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I PRIONI

COSA SONO
I prioni sono considerati AGENTI INFETTIVI NON CONVENZIONALI (AINC).Questo li
differenzia dai normali agenti infettivi che danno risposte caratteristiche nell’organismo ospite,tra le
quali la più importante è la risposta infiammatoria,che infatti manca nel corso delle TSE.
La parola “prione”significa “Proteinaceous infectious particle” che in italiano
significa”particella infettiva proteinacea”.
Sono gli agenti causali delle encefalopatie spongiformi trasmissibili(TSE).

LA SCOPERTA
La scoperta dei prioni si deve al microbiologo Prusiner,che nel 1982 pubblicò su “Science”il suo
articolo inerente l’origine dell’agente infettivo della Scrapie ovina.Nel suo articolo Prusiner coniò
per la prima volta il termine “prione”,volendo indicare un agente infettivo non convenzionale.In
realtà la scoperta del prione agente infettivo in quanto tale,sorprese lo stesso Prusiner,che aveva
mirato le sue ricerche alla scoperta di un agente infettivo già noto, che determinava la comparsa
della proteina prionica.Nel tentativo di individuare tale microrganismo,Prusiner si accorse che i dati
sperimentali non facevano altro che dimostrare come la glicoproteina prionica in realtà fosse essa
stessa particella autonoma infettante!Nel corso degli anni ’80 con i progressi ottenuti nel campo
della biologia molecolare fu possibile sequenziare la catena peptidica della protetina prionica e
ottenere così il corrispettivo gene che la codificava.Paradossalmente si scoprì che tale gene in realtà
era normalmente presente nella meggior parte delle pecore sane e che codificava per una forme non
patogenetica della proteina prionica,cioè la proteina prionica cellulare(Prp c).Questo indicava che
l’infettività era data solo dalla forma “scrapie” della proteina prionica,che veniva fuori da una
mutazione genetica o da una errata sintesi e trascrizione di tale proteina.
Questa scoperta,la cosiddetta “Teoria prionica”,generò scompiglio tra il mondo scientifico,poiché
non si capiva come potesse un agente infettivo essere tale pur non possedendo acidi nucleici.
Nel 1996 Pursiner vinse il premio Nobel per la medicina.

Le encefalopatie spongiformi trasmissibili(TSE) o


amiloidosi cerebrali trasmissibili
LA STORIA DELLE ENCEFALOPATIE SPONGIFORMI TRASMISSIBILI
La prima descrizione della scrapie risale al 1732 nel Regno Unito.Negli anni ’70 Carleton
Gajdusek(permio Nobel per la medicina nel 1976) dimostrò che la natura del KURU e della
MALATTIA DI CREUTZFELDT-JACOB(C-JD) era infettiva.Gli agenti eziologici furono
dapprima denominati “virus lenti non convenzionali”.
A metà degli anni ’80 un’epidemia di encefalopatia spongiforme bovina(BSE),sempre nel Regno
Unito,diede notevole impulso alla ricerca nel campo delle TSE,cosicché furono descritte una serie
di TSE in diverse specie animali.
Nel 1986 fu accertato il primo caso di BSE in UK.La causa si fece risalire all’utilizzo di farine di
origine animale nell’alimentazione dei bovini e in particolare si faceva riferimento a farine derivanti
da ruminanti non correttamente sottoposte a risanamento da calore.Tali farine erano in pratica il
veicolo col quele veniva introdotto l’agente infettivo nell’animale.A partire dalla fine degli anni
’70,infatti,il Regno Unito applica le disposizioni della Tucher in materia di risparmio energetico
nella produzione delle farine di origine animale.Le temperature di lavorazione di tali
materiali,così,si abbassarono a cira 90°C,cosa che rappresentava un notevole abbassamento delle
temperature di sanificazione.Inoltre un’altra disposizione stabilì che i grassi non dovevano esser più
estratti dalle farine,bensì mantenuti nel prodotto finale(visto che il prezzo dei grassi era crollato, i
costi di estrazione dei grassi sarebbero stati maggiori dei ricavi dalla vendita di tali grassi).Questi
due fattori sinergizzarono notevolmente l’insorgenza della BSE.Questo significa che le farine
furono il VEICOLO col quale l’agente infettivo contagiava i bovini.
Taluni ritiengono che l’agente causale della BSE sia in realtà uno dei 20 ceppi di scrapie conosciuti
che abbia subito una mutazione spontanea nel bovino agli inizi degli anni ’70 o una mutazione della
PrP-C sporadica come si verifica in caso di CJD umana..Talaltri ritengono che all’origine della
BSE ci sia un ceppo della Prp sc che abbia fatto un salto evolutivo nell’infezione passando da
un’INFEZIONE INTERSPECIFICA (cioè da pecora a bovino) ad un’INFEZIONE
INTRASPECIFICA(cioè da bovino a bovino).Oggi la seconda ipotesi è la più accreditata in
quanto non si spiegherebbe al contrario come possa essersi sviluppata una malattia genetica nel
bovino ed essere rimasta confinata esclusivamente nell’UK.Si pensa addirittura che l’agente mutato
possa “tornare”nuovamente alla pecora,infatti esperimenti dimostrarono come ciò sia
possibile.L’agente causale della BSE è stato dunque in grado di superare le barriere di specie ed
arrivare ai bovidi selvatici,all’uomo,al gatto(100 casi)e a 5 specie di felidi selvatici.
Nel 1988 fu vietato l’utilizzo di farine di ruminanti per l’alimentazione animale.
Nel ’96 furono segnalati 10 casi di encefalopatia spongiforme in giovani pazienti inglesi(c.ca 29
anni) con quadri clinico-patologici inediti,ma che riconducevano a malattie del gruppo delle TSE e
in particolare prove biologiche sul topo dimostrarono dopo 18 mesi che la variante della C-JD
umana era il frutto del contatto con la BSE.La variante umane era dovuta alla pregressa esposizione
dell’uomoall’agente prionico bovino.A tutt’oggi non si conosce in realtà neanche quale sia la dose
minima infettante!
La BSE è una MALATTIA TECNOLOGICA,legata,cioè,all’utilizzo di tecnologie improprie o ad
un loro scorretto utilizzo nella produzione di alimenti zootecnici.
Nelgli anni ’92-’93 la BSE ebbe una fortissima incidenza nei bovini dell’UK.Infatti fu solo dopo
l’88 che venne vietato l’utilizzo di farine di origine animale(in particolare di specie
ruminanti)nell’alimentazione dei ruminanti.Questo significava che il periodo di incubazione doveva
aggirarsi attorno ai 4-6 anni.Nel ’96 in Portogallo e in UK si ebbe il divieto di utilizzare qualsiasi
prodotto di origine animale per l’alimentazione nel campo zootecnico.Dopo il ’96 i casi di BSE
furono davvero pochi e questo conferma il ruolo cruciale che ebbero le farine nell’epidemiologia
della malattia.
Fu presa in considerazione anche la trasmissione della BSE per via verticale,cioè da madre a
feto.Tale ipotesi però non è mai stata comprovata.
Per far fronte all’epidemia di BSE,patologia conosciuta anche col nome di “MUCCA
PAZZA”dall’inglese”MAD COW DISEASE”,a causa dei sintomi neurologici,si ricorse al
principio della precauzione,seguendo il quale vennero vendute le carcasse bovine sane o meno
private dei tessuti a rischio,ovvero es le tonsille.Questo dopo 12 mesi(tempo precauzionale)perché
ci vuol tempo per il prione ad arrivare al snc..
Clinicamente distinguere la scrapie dalla BSE è abbastanza difficile.Tuttavia la BSE è una
zoonosi.mentre la scrapie no.Questo spinge a cercare di capire se la BSE possa tornare agli
ovicaprini oppure no.Ceppo della bse:CH1641,ha un corredo immunobiochimico sovrapponibile a
quello della BSE.E’ il test per la BSE.
Le TSE descritte,sempre nel Regno Unito,in varie specie animali quali gatto,ruminanti
selvatici,uomo(variante della malattia di Creutzfeld-Jakob),sarebbero la risultante dell’esposizione
all’agente causale della BSE.Infatti,a tutt’oggi la BSE E’ L’UNICA TSE CON POTENZIALE
ZOONOSICO DOCUMENTATO.
EPIDEMIOLOGIA DELLE TSE
Le TSE possono essere classificate come :a) MALATTIE EREDITARIE
b)MALATTIE TRASMISSIBILI
c)MALATTIE SPORADICHE(cioè malattie nelle quali
non è dimostrabile né la trasmissione fra individui,né la predisposizione genetica e che compaiono
all’improvviso all’interno di una popolazione senza collegamenti di spazio o di tempo con altre
manifestazioni della stessa malattia;questo termine si contrappone ai concetti di endemico e di
epidemico).

CARATTERISTICHE DI BASE DELLE TSE


-Tutte le TSE sono MALATTIE NEURODEGENERATIVE PROGRESSIVE FATALI
-Tutte le TSE sonoTRASMISSIBILI intraspecificamente,la BSE anche
interspecificamente(zoonosi)
-Tutte le TSE hanno un LUNGO PERIODO DI INCUBAZIONE
-Tutte le TSE sono caratterizzate dalla ASSENZA DI UNA RISPOSTA IMMUNITARIA E
INFIAMMATORIA

EZIOLOGIA DELLE TSE


Fino agli anni ‘60 si riteneva che le encefalopatie spongiformi fossero tutte malattie genetiche da
geni autosomici recessivi.
Oggi invece si sa che le TSE sono il frutto dell’interazione del menoma dell’ospite con l’agente
infettivo.
Riguardo la natura dell’agente infettivo sono state avanzate diverse ipotesi:a)TEORIA
VIRALE;b)TEORIA DEL VIRINO;c)TEORIA DELL’OLOPRIONE;d)TEORIA DEL
NEMAVIRUS;e)TEORIA PRIONICA.

TEORIA VIRALE
Questa teoria suppone che l’agente infettivo sia di natura virale e che pertanto sia l’acido nucleico
che la proteina Prp-Sc siano prodotte dal virus.

TEORIA DEL VIRINO


Si suppone che l’agente causale sia costituito da acido nucleico infettante e da una proteina ad esso
associata,codificata dall’ospite a seguito dell’attivazione genica esercitata dall’acido nucleico
infettante.I sostenitori di questa tesi ritengono che le prove inerenti l’assenza di acido nucleico
nell’agente infettivo delle TSE,non siano del tutto convincenti e che ,se si ammette la presenza
dell’acido nucleico ,si spiega con maggior facilità la presenza di un numero di ceppi di Prp-Sc così
elevato.

TEORIA DELL’OLOPRIONE
Suggerisce che l’acido nucleico sia di origine cellulare e che la particella infettante sia costituita da
acido nucleico e Prp-Sc.

TEORIA DEL NEMAVIRUS


Secondo Narang l’agente infettivo sarebbe costituito da tre strati:1)guscio proteico esterno2)acido
nucleico3)fibrille all’interno.Questa teoria spiegherebbe la particolare resistenza dell’agente
infettivo al trattamento con nucleasi.Inoltre dagli studi effettuati su campioni di cervelli infetti
Narang osservò proteine filamentose più lunghe delle SAF(fibrille associate alla scrapie),che
potrebbero rappresentare l’agente eziologico integro.
TEORIA PRIONICA
Introdotta da Prusiner nel 1982,è quella a tutt’oggi maggiormente accreditata.Essa introduce il
concetto rivoluzionario di prione come agente infettivo di natura proteica,privo di acido nucleico.In
ossequio a tale definizione è opportuno parlare di “amplificazione”dell’agente eziologico,piuttosto
che di “replicazione”.Questa teoria,ha come pecca quella di non riuscire a spiegare in modo
soddisfacente la presenza di numerosi ceppi di Prp-Sc.

PATOGENESI DELLE TSE


Le TSE sono definite anche AMILOIDOSI CEREBRALI TRASMISSIBILI (β-FIBRILLOSI)
in quanto nei neuroni si deposita ,in corso di TSE,una particolare proteina amiloidea:la Prp-
Sc(SCRAPIE-ASSOCIATED PRION PROTEIN),che tende a formare fibrille nastriformi dal
diametro uniforme dette SAF(Scrapie associated fibrils)note anche come PRION
RODS(bastoncini prionici).
La Prp-Sc in realtà rappresenta un’isoforma alterata della sialoglicoproteina di membrana
normalmente presente sulle membrane cellulari detta Prp-C(proteina prionica cellulare).
L’evento principale nella patogenesi delle TSE è la CONVERSIONE POST TRASLAZIONALE
DELLA Prp-C IN Prp-SC,ossia la conversione ,operata dalla stessa Prp-Sc,della Prp-C in Prp-Sc.
La proteina prionica cellulare ha struttura primaria uguale a quella della proteina prionica
patologica.Quello che differenzia queste due proteine risiede,infetti,nella loro differente
conformazione spaziale,per cui la Prp-Sc avrà una struttura secondaria e terziaria differenti dalla
Prp-C. La Prp-C ha struttura secondaria ad α-eliche e una struttura terziaria tipica delle proteine
solubili in acqua(proteine globulari come l’albumina),la Prp-Sc,invece,ha struttura secondaria a
foglietti –β e struttura terziaria tipica delle proteine fibrillari insolubili in acqua(es.collagene o
cheratina). La patogenicità della Prp-Sc risiede,dunque, nella sua struttura secondaria .
Per quanto riguarda l’IMPORTANZA DEL GENOMA DELL’OSPITE nell’insorgenza della
malattia bisogna considerare che la base genetica delle malattie prioniche risiede nell’esistenza,nel
menoma di tutti i vertebrati,di un GENE (Prnp),codificante per la Prp-C.Nella regione
biologicamente attiva di tale gene detta ORF(Open Reading Frame=struttura aperta alla
lettura),localizzata a livello del terzo esone,sono stati rilevati dei POLIMORFISMI
GENETICI,vale a dire delle mutazioni della sequenza del DNA,che sono in stretta correlazione
con la suscettibilità o meno all’agente eziologico della Scrapie.Per tali ragioni il fenotipo clinico-
patologico della patologia costituirà il prodotto dell’interazione tra ceppo dell’agente responsabile e
genotipo dell’ospite.
Riguardo le analogie tra Prp-SC e Prp-C bisogna considerare il concetto di BARRIERA DI
SPECIE,cioè quella “barriera”genetica, che una data specie animale presenta nei confronti delle
proteine prioniche patogene.Tale barriera si abbassa in modo proporzionale alla crescita di
OMOLOGIE TRA LA SEQUENZA AMMINOACIDICA DELLA Prp-Sc di partenza E
QUELLA DELLA Prp-C della specie di arrivo.
La Prp-C è presente normalmente nei vertebrati soprattutto a livello delle membrane cellulari
neuronali.La sua funzione non è stata del tutto chiarita.La sua posizione sulla membrana farebbe
ipotizzare ad un coinvolgimento nelle trasduzioni di segnale,nei fenomeni di adesione cellulare,nel
passaggio di sostanze attraverso la membrana cellulare.Altri hanno dimostrato una funzione
protettrice delle membrane della Prp-C,che agirebbe come antiossidante,legando ioni Cu++.E’ stata
ipotizzata anche una funzione ANTI-APOPTOTICA della Prp-C,che sembrerebbe interagire con
l’oncogene bcl-2.
La maggior parte degli esperimenti effettuati nel campo delle TSE sono avvenuti su topi
transgenici,il cui DNA era privo del gene Prnp.Tali esperimenti hanno fatto emergere il
coinvolgimento della Prp-C nella patogenesi della TSE,in quanto in assenza della Prp-C,non si
aveva manifestazione di malattia.Oltre a questo,gli esperimenti su topini rivelarono la presenza di
un gene molto simile a quello Prnp e cioè il GENE Prnd,codificante per una PROTEINA SIMIL-
PRIONICA detta doppel(dpl),posizionato sullo stesso cromosoma del Prnp.La proteina doppel
pare sia invece coinvolta nel processo di apoptosi cellulare,forse nel processo di maturazione della
barriera ematoencefalica,ma sicuramente ,se sintetizzata in quantità eccessive,determina atassia
locomotoria e lesioni neurodegenerative in tutto simili a quelle determinate dalla Prp-
Sc.Comprendere i legami tra Prp-Sc e doppel contribuirà alla comprensione dei meccanismi
patogenetici delle TSE.
Per quanto riguarda le differenti proprietà chimico-fisiche tra Prp-C e Prp-Sc,si annoverano la
maggiore resistenza al trattamento con enzimi proteolitici,con temperature elevate e con
disinfettanti della Prp-Sc rispetto alla Prp-C.Anche per questo motivo i prioni sono stati definiti
AGENTI INFETTIVI NON CONVENZIONALI,cioè non facilmente distruttibili coi trattamenti
convenzionali.
La resistenza ai trattamenti chimico-fisici,così come la patogenicità,sono entrambe da riferirsi alla
caratteristica struttura secondaria della Prp-Sc.
La MODIFICAZIONE POST-TRASLAZIONALE ,che porta alla Prp-Sc ,avviene in un tempo
abbastanza lungo da un punto di vista conformazionale ed è questo uno dei motivi per cui le TSE
presentano un periodo di incubazione notevolmente lungo.Alcuni ritengono che nel processo di
conversione della Prp-C in Prp-Sc siano coinvolte delle proteine dette CHAPERONINE.
Il cambiamento di conformazione da Prp-C a Prp-Sc origina un MECCANISMO A CASCATA,in
cui le molecole di Prp-Sc formate sono in grado esse stesse di determinare, attraverso una
interazione diretta,il cambiamento conformazionale delle Prp-C in Prp-Sc offrendo la propria
struttura come CENTRO DI NUCLEAZIONE E DI STAMPO!!!Tale alterazione
conformazionale potrebbe anche spiegare la presenza delle forme familiari,in cui mutazioni a carico
del gene Prnp,potrebbe favorire attraverso una maggiore instabilità delle catene α,l’insorgenza
dell’isoforma patologica oessere essa stessa causa di malattia.
Per quanto riguarda la presenza di CEPPI DIVERSI DI Prp-Sc ,si pensa che la proteina prionica
Prp-Sc possa avvolgersi in modo differente determinando una maggiore o una minore affinità a
trasformare la Prp-C in Prp-Sc.Inoltre la divese isoforme potrebbero avere tropismo differente per
diverse regioni dell’encefalo,producendo in tal modo effetti differenti da un punto di vista clinico.
Studi recenti hanno dimostrato come la conversione della Prp-C in Prp-Sc sia molto più efficiente
quando la struttura primaria delle due proteine è identica.Questo è uno dei motivi della difficoltà di
un passaggio interspecifico delle TSE.Una volta effettuato il passaggio,però ,si osserva una notevole
brevità dei passaggi dell’infezione nell’ambito della stessa specie. Questo suggerisce che una volta
effettuato il salto di specie ,la Prp-Sc muti verso una forma quanto più simile a quella della Prp-C
della specie di riferimento(es. criceto infettato con Prp-Sc di topo,produrrà Prp-Sc criceto-specifica.
Nelle TSE EREDITARIE(5-10%dei casi totali) l’origine della Prp-Sc sta in una mutazione
puntiforme del gene Pnrp che rende la Prp-C più suscettibile di assumere la conformazione a
fogliettiβ.Le Prp-C prodotte dal gene mutato,però impiegano tempo per trasformarsi in Prp-Sc, per
cui la malattia assume un decorso molto lento.Questo giustifica anche il perché i soggetti colpiti da
malattia non manifestano segni clinici nella prima infanzia.Inoltre è importante sottolineare come
gli effetti patogenetici siano dati dall’accumulo di notevoli quantità di Prp-Sc a livello cerebrale.
L’accumulo di fibrille nel citosol causa amiloidosi con degenerazione vacuolare e successiva
citolisi.Le fibrille possono essere secrete anche all’esterno della cellula e in tal caso avremo la
presenza di PLACCHE AMILOIDI EXTRACELLULARI o,se si dispongono attorno ai vasi,si
determinerà una ANGIOPATIA AMILOIDE CEREBRALE.

MORFOPATOGENESI DELLE TSE


La proteina prionica patologica penetra nell’ospite attraverso la via digerente.Una volta nel tubo
digerente viene assorbita attraverso il circolo linfatico e si distribuisce al tessuto linfatico.Per questo
motivo si distinguono due momenti della infezione da Prp-Sc:
-a)LINFOINVASIONE
Sia la linfoinvasione che la neuroinvasione sono una serie ordinata di eventi.I passaggi nei vari
distretti corporei possono essere considerati,così,dei veri e propri “colli di bottiglia”da sfruttare per
controllare l’evoluzione della patologia a seguito di una esposizione all’agente causale.
Il fenomeno della neuroinvasione è stato studiato per diversi anni dal prof Aguzzi &coll,che si sono
avvalsi di una serie di esperimenti per dimostrare come avvenisse la neuroinvasione.Gli
esperimenti più importanti di Aguzzi furono i seguenti:

1° ESPERIMENTO:
Dimostrazione dell’importanza dell’espressione della PrP-C cerebrale da parte dell’ospite
per la patogenesi delle TSE

Produzione di topi transgenici che sovraesprimono la PrP-C nell’ordine di 10 volte l’espressione


di PrP-C in topi normali e che quindi hanno una maggiore predisposizione genetica ad
ammalarsi.Questi topi sono detti TG-20.
Prelievo di un GRAFT di cervello embrionale dai TG-20 e suo inserimento in cervelli di topi
transgenici ,che non esprimono la PrP-C,detti TOPI KNOCK-OUT(topi white tipe).
Inoculo di dose infettanti di PrP-Sc intracerebrali nei topi knock-out.
Le lesioni tipiche della TSE si osservano solo ed esclusivamente nel tessuto trapiantato!!!

2°ESPERIMENTO:
Dimostrazione dell’importanza dell’espressione della PrP-C periferica da parte dell’ospite per
la patogenesi della TSE(neuroinvasione)

Inoculo intraperitoneale o nella pianta del piede di dosi infettanti di PrP-Sc in topi knock-out con
graft cerebrale di cervello di tg-20.
Attesa dei tempi di incubazione.
Sacrificio del topo knock-out e analisi anatomo-patologica.
L’animale non manifesta alcun tipo di lesioni tipiche da TSE né perifericamente,né nel cervello o
tantomeno nel graft.

3°ESPERIMENTO:
Dimostrazione del coinvolgimento della linea cellulare ematopoietica nella invasione
dell’agente della TSE,in particolare nella prima fase dell’invasione,cioè la linfoinvasione

Irradiazione di topo knock-out per ottenere la completa distruzione del suo midollo emopoietico.
Introduzione nel topo knock-out del graft cerebrale da tg-20 e di midollo emopoietico da fegato
fetale sempre di tg-20.
Inoculo di dosi infettanti di PrP-Sc a livello periferico.
Attesa dei tempi di incubazione.
Sacrificio del topo knock-out , analisi anatomo patologica,prove di ricerca di PrP-Sc
immunoistochimiche.
A livello cerebrale non si osservano lesioni tipiche delle TSE,mentre dagli esami biochimici risulta
un notevole accumulo di PrP-Sc a livello della milza e del sistema linfatico.
A livello di sistema linfatico non si osservano lesioni anatomo-isto-patologiche che si osservano nel
tessuto nervoso.
Questi dati indicano la scomponibilità del processo in due step:linfoinvasione e
neuroinvasione e soprattutto che le cellule della linea emopoietica non sono responsabili
dirette del passaggio di PrP-Sc nel tessuto nervoso!!!
4°ESPERIMENTO:
Dimostrazione dell’importanza del linfocita B nella neuroinvasione

Utilizzo di tipologie differenti di topi transgenici knock-out con tessuto nervoso esprimente PrP-
C.Ogni tipologia di knock-out presenta una linea cellulare linfatica mancante (es.linfocita B o
T),oppure una proteina immunocompetente assente(es.recettore per l’IFN).
Inoculo di dose infettante di PrP-Sc a livello periferico.
Gli unici topi a non manifestare la TSE erano quelli in cui era mancante la linea dei linfociti B.

5°ESPERIMENTO:
Dimostrazione che i linfociti B non trasportano la PrP-Sc nei neuroni

Stesse premesse del 4° esperimento,ma stavolta i topi sono knock-out anche per le linee
linfatiche(cioè non esprimono la PrP-C).
Inoculo di dose infettante a livello periferico.
Attesa dei tempi di incubazione.Sacrificio dei topini e rilievi anatomopatologici e
immunoistochimici.
Questo significa che ,se la PrP-Sc riesce ad entrare nei neuroni anche senza l’espressione della PrP-
C da parte del linfocita B,allora il linfocita B è sì essenziale alla neuroinvasione ,ma non ha la
funzione di “carrier” della PrP-Sc!!!Quindi probabilmente la sua funzione nella neuroinvasione è di
tipo secretorio.

6°ESPERIMENTO:
Dimostrazione dell’importanza delle linfotossine α e β nella neuroinvasione e del ruolo
centrale delle cellule follicolari dendritiche

Premesso che i linfociti B secernono due linfotossine necessarie alla crescita delle cellule follicolari
dendritiche,cioè dei fattori di crescita quali linfotossine α e β,si iniettano in topi da laboratorio
quantità di RECETTORE SOLUBILE PER LA LINFOTOSSINA β E QUELLA α.
Tali recettori sono rappresentati da Ab anti-linfotossina.
Si osserva il blocco della crescita delle cellule follicolari dendritiche e la conseguente assente
neuroinvasione.

Nel corso di Scrapie organi e tessuti linfatici sono sede di accumulo e di infettività della Prp-Sc e
rappresentano,pertanto,dei validi tessuti da sottoporre ad esame biochimico nel corso di sospetta
infezione da TSE(diagnosi precoce).
La prima PORTA D’INGRESSO per l’agente della Scrapie è il tessuto linfatico associato al tubo
digerente cioè le PLACCHE DEL PEYER.Queste sono anche la prima sede di replicazione del
prione.In esse il la PrP-Sc interagisce con le M-CELLS,cioè le cellule M che costituiscono
l’epitelio follicolo-associato(linfoepitelio).Le Placche del Peyer costituiscono una sede di
produzione dei linfociti B disseminata nello spessore della mucosa dell’intestino tenue dei
Ruminanti.Esse sono caratterizzate dalla presenza di follicoli linfatici nello spessore della
sottomucosa,sovrastati da un mantello(cioè un aggregato di piccoli linfociti) sul quale sorge la
cupola,ovvero una estroflessione della mucosa posta tra i villi il cui epitelio non contiene cellule
caliciformi ,ma cellule M caratterizzate dal fatto di possedere microvilli e di avere la funzione di far
passare all’interno dei follicoli gli antigeni in modo che la reazione immunitaria abbia inizio.
Successivamente la PrP-Sc passa ai macrofagi e poi ai linfociti T.
Una volta a livello linfatico la PrP-Sc negli oragni linfatici secondari dove entra in contatto con le
CELLULE FOLLICOLARI DENDRITICHE(attraverso il legame col recettore cellulare per il
C’),ossia delle cellule di natura fibroblastica(non vengono prodotte dal midollo osseo),che hanno
funzione oltre che di sostegno dei parenchimi linfatici,anche di trattenimento in loco degli
antigeni.attraveso legami con la loro superficie.

-b)NEUROINVASIONE

Avvenuta la lifoinvasione,la PrP-Sc passa al sistema nervoso periferico dal quale poi passa al SNC.
Anche per la dimostrazione delle modalità con le quali avviene la neuroinvasione furono effettuati
diversi esperimenti.

1°ESPERIMENTO:
Dimostrazione del ruolo centrale del sistema nervoso simpatico nella neuroinvasione

Somministrazione di 6-IDROSSI-DOPAMINA in topi da inoculare successivamente con la PrP-


Sc.
La 6-IDROSSI-DOPAMINA è una tossina in grado di indurre una simpatectomia chimica ,grazie
alla formazione di specie reattive dell’O2.
Inoculo di PrP-Sc.Attesa dei tempi di incubazione.
Nei topi simpatectomizzati risultavano notevolmente allungati i tempi di latenza della malattia
nonché la ovvia maggiore sopravvivenza degli stessi alla TSE.

Se ad un altro gruppo di topi si somministrava il NGF(nerve growth factor) a livello di milza,in


essi veniva indotta una proliferazione del tessuto nervoso in loco e nella fattispecie di tessuto
nervoso simpatico.
Questi topi manifestavano con largo anticipo la manifestazione della malattia.

2°ESPERIMENTO:
Importanza del CXCR5 nella neuroinvasione

Il CXCR5 rappresenta il “MEZZO DI NAVIGAZIONE” dei linfociti B nel follicolo linfatico.


Il follicolo linfatico consiste di un vaso centrale,attorno al quale vi sono linfociti T e nello strato
più esterno i linfociti B.I linfociti B,tuttavia non originano dalla periferia,ma vengono a formarsi in
prossimità del vaso.Solo più tardi,grazie all’intervento del CXCR5,passano nella loro sede
definitiva ,periferica al follicolo.
Topi knock-out per la CXCR5,dopo inoculo di dosi infettanti di prioni,presentavano i segni della
TSE in tempi ridottissimi.
Questo significava che i linfociti B producevano linfotossine nel centro del follicolo,con
conseguente crescita in sede ectopica delle cellule follicolari dendritiche e in particolare,in
prossimità del vaso centrale.
Ciò dimostra come sia DI NOTEVOLE IMPORTANZA LA DISTANZA ESISTENTE TRA LE
CELLULE FOLLICOLARI DENDRITICHE E I VASI SANGUIGNI VISTO CHE
L’INNERVAZIONE SIMPATICA SEGUE I VASI!!!

Da quanto rilevato sperimentalmente si può ragionevolmente ritenere che la neuroinvasione sia


dipendente anche dallo stato immunitario del soggetto al momento dell’esposizione alla PrP-
Sc!
Questo significa che se è in atto un’infiammazione vi sarà extravasazione di linfociti B nel luogo
della flogosi.
Particolare importanza assumono allora tutte quelle patologie che inducono un’infiammazione del
tessuto linfatico,come ad es. le malattie autoimmuni(lupus eritematoso,tiroiditi
autoimmuni,etc).Nello specifico saranno soprattutto le infiammazioni follicolari a creare le
maggiori condizioni predisponesti l’infezione da TSE.
Quanto affermato sopra aiuta a capire anche la forte concomitante incidenza nella pecora della
Scrapie e del virus del MEDI –VISNA!Tale virus è infatti immunosoppressore e causa
infiammazioni follicolari diffuse.
Tuttavia non è solo a livello dei follicoli linfatici che avviene l’extravasazione di linfociti B,ma
virtualmente ogni distretto corporeo interessato localmente da una flogosi può essere sede di
extravaso di linfociti B,quindi di crescita locale di cellule follicolari dendritiche e quindi di
accumulo di PrP-Sc!
Se si è in presenza di una mastite e la pecora è affetta anche da TSE,con buona probabilità si
ritroveranno le PrP-Sc nel latte!Così come infezioni renali in pecore affette da TSE danno
PRIONURIA.Questo spiegherebbe la trasmissione orizzontale dell’agente della TSE.

A livello di sistema nervoso periferico bisogna tener conto dell’importanza dei plessi nervosi
associati al tubo digerente:plesso sottomucoso di Meissner e quello mioenterico di Aurebach.
La PrP-Sc penetrerebbe nei neuroni e in minor misura negli astrociti,localizzandosi nelle
membrane delle cisterne dell’apparato di Golgi.A questo livello la PrP-Sc agisce sulla PrP-C
convertendola in PrP-Sc.Questa si accumulerebbe nei lisosomi,provocando la dispersione del
loro contenuto nel citoplasma,con conseguente attivazione di un particolare canale per il
Ca++(N-metil-D-aspartato),che lasciando entrare tale ione bivalente,fa aumentare la
osmolarità del neurone con conseguente RIGONFIAMENTO IDROPICO
VACUOLARE,lesione alla base della alterazione SPONGIFORME.

ISTOPATOLOGIA DELLE TSE


1)SPONGIOSI DELLA SOSTANZA GRIGIA CEREBRALE(rigonfiamento e vacuolizzazione
dei processi neuronali)

2)DEGENERAZIONE E SCOMPARSA DEI NEURONI

3)ASTOCITOSI E ASTROGLIOSI(rispettivamente ipertrofia e iperplasia astrocitarie)

4)DEPOSITI INTRANEURONALI DI PrP-Sc o presenza di DEPOSITI A PLACCHE

La valutazione dell’intensità della spongiosi nelle diverse aree del SNC,attraverso l’attribuzione di
un punteggio(score)per ciascuna area considerata,costituisce un valido mezzo attraverso il quale si
delinea un PROFILO LESIVO.Attraverso lo studio del profilo lesivo si possono classificare i vari
ceppi di TSE.Con questo metodo sono stati classificati 20 ceppi di Scrapie e nello stesso tempo si
è visto come l’agente causale della BSE sia lo stesso della vCJD.Tale metodo risulta affidabile
anche se molto lungo e indaginoso(per via dei lunghi tempi di incubazione della malattia).Un
metodo meno preciso,ma più rapido risulta essere quello del PROFILO
IMMUNOBIOCHIMICO (glycotyping),basato sul riconoscimento dei differenti modi di
glicosilazione delle varie PrP-Sc.
DIAGNOSI DI TSE
La diagnostica in questo tipo di patologie è particolarmente difficile a causa della natura stessa
dell’agente infettivo.Infatti,essendo una proteina in tutto simile a quella dell’ospite,questo
determina una assente risposta immunitaria da parte dell’ospite e quindi preclude la ricerca
sierologia di qualsiasi tipo di anticorpo.E’ altresì difficile l’impiego di anticorpi policlonali o
monoclinali per la ricerca della proteina prionica patologica per il semplice fatto che tali Ab
reagiscono indifferentemente sia con la PrP-C che con la PrP-Sc!
Esistono due tipi di diagnosi di TSE:una post mortem e una intra vitam.

DIAGNOSI POST MORTEM

E’ una DIAGNOSI ISTOPATOLOGICA.


Rilievo nel tessuto cerebrale di una triade patognomonica:
a)SPONGIOSI, b)ASTROCITOSI/ASTROGLIOSI, c)DEGENERAZIONE NEURONALE
con presenza di lesioni simmetriche del tessuto nervoso.
Non si rilevano lesioni apprezzabili microscopicamente .In caso di Scrapie l’intensità e la
disposizione della spongiosi indicano la molteplicità di interazioni tra genotipo
dell’ospite(polimorfismi del gene Prnp) e il ceppo infettante in questione.Ciò nonostante lesioni
tipiche si osservano a livello del nucleo dorsale del vago e a carico di un piccolo nucleo
telencefalico(nucleus accumbens).
Nel corso di BSE tuttavia le lesioni sono DAVVERO TIPICHE in quanto l’agente infettivo ha un
solo ceppo e a carico dell’ospite non si rilevano polimorfismi genici.Tali lesioni
interessano:nucleo dorsale del vago,nucleo del tratto solitario,nucleo del tratto spinale del
trigemino.
Le tipiche lesioni vacuolari sono rilevabili dopo colorazione con ematossilina-eosina,mentre i
tipici depositi di sostanza amiloide,detti anche SAF(Scrapie associated fibrils), vengono
evidenziati dopo colorazione con rosso Congo su omogenati di cervello.
Ovviamente la diagnosi definitiva deve essere accompagnata dal RISCONTRO A LIVELLO DEL
TESSUTO CEREBRALE DI PrP-Sc attraverso tecniche immunoistochimiche o
immunobiochimiche(Western blotting).Oggi l’UE riconosce l’utilizzo dei tests rapidi per la
diagnosi di TSE da fare subito dopo la morte dell’animale,per accelerare i tempi di risposta rispetto
alla classica prova su topini.Tali tests vengono prodotti in Svizzera e rappresentano dei validi mezzi
per la sorveglianza attiva delle TSE.Essi sono un Western blot(Ab
monoclinale),chemioluminescent ELISA(Ab policlonale),Sandwich immunoassay(due Ab
monoclinali).L’attendibilità dei tests dipende anche dalla quantità di PrP-SC accumulata nel tessuto
nervoso.

DIAGNOSI INTRA VITAM


Un primo essenziale orientamento diagnostico viene proprio da un attento esame clinico-
neurologico,in grado di evidenziare disturbi tipici a carattere progressivo tipici di tali malattie.
Fare degli esami immunoistochimici su prelievi effettuati da campioni prelevati dal tessuto
linfatico,non si è rivelata un’ottima metodica come quella che si effettua su tessuto cerebrale.
Data la sovrapponibilità delle strutture primarie della PrP-Sc e della PrP-C,sono stati introdotti
alcuni pretrattamenti chimico-fisici,atti a separare la PrP-Sc e la PrP-C presenti in uno stesso
campione.Tali procedure sono ad esempio il trattamento con proteasi k(che digerisce interamente
la PrP-C,mentre solo parzialmente la PrP-Sc,si fa reagire la protein chinasi k per 1 ora a
37°C),trattamento con acido formico al 97%,autolavaggio a 121°C ,etc…
Possono venire effettuati anche dei tests sulle urine,dove pare essere stata dimostrata la presenza di
un marker diagnostico di infezione detto UprP-Sc,la cui comparsa precederebbe di molto
l’insorgenza delle manifestazioni cliniche.
Recenti studi ,sempre sul topo,hanno rilevato la possibilità di effettuare tests anche su tessuti
bioptici di muscolo,in particolare quelli degli arti posteriori,dove pare si accumulino notevoli
quantità di PrP-.Sc.
In campo umano ,poi,è stata proposta la diagnosi effettuata su prelievi di liquido cefalo-rachidiano
attraverso una tecnica detta SIFT(Scanning for intensely fluorescent targets).

ENCEFALOPATIE SPONGIFORMI NEGLI ANIMALI E NELL’UOMO

LA SCRAPIE
Conosciuta in Europa fin dall’inizio del ‘700 e probabilmente originata da pecore Merinos
Spagnole.
L’infezione viene trasmessa per via verticale dalla madre al feto oppure per via orale attraverso
l’ingestione ad esempio della placenta da parte della pecora partoriente o da parte di altre pecore del
gregge.Esiste poi una certa predisposizione genetica ad ammalarsi di Scrapie e questa dipende dalla
razza e dalla diversa presenza di polimorfismi genetici in una particolare regione in un gene
dell’ospite detto sip(scrapie incubation period).
Il periodo di incubazione varia dai 10 mesi a diversi anni.Normalmente la sintomatologia si
manifesta nelle pecore adulte dopo secondo anno di vita.in genere attorno al terzo-quarto anno di
età a causa del lungo periodo di incubazione che varia da parecchi mesi a 4-5.Il periodo
d’incubazione è influenzato sia dal ceppo dell’agente patogeno che dal genotipo dell’ospite.
Dopo l’infezione si osserva un periodo di ECLISSI di circa un anno,trascorso il quale l’agente
patogeno si moltiplica nel tessuto linfatico(milza in particolare).Dopo passa al SNC attraverso una
via neurotropa intra-assonalee/o per via ematogena ad una velocità molto più ridotta rispetto ai virus
neurotropi(es.herpes virus).La sede di primaria invasione delle PrP-Sc a livello encefalico è
rappresentata dal nucleo motore dorsale del vago.
Le prime manifestazioni di Scrapie sono a carattere nervoso e sono :ipereccitabilità,a seguire
tremori,paralisi degli arti e in seguito morte.Caratteristico nella maggior parte delle pecore affette
da Scrapie è il PRURITO dal quale,tra l’altro ha dato il nome alla patologia stessa.Altre
manifestazioni cliniche potrebbero essere scialorrea,dimagrimento,aggressività,etc.La variabilità di
tali manifestazioni è dovuta proprio alla presenza di vari ceppi di Scrapie e dalla eterogeneità del
genotipo dell’ospite.
Le lesioni tipiche sono quelle delle TSE con l’aggiunta di abrasioni cutanee che sono
patognomoniche di un intenso prurito dell’animale,che prova a calmarlo sfregando la cute ovunque.
Particolare importanza assume il controllo parallelo della Scrapie e del virus del MEDI-VISNA(che
causa infiammaz.follicol.diffusa).
Particolare rilevanza per la trasmissione orizzontale della patologia ha il fatto che i prioni possono
rinvenirsi nel latte e nelle urine.

ENCELOPATIA SPONGIFORME BOVINA


Gran parte delle caratteristiche di questa patologia sono state trattete nella parte generale e altre
sono molto simili a quelle della Scrapie.
Le note aggiuntive degne di nota riguardano i periodi di incubazione che variano dai 3 agli 8 anni,le
razze colpite e cioè quelle da latte e la localizzazione dell’agente patogeno a livello del SNC:
-MESENCEFALO:collicoli rostrali,formazione reticolare,sostanza nera,nucleo rosso
-PROTUBERANZA ANULARE O PONTE:nuclei vestibolari,nucleo del tratto spinale del
trigemino,nucleo del facciale,formazione reticolare pontina

-MIDOLLO ALLUNGATO:nucleo del tratto solitario,nucleo dorsale del vago,nucleo del tratto
spinale del trigemino,formazione reticolare ,nucleo olivare
-MIDOLLO SPINALE:tratti cervicali,corna dorsali e ventrali

ENCEFALOPATIA SPONGIFORME DEI RUMINANTI SELVATICI O “CHRONIC


WASTE DISEASE(malattia del dimagrimento cronico)
Il segno clinico principale è rappresentato dalla cachessia in quanto la PrP-Sc si va a localizzare a
livello dei bulbi olfattivi e a livello del nucleo del nervo ipoglosso per cui l’animale perde sia il
senso dell’olfatto sia la capacità di alimentarsi.
Questa patologia è stata segnalata nei parchi zoologici inglesi,ma è nota da tempo in Nord America.
La caratteristica della CWD è la formazione a livello del SNC di PLACCHE
AMILOIDI,riproducibili anche in topi infettati con un agente causale simile nella struttura a quello
della CWD,ossia presentante una regione caratteristica fissa e non variabile detta RIGID LOOP.
La CWD è da ritenersi una malattia SPONTANEA.Infatti nei topi la malattia si manifestava senza
inoculo dell’agente infettivo,ma solo modificando geneticamente la PrP-C murina e rendendola
simile alla PrP-Sc della CWD.

ENCEFALOPATIA TRASMISSIBILE DEL VISONE(TME= Transmissible Mink


Encephalopathy)
Sembra anch’essa derivare dall’alimentazione di visoni d’allevamento con farine di origine
ruminante derivanti da capi infetti.
Probabilmente l’agente infettivo penetra nell’ospite dalle lesioni che questo si causa al momento del
pasto.
I visoni vengono definiti “DEAD END”,cioè animali a vicolo cieco,in quanto l’infezione non fa
alcun altro salto di specie e non si trasmette da visone a visone.

ENCEFALOPATIA SPONGIFORME FFELINA(FSE= Feline Spongiform Encephalopathy)


1990 è l’anno in cui fu segnalata per la prima volta questa patologia in Inghilterra.
La causa è da attribuire probabilmente a mangimi infetti usATI PER L’ALIMENTAZIONE
FELINA.Non si riscontrano all’esame istologico i tipici depositi di amiloide,mentre son tipici i
segni neurologici. L’esito è sempre fatale.

ENCEFALOPATIA SPONGIFORME DELLO STRUZZO


Registrata per la prima volta in struzzi in cattività nella Germania dell’Ovest.Le manifestazioni
cliniche nonché gli esami istopatologici rivelano i caratteri tipici delle Encefalopatie spongiformi.

KURU O “TREMORE ENDEMICO”O “MALATTIA DEL RISO”


Apparso per la prima volta verso il 1900 presso la tribù Fore nella Nuova Guinea..
Caratteristici sono i segni neurologici: ATASSIE
POSTURALI,MIOCLONIE,TETRAPLEGIE,DISCINESIE FACCIALI CON SPASMI DEI
MUSCOLI PèELLICCIAI DEL VISO(PER CUI SEMBRA CHE IL MALATO STIA SEMPRE
RIDENDO).
All’inizio il Kuru fu messo in relazione agli atti di cannibalismo praticati dalla popolazione,ma poi
fu riscontrato che in realtà erano delle microlesioni cutanee a determinare il contagio.In particolare
erano colpite le donne ,che erano quelle deputate alla preparazione dei cadaveri per le pratiche
rituali.
La malattia è scomparsa con l’introduzione del divieto di applicare pratiche antropofagiche nonché
dei riti preparatori ad esse connessi..

MALATTIA DI CREUTZFELDT-JACOB(C-J D)
Caratterizzata da demenza,atassie posturali e tracciato elettroencefalografico caratteristico,colpisce
individui di età tra i 50 e 70 anni con esito letale entro un anno dalla comparsa dei sintomi.
E’ sporadica,cioè si presenta in media 1 caso su 1.000.000!
Se ne riconoscono tre forme:
-SPORADICA
-FAMILIARE:è IL 10-15%dei casi ed è associata a mutazioni autosomiche del gene per la PrP-C
-IATROGENA: causata dall’uomo per cattiva sterilizzazione degli elettrodi profondi da EEG o
dopo trapianti di cornea o dura madre provenienti da soggetti infetti.

MALATTIA DI GERSTMANN-STRÄUSSLER-SCHEINKER(GSS)
Esordisce principalmente con disturbi di tipo posturale.
Evolve in circa 5 anni ed è stata descritta in poche famiglie del mondo.E’ dovuta ad muna
mutazione puntiforme del gene per la PrP normale.

INSONNI FATALE FAMILIARE(FFI =Fatal Familial Insomnia)


Fu descritta per la prima volta in Italia nel 1986 caratteristica per una forma di insonnia
intrattabile.E’ a carattere ereditario ed è associata ad una mutazione puntiforme del gene per la
PrP.E’ anch’essa fatale sempre.