la parte attiva del cervello, essendo direttamente coinvolti nella generazione e nella trasmissione dellimpulso nervoso, e le cellule gliali. I neuroni si possono classicare in base alla loro funzione in tre categorie: i neuroni sensitivi, specializzati nella captazione dei segnali esterni e nella trasmissione di tali segnali al sistema nervoso centrale; i neuroni motori, che si occupano del comando dei muscoli e del sistema ghiandolare; e inne gli interneuroni, che connettono diverse regioni del sistema nervoso; sono questi i neuroni di gran lunga pi numerosi. I neuroni hanno una morfologia complessa, con parti anatomiche distinte deputate a diversi compiti funzionali. Essi sono costituiti da un Figura 1.4: una sinapsi; il tercorpo cellulare centrale, da una lunga appendice minale assonico (in alto) (assone) e da vari processi lamentosi (dendriti). ricco di vescicole (da [5]). Il corpo cellulare, le cui dimensioni sono comprese fra 5 e 100 m, contiene il nucleo ed specializzato nella sintesi e nella degradazione delle macromolecole e di interi organelli, come i mitocondri. I ribosomi, che compiono la sintesi proteica, sono raggruppati nei cosiddetti corpi di Nissl e aderiscono ad una rete di tre tipi di proteine lamentose estesa per tutto il neurone, che costituisce il citoscheletro. Tale apparato, oltre ai compiti strutturali e funzionali comuni a tutte le cellule eucariotiche, implicato nel trasporto attivo di molecole e organelli lungo lassone, che privo di ribosomi. Lassone unappendice cilindrica che emerge bruscamente dal corpo cellulare; ha dimensioni molto variabili: normalmente lungo circa 1 mm (dimensione comunque rispettabile per una cellula) ma pu anche superare il metro nel caso di assoni che si estendono dallencefalo al midollo spinale. Esso termina a distanza ravvicinata, ma non a contatto, con i dendriti dun altro neurone, formando una regione chiamata sinapsi; nei vertebrati gli assoni sono avvolti in una membrana detta mielina4 che rende pi rapido il passaggio dellimpulso nervoso. Questultimo innescato da un complesso insieme di fenomeni elettrici e chimici, e va sotto il nome di potenziale dazione; esso consiste in unonda di depolarizzazione e
La mielina presente in segmenti non pi lunghi di 1 mm, intervallati da brevi sezioni dette nodi di Ranvier, in cui lassone non ricoperto.
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successiva, rapida ripolarizzazione della membrana assonica ottenuta tramite lalterazione della permeabilit della membrana stessa ad alcuni ioni5 . Il pervenire alla sinapsi del potenziale dazione provoca il rilascio nello spazio intersinaptico di vari neurotrasmettitori, che diffondono verso la membrana postsinaptica del neurone adiacente. Lassorbimento dei neurotrasmettitori ha un effetto diretto (di stimolo o inibizione) sullo sviluppo del potenziale dazione nel neurone. I neuroni hanno quindi un verso funzionale, in quanto i segnali elettrici scorrono sempre dai dendriti allassone attraverso il corpo cellulare. I dendriti, contrariamente agli assoni, appaiono come estensioni appuntite del corpo cellulare, e di questo conservano la composizione citoplasmatica, seppure arricchita in mitocondri, specie vicino alle sinapsi. Le cellule gliali costituiscono il 50% del volume cerebrale, pur essendo almeno 10 volte pi numerose dei neuroni; esaminando al microscopio il tessuto cerebrale si nota che le cellule gliali sono strettamente frammiste ai neuroni, colmando quasi ogni spazio fra un neurone e laltro; anche se si potrebbe pensare che siano cellule esclusivamente riempitive, in realt svolgono pi di un compito funzionale. Nel sistema nervoso centrale ne esistono vari tipi: gli oligodendrociti (g. 1.5), che rivestono con uno strato mielinico gli assoni pi grandi6, le cellule ependimali, che formano lepitelio che secerne il liquido cerebrospinale, le cellule microgliali, implicate nel recupero dei danni cerebrali, e inne gli astrociti, cos chiamati a causa della loro forma (g. 1.6). Gli astrociti si dividono in due categorie: astrociti protoplasmatici e brosi, che si trovano rispettivamente nella materia grigia e bianca; nonostante laspetto differente, la struttura e le funzioni sono simili: il citoscheletro ben sviluppato indica chiaramente la loro funzione strutturale di sostegno meccanico per i neuroni.

Figura 1.5: un oligodendrocita che mielina due assoni (da [5]).

In particolare ioni Na+ e K+ , la cui concentrazione in ambiente extracellulare e intracellulare diversa e ben lontana dallequilibrio. 6 Ogni oligodendrocita ha in genere pi processi che avvolgono neuroni distinti.
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Gli astrociti possiedono numerosi lamenti (processi) dotati di un piede allargato che aderisce ai capillari (costituendo parte della BBB7 (g. 1.7) o alla supercie neuronale, in particolare ai dendriti, alla regione sinaptica e ai nodi di Ranvier (vedi nota 4). Molte zone del neurone sono quindi tappezzate di piedi astrocitari, e tale caratteristica suggerisce un intervento attivo degli astrociti nel metabolismo cerebrale: probabilmente gli astrociti contribuiscono alla regolazione delle concentrazioni extracellulari di ioni8 e di vari altri composti, costituendo una sorta di sistema tampone. Tale idea stata sviluppata ed estesa da L. Pellerin e P. J. Magistretti: il modello da loro proposto sar analizzato estesamente a partire dal paragrafo 1.3.2. Figura 1.6: il citoscheletro di alcuni astrociti (da [5]).

Figura 1.7: un astrocita broso nel cervelletto di un ratto; si pu notare il processo (contenente un evidentissimo fascio broso) che raggiunge il vaso sanguigno e lo avviluppa parzialmente con lestensione del piede (da [5]).

Barriera ematoencefalica In particolare ben documentata la capacit astrocitaria di assumere leccesso di K+ eventualmente provocato dalla ripetuta trasmissione di potenziali dazione e di drenarla verso i vasi, dove fra laltro si esplica la propriet vasodilatatrice del potassio [1].
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1.2

La produzione cellulare di energia

La caratterizzazione dei meccanismi tramite i quali avviene lestrazione e limmagazzinamento dellenergia da parte degli esseri viventi uno dei maggiori scopi della biochimica, e come tale costituisce un campo eccezionalmente vasto; in questo contesto riassumeremo alcuni fatti principali, specialmente riguardanti il metabolismo del glucosio, che pi sono importanti nello studio della funzionalit cerebrale. Anzitutto notiamo che i meccanismi di produzione dellenergia in genere non avvengono in un solo step, ma prevedono molti passaggi successivi che si organizzano in vie metaboliche; in questo modo si ottengono tre vantaggi:

parte delle reazioni e degli enzimi sono comuni a pi metabolismi, con evidente risparmio metabolico;

ciascuna reazione avviene con minor |G0 |, in modo che leventuale accoppiamento con idrolisi/sintesi di ATP risulti pi efciente;

la distribuzione degli intermedi pu essere ottimizzata attraverso la modulazione di ciascun passaggio. Una reazione chimica pu avvenire spontaneamente solo se la sua variazione di energia libera G negativa; daltra parte la biosintesi delle molecole necessarie al sostentamento della vita cellulare9 e il trasporto attivo di molecole e di ioni sono processi endoergodici. Di conseguenza, necessario accoppiare ciascuna reazione con almeno unaltra reazione il cui G, negativo, fornisca lenergia Figura 1.8: lATP; i suoi costituenti sonecessaria: tale energia viene fornita in no il nucleotide adenina (in azzurro), modo pressoch universale dallidrolisi di il monosaccaride ribosio (in nero) ed adenosina trifosfato (ATP, g. 1.8)10 . In ununit trifosfato (in rosso) (da [6]). modo simmetrico la produzione di ATP pu avvenire (negli animali) solo grazie alla demolizione di molecole assunte con la
Linsieme di tali biosintesi chiamato anabolismo, viceversa linsieme dei processi degradativi che comportano produzione di energia detto catabolismo. 10 Esistono altri composti ricchi di energia, usati in speciche reazioni metaboliche e in genere convertibili allequilibrio con ATP: per esempio gli altri nucleosidi trifosfati (CTP, UTP, GTP), la creatina fosfato, lacetil coenzima A.
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dieta: in altri termini lATP costituisce la moneta comune di scambio fra tutti i metabolismi. I legami fosfoanidridici dellATP liberano, nella loro idrolisi, una notevole quantit di energia11 :

AT P + H2 O ADP + Pi + H +

G0 = 7.3 kcal/mol.

Questa reazione ha la funzione di donatore immediato di energia libera ed avviene continuamente e con estrema rapidit nellorganismo: il turnover dellATP cos veloce che un uomo ne consuma mediamente 40 kg al giorno, di conseguenza altrettanto rapidi ed efcienti devono essere i meccanismi di produzione. La sintesi dellATP pu avvenire a spese della demolizione di zuccheri, proteine o grassi; noi ci occuperemo esclusivamente del metabolismo del glucosio. Il glucosio (g. 1.9) un aldoso a sei atomi di carbonio estremamente frequente come tale o come costituente di oligo- o polisaccaridi (saccarosio, lattosio, amido, glicogeno, cellulosa) che forma agevolmente con legami glicosidici. Esso estremamente solubile in acqua ed dotato (nella forma aperta) di propriet riducenti; la sua ossidazione (pi o meno completa) unimportantissima fonte di energia per tutti gli esseri viventi. Le cellule animali conservano il glucosio sotto forma di glicogeno, che unestesa e ramicata catena di residui di questo monosaccaride.

Figura 1.9: il glucosio nelle sue forme a catena aperta e anulare (da [6]). opportuno accennare anche alla funzione del NAD+ (nicotinamide adenin dinucleotide). Si tratta di una molecola composta da due basi nucleotidiche unite da un ponte difosfato; il principale accettore di elettroni nelle ossidoriduzioni di molecole energetiche, infatti in grado di accettare un protone e due elettroni, trasformandosi cos nella sua forma ridotta, indicata con NADH. un substrato indispensabile a numerosi enzimi coinvolti in metabolismi energetici, nei quali viene
Ricordiamo che con la scrittura G0 si intende la variazione di energia libera nel caso di concentrazioni unimolari dei reagenti e in condizioni ambientali standard, che sono spesso molto diverse da quelle cellulari: per esempio negli eritrociti lidrolisi di ATP libera circa 12 kcal/mol.
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anche usato per immagazzinare potere riducente, da sfruttare in seguito per la sintesi di ATP; dunque importante che nessun metabolismo lo consumi interamente, pena larresto di moltissime reazioni enzimatiche.

1.2.1 La glicolisi
Col termine glicolisi si indica la via metabolica che porta dal glucosio al piruvato, con produzione di 2 ATP per ogni glucosio processato, senza consumo di ossigeno12 . Complessivamente la glicolisi comporta dieci reazioni, ciascuna catalizzata da uno specico enzima; la stechiometria della reazione :

Glc + 2Pi + 2ADP + 2NAD+ 2Pyr + 2AT P + 2NADH + 2H + + 2H2 O

Alcuni autori distinguono fra glicolisi aerobica ed anaerobica, ma non v uniformit di vedute sul signicato di queste espressioni, che daltra parte si riferiscono comunque allunica via metabolica che porta da glucosio a piruvato.

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I vari passaggi sono illustrati in gura 1.10; notiamo in particolare che la resa netta complessiva di 2 ATP conseguenza del consumo di 2 ATP, sfruttati nelle prime reazioni per attivare il glucosio, e della produzione di 4 ATP (due per ciascun trioso prodotto dallaldolasi). La maggior parte delle reazioni avviene pressoch allequilibrio e il procedere della demolizione determinato dalla rapida scomparsa dei prodotti; tre reazioni invece avvengono fuori dallequilibrio e sono quelle regolate. La prima regolazione avviene sulla reazione iniziale, catalizzata dallesochinasi, che porta da glucosio a glucosio 6fosfato; pur comportando lidrolisi di un ATP tale passaggio non fortemente regolato, visto che comune a pi metabolismi13 che consumano glucosio 6-fosfato. Lunica regolazione logicamente presente dunque linibizione diretta da prodotto: lenzima rallenta la sua azione in presenza di concentrazioni crescenti di glucosio 6-fosfato. La seconda tappa irreversibile la pi Figura 1.10: le tappe della glicolisi; a fortemente regolata di tutta la glicolisi; lenanco di ciascuna reazione indicato zima coinvolto la fosfofruttochinasi (PFK) lenzima coinvolto (da [6]). che inibita da ATP, citrato e ioni H+ e stimolata da AMP e (nel fegato) da fruttosio 2,6-bisfosfato; linibizione da ATP e H+ una semplice inibizione da prodotto di tipo feedback, il citrato si forma durante il ciclo di Krebs (che nel metabolismo aerobico segue la glicolisi, vedi paragrafo 1.2.2) e la sua abbondanza indica che il ciclo bloccato; viceversa la presenza di AMP indice di scarsa carica energetica14 e dunque di necessit di accelerare i processi catabolici. Leffetto di stimolo del fruttosio 2,6-bisfosfato negli epatociti richiede maggiore attenzione per la sua complessit e le sue implicazioni: il fruttosio 2,6-bisfosfato si forma a partire dal glucosio 6-fosfato ad opera della fosfofruttochinasi 2 (PFK2); lo
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Citiamo ad esempio la via del pentoso fosfato e la sintesi del glicogeno.


2 La carica energetica cellulare denita come [AT P]+[ADP]+[AMP] .

[AT P]+ 1 [ADP]

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stesso enzima catalizza, grazie ad un diverso sito, il passaggio inverso da fruttosio 2,6-bisfosfato a fruttosio 6-fosfato15 : le due opposte attivit sono reciprocamente regolate dalla fosforilazione o defosforilazione di un residuo di serina, che a sua volta avviene come risposta ad un messaggio ormonale. In particolare lormone glucagone viene secreto in caso di carenza di glucosio, ed dunque un messaggero di scarsit di substrato per la glicolisi. Tale ormone viene legato da specici recettori presenti sulla membrana delle cellule epatiche, che trasmettono il messaggio ad unadiacente proteina G, che a sua volta agisce sullenzima adenilato ciclasi che catalizza la trasformazione di ATP in AMP ciclico (cAMP) e pirofosfato. Il cAMP ha un ruolo regolatore anche nei batteri ed evidente la sua lunga storia evolutiva come molecola regolatrice, in particolare come segnale di carenza di nutrienti; qui interviene attivando una proteina chinasi A che fra laltro16 fosforila la PFK2, provocando cos il consumo del fruttosio 2,6-bisfosfato e di conseguenza la mancata stimolazione della glicolisi nel fegato: in altri termini in risposta alla mancanza di glucosio il fegato rallenta la glicolisi, come ovvio se si considera il ruolo di magazzino di questo organo. Altri messaggi ormonali possono agire in modo opposto: ladrenalina, secreta sotto sforzo, ha recettori nelle cellule muscolari dove, con meccanismo analogo a quello visto, stimola lattivit chinasica dun isoenzima muscolare della PFK2, provocando la formazione di fruttosio 2,6-bisfosfato e dunque la stimolazione della glicolisi, come richiesto in un muscolo in attivit. La terza reazione irreversibile e regolata lultima della glicolisi, il passaggio da fosfoenolpiruvato a piruvato. Lenzima associato, piruvato chinasi, stimolato da fruttosio 1,6-bisfosfato (un precursore) e inibito dai prodotti ATP e alanina17 . Il destino del piruvato La glicolisi non pu terminare con la produzione del piruvato, infatti ci determinerebbe un accumulo di NADH e una concomitante carenza di NAD+ , dunque il piruvato viene ulteriormente elaborato e pu seguire tre vie (vedi g. 1.11):

pu passare ad acetaldeide e inne ad etanolo, con consumo di 2 H+ e 1 NADH e produzione di 1 NAD+ e 1 CO2 ; pu essere ridotto a lattato con consumo di 1 H+ e 1 NADH e produzione di 1 NAD+ ;
La doppia funzione, di chinasi e fosfatasi, ha suggerito per la PFK2 il nome di enzima tandem. Questo enzima interviene in vari altri modi nel metabolismo energetico: infatti inibisce la sintesi del glicogeno fosforilando la glicogeno sintasi e viceversa ne stimola la scissione fosforilando (mediante lazione dun ulteriore enzima) la glicogeno fosforilasi. 17 Lalanina si forma per transaminazione dal piruvato.
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pu trasferirsi nei mitocondri grazie ad una specica proteina carrier di membrana e fondere col CoA dando origine ad acetil CoA, con consumo di 1 NAD+ e produzione di 1 NADH e 1 CO2 ; tale passaggio preludio al ciclo di Krebs che porta alla completa ossidazione dei prodotti della glicolisi.

Figura 1.11: epiloghi della glicolisi (da [6]). Il catabolismo anaerobico del glucosio prende il nome di fermentazione (rispettivamente alcolica o lattica, secondo il prodotto nale), e molti organismi (per esempio i lieviti) la usano come esclusivo metabolismo energetico. Lefcienza della glicolisi elevata: in condizioni standard il passaggio da glucosio a lattato libera 47 kcal/mol, mentre la sintesi dei 2 ATP prodotti richiede 15 kcal/mol, di conseguenza il rendimento energetico di circa il 30%, valore che cresce molto in condizioni cellulari. Naturalmente il lattato (come del resto lalcool etilico) contiene ancora una notevole quantit di energia, dunque la sua eventuale eliminazione come scarto si traduce in una scarsa utilizzazione dei nutrienti. Molti organismi hanno sviluppato un metabolismo aerobico, che sfrutta lossigeno atmosferico come accettore ultimo di elettroni; questi organismi possono talora utilizzare la sola glicolisi come fonte di ATP, per esempio nei muscoli sotto intenso sforzo, dove lafusso di ossigeno non sufciente a ossidare completamente il piruvato 17

prodottosi; in tal caso in genere il lattato non va sprecato, ma viene immesso nel circolo sanguigno e di qui penetra nel fegato, dove tramite la gluconeogenesi viene ritrasformato in glucosio (Linsieme di glicolisi nei muscoli e gluconeogenesi nel fegato chiamato ciclo di Cori). Naturalmente questo ciclo comporta delle perdite (la gluconeogenesi richiede 4 ATP e 2 GTP per ogni glucosio prodotto, contro i 2 ATP/glucosio generati dalla glicolisi), ma permette di conservare la grande carica energetica contenuta nel lattato, in modo da poterla sfruttare aerobicamente in seguito. Centriamo lattenzione sulla reazione nale della fermentazione lattica: la riduzione del piruvato a lattato, catalizzata dalla lattato deidrogenasi (LDH). La reazione avviene praticamente allequilibrio, dunque la sua direzione dipende largamente dalla concentrazione dei reagenti (lattato, piruvato, NAD+ , NADH e H+ ) secondo la ben nota relazione

G = G0 + RT ln

[prodotti] [reagenti]

Lenzima esiste in realt in varie forme: si tratta di un tetramero composto da subunit di due tipi, con massa di 35 kd: la subunit H, la quale pi presente nel cuore, e la subunit M che si trova maggiormente nei muscoli scheletrici e nel fegato [6]. Le subunit si associano in modo da formare 5 isoenzimi diversi, numerati da LDH1 a LDH518 , che hanno propriet catalitiche simili, ma differiscono in due fattori dipendenti dalle subunit:

Gli isozimi con prevalenza di subunit H hanno una maggiore afnit per i
substrati principali (lattato o piruvato): in particolare la LDH1 (H4 ) ha una KM per il lattato pari a 7.5 mM contro gli 11 mM della LDH5 (M4 ), ed una KM per il piruvato di 0.05 mM contro gli 0.2 mM della LDH519 [7, 8];

LLDH1 viene inibito allostericamente dal prodotto piruvato in misura maggiore della LDH5 (Ki pari rispettivamente a 0.18 mM e 0.28 mM) [6, 7, 8].

1.2.2 Il ciclo di Krebs e la catena respiratoria

La composizione degli isoenzimi rispettivamente H4 , H3 M, H2 M2 , HM3 , M4 . Ricordiamo che la costante di Michaelis correlata allinverso dellafnit dellenzima per il substrato.
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Il contenuto energetico del glucosio pu essere sfruttato interamente mediante lossidazione aerobica: in seguito allossidazione dei prodotti derivanti dalla demolizione completa di un glucosio si ottengono 34 ATP20 che vanno a sommarsi ai 2 ATP generati durante la glicolisi per una resa complessiva teorica di 36 ATP21 . Il metabolismo aerobico comporta due blocchi di reazioni: nella fase iniziale lacetil CoA prodotto dalla decarbossilazione del piruvato condensa con ossalacetato e forma citrato, entrando cos nel ciclo di Krebs; in una seconda fase tutte le molecole di NADH prodotte vengono ossidate a NAD+ nella catena respiratoria, con 22 Figura 1.12: immagine al microscopio elet- rilascio di ATP . Il ciclo di Krebs, detto anche citronico (a) e schema (b) di un mitocondrio; clo dellacido citrico o degli acidi trilorganello misura in media 0.5 2 m. (da carbossilici23, avviene allinterno del[6]). la matrice mitocondriale (g. 1.12) e comporta nel suo complesso la reazione:

CH3CO SCoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + H2 O 2CO2 + 3NADH + FADH2 + GT P + 2H + +CoA


In gura 1.13 rappresentato lintero ciclo: un complesso C4 (lossalacetato) condensa con lacetile (C2 ) dando origine al citrato, un acido tricarbossilico C6 ; questo composto subisce unisomerizzazione e due successive decarbossilazioni; il composto rimanente, un C4 , rigenera poi lossalacetato chiudendo il ciclo. Nel ciclo entrano due atomi di carbonio sotto forma di acetile ed escono due CO2 , che sono pi ossidati: le reazioni di ossidoriduzione coinvolte provvedono a trasferire il potere riducente (e dunque lenergia) a 3 NADH e 2 FADH2; durante il ciclo si forma un solo legame ricco di energia (come GTP). La regolazione avviene in corrispondenza di quattro reazioni irreversibili: la prima tappa regolata la decarbossilazione del piruvato, stimolata da ioni Ca2+ e
Oltre a CO2 e acqua. In pratica una serie di fattori fanno s che la resa effettiva media superi di poco i 30 ATP/Glc. 22 questo il meccanismo che produce la maggior parte degli ATP. 23 Da cui labbreviazione TCA cycle: i primi composti, citrato e isocitrato, sono per lappunto acidi con tre gruppi carbossilici.
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Figura 1.13: il ciclo di Krebs; gli enzimi coinvolti sono: (1) citrato sintasi, (2) e (3) aconitasi, (4) isocitrato deidrogenasi, (5) -chetoglutarato deidrogenasi, (6) succinil CoA sintetasi, (7) succinato deidrogenasi, (8) fumarasi, (9) malato deidrogenasi (da [6]).

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inibita da vari composti indicatori di alta carica energetica cellulare; la seconda regolazione avviene al livello della citrato sintasi, inibita da ATP; la terza avviene al livello della isocitrato deidrogenasi, e risulta inibita da ATP e stimolata da ADP; lultima simile alla prima e riguarda l-chetoglutarato deidrogenasi. Nel complesso dunque il ciclo di Krebs sensibile ai livelli energetici cellulari, in quanto la carenza di ATP lo stimola e la sua abbondanza lo inibisce. I reagenti del ciclo di Krebs sono precursori di parecchie biomolecole: dunque possibile, in caso di accelerato anabolismo, che il ciclo si svuoti perch il suo pool stato sfruttato in varie biosintesi; di conseguenza esiste una reazione che rigenera ossalacetato a partire dal piruvato24 . Il ciclo di Krebs non comporta consumo di ossigeno, tuttavia in condizioni anaerobiche si ferma rapidamente perch si ha accumulo di NADH e FADH2 : la catena respiratoria rigenera NAD+ e FAD25 , accoppiando questa ossidazione ad una massiccia produzione di ATP. La catena respiratoria, o fosforilazione ossidativa, avviene nello spazio intermembrana dei mitocondri (vedi g. 1.12); essa sfrutta lelevato potenziale degli elettroni di NADH e FADH2 presenti nella matrice mitocondriale per produrre ATP; tale produzione avviene durante il trasporto degli elettroni allossigeno, attraverso una serie di trasportatori concatenati, come schematizzato in g. 1.14.

Figura 1.14: la catena respiratoria; a anco di ciascuna reazione o gruppo di reazioni riportato lenzima responsabile (da [9]).
Tale reazione scarsa o addirittura assente nei neuroni che sono privi dellenzima piruvato carbossilasi. 25 Ed in ci svolge un ruolo analogo alla formazione del lattato.
24

21

Gli enzimi chiave del meccanismo sono la NADH-Q reduttasi, la citocromo reduttasi e la citocromo ossidasi, che catalizzano varie ossidoriduzioni tramite le quali il conferimento degli elettroni da NADH e FADH2 allossigeno molecolare accoppiato al trasferimento di protoni verso lo spazio intermembrana del mitocondrio; in tal modo si formano un gradiente di concentrazione protonica (e di conseguenza un pH) ed una d.d.p., che vengono sfruttati da unaltra proteina presente sulla membrana mitocondriale interna, lATP sintasi, per sintetizzare ATP a partire da ADP e Pi . Linsieme di reazioni strettamente regolato dalla concentrazione di ADP, il cui aumento stimola fortemente la velocit complessiva (e dunque il consumo di ossigeno); tale regolazione chiamata controllo respiratorio. Come gi accennato la resa complessiva del metabolismo ossidativo del glucosio in teoria di 36 ATP per ogni molecola di zucchero: tale resa conseguenza della produzione di 3 ATP per ogni NADH e 2 ATP per ogni FADH2 elaborati nella catena respiratoria, come riassunto in tabella 1.1. La stechiometria complessiva risulta essere:

Glc + 36ADP + 36Pi + 36H + + 6O2 6CO2 + 36AT P + 42H2 O


Il meccanismo illustrato prevede lintervento di proteine e molecole antichissime altamente conservate nei sistemi biologici pi disparati (i citocromi, le proteine ferro-zolfo, leme) ed sostanzialmente simile alla fotosintesi. Esso inoltre richiede come ambiente una semplice doppia membrana lipidica26 , la quale risulta in grado di mantenere il gradiente protonico; per questi motivi si pensa che alcuni meccanismi di base siano tramandati in sostanza intatti n dagli albori dellevoluzione chimica, precedente alla comparsa della vita cellulare.

1.3

Le problematiche sul metabolismo in fase dattivazione neuronale

1.3.1 Il consumo denergia nella conduzione nervosa


I neuroni hanno un consumo di energia legato alla loro funzione eccezionalmente alto: studi condotti con metodi biochimici di tipo classico27 hanno messo in rilievo che il consumo di ATP a riposo cos suddiviso fra i vari metabolismi [9, 5]:
Ricordiamo che strutture chiuse a doppia membrana (liposomi) si formano spontaneamente in determinate condizioni siche dalla mescolanza fra lipidi e acqua [10]. 27 Tali esperimenti comportano in genere prove in vivo su animali con uso di droghe e inibitori per bloccare selettivamente determinati metabolismi: dalla conseguente riduzione della richiesta di ossigeno si deduce il consumo energetico del metabolismo bloccato.
26

22

Tabella 1.1: resa energetica teorica del metabolismo ossidativo del glucosio. Dalla defosforilazione dell1,3-bisfosfoglicerato in poi la resa corrisponde al metabolismo di due molecole, quante se ne formano a seguito della demolizione di una molecola di glucosio. Reazione Glicolisi Fosforilazione del glucosio Fosforilazione del fruttosio 6-fosfato Ossidazione della gliceraldeide 3-fosfato Defosforilazione del 1,3-bisfosfoglicerato Defosforilazione del fosfoenolpiruvato Trasformazione del piruvato Conversione del piruvato in acetil CoA Ciclo di Krebs Ossidazione dellisocitrato Ossidazione dell-chetoglutarato Scissione del succinil CoA Ossidazione del succinato Ossidazione del malato Fosforilazione ossidativa Trasporto dellNADH della glicolisi Ossidazione dellNADH Ossidazione del FADH2 RESA COMPLESSIVA 0 NADH FADH2 ATP

1 1 +2 +2 +2 +2 +2 +2 +2 +2 +2 2 8 +2 4
0

+24 +8 +36

23

Pompe ioniche. La pompa Na+/K+ assorbe la maggior parte dellATP consumato dal cervello, si stima pi del 65%; le altre pompe (Ca2+ -H+ , H+ -K+ ) contribuiscono assieme per un ulteriore 1%. Messaggeri secondari. La formazione di messaggeri secondari come il cAMP e la fosforilazione regolativa di proteine inuiscono per meno dell1%. Sintesi dei neurotrasmettitori. Si tratta di un processo anabolico che, a partire dallimmediato precursore, richiede in genere 1 ATP o 1 GTP, ma
pu anche avvenire allequilibrio; nel complesso non dovrebbe assorbire pi di qualche percento dellATP consumato. Molti neurotrasmettitori possono anche essere sintetizzati a partire da intermedi del ciclo di Krebs o dal piruvato: in tal caso non consumano ATP, ma ne provocano una indiretta minor produzione, in misura tuttavia non quanticabile.

Trasporto assonale veloce. Esiste un meccanismo specializzato di trasporto attivo veloce di vari composti dal corpo cellulare ai terminali assonici e viceversa che consuma parecchia energia, almeno il 6% del totale; il consumo dipende dalla velocit di trasporto.

Sintesi proteica. Il pool di proteine neuronali sottost ad un tasso di ricambio orario di poco inferiore all1%; ci comporta un consumo di ATP stimabile in circa il 6% del totale (5 ATP sono richiesti per aggiungere un aminoacido
alla catena polipeptidica nascente).

Sintesi del glicogeno. Secondo alcune stime indirette potrebbe assorbire no al 5% dellenergia consumata, tuttavia tale dato appare in contrasto
con la scarsit di riserve di glicogeno cerebrali ed in ogni caso da riferirsi soprattutto alle cellule gliali.

Sintesi dei lipidi. Potrebbe contribuire per circa il 2%. Sintesi dei nucleotidi. Si stima che intervenga per l1%.
Nello stato di attivazione si ha un sostanziale aumento del consumo di energia conseguente agli specici meccanismi di trasmissione del segnale nervoso; non facile stimarne lentit, anche se si pu ipotizzare una generale diminuzione dei meccanismi anabolici non direttamente collegati con lattivit neuronale e viceversa unamplicazione del catabolismo; le variazioni metaboliche ipotizzate sono le seguenti [9]:

Aumenta il consumo di energia da parte della pompa Na+/K+ , di un ammontare che secondo le stime varia tra il 30% e l80%, a causa di due fenomeni
che in attivazione tendono a uniformare concentrazione dei ioni ai due lati della membrana neuronale: 24

la trasmissione del potenziale dazione, che comporta un incremento della permeabilit ionica della membrana dellassone, il reuptake di vari neurotrasmettitori (colina, glutamato, aspartato, GABA, noradrenalina, serotonina e istamina) che viene compiuto da speciche proteine di membrana sotto forma di cotrasporto di neurotrasmettitore e Na+ ;

non nota la variazione delle richieste energetiche dovuta alla formazione


di messaggeri secondari;

il consumo di energia a seguito della accresciuta sintesi di neurotrasmettitori


aumenta, ma in misura trascurabile, in quanto parte dei neurotrasmettitori secreti viene riassorbita;

il trasporto assonale sembra scorrelato dallattivit neuronale; sintesi di proteine, lipidi, nucleotidi e glicogeno non sembrano in relazione
diretta con lattivit neuronale, anche se spesso mancano prove dirette a conferma; in ogni caso i normali meccanismi di regolazione in presenza di forte consumo di ATP rallentano i processi anabolici, in particolare quelli di accumulo (sintesi del glicogeno e dei lipidi), per cui ragionevole una riduzione dei consumi di energia dovuti a questi processi. Come si vede gli incrementi delle richieste energetiche in fase di attivazione sono dovuti in sostanza alla pompa Na+ /K+ ; tali richieste vengono nellimmediato soddisfatte dai sistemi tampone della fosfocreatina e dellenzima adenilato chinasi, che mantengono quasi inalterati i livelli di ATP28 ; tuttavia dal metabolismo consegue una immediata sovrapproduzione di ADP e AMP, che abbassa la carica energetica e stimola, come gi visto a pag. 14 e seguenti, la demolizione del glucosio in varie sue tappe29 . Si noti che il passaggio del potenziale dazione altera di poco la concentrazione intracellulare degli ioni coinvolti, infatti una bra nervosa con la pompa Na+ /K+ avvelenata in grado di trasmettere no a 500.000 impulsi prima che le differenze di concentrazione fra i due lati della membrana cellulare si siano ridotte al punto da inibire il funzionamento del potenziale dazione, tuttavia lATPasi sodio/potassio estremamente sensibile alle variazioni della concentrazione interna di sodio e reagisce immediatamente al passaggio del potenziale dazione [11]30
Mediante le reazioni allequilibrio f os f ocreatina + ADP + H + AT P + creatina e 2ADP AT P + AMP. 29 Anche laumentata concentrazione intracellulare dello ione Ca2+ , ulteriore conseguenza della trasmissione del potenziale dazione, ha propriet regolatrici. 30 Nota per il corso di Fisica Medica: per stime pi recenti del bilancio energetico cerebrale, si vedano [12, 13]e la review [14]
28

25

Il metabolismo energetico del cervello di norma sostenuto interamente da glucosio, solo in condizioni eccezionali (per esempio digiuno prolungato) vengono sfruttate anche altre fonti di energia, in particolare i corpi chetonici; il consumo di glucosio a riposo avviene quasi esclusivamente per via aerobica [6] come ampiamente provato dal rapporto stechiometrico fra consumo di glucosio e di ossigeno, e no a circa 15 anni fa si ritenuto che anche in condizioni di attivazione fosse mantenuto questo meccanismo. Ma nel 1986 Peter T. Fox e Marcus E. Raichle misero per la prima volta in dubbio questo paradigma, misurando in zone attivate del cervello un sostanziale aumento del usso sanguigno, non accompagnato da un equivalente aumento del consumo di ossigeno [15]. In conseguenza di questo primo articolo si scatenato un lungo dibattito sui meccanismi di sostentamento dellattivazione neuronale, dei quali ci occuperemo nei prossimi paragra.

1.3.2 I modelli proposti


Per comprendere i meccanismi biochimici che accompagnano lattivazione neuronale si largamente ricorsi anche a tecniche di neuroimaging funzionale come la PET e la fMRI; prima di tutto la caratterizzazione dello stato di riposo, o rest, risulta particolarmente importante, cosa che gi non priva di difcolt sperimentali ed interpretative. Infatti tale stato pu essere rappresentato tramite alcuni parametri metabolici (fra i pi signicativi citiamo CMRglc, CMRO2 , CBF) non facilmente misurabili, e variabili da zona a zona del cervello; in particolare il CMRO2 non direttamente misurabile, ma richiede lapplicazione di un modello non univoco, dalla cui scelta dipende ampiamente il risultato della misura. In tabella 1.2 riportiamo alcuni valori dei principali parametri, riferiti a giovani uomini sani [16, 17, 18, 19, 20, 21]: come si nota il rapporto fra i consumi molari di ossigeno e glucosio si assesta attorno al 5:1, simile al rapporto stechiometrico di 6:1 fra ossigeno e monosacTabella 1.2: parametri metabolici del cervello umano a riposo. Parametro CMRO2 CMRglc CBF media 156 31 58 minimo 139 28 30 massimo 290 43 71

mol 100 g1 min1 mol 100 g1 min1


ml 100 g1 min1

caride nel metabolismo aerobico del glucosio. evidente, quindi, che gran parte del glucosio consumato a riposo viene metabolizzato aerobicamente; daltra parte la quota eccedente di glucosio parzialmente impiegata in processi anabolici non energetici (come la sintesi dei nucleotidi e degli acidi grassi o la produzione di NADPH) e dunque il peso del metabolismo anaerobico del glucosio senzaltro 26

trascurabile; fra laltro i neuroni sono particolarmente ricchi degli enzimi coinvolti nellossidazione del glucosio[9, 5] tanto che sono considerati le cellule dotate di maggiore capacit aerobica nel corpo umano. Lattivazione neuronale comporta un marcato aumento del consumo di energia da parte dei neuroni, dunque a lungo sembrato naturale che in queste condizioni il cervello incrementasse il metabolismo aerobico del glucosio, per ricavare la maggior quantit di energia possibile; ci implicherebbe una variazione proporzionale dei parametri CMRO2 e CMRglc e, verosimilmente, anche del CBF. La bomba di Fox e Raichle Come abbiamo gi accennato, P. T. Fox e M. Raichle, attraverso alcuni studi condotti con la PET, hanno riscontrato un forte disaccoppiamento fra CBF, CMRglc e CMRO2 in fase di attivazione: infatti a fronte di un modesto incremento nel consumo di ossigeno, contenuto entro il 5% del valore basale, hanno misurato un marcato aumento del usso perfusivo (+30 50%) e soprattutto un forte incremento del consumo di glucosio (+51%). Per spiegare tali osservazioni sperimentali gli autori hanno formulato lipotesi che la capacit aerobica neuronale sia gi satura a riposo, e dunque per le ulteriori richieste energetiche dellattivazione il neurone ricorra alla fermentazione lattica. Nel loro primo lavoro [15] Fox e Raichle studiano 33 volontari a riposo e 9 di questi anche sotto stimolazione tattile vibratoria alle dita di una mano; la stimolazione comincia da 60 a 300 secondi prima della somministrazione del radiotracciante (15 O) ed protratta per tutta la durata dellacquisizione dei dati (no a 40 minuti); viene riscontrata uninequivocabile correlazione fra le regioni interessate da variazioni del CBF e del CMRO2 , che cadono nella corteccia perirolandica controlaterale alla mano interessata dalla stimolazione; allinterno di queste zone la perfusione aumenta molto pi del consumo di ossigeno (+29% contro +5%), e conseguentemente cala lestrazione dossigeno (OEF), inoltre le variazioni non sembrano correlate alla durata della stimolazione. Due anni pi tardi vengono pubblicati [22] i risultati di una nuova serie di esperimenti basati su stimolazione visiva su 5 soggetti; anche in questo caso vericato il disaccoppiamento fra CBF e CMRO2 (+50 13% contro +5 12%), ma in aggiunta viene determinato un CMRglc di +50.8 9.0% in accordo con la variazione di usso e molto maggiore della variazione nel consumo di ossigeno: il rapporto stechiometrico fra CMRO2 e CMRglc passa da 4.1 : 1 in condizioni di rest (valore conforme a quelli presenti in letteratura: cfr. tabella 1.2) a 0.4 : 1 in attivazione, cio il 91% dellaumento del consumo di glucosio indotto dalla stimolazione viene metabolizzato anaerobicamente. Ci porta gli autori a concludere che leccedenza di glucosio consumato pu seguire due strade, eventualmente coesistenti: 27

viene utilizzata nella fermentazione lattica; viene trasformata in glicogeno.


Ambedue queste ipotesi comportano un aumento molto moderato delle richieste energetiche in attivazione31, stimabile nellordine del 10%, cosa che contrasta con le conoscenze acquisite sul metabolismo cerebrale (vedi par. 1.3.1); al ne di spiegare per quale motivo il cervello ricorra ad un metabolismo cos poco prestante, gli autori sostengono inoltre che il pool enzimatico aerobico sia gi sfruttato al massimo a riposo, e che di conseguenza ogni ulteriore richiesta di energia debba essere soddisfatta anaerobicamente. A parte alcuni dettagli poco convincenti32 le misure di Fox e Raichle costituiscono senzaltro una grossa novit nel panorama scientico dellepoca, tanto che vari altri gruppi si affrettano a eseguire propri esperimenti; come si pu riscontrare in tabella 1.3 quasi tutti i gruppi confermano almeno qualitativamente un disaccoppiamento fra CBF e CMRglc da una parte, e CMRO2 dallaltra33 . Tuttavia non vi accordo da un lato sullentit di questo disaccoppiamento, che secondo alcune stime risulta meno drammatico di quanto sostenuto da Fox e Raichle [20, 24, 25, 26], dallaltro sulla presenza o meno di un aumento del CMRO2 , che in alcuni casi [15, 22, 27, 28, 29, 30, 31] viene escluso, in altri [18, 20, 23, 24, 25, 26] no, sia pure in genere in misura molto inferiore al rapporto stechiometrico col glucosio. Vale la pena inoltre di notare che anche le stime pi ottimistiche sullaumento del CMRO2 non superano il +25%, e ci comporta che le precedenti stime sullincremento del consumo energetico in fase di attivazione (+30 80%, vedi pag. 22) dovrebbero comunque risultare eccessive: dunque lipotesi di Fox sullo scarso incremento di richieste energetiche in attivazione non sarebbe poi cos arbitraria. Rimane il problema di base che misure cos diverse e sostanzialmente incompatibili gettano unombra sulla validit dei metodi sperimentali ovvero dei modelli di calcolo utilizzati; fra laltro il gruppo di Marrett osserva in vari esperimenti[23, 27, 36, 37] che laumento dei parametri fortemente dipendente dal tipo della stimolazione e dallarea cerebrale interessata, mentre Hoge et al. [26] misurano un andamento della variazione dei parametri dipendente dallintensit della stimolazione, pur conservandosi un rapporto 2 : 1 fra CBF e CMRO2 .
La prima via produce pochi ATP, la seconda addirittura ne consuma. Per esempio su uno dei volontari viene riscontrata una diminuzione del 12% del CMRO2 in attivazione e gli studiosi sono vaghi no alla reticenza sugli errori di misura. 33 A parte Marrett et al. [23] che misurano un buon accoppiamento fra CBF e CMRO2 e Roland et al. [18], che addirittura misurano un CMRO2 doppio del CBF, compiendo per misure su tutto il cervello, senza isolare le regioni attivate.
32 31

28

Tabella 1.3: misure della variazione dei parametri emodinamici e metabolici in regioni attivate a seguito di stimolazione su umani in salute presenti in letteratura; * valore medio riferito a tutto il cervello totale ossidativo signicativo incremento ottenuti con lo stimolo pi intenso (con stimoli meno intensi ottengono sempre un rapporto 2 : 1 fra CBF e CMRO2 ). R EF. [15] [18] [22] [20] [32] [23] [27] [33] [28] [34, 35] [36, 37] [29] [24] [38] [30] [25] [31] [26] T ECNICA PET PET PET PET MRS PET PET PET Kety-Schmidt BOLD PERFUSION MRS PET BOLD BOLD PET BOLD PERFUSION BOLD PERFUSION BOLD PERFUSION BOLD PERFUSION +74% +44% +61% +48% +27% +23.4%; +11.7% +12% +21% +5068% +43% +45% +2225% +6% +16% +4% +16% +2% +25% +15% +0% +22% +1525% +43% +1525% +0% +51%

CMRglc

CBF
+29% +7%* +50% +40%

CMRO2
+5% +13%* +5% +28%

29

opportuno osservare che le stimolazioni utilizzate, a causa delle limitazioni proprie delle tecniche sperimentali, sono protratte in genere per parecchi minuti; lecito a questo punto chiedersi se in questo modo si riesca realmente ad indurre un coerente stato di attivazione protratto per tutta la durata della stimolazione, o se invece non si instaurino fenomeni di habituation che variano lo stato neuronale durante la misura producendo unindenita condizione intermedia fra rest ed attivazione, i cui parametri niscono per dipendere pi dal paradigma sperimentale che dallattivit neuronale. Pi in generale si pu dubitare se un(eventuale) attivazione di mezzora sia siologica, o non esuli completamente dalla normale siologia neuronale. Una parziale conferma qualitativa dei dati di Fox e Raichle viene anche dalla scoperta di una fase di iperossigenazione sanguigna dopo lo stimolo, conseguenza dellaumento di usso non accompagnato da un equivalente aumento dellestrazione di ossigeno: tali misure, ottenute con studi di riettanza ottica sulla superFigura 1.15: andamento di HbR (a) e HbO2 (b) cie cerebrale di animali [40, 41, a seguito di una stimolazione di 4 s (indicata 39, 42, 43] e con tecniche NIRS dallombreggiatura), studiato con la riettanza [44, 45, 46], hanno rivelato un auottica; i graci rappresentano il prodotto della mento della concentrazione di os34 concentrazione per il cammino ottico della lu- siemoglobina ce, espresso nelle stesse unit arbitrarie (da (HbO2 ) nei primi secondi dopo linizio dello stimolo (impulsivo o pro[39]). tratto durante tutto lesperimento, ma comunque di durata dellordine dei secondi), accompagnata da una diminuzione di desossiemoglobina (HbR), con un picco di ambedue i fenomeni tipicamente attorno a 6 s dopo linizio di uno stimolo della durata di due/quattro secondi (g. 1.15)35 [39]. Una diminuzione di HbR stata osservata anche in numerosi esperimenti di fMRI condotti mediante luso del contrasto BOLD36 [47, 48, 49]; tuttavia caratteLemoglobina pu essere legata allossigeno, e in tale forma indicata con HbO2 (ossiemoglobina), oppure no, ed abbreviarsi con HbR (desossiemoglobina). 35 I segnali di HbO2 e HbR sono pi o meno speculari, ma quello dellHbO2 in genere in ritardo di uno o due secondi rispetto a quello dellHbR, mentre sullampiezza i risultati sono poco chiari e difcilmente paragonabili, anche a causa delle stimolazioni e dei protocolli sperimentali estremamente diversi. 36 Tale metodo sfrutta le alterazioni nel campo magnetico locale indotte dalle propriet parama34

30

ristica di tale metodo una complicata dipendenza multiparametrica da CBV, CBF e CMRO2 , per cui la variazione di segnale NMR su cui si basa il contrasto BOLD pu s indicare una diminuzione della HbR dovuta allaumento di CBF non accompagnato dallaumento di CMRO2 , confermando i risultati della PET, ma pu anche nascondere un metabolismo in realt aerobico, se le variazioni di usso sono abbastanza grandi da celare leventuale aumento del consumo di ossigeno. Sui primissimi istanti seguenti lattivazione si hanno tuttoggi pochi dati, peraltro non univoci e generalmente dovuti ad esperimenti su animali: il gruppo di D. Malonek e A. Grinvald, che utilizza un proprio metodo di riettanza ottica nel visibile e nellinfrarosso, osserva pi volte [40, 41, 39, 42, 43]37 un iniziale aumento della concentrazione di HbR (g. 1.15) prima della successiva diminuzione, avvalorando con ci lipotesi, opposta a quella di Fox e Raichle, delliniziale innescarsi dun metabolismo aerobico, nascosto in seguito dal dilavamento causato da un preponderante aumento del usso ematico; grazie allalta risoluzione spaziale del loro metodo sono anzi in condizione di sostenere che il Figura 1.16: andamento di HbR e HbO2 a consumo di ossigeno localmente riseguito di una stimolazione di 2 s (indicata stretto alla zona attivata, mentre laudallombreggiatura), secondo Lindauer et mento di usso e volume sanguigno al.; il graco in basso comprende la corre una risposta metabolica pi genezione per la lunghezza di radiazione indirale e riguarda una zona pi ampia. cata nel testo, il graco in alto non corRecentemente, tuttavia, questi risultaretto e va confrontato con gura 1.15 (da ti sono stati criticati da Lindauer et al. [50]). [50] che usano varie tecniche sperimentali indipendenti38 e non osservano alcun precoce aumento di HbR, anzi sostengono che laumento osservato da Malonek e Grinvald puramente artefattuale
gnetiche della HbR, che provocano un defasamento degli spin dellacqua che diffonde nei pressi di un capillare, e di conseguenza una diminuzione del segnale. 37 Altri esperimenti compiuti con tecniche NIRS, che per generalmente hanno una risoluzione temporale peggiore, non confermano tale andamento [44, 45, 46]. 38 Tutte di tipo ottico: optical imaging spectroscopy, single ber spectroscopy, oxygen-dependent phosphorescence quenching.

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e scompare in seguito alla correzione che compensa la dipendenza del cammino ottico dei fotoni dalla lunghezza donda (g. 1.16). Alcuni particolari studi fMRI, inoltre, hanno rivelato una dinamica del segnale NMR (e precisamente un iniziale decremento, il cosiddetto BOLD negativo, seguito dal pi noto e ampio BOLD positivo) [52, 51, 53, 54] imputabile ad un aumento della concentrazione di HbR di poco successivo allo stimolo. Anche in questo caso si tratta di un fenomeno molto dibattuto e scarsamente riproducibile [55, 56, 57], e daltra parte stato osservato [56] che non affatto necessario supporre un aumento del CMRO2 per giusticare un tale andamento, che pu anche essere spiegato ricorrendo a soli effetti di volume [58].

Figura 1.17: andamento del segnale BOLD a 4 T a seguito di una stimolazione visiva di 10 s; visibile il dip iniziale, il successivo marcato aumento (BOLD positivo) e il prolungato undershoot nale (da [51]). Gli esperimenti sul lattato

Contemporaneamente ai lavori esaminati altri gruppi si sono dedicati alla ricerca, mediante 1 H-MRS, di un eventuale dinamica del lattato nel cervello, che dovrebbe essere conseguenza dun metabolismo anaerobico; in realt in letteratura si trovano quasi solo lavori in cui si misura il lattato in condizioni stazionarie durante prolungate stimolazioni, esigenza dettata dalla difcolt didenticare il lattato, che in assenza di molteplici medie scompare nel rumore di fondo degli spettri. La tecnica dacquisizione inizialmente usata prevede lacquisizione ripetuta di diversi spettri per un periodo di pi minuti, che vengono mediati fra loro e globalmente utilizzati per stimare la concentrazione di metabolita in quella fase. Un accumulo di lattato nella corteccia visiva a seguito di stimolazione prolungata viene osservata per la prima volta nel 1991 da J. Prichard et al. [59], che conducono esperimenti acquisendo il segnale a 2.1 T39 durante una stimolazione visiva di 12 18 minuti (no a 48 minuti in alcuni casi); vengono acquisite diverse serie di spettri durante la stimolazione in modo da ottenere una sorta di andamento temporale: si osserva un netto aumento del lattato allinizio della stimolazione (+57%: da 0.71 a 1.1 mM), seguito da un plateau a livello pi basso e da un pronAltri parametri sperimentali signicativi: ISIS, 128 scan/spettro, T R = 2.8 s, voxel di 13 cm3 centrato sulla scissura calcarina; stimolazione: griglia di LED rossi lampeggianti a 16 Hz.
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to ritorno ai livelli normali allo spegnimento della stimolazione (g. 1.18). I livelli assoluti misurati sono un aumento di 0.3 0.9 mM rispetto ad un livello basale medio di 0.71 mM40 .

Figura 1.18: spettri 1 H in varie fasi della stimolazione (a sinistra) e andamento temporale del lattato durante una stimolazione di 48 minuti (indicata dal riquadro, a destra) (da [59]). Laumento di lattato causato dalla stimolazione inequivocabile e avvalora lipotesi di Fox, tuttavia lentit del fenomeno sembra abbastanza limitata: nellipotesi (peraltro abbastanza arbitraria e tendenzialmente inverosimile) che il washout del lattato resti costante41 , tale aumento giustica secondo gli autori un mismatch fra glicolisi e respirazione solo per il primo periodo della stimolazione (1 3 min, il calcolo basato su un aumento della glicolisi stimato a partire dai dati di Fox in [22]). Gli esperimenti condotti successivamente da altri gruppi permettono di approfondire quanto riscontrato dal gruppo di Prichard: D. Sappey-Mariner et al. [60] osservano42 un aumento del lattato decisamente pi sostanzioso, attorno al +150%, durante i primi 6 minuti di stimolazione; in seguito il lattato assume un andamento decrescente, mantenendosi comunque sopra il livello di riposo. Il segnale EEG, acquisito in contemporanea, mostra un declinare del potenziale evocato simultaneo alla diminuzione della concentrazione di lattato, consentendo di ipotizzare
In questo, come in parecchi altri casi, non affatto chiaro lerrore sperimentale, e neppure se e quali dati sono frutto di singole prove e quali medie di diversi esperimenti, fermo restando che ciascuno spettro frutto della media di pi acquisizioni cronologicamente adiacenti. 41 Tutti i tipi di trasporto molecolare a livello cellulare, anche quelli attivi, dipendono almeno in parte dai gradienti di concentrazione; ci vale tantopi per il trasporto del lattato che afdato a proteine canale passive. 42 2 T, ISIS, 256 scan/spettro, T R = 1.5 s, T E = 272 ms, voxel di 32 cm3 centrato sulla scissura calcarina; stimolazione: scacchiera bianco/nera lampeggiante a 16 Hz.
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lintervento di meccanismi adattativi che causano un decremento dellattivit neuronale, pur perdurando la stimolazione, cosa che spiegherebbe il declino del lattato. Di conseguenza questi dati, mentre stabiliscono inequivocabilmente che il massimo accumulo di lattato (e perci il massimo disaccoppiamento fra CMRO2 e CMRglc) si ha nei primi minuti di stimolazione, non permettono daltro canto di concludere che dopo tale intervallo intervenga un recoupling di tali parametri nel senso di un passaggio al metabolismo aerobico, in quanto come detto sono facilmente interpretabili ipotizzando una diminuzione globale del metabolismo a causa delladattamento neuronale. Al contrario K. D. Merboldt et al.43 [61] non rivelano44 alcuna signicativa dinamica del lattato, osservando una variabilit intersoggetto nel suo livello di base ben pi ampia dalla dinamica attivativa osservata dagli altri gruppi, con valori compresi fra meno di 0.3 e 1 mM. Tuttavia le condizioni sperimentali estremamente varie45 e spesso sfavorevoli allosservazione del lattato rendono questo lavoro non molto probante. Contemporaneamente viene condotto uno studio sul glucosio in condizioni molto pi normalizzate (tipo di stimolazione e parametri di acquisizione ssati e non variabili come nei precedenti studi)46 durante il quale viene osservato un decremento della concentrazione di glucosio di circa il 50%, protratto durante tutta la stimolazione. La diminuzione della concentrazione cerebrale di glucosio durante lattivazione viene confermata anche da W. Chen et al. [32] che misurano47 per una dinamica del glucosio durante una stimolazione di 30 minuti, rilevando una diminuzione massima della sua concentrazione del 31%48 attorno al 15o minuto e un successivo recupero. Tramite lapplicazione del modello enzimatico di Michaelis-Menten e luso di parametri cinetici da loro stessi valutati in precedenti lavori [62, 63]49 , gli
Notare che si tratta del gruppo di J. Frahm, del Max-Plank-Institut di Gttingen, che incontreremo in seguito. 44 2 T, STEAM, T E = 20 270 ms, voxel di 8 64 cm3 nel lobo occipitale; stimolazione: matrice di punti rossi lampeggiante a 4 16 Hz. 45 Oltre a quanto riportato nella nota precedente va segnalato luso di due bobine RF di diversa concezione. 46 2 T, STEAM, 128 scan/spettro, T R = 6 s T E = 20 ms, voxel di 8 cm3 nel lobo occipitale; stimolazione: matrice di punti rossi lampeggiante a 16 Hz. 47 2.1 T, 64 scan/spettro, T R = 2.8 s, T E = 16 ms, voxel di 12 cm3 centrato sulla scissura calcarina; stimolazione: griglia di LED rossi lampeggianti a 8 Hz. 48 Una singolare osservazione degli autori che i risultati di Merboldt [61] (50%) sono compatibili con questo dato, pur di calcolare la diminuzione sul valore di rest stimato da Chen et al.. . . ma se si riuta il dato di rest di Merboldt, non si vede perch bisognerebbe accettare quello sotto stimolazione. 49 Il primo degli articoli citati comprende un errore nel tting dei dati sperimentali, corretto in seguito [64], che ha portato a sovrastimare la costante di Michaelis KT del 27%. In [32] utilizzato il valore corretto.
43

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autori stimano un aumento del CMRglc del 22%50 . Ulteriori elementi di valutazione sono portati da B. G. Jenkins et al. [65] che osservano51 un aumento del lattato pi elevato durante una stimolazione di 3 minuti che durante una di 6 minuti (+92% contro +76%), riproponendo il problema di medie temporali troppo lunghe che tendono a nascondere le dinamiche rapide: gli autori ipotizzano che laumento del lattato avvenga in realt durante il primo minuto. Inoltre viene sottolineata la laboriosit della rivelazione del lattato oltrech per le difcolt intrinseche dovute alla debolezza del segnale, anche per fattori quali la variabilit del livello basale fra diversi soggetti o anche nello stesso soggetto a distanza di tempo, e gli errori di volume parziale, che portano a comprendere nel voxel anche sostanza bianca e addirittura materia non cerebrale, e che risultano inevitabili a causa della morfologia della corteccia e delle tecniche di selezione della ROI. M. Singh et al. [66] usano una stimolazione uditiva prolungata per quasi unora e rivelano52 un iniziale aumento del lattato (+50%), che tende a declinare no al decimo minuto; individuano anche un secondo picco, ampio quasi quanto il primo, dopo circa 30 minuti di stimolazione. Il gruppo di T. Kuwabara [67] misura53 landamento del lattato in seguito ad un task motorio (opposizione delle dita) protratto per alcuni minuti: viene osservato un aumento del lattato piuttosto sostanzioso in valore assoluto (il rapporto lattato/creatina raggiunge il valore di 0.201 0.056 corrispondente ad una concentrazione di 1.93 0.56 mM)54 ma non quanticabile in termini relativi, perch gli autori non sono in grado di separare il segnale del lattato a riposo dal rumore di fondo. Inne R. S. Menon e J. S. Gati [68] compiono nuove misure55, introducendo la grossa novit di una stimolazione di soli 40 secondi preceduta e seguita da due periodi di riposo lunghi altrettanto, e di acquisizioni ogni due secondi. Per compensare la brevit del tempo a disposizione per il campionamento dei dati, la sequenza riposo-stimolazione-riposo viene ripetuta otto volte e la media viene compiuta fra spettri corrispondenti nelle diverse serie; si abbandona cos il metodo seguiDato gi riportato in tab. 1.3. 1.5 T, STEAM, T R = 2 s T E = 272 ms, voxel di 16 cm3 centrato sulla scissura calcarina; stimolazione: griglia di LED rossi lampeggianti a 7.8 Hz. 52 1.5 T, 64 scan/spettro, T R = 3 s T E = 272 ms, voxel di 27 cm3 comprendente la corteccia auditiva primaria e associativa nellemisfero destro; stimolazione: tono di 1 kHz pulsato a una frequenza di 1 o 40 Hz. 53 1.5 T, SE+CHESS, 256 scan/spettro, T R = 1.5 s T E = 270 ms, voxel di 56 cm3 centrato sui gangli basali dellemisfero sinistro. 54 Calcolo effettuato sulla base di una concentrazione della creatina pari a 9.6 mM, come suggerito da Prichard et al. [59]. 55 4 T, STEAM, 8 scan/spettro, T R = 2 s T E = 20 ms, voxel di 11 cm3 centrato sulla scissura calcarina; stimolazione: scacchiera radiale lampeggiante a 8 Hz.
51 50

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to in precedenza dagli altri gruppi (che come detto prevedeva la media fra spettri adiacenti, acquisiti durante lunghi periodi di stimolazione, dellordine dei minuti) in modo da ottenere un andamento del lattato con unalta risoluzione temporale e una coerente stima dellerrore statistico. I risultati sono interessanti e per certi versi sorprendenti (g. 1.19): laccensione della stimolazione viene immediatamente seguita da un aumento del lattato, che gi nei primi secondi cresce di circa il 18%; la concentrazione di lattato ha nei secondi successivi un andamento piuttosto irregolare, ma comunque raggiunge una crescita massima del 24% verso la ne della stimolazione , per poi scenFigura 1.19: segnale BOLD e anda- dere prontamente al suo termine. Nella mento temporale del lattato a 4 T a fase di riposo successiva si manifesta un seguito di una stimolazione visiva, at- forte andamento oscillatorio, piuttosto anotivata fra le righe verticali, con una malo, che gli autori collegano ad un supposto riavvio della glicolisi contemporarisoluzione temporale di 2 s (da [68]). neo alla diminuzione del usso sanguigno; questipotesi va messa in relazione col fatto che landamento temporale del lattato si sovrappone alle fasi del segnale BOLD acquisito nelle medesime condizioni sperimentali: secondo gli autori si ha levidenza del legame fra la produzione del lattato (posta in relazione con un metabolismo anaerobico) e i parametri emodinamici e metabolici implicati nel BOLD. Il fatto, per, che risultati cos interessanti siano stati pubblicati solo sotto forma di abstract ad un congresso forse indicativo di poca robustezza dei dati sperimentali ottenuti. In tabella 1.4 riportiamo le variazioni della concentrazione di lattato osservate dai vari gruppi di ricercatori in cervelli umani in seguito ad attivazione funzionale.

Il modello di Magistretti Quando nel 1994 L. Pellerin e P. J. Magistretti espongono per la prima volta in modo compiuto il loro modello [69] s gi accumulata una buona quantit di dati, ottenuti in genere con esperimenti in vitro su colture cellulari murine56 , in rari casi in vivo su topi e ratti, che collegano in vari modi il metabolismo energetico degli astrociti con la presenza di neurotrasmetitori e con la formazione di lattato, sugTali esperimenti si sono spesso avvalsi delluso di 2-desossiglucosio marcato, un analogo del glucosio.
56

36

Tabella 1.4: misure MRS su umani della variazione della concentrazione di lattato in regioni attivate a seguito di stimolazione presenti in letteratura; * sensibile aumento. Per le misure di J. Frahm [34, 35] si veda pag. 45. R EF. [59] [60] [61] [65] [66] [67] [68] [34, 35]

[Lac] +57% +150% +0% +76 92% +50%


*

+24% +70%

gerendo che gli astrociti stessi svolgano un qualche ruolo nei fenomeni legati alla trasmissione dellimpulso nervoso:

La glicogenolisi astrocitaria viene promossa da vari neurotrasmettitori (il VIP,


la noradrenalina [70, 71, 72] , ladenosina [73]), tramite un meccanismo che prevede lintervento del cAMP come messaggero secondo per la fosforilazione regolativa, in modo del tutto equivalente a quello esaminato a proposito delleffetto del glucagone sulla glicolisi (pag. 15).

Ci sono varie evidenze sperimentali che confermano la presenza sulla membrana astrocitaria di recettori per i neurotrasmettitori e la loro effettiva funzionalit, dato che loccupazione del recettore si riette nella generazione di messaggeri secondi, in particolare cAMP [74], e nellalterazione del potenziale di membrana [75].

Alcuni neurotrasmettitori57 stimolano luptake di glucosio da parte degli astrociti [76, 72].

Gli astrociti rilasciano lattato, ma non glucosio58 nello spazio intracellulare


[77].
Per esempio la NA, ma non il VIP. Questa affermazione non deriva da verica sperimentale diretta ma dal confronto fra le KM dellesochinasi astrocitaria e della glucosio-6-fosfatasi cerebrale, pari rispettivamente a 40 M ed a 9 mM: infatti il rilascio di glucosio generato metabolicamente possibile solo dopo defosforilazione del glucosio 6-fosfato (generato dalla glicogenolisi) ad opera della glucosio-6-fosfatasi, perch i composti fortemente polari non possono traversare la membrana cellulare in assenza di uno
58 57

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Questo insieme di cognizioni viene integrato da Magistretti e Pellerin con la scoperta che il glutamato, il maggior neurotrasmettitore eccitatorio, da solo in grado di evocare tutti questi effetti sul metabolismo degli astrociti [69]; in particolare osservano che:

Il glutamato stimola luptake di glucosio e la sua successiva fosforilazione


con una dinamica saturabile e dipendente dalla concentrazione. Tale effetto non viene alterato da inibitori dei suoi recettori, mentre viene bloccato dal THA, inibitore del suo trasportatore, e scompare anche in assenza di ioni Na+ , in accordo con la cognizione che lassorbimento di glutamato negli astrociti comporta anche lingresso di sodio59 . Tutto ci indica che leffetto di stimolo del glutamato conseguenza del suo assorbimento negli astrociti.

Il glutamato stimola la glicolisi, con un meccanismo che coinvolge la pompa


sodio/potassio, prontamente attivata dallaumentata concentrazione intracellulare di Na+ , conseguenza delluptake dellaminoacido. La glicolisi viene stimolata non solo in termini generali dalla diminuita carica energetica cellulare causata dallazione della pompa, ma anche da un pi specico meccanismo: la Na+ /K+ -ATPasi strettamente associata ad alcuni enzimi glicolitici, in modo che lATP generato dalla glicolisi (specialmente al livello della fosfoglicerato chinasi) nei pressi di una pompa60 venga da questa preferenzialmente utilizzato.

Il glutamato stimola il rilascio di lattato nello spazio extracellulare; questo


fenomeno inibito da THA, suggerendo che anche in questo caso leffetto stimolante sia conseguenza delluptake e che non sia mediato da recettori di membrana. Inoltre la citoclasina B, che inibisce il trasportatore del glucosio61 , blocca allo stesso modo il rilascio di lattato, indicando che tale rilascio causato dalluptake del glucosio e dalla successiva glicolisi. Gli astrociti rilasciano anche piruvato, con dinamiche simili a quelle del lattato ma in quantit circa tre volte inferiore, e questo fenomeno soggetto agli stessi inibitori. Come abbiamo osservato in precedenza (vedi pag. 11) gli astrociti da un lato costituiscono la prima barriera cellulare per i nutrienti (in particolare glucosio) che
specico meccanismo di trasporto, che nella fattispecie non esiste; di conseguenza la molto maggiore afnit per il comune substrato dellenzima esochinasi, che fosforila il glucosio, rende poco verosimile la produzione in quantit signicative di glucosio defosforilato. 59 In particolare un glutamato viene cotrasportato con tre Na+ o due Na+ e un H+ , e scambiato con un K+ e un OH oppure un HCO [78]. 3 60 Ricordiamo che la glicolisi avviene nel cytosol, in modo non localizzato. 61 Il glucosio attraversa la membrana cellulare per trasporto facilitato grazie al trasportatore GLUT, che esiste in cinque forme.

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dal sangue penetrano nel parenchima cerebrale, dallaltro sono un ottimo sensore dellattivit neuronale, sia perch alcuni processi circondano le sinapsi, sia perch la membrana astrocitaria ricca di recettori per i neurotrasmettitori. Ci permette a Magistretti e Pellerin di ipotizzare che siano le cellule cerebrali pi adatte allassorbimento del glucosio indotto dallattivit neuronale; in base a queste considerazioni ed alle prove sperimentali summenzionate, propongono[69] il loro modello sul metabolismo energetico cerebrale (g. 1.20), che prende il nome di navetta del lattato, o astrocyte-neuron lactate shuttle (ANLS): 1) Il glutamato, rilasciato nello spazio intersinaptico a seguito della propagazione dun impulso nervoso, viene assorbito dagli astrociti, assieme ad altri ioni (principalmente sodio). 2) Laumentata concentrazione intracellulare di Na+ provoca un aumento dellattivit della pompa sodio/potassio sopra il livello di base, ci comporta consumo di ATP. 3) Il glutamato assorbito viene convertito in glutamina ad opera dellenzima glutamina sintetasi, che a sua volta consuma ATP; la glutamina viene in seguito rilasciata allesterno dellastrocita. necessario ipotizzare il rilascio di glutamina e non di glutamato perch il rilascio di glutamato mimerebbe la trasmissione dun segnale nervoso. 4) Il consumo di ATP e lattivit della pompa sodio/potassio innescano luptake di glucosio negli astrociti e lavvio della glicolisi; contemporaneamente stimolata la glicogenolisi, che fornisce ulteriore glucosio alla glicolisi. 5) Il ciclo di Krebs astrocitario non stimolato, di conseguenza leccesso di piruvato prodotto dalla glicolisi viene convertito a lattato dalla lattato deidrogenasi. 6) Il lattato prodotto dagli astrociti diffonde nello spazio intercellulare e di qui nei neuroni. 7) Lattato e glutamina rilasciati dagli astrociti vengono assorbiti dai neuroni, presumibilmente nella zona della sinapsi. 8) Nei neuroni il lattato viene ossidato a piruvato dalla LDH; tale piruvato entra nel ciclo TCA e va incontro a completa ossidazione nel metabolismo aerobico, producendo lenergia necessaria al neurone. La glutamina viene riconvertita a glutamato dalla glutamina sintetasi funzionante al contrario e riutilizzata come neurotrasmettitore. 39

Figura 1.20: il modello di Magistretti e Pellerin (la descrizione nel testo) (da [79]). Secondo Magistretti e Pellerin anche il pi volte osservato aumento della concentrazione di lattato in ambito cerebrale a seguito di stimolazione interpretabile in questo contesto, sotto forma di disaccoppiamento temporale fra la produzione del lattato negli astrociti e il suo consumo nei neuroni [69]: si tratterebbe insomma di un fenomeno transiente che rispecchia i tempi di trasporto intercellulare del lattato. A favore di questa osservazione Magistrettti e Pellerin adducono lesistenza di meccanismi di trasporto del lattato attraverso le membrane delle cellule cerebrali, sia pure tramite trasportatori non specici [80]; daltronde vero che appare improbabile che il lattato possa oltrepassare in quantit sensibile la BBB e riversarsi nel circolo sanguigno [81, 5, 28, 82] ed dunque verosimile un suo consumo locale. In questo stadio di elaborazione i due studiosi ipotizzano che lANLS sia uno dei cammini metabolici per la produzione di energia nei neuroni, verosimilmente attivo in maniera maggiore od esclusivamente in fase di attivazione neuronale, a causa del suo meccanismo di innesco dipendente dal glutamato, che non esclude il pi tradizionale meccanismo di uptake diretto del glucosio da parte dei neuroni. Altre prove sperimentali a favore del modello A seguito della pubblicazione del modello di Magistretti e Pellerin si susseguono molti lavori volti a fornire ulteriori conferme sperimentali; nel volgere di pochi anni si raggiungono questi risultati: 40

Negli astrociti e nellendotelio della BBB umana presente la proteina trasportatrice di glucosio, e precisamente lisoforma GLUT1 [83].

Aumentando articialmente la concentrazione di Na+ allinterno di colture


astrocitarie fetali o neonatali di ratto viene stimolata la glicolisi, tale effetto cessa se si blocca la pompa sodio/potassio [84].

Negli astrociti sono presenti almeno due trasportatori del glutamato di cui
uno (GLT-1) esclusivamente astrocitario [85].

Il rilascio di lattato nel liquido intercellulare a seguito dellaumento della concentrazione di glutamato stato confermato in vivo, mediante studi di microdialisi su ratti coscienti; tale aumento paragonabile a quello che segue unattivit motoria articialmente indotta. La somministrazione di THA e PDC62 si riette stranamente in un forte aumento della produzione di lattato, in misura tripla a quanto indotto dal glutamato o dallattivit sica, forse conseguenza del fatto che si tratta di inibitori competitivi che in qualche modo possono mimare lazione del glutamato63 ; provocando attivit motoria sotto somministrazione di THA non si verica un ulteriore aumento di lattato [86, 87].

Colture di astrociti e neuroni di topo in presenza di quantit saturanti di


2-DG metabolizzano entrambe il substrato, ma gli astrociti hanno unattivit enzimatica specica pi che tripla (22.3 contro 6.3 nmol/mg prot/min)64 [88].

Nelle strutture a rosetta della retina del fuco dellape domestica65 , incubate
in presenza di 2-DG, la radioattivit si accumula esclusivamente nelle cellule gliali, indicando che solo esse assorbono glucosio; inoltre la luce (che direttamente stimola i soli neuroni) produce un aumento della glicolisi nelle cellule gliali pari al 50%, confermando che lattivazione metabolica degli astrociti pu essere indotta dai neuroni66 [89].
Un altro inibitore del trasportatore del glutamato. Questa classe di inibitori compete con il substrato naturale per il legame con lenzima; in questo caso gli autori stanno supponendo che linibitore, visto che trasportato come il substrato naturale, induca effetti paragonabili a questultimo. 64 Lunit di misura riportata per lattivit specica enzimatica rappresenta la quantit di substrato trasformato nellunit di tempo, normalizzata alla quantit totale di proteine; si usa per omogenati di cui si vuole esprimere la capacit catalitica complessiva, senza separare lenzima specicamente implicato dalle restanti proteine. 65 Tali strutture possiedono la particolarit che i neuroni fotosensibili e le cellule gliali presenti sono compartimentati, cosicch possibile seguirne individualmente il metabolismo senza dover eseguire colture cellulari separate. 66 Va notato che si tratta di un sistema biologico molto particolare, in cui i neuroni non hanno esochinasi, enzima fondamentale della glicolisi: il ruolo nutrizionale degli astrociti qui obbligato.
63 62

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Con altri esperimenti di microdialisi stata osservata una rapida diminuzione


dei livelli intercellulari di glucosio, con una tempistica pi o meno corrispondente a quella del rilascio di glutamato da parte dei neuroni; viceversa il consumo di ossigeno ritarda sensibilmente, suggerendo una fase iniziale di metabolismo anaerobico [90].

Gli astrociti di topo in coltura possono raggiungere una velocit massima


di assorbimento del glutamato nettamente maggiore di quella dei neuroni: Vmax = 57.4 nmol/mg prot/min nel caso degli astrociti, Vmax = 0.74 nmol/mg prot/min per i neuroni. [91].

Nel cervello presente mRNA per due diversi trasportatori di monocarbossilati, MCT1 ed MCT2 [92], inoltre test specici hanno vericato la presenza di MCT1 e MCT2 nel cervello; tuttavia MCT1 sembra colocalizzato soprattutto con lepitelio della BBB e MCT2 con i neuroni; c qualche indizio che gli astrociti esprimano MCT1, ma non pu considerarsi accertato [80];

Un saggio effettuato con anticorpi monoclonali ha evidenziato che i neuroni


esprimono solo lisoforma LDH1 della lattato deidrogenasi, mentre gli astrociti esprimono principalmente LDH5 (LDH1 presente, ma in minor misura); ci indicherebbe che il lattato venga preferenzialmente prodotto negli astrociti e consumato nei neuroni, dato che si ipotizza che la LDH5 sia pi adatta alla riduzione del piruvato e la LDH1 allossidazione del lattato (vedi pag. 18) [92].

Esperimenti in vitro di 13 C-MRS hanno rivelato che neuroni di topo cresciuti


in presenza di lattato marcato (ma senza glucosio) sono in grado di metabolizzare energeticamente il lattato, infatti la marcatura viene ritrovata in vari metaboliti, specie derivanti da intermedi del ciclo di Krebs (Glu, GABA, Asp). Laggiunta di glutamina non marcata provoca una minore marcatura dei metaboliti, suggerendo che la glutamina venga prontamente metabolizzata e convertita nei medesimi composti. Astrociti allevati nelle medesime condizioni incorporano meno marcatura, e ci potrebbe indicare una minore abilit astrocitaria nel consumare il lattato [93, 94].

Misure MRS con 13 C e 15 N su ratti sottoposti ad anestesia graduata hanno


permesso di stabilire che nella corteccia cerebrale la velocit di sintesi del glutamato a partire dalla glutamina (Vciclo ) quasi in rapporto 1 : 1 con il tasso di consumo aerobico del glucosio (CMRglc(O2)); la legge ricavata in base ad una complessa modellizzazione del metabolismo cerebrale :

CMRglc(O2 ) = 1.04Vciclo + 0.10


42

[mol/g/min]

Ci suggerisce uno stretto accoppiamento fra metabolismo neuronale e riciclaggio della glutamina, presuntivamente rilasciata dagli astrociti (g. 1.21); unaltra conseguenza di questi dati che il consumo energetico legato allattivit sinaptica molto alto, pi di quanto atteso: infatti gi in condizioni di media anestesia il ciclo del glutamato rende conto dell80% del CMRglc(O2). Questo modello trascura lattivit sinaptica non glutamatergica; si stima che linclusione del contributo del GABA porterebbe ad un aumento massimo del 30% della pendenza della retta [95, 96, 97].

Figura 1.21: correlazione tra il rateo di consumo aerobico del glucosio e la velocit di sintesi della glutamina nella corteccia di ratto (a) e schema del meccanismo di accoppiamento del metabolismo neuronale a quello astrocitario (b) (da [96]). Magistretti e Pellerin tornano pi volte sul loro modello [98, 99, 100, 91, 101, 102, 103, 104] elaborandolo ulteriormente, no a sostenere che lANLS sia la principale se non unica fonte di substrati energetici per i neuroni; in questottica il metabolismo del glucosio sarebbe completamente compartimentato, con la glicolisi negli astrociti, il ciclo TCA e la fosforilazione ossidativa nei neuroni67 I neuroni nirebbero dunque per possedere un metabolismo iperaerobico, in quanto il consumo di ossigeno in proporzione alla quantit di substrato metabolizzato sarebbe maggiore di quanto previsto per lossidazione aerobica del glucosio. Lultima proposta di integrazione del modello di Magistretti stata presentata di recente da R. G. Shulman et al. [105], per cercare di giusticare il basso rapporto stechiometrico fra CMRO2 e CMRglc durante stimolazione protratta, pi volte
Entrambi i tipi di cellule sono comunque in grado di metabolizzare completamente il glucosio, come ovvio, anche perch, come gi osservato, vari altri metabolismi essenziali hanno passaggi in comune con glicolisi e ciclo TCA.
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osservato a partire da Fox e non interpretabile nellambito del modello di Magistretti. Shulman osserva che un abbassamento del rapporto teorico fra consumo di ossigeno e di glucosio pu essere spiegato ipotizzando lutilizzo di una via metabolica meno efciente della glicolisi per la produzione di lattato, e identica tale via nel metabolismo del glicogeno. Se si suppone che il glucosio assorbito, invece di seguire la normale via glicolitica, venga almeno in parte convertito in glicogeno, che viene poi successivamente degradato, possibile ottenere un rapporto CMRO2 /CMRglc compreso fra 3 e 6, secondo il peso di questo glycogen shunt; infatti il passaggio da glucosio a lattato, via glicogeno, comporta la produzione di un solo ATP/glucosio contro i due generati durante la glicolisi; di conseguenza per assicurare agli astrociti la fornitura di energia necessaria a sostenere il ciclo glutamato/glutamina (che ricordiamo assomma a circa due ATP per ogni Glu assorbito, convertito e ceduto ai neuroni) il consumo di glucosio cresce no a raddoppiare, nel caso di utilizzo esclusivo del glycogen shunt, valendo la reazione complessiva

Glc 2Lac + (2 x)AT P


dove x la frazione di glucosio metabolizzato che segue il glycogen shunt, cio il peso di questa via. Tale approccio risolve apparentemente il dibattuto problema del rapporto fra CMRO2 e CMRglc, ma introduce altri punti critici:

il glucosio assorbito in eccesso viene necessariamente convertito in lattato,


che non pu essere utilizzato dai neuroni, che non ne abbisognano, e deve dunque essere riciclato localmente con meccanismi non noti68 , o nire nel circolo sanguigno in proporzioni massicce, nonostante la pi volte affermata impermeabilit della BBB al lattato [81, 5];

viene introdotto un ulteriore ritardo metabolico apparentemente immotivato,


come sembra immotivato anche lo spreco di energia che avverrebbe localmente nel cervello: non si vede perch dovrebbe essere stata selezionata una via metabolica inefciente quando ce n una migliore;

il glycogen shunt altererebbe anche il rapporto teorico fra CMRglc(O2)e la


velocita del ciclo glutamato/glutamina, che risulterebbe ssato fra 1 e 2, secondo il peso di questa via. In conclusione il glycogen shunt, che fra laltro gode lappoggio di poche e non troppo probanti veriche sperimentali, sembra pi un articio numerico che una valida ipotesi interpretativa del metabolismo.
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E anche difcilmente immaginabili, almeno in condizioni stazionarie.

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Le misure di Frahm Trattiamo separatamente le misure sul lattato compiute dal gruppo di J. Frahm per il loro specico interesse e per i legami col modello di Magistretti. Questo gruppo, che aveva precedentemente escluso la presenza di una dinamica del lattato nel corso di una lunga stimolazione ([61], vedi pag. 34), torna sul problema utilizzando una nuova metodica sperimentale, che prevede di ripetere pi volte la sequenza di stimolazione, e di mediare gli spettri non solo tra acquisizioni temporalmente contigue, ma anche tra spettri corrispondenti allo stesso intervallo nelle varie sequenze. Tale tipo di media, simile a quello adottato da Menon (pag. 35), presuppone la riproducibilit degli effetti metabolici di stimolazioni ripetute, cosa che in realt non sempre garantita dato lintervento di fenomeni di assuefazione e di apprendimento. J. Frahm et al. misurano69 contemporaneamente vari parametri metabolici durante e dopo una stimolazione di 6 minuti, con una risoluzione temporale di 30 s, ricorrendo, oltre che alla MRS, anche al contrasto BOLD e alla perfusion [34, 106, 35]. Gli autori osservano un aumento della concentrazione di lattato (no a +70%) nella prima fase della stimolazione, seguito da un ritorno a valori basali prima ancora della ne della stimolazione; al contrario la concentrazione di glucosio raggiunge il minimo (40%, corrispondente ad un aumento del consumo del 21%, stimato applicando la cinetica di trasporto di Michaelis e Menten) solo verso la ne della stimolazione (g. 1.22 a, b).

2 T, STEAM, 4 scan/spettro, T R = 6.0 s, T E = 20 ms, voxel di 11 cm3 centrato sulla scissura calcarina; stimolazione: griglia lampeggiante a 10 Hz.
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45

Il diverso andamento temporale delle dinamiche di consumo del glucosio e di produzione del lattato suggerisce che il disaccoppiamento fra CMRO2 e CMRglc sia concentrato nella fase iniziale della stimolazione, in cui sembra prevalere un metabolismo di tipo anaerobico, mentre successivamente laccumulo di lattato cala mentre il glucosio continua ad essere consumato, indicando uno switch verso un metabolismo globalmente aerobico; daltra parte leccesso nel consumo di glucosio sembra in buon accordo con liniziale accumulo di lattato. I dip di iperossigenazione e ipoossigenazione osservati allinizio e alla ne della stimolazione, in corrispondenza delle variazioni nel usso sanguigno (g. 1.22 c, d), sembrano confermare questa interpretazione: il primo corrisponderebbe ad un aumento del usso in presenza di consumo di ossigeno ancora immutato, il secondo ad una diminuzione del usso in corrispondenza alla ne della stimolazione, in presenza per di un metabolismo aerobico ancora attivo, necessario a compensare la prima fase di metabolismo anaerobico. Si tratterebbe insomma di un meccanismo globalmente simile a quello del funzionamento muscolare sotto sforzo, in cui leccesso di produzione di lattato, dovuto in questo caso al carente trasporto dossigeno, viene compensato in una fase successiva, in cui il consumo dossigeno in parte legato al recupero del sovrappi di lattato (debito dossigeno). Nel caso dellattivazione neuronale, in assenza di meccanismi paragonabili al ciFigura 1.22: andamento temporale clo di Cori (vedi pag. 18), Frahm si ricollega della concentrazione di glucosio (a) al modello di Magistretti: la prima fase, di e lattato (b), dellossigenazione (c) e metabolismo anaerobico, corrisponderebbe allavvio della glicolisi astrocitaria, immediadella perfusione (d) (da [34, 106]). tamente attivatasi a seguito del rilascio di glutamato nello spazio intersinaptico, 46

mentre solo successivamente comincerebbe il metabolismo aerobico dei neuroni, con il lattato prodotto dagli astrociti come substrato. In altri termini secondo Frahm e Merboldt lattivazione neuronale determinerebbe non solo variazioni nei parametri ematici locali, ma anche una variazione del tipo di metabolismo, che passerebbe da anaerobico ad aerobico nel corso della stimolazione.

Figura 1.23: andamento dei principali parametri del metabolismo cerebrale secondo J. Frahm et al. (da [35]). In gura 1.23 fornita una rappresentazione schematica delle variazioni associate allattivazione neuronale secondo Frahm e Merboldt: laccensione della stimolazione provoca laumento del usso sanguigno e lavvio del metabolismo anaerobico; di conseguenza la concentrazione cerebrale di glucosio decresce (si suppone che il maggiore consumo di glucosio non sia compensato dallaumento del usso) mentre si ha un aumento impulsivo dellossigenazione sanguigna; solo in seguito si innesca il metabolismo aerobico, che gradualmente sostituisce quello anaerobico, determinando una diminuzione del lattato e del grado di ossigenazione (CBO). La ne della stimolazione provoca la ridiscesa del CBF e di conseguenza un picco negativo della CBO, mentre metabolismo aerobico e livello di glucosio tornano gradualmente al livello basale. Torneremo a discutere di questi modelli in occasione della discussione dei risultati, per analizzarli criticamente anche alla luce delle nostre misure.

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