24/03/2011

Coleta de solo e razes e mtodos para extrao de fitonematides para anlises nematolgicas
Prof. Arlete Silveira DCAA

A metodologia para coleta de amostras de solo, de razes e de outros tecidos vegetais para fins de diagnsticos de problemas causados por fitonematides ou de monitoramento de suas populaes uma etapa de maior relevncia. Os dados obtidos, a partir delas, podem ser extrapolados para toda a rea em estudo. A identificao e a quantificao precisa de nematides dependem da utilizao de amostragens, extrao e mtodos corretos.

COLETA DE AMOSTRAS DE SOLO E RAZES 1. Coletar as amostras de solo e razes, de preferncia, com a umidade natural. Obs. Nematides no sobrevivem em solo seco ou razes secas. 2. Equipamentos necessrios: enxado, trado ou enxada, sacos plsticos, balde, etiqueta, caneta, ficha de campo. 3. Amostrar a rea, caminhando em ziguezague, abrindo o solo em forma de V, e coletar uma camada deste solo a uma profundidade de 0 a 25 cm, colocando-a no balde. 4. Amostrar em toda a rea: focos que apresentarem fortes sintomas (reboleiras) sintomas mdios e, em reas, sem sintomas. Deve-se coletar uma amostra composta/ha que corresponde coleta de 10 subamostras/ha.

Cont... 5. Culturas anuais: coletar solo na zona das razes das plantas, incluindo sempre, que possvel, razes na amostra. Tomar no mnimo 10 subamostras por hectare. 6. Culturas perenes: coletar em 10 planta no mnimo, por hectare. Se a cultura for adensada pode-se coletar, alternadamente, em dois pontos na projeo da copa de uma planta e, em dois pontos opostos, na projeo da prxima planta, e assim sucessivamente, totalizando 20 subamostras por hectare. Se o plantio no for adensado, pode-se coletar nos quadrantes (norte, sul, leste e oeste) na projeo da copa de cada planta totalizando 40 subamostras, incluindo razes. 7. Viveiros: coletar aleatoriamente, no mnimo, 10 mudas para cada lote de 1.000 mudas. Obs. Pode-se coletar parte do solo e razes das plantas, sem destru-las, se as mudas forem muito raras e, ou de valor comercial elevado.

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Cont...

EXTRAO A PARTIR DE AMOSTRAS SOLO PRINCPIO DO MTODO O mtodo tem por base a diferena de densidade entre os nematides, a soluo de sacarose e as partculas de solo. Na primeira centrifugao, os nematides e as partculas de solo, por serem mais densos que a gua, iro depositar-se no fundo dos tubos. Na segunda centrifugao, a soluo de sacarose, proporciona uma densidade intermediria, entre os nematides e as partculas de solo. Neste caso os nematides estaro no sobrenadante e as partculas de solo, por serem mais pesadas, iro novamente depositar-se no fundo dos tubos.
Soluo de sacarose: misturar 400 g de acar refinado em 750 mL de gua.

8. Embalar em sacos plsticos, fechando-os em seguida para evitar perda de umidade e identific-los (data de coleta, local, cultura, etc.). 9. Preencher sempre, que possvel, uma ficha de campo, fazendo um croqui da(s) reas(s) amostradas(s) e com informaes tais como: nome do proprietrio, local, data de coleta, cultura atual, tipos de solo, topografia, cultura a ser implantada, se foi aplicado defensivos agrcolas, e outros dados que julgarem necessrios. 10. Enviar as amostras o quanto antes para o laboratrio, no deixar expostas ao sol. No laboratrio, se no forem processadas no mesmo dia, armazenar em geladeira (4 - 5 oC). Nunca congelar as amostras.

Mtodo da flutuao centrfuga em soluo de sacarose (JENKINS, 1964)

METODOLOGIA

Cont... 6. Transferir a suspenso do Becker para o tubo da centrfuga (50 mL), cuidar para que fiquem balanceados. Centrifugar por 4 minutos a uma velocidade de 1.750 rpm. 7. Eliminar cuidadosamente o lquido sobrenadante, limpar as bordas dos tubos e adicionar a soluo de sacarose com auxlio de pisseta, dirigindo o jato para o fundo dos tubos, de modo a promover a ressuspenso do material sedimentado ou misturar os sedimentos com um basto de vidro. 8. Centrifugar novamente por 1 minuto, na mesma rotao. Verter o sobrenadante em uma peneira de 500 mesh, derrame bastante gua de torneira na peneira para retirar todo o resduo de sacarose. Com auxlio de uma pisseta recolher os nematides com jatos de gua, para um Becker. 9. Transferir para tubos de ensaio e deixar decantar por 2 h ou mais e, com auxlio de sifo ou pipeta, retirar o sobrenadante, deixando 4 mL. 10. Antes da contagem ao microscpio, homogeneizar bem a amostra.
Obs: As suspenses, contidas nos tubos de ensaio, podem ser guardadas em geladeira a 4 OC, se no for possvel a quantificao e identificao das mesmas, logo aps as extraes.

1. Homogeneizar bem a amostra de solo. 2. Retirar uma alquota de 100 cc de solo e coloc-la em um recipiente, acrescentar 2 a 3 L de gua de torneira e misturar bem para quebrar os torres maiores e deixar em repouso por cerca de um minuto. 3. Verter o lquido em peneira de malha de 20 mesh (0,84 mm) sobre uma bacia. 4. Descartar o material retido nessa peneira. Verter, aos poucos, todo o lquido da bacia em peneira de 500 mesh (0,025 mm), em uma pia. 5. Com jatos fortes de gua, usando uma pisseta, recolher o lquido e os nematides da peneira de 500 mesh, transferindo-os para um Becker. Obs. Retirar bem a gua at obter em torno de 40 mL da suspenso aquosa de nematides.

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EXTRAO DE NEMATIDES A PARTIR DE AMOSTRAS DE RAZES

Este mtodo indicado para extrao de ovos e juvenis de Meloidogyne spp.. Nesse caso, utilizar soluo de hipoclorito de sdio (NaClO = gua sanitria) na concentrao de 0,5 % (cloro ativo) para dissolver a massa gelatinosa que envolve os ovos. No caso de poucos sinais e,ou sintomas de nematides formadores de galha pode-se substituir o hipoclorito por gua visando extrair as formas jovens e adultas de nematides endoparasitos migradores como Pratylenchus, Radopholus, etc.

Mtodo de extrao de razes (COOLEN e DHERDE, 1972)

METODOLOGIA 1. Coletar as razes infectadas, lav-las cuidadosamente e cort-las em pedaos de aproximadamente 1 cm. Homogeneizar e pesar 10 gramas (no mnimo). 2. Triturar as razes em liquidificador, por 15 segundos (o tempo pode variar com o tipo de razes) em alta rotao em um volume de hipoclorito ou gua, suficiente para cobrir os fragmentos. 3. Passar a suspenso resultante pela peneira de 20 mesh sobre a de 500 mesh. Lavar com gua corrente para retirar o excesso de hipoclorito. 4. Transferir a suspenso de nematides mais os tecidos vegetais, retidos na peneira de 500 mesh para um Becker, deixando um volume de 40 mL no mximo. Acrescentar 1 cm de caulim e homogeneizar a suspenso com auxlio de um basto de vidro.. Obs. Os tubos da centrfuga (utilizada nas aulas prticas) so de 50 mL. 5. Transferir a suspenso para os tubos da centrfuga e balance-los. 6. Centrifugar por quatro minutos a 1.750 rpm.

Fixao dos nematides

Cont... Se os nematides no forem identificados e quantificados logo aps a extrao, devero ser fixados. Ex. FAA (formalina 40% - 30 mL, cido actico glacial 5 mL, etanol 96% - 100 mL e 200 mL de gua destilada). Aps a decantao dos nematides nos tubos de ensaio por, no mnimo, duas horas, retirar o sobrenadante com um sifo (feito com uma mangueira acoplada a uma seringa de injeo) ou pipeta deixando apenas 4 mL (Obs. Cuidado para no ressuspender os nematides). Mat-los, em aquecimento tipo banho-maria a 55 oC por 2 a 4 minutos. Acrescentar 4 mL da soluo de formalina a 8%. Preparo da soluo de formalina concentrao dupla (8%): Formaldedo a 37 - 40% ............................................................ 276 mL gua destilada ............................................................................ 724 mL CaCO3 (carbonato de clcio) / L ................................................. 100 g Obs. Deve-se deixar o carbonato de clcio decantar, aps a mistura na soluo de formalina e no mais ressuspend-lo quando da utilizao do fixativo. Funo do CaCO3 Neutralizar os cidos livres da soluo e prevenir a formao de grnulos no interior do corpo do nematide.

7. Eliminar o sobrenadante, limpar as paredes dos tubos e adicionar a soluo de sacarose com jatos fortes de pisseta ou misturar o pellet com um basto de vidro. 8. Centrifugar novamente a 1.750 rpm por um minuto, no mximo. 9 Em seguida verter o sobrenadante sobre uma peneira de 500 mesh e lavar os nematides retidos na peneira com gua de torneira. Com jatos de gua de uma pisseta recolher os nematides em cerca de 20 a 40 mL de suspenso aquosa. A suspenso de nematides, assim obtida, pode ser examinada para identificao e contagem.

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Mtodo do Funil de Baermann (BAERMANN, 1917) modificado por Southey (1970) PRINCPIO DO MTODO

Baseia-se na gravidade e na movimentao dos nematides. Os nematides quando entram em contato com o papel, atravessam-no pelos poros e caem na coluna de gua. Como os nematides so mais densos (1,09 1,1) que a gua (1,0) ficaro depositados no fundo da coluna de gua, na extremidade fechada da mangueira de borracha onde, ento, sero coletados.

O Mtodo do Funil de Baermann pode ser usado para extrair nematides de solo, partes de tecidos vegetais (razes, folhas, flores, sementes, etc.). Contudo, somente nematides (mveis) podem ser recuperados. ativos

Muito til para extrao de nematides endoparasitos migradores, que se encontram no interior dos tecidos das plantas.
Exs. Pratylenchus spp., Radopholus spp., etc.

Cont... METODOLOGIA 1. Acoplar, ao prolongamento basal de um funil cnico de vidro ou plstico, um seguimento de mangueira de silicone ou de borracha de cerca de 10 cm de comprimento. 2. Na extremidade oposta da mangueira adaptar um pequeno frasco (funil ou vidro de anestsico de dentista) ou vedar a mangueira com uma presilha metlica. O funil colocado sobre um suporte de madeira ou metal. 3. Sobre cada funil, colocar uma pequena peneira (coador) e, um leno de papel facial de folha dupla. 4. Sobre o papel facial, colocar o material que se deseja extrair os nematides. Obs. Se o material for solo, colocar cerca de 50 a 100 cm. Se for material vegetal (razes, folhas, caules, etc.) deve ser seccionado em pedaos de cerca de 1 cm. Sementes (gros) e bulbilhos devem ser descascados porem, usar todo o material para a anlise. Homogeneizar e pesar 10 g.

Cont... 5. Colocar certa quantidade de gua no funil e completar o nvel de gua, com auxlio de uma pisseta, at tocar no fundo do coador, para que haja sempre contato da amostra com a gua. 6. Retirar as bolhas de ar que, geralmente, se formam no seguimento da mangueira. 7. Depois de 12 a 24 horas, fazer a coleta da suspenso de nematides. 8. Liberar 10 a 20 mL da suspenso em Becker. Obs. Caso haja interesse, repetir diariamente essa operao at no se obter mais nematides (em torno de trs a cinco dias). Desvantagens do mtodo: recupera em torno de 30% dos nematides. Somente os nematides vivos e mveis atravessam o papel facial. Nematides com anelaes na cutcula (Ex. Mesocriconema, etc.), nematides que no esto movimentando e nematides muito grandes, geralmente, no so recuperados.

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Mtodo do peneiramento mais Baermann

METODOLOGIA 1. Homogeneizar bem a amostra composta do solo que veio do campo. 2. Retirar uma alquota de 300 cc3 de solo e coloc-la em um recipiente, acrescentar 2 a 3 L de gua de torneira e misturar bem para quebrar os torres maiores. 3. Verter o lquido em peneira de malha de 20 mesh, sobre uma bacia. 4. Verter o lquido da bacia em peneira de 500 mesh. 5. Com jatos fortes de gua, usando pisseta, recolher a suspenso da peneira, transferindo-a para Becker, em um volume de 20 mL. Se no conseguir este volume, devolva para a peneira e retire mais gua. 6. Levar a suspenso para o funil de Baermann, previamente preparado.
7. Aps 12 a 24 h recolher a suspenso de nematides.

Cont... A suspenso obtido do peneiramento pode ser colocada em placa de Petri. Despejar a suspenso sobre algodo ou papel facial, previamente colocado sobre uma tela de plstico em uma placa de Petri. Tampar a placa para evitar que o lquido evapore. Aps 12 a 24 horas transferir o lquido da placa de Petri, para uma peneira 500 mesh. Com jatos fortes de gua, usando pisseta, recolher a suspenso novamente e efetuar a contagem dos nematides.

Extrao de cistos do solo METODOLOGIA 1. Homogeneizar bem a amostra de solo e sec-la sobre papel toalha. 2. Retirar uma alquota de 50 cm de solo e coloc-la em um recipiente, acrescentar 1 L de gua de torneira e misturar bem para quebrar os torres maiores. 3. Verter o lquido em Erlenmeyer e, deixar decantar por 10 minutos no mnimo. 4. Verter o lquido sobrenadante em peneira de malha de 60 300 mesh. 5. Com jatos fortes de gua, usando pisseta, recolher o lquido e os nematides da peneira, transferindo-os para um Becker de 100 mL. 6. Despejar a suspenso de nematides sobre papel de filtro, previamente colocado sobre uma tela de plstico, em um funil de Baermann. 7. Aps a drenagem da gua, pode-se levar o papel de filtro para ser examinado ao microscpio estereoscpico e efetuar a contagem.
Obs. Os cistos so muito leves. Por isso, tomar cuidados para que eles no sejam levados por vento ou corrente de ar.

Tcnica de incubao de razes (YOUNG, 1954) Este mtodo recomendado para extrair endoparasitos das razes. Exs. Meloidogyne, Pratylenchus e Radopholus e tambm estdios imaturos e machos de parasitos sedentrios. Esta tcnica tambm recomendada para diagnstico de Ditylenchus dipsaci - o nematides de bulbilhos de alho; para nematides de sementes (capins, trigo, arroz, etc.); de folhas; de flores; do estipe de coqueiro, etc.). Princpio do mtodo Quando material infectado armazenado com umidade, ou imerso em gua, as formas endoparasitas migradoras, tendem a sair do material para a gua.

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Cont...

METODOLOGIA PARA RAZES 1. Lavar as razes e cort-las em pedaos de 1 2 cm. Razes mais grossas podem ser cortadas longitudinalmente para facilitar a sada dos nematides. 2. Colocar estas razes em recipientes como placa de Petri, Becker ou sacos de polietileno. 3. Depois de 24 horas temperatura ambiente, recolher a gua dos recipientes em uma peneira de 150 mesh sobre outra de 500 mesh. 4. Recolher os nematides em cerca de 20 mL de suspenso aquosa, com jatos de pisseta, em Becker. Fazer a contagem e identificao. Pode ser guardada em geladeira, se a contagem no for feita no mesmo dia. Obs.: A extrao pode continuar por mais 4 a 7 dias, bastando-se trocar a gua do recipiente. Para bulbilhos desprender um pouco as cascas e para semente (arroz, capins, etc.) macer-las cuidadosamente.

LITERATURA CONSULTADA COOLEN, W.A., DHERDE, C.J. A method for the quantitative extraction of nematodes from plant tissue. Ghent: State Agricultural Research Center, 1972. 77p. FREITAS, L.G.; OLIVEIRA, R.D. de L.; FERRAZ, S. Caderno Didtico. Introduo Nematologia. 58 Cincias Agrrias. Viosa, MG: Editora UFV, 2006, 84p. JENKINS, W.R. A rapid centrifugal flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter, v.48, n.9, p.692, 1964. SOUTHEY, J.F. Laboratory methods for work with plant end soil nematodes. London: Minist. Agric. Fish and Food, 1970. 148p. (Tech. Bull. 2). TIHOHOD, D. Nematologia Agrcola Aplicada. Jaboticabal: FUNEP/UNESP, 1993. 372p. YOUNG, T.W. An incubation method for collecting migratory endoparasitic nematodes. Plant Disease Reporter, v.38, p.794, 1954.