LECTURA 18 IDENTIFICACION DE INDIVIDUOS MEDIANTE EL ANALISIS DE DNA La aplicacin de la tecnologa del DNA recombinante en la identificacin de individuos se basa en los

avances de las tcnicas bsicas de la biologa molecular, el descubrimiento de marcadores genticos muy variables en las poblaciones humanas y el desarrollo de sistemas muy sensibles de anlisis del material gentico. Actualmente se conocen tres tipos de marcadores genticos que se utilizan para identificar individuos: los marcadores de variacin de secuencia, los minisatlites y los microsatlites. Los minisatlites son los ms polimrficos y fueron los primeros que se utilizaron cuando se desarroll esta tecnologa. Sin embargo, son poco tiles en muestras pequeas o muy degradadas y se analizan mediante el mtodo de Southern blot genmico, el cual es laborioso y poco sensible. Aunque los microsatlites son menos polimrficos existe una gran cantidad de stos en el genoma humano y se pueden analizar en muestras biolgicas pequeas y muy degradadas, por lo cual actualmente se utilizan en la mayora de los casos de identificacin de individuos. Adems, tienen la ventaja de que se pueden amplificar mediante la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), lo cual ha permitido su utilizacin en muestras que contienen poco DNA. Actualmente existen mtodos colorimtricos o fluorescentes para el marcaje y deteccin de los cidos nucleicos, y ello ha facilitado su utilizacin en laboratorios clnicos y privados. Adems, en los ltimos aos se han desarrollado analizadores automticos del DNA. Cada ser humano tiene un fenotipo o apariencia fsica caracterstica, porque posee una informacin gentica nica. Los gemelos idnticos son la excepcin de esta regla, puesto que poseen el mismo genotipo o material gentico. La individualidad gentica de una persona est definida por la informacin gentica que hered de sus padres. El material gentico est contenido en los 46 cromosomas (23 pares homlogo s) del ncleo celular y en el DNA mitocondrial. En la fertilizacin, el vulo y el espermatozoide, que contienen slo 23 cromosomas diferentes, se combinan para dar una clula con 23 pares de cromo sornas (46 cromosomas). As, una copia de cada par de cromo sornas es derivada del padre y la otra de la madre. Ambas copias de cada par de cromo sornas contienen la misma informacin gentica, con pequeas variaciones. Los alelos polimrficos se heredan de acuerdo con las leyes mendelianas de la gentica clsica. Por tanto, las frecuencias genotpicas o haplotpicas (conjunto allico de un individuo) pueden ser establecidas y abordadas estadsticamente de acuerdo a la frecuencia allica de la poblacin. Las diferencias estructurales de los alelos de los loei polimrficos pueden ser detectadas por las tcnicas del DNA recombinante. En el polimorfismo de los loci tipo VNTR, la utilizacin de marcadores genticos de un tipo u otro depende ms bien de la cantidad y grado de integridad del DNA extrado de las muestras biolgicas y del tipo de problema en estudio. Por ejemplo, para el sistema de los minisatlites se requiere cuando menos 1mg del DNA de gran tamao molecular, por lo que no se puede utilizar en muestras con poco DNA o con DNA degradado. Los marcadores minisatlites son tiles en casos de identificacin de cadveres recientes, de paternidad y en algunos casos de violaciones en donde sea factible recolectar suficiente muestra biolgica (0.1 g o ms de sangre, semen u otros tejidos) y se encuentre bien conservada. Sin embargo, en los casos donde hay poco material biolgico, como en los crmenes en los que se cuenta con una gota de sangre o un cabello, o en muestras antiguas mal conservadas, como es el caso de identificacin de cadveres o restos seos de mucho tiempo, donde el DNA est degradado, no se puede utilizar el sistema de los minisatlites y se utilizan marcadores microsatlites o de variacin de secuencia como el HLA y el DNA mitocondrial. Grecia Alaska Alarcn Molina

Una vez que se ha realizado la prueba de la huella digital del DNA, existen tres resultados posibles. Primero, la prueba puede resultar no concluyente, ya sea porque el material fue insuficiente para la prueba o por problemas tcnicos de la metodologa. Segundo, cuando el patrn de la huella digital del DNA de la muestra problema no coincide con la del sospechoso, el resultado es excluyente; es decir que la prueba biolgica no proviene del individuo sospechoso y puede ser declarada exculpatoria. Para estos dos casos, no se requiere disponer de una base de datos de gentica de poblacin de los marcadores utilizados; de 60 a 65% de los casos de crmenes caen en una de estas dos categoras. En el caso de la tercera alternativa, cuando coinciden los patrones genticos de la muestra de la prueba del crimen y del sospechoso, el estudio es concluyente; o sea, que la evidencia biolgica proviene del individuo sospechoso. La frecuencia allica depende del nmero y distribucin de los alelos en la poblacin; entre menor sea la frecuencia de un alelo en la poblacin, menor ser la PCA. La PCA global para un sistema de identificacin depende del nmero de marcadores utilizados y se calcula multiplicando la PCA de cada uno de los marcadores; entre mayor sea el nmero de marcadores, menor ser la PCA. Para un pas de 80 millones de habitantes, una PCA de 1 x 10-8 (0.00000001 o 1 en 100 millones) o menor podra ser suficiente en los casos de identificacin. El grado de certeza no debe expresarse en forma de porcentaje porque resulta engaoso. Por ejemplo, decir que un sistema de identificacin tiene 99.9% de certeza, que pareciera que es una certeza prcticamente de 100%, significa que 1 de cada 1 000 individuos explorados al azar coinciden y en un pas de 80 millones, habra 80 000 individuos con un genotipo idntico. Por ello, la certeza, ms bien debe expresarse como probabilidad de error, la cual es igual a la PCA.

GEN TICA DE POBLACiN DE MARCADORES GEN TICOS UTILIZADOS EN LA IDENTIFICACiN DE INDIVIDUOS Sin el clculo de la peA, el anlisis del DNA para la identificacin de individuos en casos de inclusin prcticamente no tiene validez alguna. Es muy poco probable que las bases de datos de frecuencias allicas y genotpicas, as como los valores de la peA de los marcadores genticos de la huella digital del DNA encontrados en los grupos de poblaciones anglosajonas sean similares en la poblacin mexicana. En el peor de los casos se deben considerar las frecuencias allicas encontradas en poblacin hispana de EVA. Aunque esta poblacin hispana, seleccionada por el apellido, incluye mexicanos, espaoles, cubanos, sudamericanos, centroamericanos, etctera, la informacin obtenida de sta es la ms cercana que podemos utilizar, al menos para individuos mestizos. Para que esta metodologa se pueda interpretar apropiadamente en casos de inclusin en Mxico es necesario tener informacin de la peA en diversos grupos de la poblacin mexicana: blancos, mestizos e indgenas. En las poblaciones indgenas del pas, por ejemplo, es comn el matrimonio entre parientes cercanos, incluso entre hermanos, y en general, entre miembros de la misma comunidad, con poco intercambio con otras comunidades y por ello es comn una frecuencia alta de consanguinidad. En estas poblaciones, la diversidad gentica es mucho ms baja y la homocigocidad es mucho ms alta que en grandes poblaciones sin consanguinidad, y es probable que se encuentren pocas variantes genticas en la mayora de las regiones cromosmicas.

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Actualmente existe la tecnologa del DNA recombinante, necesaria para identificar individuos genticamente en casos de violaciones, crmenes, identificacin de cadveres y casos de paternidad, con una exactitud absoluta. Existen tres tipos de marcadores genticos para identificar individuos: a) de variacin de secuencia, 2) microsatlites y 3) minisatlites. Para aplicar esta tecnologa en Mxico es necesario conocer la diversidad gentica de los marcadores genticos utilizados para la identificacin de individuos en las diferentes poblaciones del pas. Estos datos permiten calcular la probabilidad de que dos individuos no relacionados genticamente coincidan al azar (PCA). En los casos de inclusin se debe utilizar el nmero suficiente de marcadores genticos, para tener una PCA menor a 1 x 10-8 (1 en 100 millones), con los cuales difcilmente, en un pas de 100 millones de individuos, coincidiran genticamente dos individuos. La exclusin, en los casos de violaciones y crmenes, es absoluta con un solo marcador que no coincida entre el individuo sospechoso y la evidencia biolgica. En los casos de paternidad, para excluir al supuesto padre se requiere que cuando menos tres marcadores no coincidan entre l y el hijo en estudio. Como la frecuencia de mutacin de estos marcadores es de aproximadamente 1 x 10-3, la probabilidad de que los tres marcadores que no coinciden sean mutaciones generadas en una misma clula germinal es muy baja (l x 10-9 ). La direccin, diseo e interpretacin de los estudios de identificacin de individuos mediante el anlisis del DNA deben ser llevados a cabo por personal con la formacin acadmica de doctorado y amplia experiencia en el rea de la gentica molecular. La interpretacin de los resultados de la prueba del DNA debe basarse slo en los datos experimentales y los clculos estadsticos obtenidos a partir de las bases de datos de gentica de poblacin.

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LECTURA 19 LA FARMACOGENTICA Y SU IMPORTANCIA EN LA CLNICA El estudio de las variaciones genticamente determinadas en relacin con la respuesta a los frmacos, es frecuentemente referido como farmacogentica, ste es un campo relativamente nuevo en la investigacin farmacolgica, en donde uno de los principales desafos de los farmaclogos es incrementar el conocimiento de las bases biolgicas y moleculares de las variaciones individualesen la respuesta a los frmacos. Garrod en 1909 fundador de la bioqumica gentica, fue el primero en sugerir que las variaciones en el metabolismo eran caractersticas que se heredaban a los descendientes. Motulsky en 1957, enfatiz que ciertas reacciones adversas pueden ser causadas por variaciones en la actividad de las enzimas que estn genticamente determinadas. El campo de la farmacogentica cobra un gran inters en la dcada de los setentas, cuando Vesell y sus colegas en 1973 demuestran que el metabolismo de varios frmacos en gemelos idnticos es menos divergente que en los gemelos no idnticos. En menos de 30 aos, se han observado respuestas notablemente distintas, en lo que se refiere a la eficacia de los frmacos administrados; estas diferencias radican en respuestas exageradas en relacin con su comportamiento farmacocintico. Los factores genticos son importantes ya que pueden causar cambios en la estructura de las enzimas metabolizantes de frmacos, las cuales llevan acabo la biotransformacin de los frmacos; estos cambios pueden ser de carcter polignico o monognico. En el caso de un solo gen (monognico) se conocen dos diferentes clases de polimorfismos farmacogenticos: 1) los polimorfismos comunes, y 2) los polimorfismos raros. Las tcnicas del ADN recombinante como es el RFLP de ADN genmico que dan patrones de fragmentos caractersticos de ADN, y la amplificacin enzimtica del ADN por PCR as como las tcnicas de HPLC para la cuantificacin de metabolitos de frmacos en orina o plasma, son tiles para identificar individuos que se comportan como ML y MR de algunos frmacos que sufren biotransformacin heptica. Algunas enzimas metabolizantes de frmacos que tienen un comportamiento polimrfico, pueden tener implicaciones clnicas relevantes en el desarrollo de algn tipo de cncer, como es el caso de los individuos que presentan el fenotipo ML, en los cuales la detoxificacin del frmaco es inadecuada. En el metabolismo y en la disposicin de compuestos externos incluyendo a los frmacos, los factores son dependientes del husped. Sin embargo las bases genticas para la individualidad en el metabolismo de los frmacos han sido bien reconocidas y recientemente confirmadas. Ahora se entiende que un nmero finito de alelos de genes que codifican para las enzimas metabo lizantes de frmacos que corresponden a fenotipos distintos en farmacologa. El inicio de la farmacogentica en el laboratorio clnico, resalta la influencia de la gentica en la farmacologa, Linder y Cols., en 1999 sealan la importancia de la estructura de las protenas para mantener la concentracin del frmaco en el estado de equilibrio, ellos revisan los conceptos fundamentales relacionados con la gentica y con las enzimas metabolizadoras de los frmacos y dan ejemplos de como las distintas variaciones genticas (polimorfismos) alteran la respuesta (fenotipo) de ciertas terapias en individuos seleccionados. Estas observaciones sealan la importancia de genotipificar y/o fenotipificar, la capacidad para la biotransformacin de frmacos a los pacientes, que requieren el uso Grecia Alaska Alarcn Molina

de medicamentos, ya que existen numerosos tratamientos con frmacos de uso clnico frecuente, que al ser administrados a individuos deficientes en el metabolismo de estos frmacos, presentan serias complicaciones, ya sea por deficiencia o por la ausencia de stas enzimas metabolizantes de frmacos. En virtud de que existen pocos trabajos de farmacogentica realizados en poblaciones mexicanas, resulta muy importante el que se lleven a cabo este tipo de estudios antes de iniciar el tratamiento con medicamentos, con la finalidad de obtener resultados eficaces en la terapia de pacientes que cursan con una deficiencia enzimtica en el metabolismo de frmacos, lo cual implica un riesgo de toxicidad para el paciente y la predisposicin a desarrollar algn tipo de cncer. El desafo para quienes trabajan farmacogentica, es identificar las causas de la variacin individual en la respuesta a las sustancias endgenas, as como la bsqueda de estrategias que permitan identificar pacientes a riesgo de sufrir fracaso teraputico o reacciones adversas a los medicamentos.

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LECTURA 20 IMPORTANCIA DE LA DETERMINACIN DE VARIANTES GENTICAS QUE INFLUYEN EN LA EFICACIA Y TOXICIDAD FARMACOLGICA EN ONCOLOGA Los polimorfsmos genticos incluyen repeticiones de nucletidos, deleciones, inserciones y sustituciones de nucletidos aislados que infuyen en la expresin y/o funcin de los genes. Se asocian con diferencias interindividuales de la eficacia y toxicidad de medicamentos y estn presentes en el 93 % de los genes conocidos. Los polimorfsmos del gen que codifca a la TPMT constituyen uno de los ejemplos clnicos de farmacogenmica ms desarrollados. Esta enzima citoplsmica se encuentra en procariontes y eucariontes. Se describi originalmente en el rin e hgado de ratas y ratones, posteriormente se demostr en la mayora de tejidos humanos. La TPMT humana tiene una masa molecular de 28 kDa y se compone de 245 aminocidos y no depende de metal. Cataliza la S-metilacin de las tiopurinas, incluyendo azatioprina, 6-MP y tioguanina, medicamentos que se indican en el tratamiento de la leucemia aguda linfoblstica, como inmunosupresores para enfermedades infamatoria, enfermedades reumticas severas o posterior al trasplante de rganos. No se conoce el sustrato natural para TPMT. La actividad de la TPMT se ve modifcada por polimorfsmos genticos y mutantes allicos con herencia codominante. Aproximadamente 90% de los individuos tienen actividad elevada (tipo silvestre), 10% tienen actividad moderada (individuos hetercidos) y 0.3% no tienen actividad enzimtica detectable, porque heredan los dos alelos no funcionales. Actualmente se conocen 13 polimorfsmos y la mayora se localizan en los exones 5, 7 o 10. La forma silvestre se conoce como TPMT*1. La mayora de polimorfsmos de nucletidos aislados que se conocen para TPMT son funcionales, sea a travs de la sustitucin de aminocios (TPMT*2), *3, *3B, *3C, *3D, *5, *7 y *8), formacin de un codon de trmino temprano (TPMT *3D) o destruccin de un sitio de unin (TPMT*4). La primera variante allica que se identifc contie ne una transversin en la posicin 238 G->C, que permite la sustitucin del anillo rgido de prolina por un residuo ms fexible de alanina (Ala80Pro) Como consecuencia, cambia la estructura terciaria de la protena, lo que permite inestabilidad de la protena y disminucin de su actividad cataltica. La variante, TPMT*3A contiene dos polimorfismos de transicin (18) uno en el exn 7 (460 G>A) y el otro en el exn 10 (719 A->G), cada una sustituye a un aminocido, mientras que la variante TPMT*3C contiene solamente el cambio en e exn 10 (719 A>G). Adicionalmente, los polimorfsmos de TPMT que no alteran los aminocidos codifcados se localizan en lo intrones y se han identifcado dentro del exn 3, y do polimorfsmos aislados dentro de los exones 5 y 12. La posibilidad de predecir una respuesta, as como toxicidad potencialmente letal en pacientes que reciben quimioterapia, permitira el uso individualizado de estos medicamentos, que tienen un ndice teraputico estrecho. Estos avances y aplicaciones han permitido la evolucin de la farmacogentica a la farmacogenmica. Sin embargo, an falta evaluar en estudios prospectivos y aleatorios el papel de los polimorfsmos enzimticos, as como la integracin del anlisis de vas metablicas para establecer lineamientos que puedan ser utilizados en el manejo estndar de pacientes con cncer.

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LECTURA 21 IMPORTANCIA DE LA DETERMINACIN DE VARIANTES GENTICAS QUE INFLUYEN EN LA EFICACIA Y TOXICIDAD FARMACOLGICA EN ONCOLOGA

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