Cuidado y Uso de Columnas con Base de Silice

Al hablar de Cromatografa un punto crtico es el uso de las columnas cromatograficas, aqu van algunas recomendaciones de uso y almacenamiento para ellas que he buscado en la web. Recomendaciones de uso 1. Mantenga al mnimo el volumen muerto del camino que recorre la muestra. Con columnas de 4 o 4,6 mm de diametro interno utilice tuberas de 0,010" o 0.007" de diametro interno (o el mnimo compatible con el equipamiento que se cuenta) y minimice la longitud entre inyector, columna y detector. Si se utiliza columnas de 2,1 mm de diametro interno utilice tuberas de 0,007" o 0,005". 2. Use fases moviles con pH entre 2 y 7,5. Los enlaces siloxano, an cuando son estables en la mayora de los ambientes, pueden hidrolizarse a valores de pH extremos. 3. Haga circular el flujo de eluente en el sentido indicado por la flecha impresa en la columna. 4. Use solamente solventes grado HPLC y filtre los mismos antes de utilizarlos (filtros de membrana). Esto ltimo es particularmente importante cuando se utilice "buffers". 5. Si sospecha que sus muestras contienen slidos en suspensin, filtre las mismas antes de su inyeccin en la columna (filtros de jeringa). 6. Salvo que se conozca de antemano la inexistencia de partculas o compuestosque puedan quedarretenidos irreversiblemente en la columna, es altamente recomendado el uso de "garda columnas" (o precolumnas). 7. Evite utilizar presiones por encima de las 4500 psi. La Slice es una forma de vidrio y puede por lo tanto fracturarse. De la misma manera, evite todo golpe mecnico sobre la columna. 8. Siempre que sea posible evite la presencia de sales de halgenos en la fase movil. Estas inducen la corrosin de las superficies de acero inoxidable cuando quedan dentro de la columna. Si las debe utilizar, asegrese, antes de guardar la columna, que estas sales sean rigurosamente eliminadas con agua grado HPLC y luego con solventes orgnicos apropiados. La desgasificacin de la fase mvil para eliminar el Oxgeno tambin es recomendable para esta situacin. 9. Antes de comenzar con la separacin, es recomendable equilibrar adecuadamente la columna con la fase movil a utilizar. Las columnas de fase unida ("bonded phase") requieren aproximadamente 20 volmenes de columna (aprox. 50 mL), mientras que las de slica no unida requieren aproximadamente 60 volmenes de columna. 10. La aplicacin de temperatura ayuda en muchas ocasiones a mejorar la selectividad, reproducibilidad y resolucin. En estos casos la temperatura mxima recomendada es de 70C. Temperaturas mayores pueden producir la hidrlisis de fases unidas y tambin acortar la vida de la columna. 11. Evitar la utilizacin de Aldehdos y Cetonas con columnas de Aamino.

Almacenamiento de la columna Como recomendacin general, si se utilizan fases mviles que contengan "buffers" o reactivos de apareamiento inico (PIC) es muy importante que esas fases mviles sean eliminadas completamente de la columna antes de su almacenaje. Debe lavarse la columna con al menos 5 volumenes de columna con agua grado HPLC y con solventes orgnicos que no contengan "buffers" o reactivos PIC. Para estimar el volumen de columna se puede utilizar la siguiente ecuacin: V = *r2*L Donde: V : Volumen de columna en mL r : Radio de la columna en cm L : Longitud de la columna en cm Las condiciones de almacenamiento ms comunes para columnas HPLC con base de slice son las siguientes: Columna Fase Reversa (C18, C8, Fenilo, etc.): Usar 65% Acetonitrilo + 35% Agua Columna Fase Normal (Slice, Nitrilo, Amino, etc.): Usar Isopropanol o Hexano Columnas de Intercambio Inico (SAX, SCX, etc.): Usar Metanol (lavar la columna con 50 mL de Agua antes de fluir el Metanol)