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PONTIFICA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE FACULTAD DE INGENIERA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA Y BIOPROCESOS

Laboratorio 2 - Informe

Curso: IIQ3682 Seccin 1 Biotecnologa Microbiana Profesor: Eduardo Agosn Ayudantes: Benjamn Snchez, Daniela Soto

Phammela Abarza I. Guillermo Gutierrez H. Pradyumna Sepulveda D.

Mircoles 20 de Junio, 2012

Indice
Resumen.............................................................................................................................................. 5 Introduccin ........................................................................................................................................ 6 Objetivos ............................................................................................................................................. 6 Fundamentos Tericos ........................................................................................................................ 7 Cultivo batch ................................................................................................................................... 8 Cultivo Continuo.............................................................................................................................. 9 Cultivo Fedbatch ............................................................................................................................. 9 Metodologa ...................................................................................................................................... 11 Seguridad....................................................................................................................................... 11 Obtener volumen se desecho y volumen de muestra .................................................................. 11 Medicin de peso seco .................................................................................................................. 11 Centrifugacin ............................................................................................................................... 12 HPLC .............................................................................................................................................. 12 Espectrofotometra ....................................................................................................................... 12 Resultados ......................................................................................................................................... 13 Cultivo Batch ................................................................................................................................. 14 Cultivo Continuo (Quimiostato) .................................................................................................... 17 Cultivo Fed-batch .......................................................................................................................... 21 Discusin ........................................................................................................................................... 26 Cultivo continuo ............................................................................................................................ 26 Cultivo fed-batch ........................................................................................................................... 28 Cultivo Batch ................................................................................................................................. 29 Conclusiones y Recomendaciones .................................................................................................... 31 Nomenclatura.................................................................................................................................... 32 Bibliografa ........................................................................................................................................ 33 Anexos ............................................................................................................................................... 34

Indice de Tablas
Tabla 1 ............................................................................................................................................... 12 Tabla 2 ............................................................................................................................................... 13 Tabla 3 ................................................................................................ 1Error! Marcador no definido. Tabla 4 ................................................................................................ 1Error! Marcador no definido. Tabla 5 ............................................................................................................................................... 17 Tabla 6 ................................................................................................ 1Error! Marcador no definido. Tabla 7 ............................................................................................................................................... 19 Tabla 8 ............................................................................................................................................... 20 Tabla 9 ............................................................................................................................................... 22 Tabla 10 ............................................................................................................................................. 23

Indice de Figuras
Figura 1 ................................................................................................................................................ 7 Figura 2 ................................................................................................................................................ 7 Figura 3 .............................................................................................................................................. 13 Figura 4 .............................................................................................................................................. 14 Figura 5 .............................................................................................................................................. 15 Figura 6 .............................................................................................................................................. 16 Figura 7 .............................................................................................................................................. 16 Figura 8 .............................................................................................................................................. 17 Figura 9 .............................................................................................................................................. 18 Figura 10 ............................................................................................................................................ 18 Figura 11 ............................................................................................................................................ 19 Figura 12 ............................................................................................... Error! Marcador no definido. Figura 13 ............................................................................................... Error! Marcador no definido. Figura 14 ............................................................................................................................................ 21 Figura 15 ............................................................................................... Error! Marcador no definido. Figura 16 ............................................................................................................................................ 23 Figura 17 ............................................................................................... Error! Marcador no definido. Figura 18 ............................................................................................................................................ 26 Figura 19 ............................................................................................... Error! Marcador no definido.

Resumen
Este laboratorio consisti en realizar anlisis sobre las muestras tomadas a los tres tipos de cultivos disponibles (quimiostato, batch y fed batch), los anlisis se realizaron en base a las herramientas de clculo y balances entregadas en el curso biotecnologa microbiana. As, de los diferentes cultivos se tomaban cada treinta minutos muestras de aproximadamente 5mL para los cultivos batch y fed batch y 7mL para el cutivo continuo de las cuales se meda absorbancia a 600nm (valor que mediante un ajuste lineal nos entregara la biomasa), y se guardaba el sobrenadante de su centrifugado (3600 rpm por 5 minutos) para posteriormente sera sometido a un HPLC entregndonos las concentraciones de glucosa y acetato. Para llevar a cabo el anlisis de los datos entregados por el muestreo nos servimos principalmente de balances de masa y la ecuacin de Monod. Ecuaciones mediante las cuales fue posible calcular datos como coeficiente de mantencin, mximo y Ysx entre otros. En el cultivo continuo se observo una lavado completo del sistema para una dilucin de 0.6 1/hr. Para el cultivo fed-batch tenemos que se realiza una etapa previa de crecimiento de un cultivo batch normal. Por lo tanto, para todos los clculos de parmetros y coeficientes se tom como tiempo cero T= 7,7 horas. La diferencia entre batch y fed-batch es que el segundo tiene una entrada de alimentacin con sustrato limitante, glucosa. En este caso el flujo que ingresa se calcula segn ecuaciones que dependen de (XV)0 al inicio del fed-batch y parmetros de rendimiento, tasa de crecimiento y sustrato en alimentacin fijas. De hecho, el cultivo por lotes alimentados permite mantener un crecimiento a una tasa seteada ( =0, 3 para este caso). El flujo Fin presenta un aumento en su magnitud con el tiempo, pues debe alimentar con suficiente sustrato limitante a un volumen creciente de biomasa. Se calcul el experimental al realizar un grfico Ln (XV)t vs. Tiempo (hr.), ya que la pendiente de la recta que ajusta para el grupo de datos corresponde a este valor. Se encontr que , menor que lo previsto. Posibles causas de este crecimiento restringido se discuten en la seccin correspondiente.

Introduccin
Un cultivo es un mtodo para la multiplicacin de microorganismos. En biotecnologa se han desarrollado distintos tipos de cultivo para maximizar distintos componentes tales como biomasa o un cierto producto. Los 3 tipos de cultivos ms utilizados para optimizar el crecimiento de microorganismos son batch, fed-batch y continuo. En un cultivo batch, no hay flujos de entrada ni salida. Todos los componentes del sistema se ingresan el sistema el principio del proceso. El sistema se deja funcionando solo hasta que los el sustrato limitante y/u otros nutrientes se van limitando u se producen productos inhibitorios tal como acetato. En un cultivo fed-batch hay flujo de entrada pero no hay flujo de salida. Por esta razn el volumen va aumentando continuamente en el tiempo. En un cultivo continuo hay un flujo de entrada y un flujo de salida. Al ser ambos flujos iguales, el volumen se mantiene constante. Adems, el cultivo opera en fase estacionaria, es decir, no hay acumulacin de producto, biomasa ni sustrato. Por ende, las variables del proceso son constantes. En este laboratorio se analizaron los 3 tipos de cultivo para poder compararlos y entender cmo se diferencian. Tambin, con las mediciones tomadas y utilizando las ecuaciones de balance de masa se podr construir modelos para poder explicar y predecir el comportamiento de los componentes en los cultivos.

Objetivos
1. Tomar sistemticamente mediciones a cultivos batch, fed batch y continuo (quimiostato) de Escherichia coli para posteriormente analizarlas y as familiarizarse y comprender a cabalidad el funcionamiento de estos tres tipos de cultivo. 2. Poder construir un modelo que describa el comportamiento de los cultivos y comparar los valores tericos del modelo con los datos experimentales.

Fundamentos Tericos
Para los distintos clculos de concentracin y los parmetros de cultivos, utilizamos las ecuaciones de balance de materia para cada tipo de cultivo. La ecuacin general de balance es:

La ecuacin general para el sustrato es:

Con: S (t): concentracin de sustrato dado en un tiempo t: tiempo (hr) Ff = flujo de alimentacin (L/hr) F = flujo de salida (L/hr) Sf = concentracin de sustrato en el flujo de alimentacin (g/L) V= volumen (L) qS=tasa volumtrica de generacin de sustrato La ecuacin general para la biomasa es:

Con: X (t): concentracin de sustrato dado en un tiempo t: tiempo (hr) Ff = flujo de alimentacin (L/hr) F = flujo de salida (L/hr) Xf = concentracin de sustrato en el flujo de alimentacin (g/L) V= volumen (L) qX=tasa volumtrica de generacin de biomasa Para describir la tasa de crecimiento de la biomasa utilizamos la ecuacin de Monod. Esta es un modelo de cintica simple. Su ecuacin esta dado por:

Con, : tasa de crecimiento celular (1/hr) max: tasa de crecimiento celular mxima (1/hr) Ks : medida inversa de la afinidad entre el microorganismo y el sustrato limitante (Tambin se describe como el valor de S(t) cuando ) Si se reordena la ecuacin de Monod se llega a la siguiente expresin:

Esta expresin corresponde a la ecuacin de una recta como se observa en la Figura 1.

Figura 1 Grafico de la ecuacin de Monod

Cultivo batch
En un cultivo batch, no hay flujo de entrada ni salida. Solo hay trminos de acumulacin y generacin y/o consumo. Luego desde el balance de biomasa se tiene:

Para obtener , se integra ambos lados de la ecuacin anterior obteniendo:

Con X0 = concentracin inicial de biomasa (g/L). Para obtener max (la tasa de crecimiento celular mxima) se usa la zona fase de crecimiento exponencial donde la pendiente de la curva es mayor (Fig. b) La pendiente de esta zona es max.

Figura 2 Fases de un cultivo batch. Cuando interesa maximizar el crecimiento de un microorganismo, se asume que el sustrato no se utiliza para formar producto, sino que solamente se usa para el crecimiento y el mantenimiento de la clula. Luego la ecuacin de balance para el sustrato queda: 8

Con,

m = coeficiente de mantenimiento celular YSX = rendimiento de sustrato para producir biomasa (g/g) =

Igual que la ecuacin de Monod, la ecuacin de sustrato se puede reordenar para que represente una recta

Cultivo Continuo
En un cultivo continuo hay flujos de entrada y salida. Tambin se opera en fase estacionaria. Por lo tanto, las ecuaciones de balance no van a tener un trmino de acumulacin y el volumen del reactor va a ser constante. Adems, la alimentacin es estril, es decir no tiene biomasa. Entonces, la ecuacin de balance para la biomasa queda: Como F/V es lo mismo de la tasa de dilucin D, entonces la ecuacin queda: Con D: tasa de dilucin (1/hr) La ecuacin para el sustrato queda:

Con la ecuacin anterior y reemplazando la condicin D= se puede obtener una expresin para X(t):

Especficamente en este laboratorio vamos a trabajar con un quimiostato, lo cual es un cultivo continuo donde todos los parmetros se mantienen constante, menos la alimentacin de sustrato para as maximizar la produccin de biomasa.

Cultivo Fedbatch
El cultivo fedbatch tiene 2 etapas. La primera etapa se parece a un cultivo batch y la segunda es un cultivo fedbatch. En un cultivo fedbatch hay un flujo de entrada pero no de salida. Luego la ecuacin de balance tiene trminos de acumulacin, entrada y consumo y/o generacin. Ademas se asume que el flujo de alimentacin no tiene biomasa. Luego, el balance de biomasa queda:

Integrando la ecuacin, se tiene: 9

La ecuacin para el sustrato es:

Integrando lo anterior, despejando Ff y reemplazando la ecuacin de biomasa se tiene:

Ley de Lambert-Beer Esta ley relaciona la absorcin de luz con las propiedades de un material. Se ve expresado como:

Siendo: A: absorbancia I: intensidad de luz transmitida I0: intensidad de luz incidente : coeficiente de absorcin molar (M/cm) L: la distancia que viaja la luz (cm) c: concentracin del material (g/cm3) Esta ley describe una funcin lineal entre absorbancia y concentracin, pero solo dentro de un cierto rango de absorbancia. Lambert-Beer solo es aplicable a soluciones diluidas. Esto se debe a varios factores. Por ejemplo, a altas concentraciones, las molculas del material estn mas cercas entre si y se producen interacciones entre ellas lo que produce una alteracin en la capacidad de absorcin.

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Metodologa
Seguridad
1. Para establecer condiciones mnimas de seguridad e higiene en laboratorio se ocup un delantal de laboratorio. 2. Las manos previamente lavadas se cubren con guantes de ltex. 3. Para proteger los ojos se ocuparon antiparras

Obtener volumen se desecho y volumen de muestra


Cultivo batch y fedbatch: 1. Se roca la manguera donde se sacan muestras con etanol 70% 2. Se abre el sello de la manguera donde se va a extraer la muestra. Luego se conecta la jeringa a la manguera. 3. Se abre la vlvula del reactor y se extrae aproximadamente 3mL de desecho para ambientar el tubo falcon y sacar el cultivo que est dentro de lo largo del tubo donde se sacan muestras. Se anota el volumen de desecho y luego se descarta. 4. Repetir paso anterior pero con 5mL y sin descartarlo. Esta ser la muestra para hacer las mediciones. El tubo se mete en un envase con hielo. Esto es para que las clulas no sigan creciendo. 5. Cerrar la vlvula y sellar manguera Cultivo continuo: 1. Se roca la manguera de salida con etanol 70%. 2. Se obtiene 5mL de volumen de desecho de la manguera de salida donde continuamente sale cultivo. Esto se hace para eliminar el cultivo dentro de la manguera y para ambientar el tubo falcon. El volumen se anota y luego se descarta. 3. Se obtiene 7mL de muestra en el tubo falcon. El tubo se pone en hielo.

Medicin de peso seco


1. Cuidar que la implementacin sea apropiada, usando implementos de seguridad personales como lentes o guantes. 2. Se pesa el filtro en la balanza infrarroja 3. Se coloca el filtro (seco) sobre el embudo, el cual esta acoplado a un matraz y a la bomba. 4. Se pipetean 20 mL (10mL + 10mL) desde el falcon con la muestra de S.cerevisiae al filtro. 5. Se lava la muestra usando agua. 6. Se inicia el proceso de filtrado, con la bomba que permite alcanzar los 10 mbar, hasta que no se aprecie ms escurrimiento de fluido. 7. Una vez terminado se quita cuidadosamente el filtro del embudo (tomndolo desde el costado) para evitar su ruptura. 8. Se lleva el filtro con la muestra a la balanza infrarroja (no superar 65 C) dejndolo hasta que la variacin de peso en el tiempo sea despreciable. 11

9. Se le quita al peso encontrado el del filtro, obtenindose el peso seco de la muestra.

Centrifugacin
1. 2. 3. 4. Se mide 2 muestras de 1.5mL cada uno en tubos eppendorf. Se programa la centrifuga a 6C, 14000 RPM y 5 minutos. Se colocan las muestras idnticas en lados opuestos de la centrifuga para balancearla. Se inicia el proceso de centrifugado, despus de verificar que este bien cerrado. Corroborar que no hayan ruidos extraos que indiquen algn malfuncionamiento de la centrfuga. 5. Una vez terminado el proceso se abre la centrfuga y se sacan ambas muestras. 6. Se extrae el sobrenadante en otro tubo eppendorf rotulado y se guarda en el refrigerador a -80C . Este se va a usar para el anlisis de glucosa y acetato con HPLC. El pellet se descarta.

HPLC
1. Seleccionar la fase estacionaria y mvil adecuada para la realizar la separacin. 2. Para calibrar el HPLC se realiza el proceso de cromatografa con una sustancia de concentracin conocida, luego el rea bajo la curva en el cromatograma correspondiente se calibra hasta la concentracin de la sustancia introducida. Adems, mediante software es posible regular los tiempos de retencin para cada compuesto y el rea bajo la curva para la concentracin del compuesto, todo esto para mejorar la identificacin y cuantificacin de las sustancias en la muestra. 3. Para realizar la medicin, se carga la muestra a analizar en la matriz de tubo. 4. Se selecciona la posicin en que se coloc la muestra y se inicia el proceso de cromatografa. La duracin del muestreo es cercana a los 30 minutos. 5. En el cromatograma se identifican y cuantifican los componentes de la muestra segn su tiempo de residencia e ndices de refraccin. Dada una base de datos previa donde se identifican estos datos para los compuestos probables, el programa identificar los peaks y determinar el (los) compuesto (s) correspondiente.

Espectrofotometra
1. Se lavan y limpian las cubetas evitando el dao a la superficie de esta, lo cual podra impedir la correcta medicin de absorbancia. 2. Se calibra el espectrofotmetro con una muestra blanco de 1mL de, en este caso, NaCl 0.9%. 3. Se pipetea la muestra en la cubeta. La dilucin depender del valor de la absorbancia. La dilucin se hace con NaCl 0.9% (medio isotnico) para evitar la lisis de las clulas. 4. Se mide la absorbancia de la muestra con materia orgnica: de estar entre 0 a 0.6 se puede considerar la medicin ya que estamos en el rango lineal en la relacin concentracin vs. Absorbancia, es decir, se puede usar la ley de Lambert-Beer. Si es que se supera este valor, es necesario diluir la muestra hasta cumplir ese rango y extrapolar luego a la concentracin inicial. 12

Resultados
Se hicieron mediciones para 3 tipos de cultivos: batch, continuo y fed-batch. Obtuvimos datos para la densidad ptica, y concentraciones de glucosa y acetato. Con estos datos luego se procedi a calcular los parmetros cinticos de cultivos tales como YSX, y ks. Primero se calculo la ecuacin para la curva de calibracin. Utilizando los datos dados de 3 experimentos para cada uno de las 5 muestras se obtuvo la masa de cada experimento, la masa promedio de cada muestra y un valor promedio de la densidad ptica (OD600). Los valores se muestran en la Tabla 1. Tabla 1 Mediciones para la curva de calibracin.

Muestra (g)
0.008427 0.00834726 0.008379 0.009959 0.0098028 0.0097414 0.01319954 0.0129926 0.0119 0.029289 0.027994 0.029994 0.03242 0.03286 0.03382

Promedio OD600
4.2

Promedio Muestra (g)


0.00838442

Biomasa (g/L)
4.19221033

5.92

0.0098344

4.9172

9.64

0.01269738

6.34869

27.8

0.02909233

14.5461667

31.3

0.03303333

16.5166667

Con los valores de OD600 promedio y concentracin de biomasa se hizo un grafico de absorbancia de OD vs biomasa (Fig. 3). Luego se ajusto una recta a esos puntos. La ecuacin de la recta obtenida (ec. 17) es la ecuacin de la curva de calibracin. Este se va a usar para calcular la concentracin de biomasa en funcin de OD.

Luego se procedi hacer los clculos respectivos para cada tipo de cultivo.

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Curva Calibrado de Absorbancia


40 30 OD600 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Biomasa (g/L) y = 2,212x - 4,8087 R = 0,999

Figura 3 - Curva de calibracin con densidad ptica vs concentracin de biomasa

Cultivo Batch
La tabla A1 en anexos muestra los datos de las condiciones del cultivo. Las mediciones que se obtuvieron se encuentran en la tabla 2. Tabla 2 Mediciones de cultivo batch Volumen Volumen Hora Desecho Muestra (mL) (mL) 14:00 3 5 15:48 4 5 17:13 3.75 4 17:33 4.25 5.75 17:56 1 4 18:37 2.3 4 19:19 3 4 19:43 2 4.5 20:00 2.5 10 20:49 4 6.5 21:17 3 7

OD600 0.275 0.114 0.261 0.342 0.425 0.55 0.405 0.497 0.545 0.537 0.554

Factor de Dilucin 1 10 10 10 10 10 20 20 20 20 20

Glucosa (g/L) 9.028 8.189 7.010 6.570 5.784 4.351 2.205 0.546 0.011 0.009 0.005

Acetato (g/L) 0.040 0.030 0.035 0.028 0.032 0.024 0.079 0.133 0.123 0.041 0.004

De los datos de la Tabla 2, calculamos el tiempo en horas, con 14:00hr como t=0, y la biomasa en g/L con la ec. 1. De esta manera se obtuvieron los siguientes valores (Tabla 3).

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Tabla 3 Cantidad de concentracin de biomasa (X) en el tiempo Tiempo (hr) X (g/L)

0 2.3049175 1.8 2.695638 3.21666667 3.359637 3.55 3.725514 3.93333333 4.100425 4.61666667 4.66505 5.31666667 5.83947 5.71666667 6.670598 6 7.10423 6.81666667 7.031958 7.28333333 7.185536 Utilizando los valores de las concentraciones de glucosa, acetato y biomasa (Tablas 2 y 3), se hizo un grafico de concentracin vs tiempo (Fig. 4) para ver el comportamiento de cada componente en el tiempo.

Biomasa, glucosa y acetato vs tiempo


10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 0 Concentracion (g/L)

Biomasa Glucosa Acetato

4 Tiempo (hr)

Figura 4 Concentraciones de biomasa, glucosa y acetato vs tiempo en cultivo batch. Se grafico el acetato por separado para ver con ms detalle su comportamiento en el tiempo (Fig. 5).

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Concentracion de acetato en el tiempo


0,160 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Conentracion (g/L)

Tiempo (hr)

Figura 5 Produccin de acetato en el tiempo en cultivo batch Para el clculo de los parmetros de rendimiento YSX, se utilizo los valores de la biomasa de la Tabla 3 y sabiendo que YSX = se obtienen los valores de la Tabla 4. Tabla 4 Valores calculadas de parmetros de crecimiento

X (g/L)
2.3049175 2.695638 3.359637 3.725514 4.100425 4.66505 5.83947 6.670598 7.10423 7.031958 7.185536

ln(X)
0.83504488 0.99163491 1.21183293 1.31520483 1.41109063 1.54009855 1.76464004 1.89770951 1.96069038 1.95046519 1.97207012

Ysx OD600*FD Rendimiento


0.46539521 0.56301558 0.8319887 0.47683973 0.39413763 0.54738617 0.50095051 0.8094528 -54.2333377 34.9591162 0.275 1.14 2.61 3.42 4.25 5.5 8.1 9.94 10.9 10.74 11.08

Dejando fuera los ltimos 2 valores de YSX, se hizo un promedio de YSX con los valores de la Tabla 4, llegando a un valor de YSX_promedio = 0.57364579 g/g Adems se construy un grafico de ln(x) en el tiempo para obtener el valor de la pendiente de la curva, o sea, . Especficamente se deseaba encontrar max, o sea, en la fase de crecimiento exponencial. Desde la figura 6 se puede observar que el valor de max es 0.3246 (1/hr)

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Ln(X) v/s t , en la fase exponencial


2 1,5 ln(X) 1 0,5 0 0 2 4 Tiempo (hr) 6 8 y = 0,3246x + 0,0408 R = 0,9999 Ln(X) Lineal (Ln(X))

Figura 6 ln(X) en el tiempo para la fase exponencial de crecimiento en cultivo batch. Para el clculo de Ks se hizo algo similar a lo anterior pero tratamos que encontrar el valor de tale que = max/2. El valor de la concentracin de glucosa en ese punto es el valor de Ks. La pendiente de los puntos 2, 3 para tiempos y ln(X), daba una pendiente de =0.1554, lo cual es muy cercano a max /2 = 0.1623 (Fig. 7). Se tomo un promedio de los tiempos y concentracin de glucosa en los puntos 2 y 3 y se obtuvo que aproximadamente en el tiempo t=2.5 hr, la concentracin de glucosa es 7.6 g/L, lo que es el valor de Ks buscado.

ln(X) vs tiempo
1,4 1,2 1 ln(X) 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Tiempo (hr) y = 0,1554x + 0,7119 R = 1

Figura 7 - ln(X) en el tiempo para la fase lag de crecimiento en cultivo batch

Cultivo Continuo (Quimiostato)


Las condiciones del cultivo se pueden ver en la Tabla A2 en Anexos. Se midi las cantidades de glucosa, acetato, oxigeno y CO2 disuelto en el medio para diluciones distintas hasta que se observa un lavado del sistema (Tabla 5).

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Tabla 5 Mediciones del cultivo continuo

D (OD600)*F (1/h) D
0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.6 10.99 10.34 11.34 10.54 11.46 11.22 0

Glucosa (g/L)
0.047 0.073 0.115 0.171 0.266 0.476 10

Acetato (g/L)
0.004 0.003 0.003 0.003 0.003 0.016 0

%O2 (v/v)
0.209 0.209 0.209 0.208 0.208 0.209 0.21

%CO2 (v/v)
0.086 0.097 0.108 0.120 0.131 0.143 0.04

Oxigeno Disuelto (ppm)


5.273 5.109 4.765 4.643 4.265 4.070 6.2

Con la ecuacin 1, se calcula la concentracin de biomasa en el reactor para cada dilucin, obtenindose los valores de la Tabla 6. Con estos datos se construyo un grafico de concentracin de biomasa vs dilucin (Fig. Tabla 6 Concentracin de biomasa para distintas diluciones

D (1/h)
0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.6

Biomasa (g/L)
7.14306258 6.85110054 7.30090347 6.94290078 7.35850603 7.24889268 2.1807

Luego se grafico la produccin de acetato y biomasa y el consumo de glucosa para las distintas diluciones. (Fig. 8)

Biomasa, glucosa y acetato vs dilucion


12,000 10,000 Concentracion (g/L) 8,000 6,000 4,000 2,000 0,000 -2,000 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 Dilucion (1/hr) 0,5 0,6 0,7 Glucosa (g/L) Acetato (g/L) Biomasa

Figura 8 Concentracin de biomasa, glucosa y acetato para distintas diluciones en cultivo contino 18

Para observar mejor el comportamiento de acetato (Fig. 9), y glucosa (Fig. 10), se construyeron grficos separados. Para el grafico de glucosa, solo se grafico hasta la dilucin 0.5 1/hr dado que a 0.6 1/hr la concentracin de glucosa se dispara y aumenta en 2 rdenes de magnitud (desde 0.476 g/L hasta 10 g/L). Luego para ver cmo se comporta la glucosa antes del lavado (dilucin 0.6 1/hr) se grafica hasta la dilucin 0.5 1/hr.

Acetato
0,020 Concentracion (g/L) 0,015 0,010 0,005

0,000
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Dilucion (1/hr)

Figura 9 Concentracin de acetato para distintas diluciones en cultivo contino

Glucosa
0,500 Concentracion (g/L) 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Dilucion (1/hr)

Figura 10 Concentracin de glucosa hasta antes del lavado del sistema en cultivo contino. Tambin se grafico la cantidad de O2 y CO2 en %v/v en el reactor para cada dilucin. (Fig. 11)

19

O2 y CO2 vs dilucion
0,250 0,200 % (v/v) 0,150 0,100 0,050 0,000 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 %O2 (v/v) %CO2 (v/v)

Dilucion (1/hr)

Figura 11 Cantidad de oxigeno y CO2 disuelto en el reactor (0.4L) para cultivo continuo Luego se procedi a calcular los valores de la Tabla 7.

Ysx

1/Ysx

1/Mu

1/Glucosa

Mu

0.71768092 1.39337688 5 21.266755 1.39337688 0.69014069 1.44897992 4 13.71876 1.44897992 0.73861114 1.35389239 3.33333333 8.66833666 1.35389239 0.70638726 1.41565407 2.85714286 5.83927175 1.41565407 0.7559785 1.32278894 2.5 3.75587376 1.32278894 0.76111411 1.31386344 2.22222222 2.10108329 1.31386344 1.66666667 0.1 Tabla 7 Valores de Rendimiento y tasa de crecimiento para distintas diluciones Con los valores de la tabla 7 se construyeron las figuras 12 y 13

1/Ysx v/s 1/Mu


2
1,5 1 0,5 0 0 2 4 6 y = 0,032x v/s 1/Mu 1/Ysx + 1,2686 R = 0,3829

Figura 12 Relacin entre rendimiento y tasa de crecimiento celular

20

1/Mu v/s 1/s


6

5
4 3

y = 0,1522x + 1,8772 R = 0,9876 1/Mu v/s 1/s

2
1 0 0 10 20 30

El intercepto es Mu max La pendiente Ks/Mu max Mu max=0,532 Ks=0,0810

Figura 13 Relacin entre tasa de crecimiento celular y tiempo

Cultivo Fed-batch
Las condiciones del cultivo fed-batch se pueden observar en la Tabla A3 en los Anexos. Utilizando los datos de medicin (Tabla A4 en Anexos) y la ecuacin 1, calculamos la concentracin de biomasa en el reactor en el tiempo (Tabla 8). Tabla 8 Valores calculados para biomasa (X)

Tiempo (hr)

X (g/L)

ln (X)

0 2.338795 0 2 2.347829 0.85349107 3.06666667 2.528509 0.9276298 3.93333333 2.731774 1.00495122 4.83333333 3.070549 1.12185637 5.61666667 3.49063 1.25008224 6.31666667 4.104942 1.41219161 7.1 4.827662 1.57436229 8.48333333 7.23974 1.97958529 8.96666667 8.5045 2.14059544 10.05 10.67266 2.36768533 10.7 12.97633 2.56312693 11.35 15.46068 2.73830003 12.4333333 19.3453 2.9624495 12.9666667 20.83591 3.03667794 13.4666667 22.484615 3.1128313 14.0166667 23.5762233 3.16023872 14.7166667 24.314 3.19105232 21

15.2333333 15.7333333 16.2666667 16.8833333

25.39808 25.62393 25.39808 25.03672

3.23467358 3.24352668 3.23467358 3.22034355

Considerando que el proceso fed-batch no comienza al mismo tiempo que el muestreo, se debe considerar el punto en el que comienza la alimentacin. Esto es aproximadamente a los 7.7 hr desde el comienzo del muestreo. El perfil del desarrollo de este proceso se ve en las figuras siguientes.

Biomasa vs tiempo
30 25 Biomasa (g/L) 20 15 10 5 0 0 10 Tiempo (hr) 20 Biomasa (g/L)

Figura 14 Perfil de biomasa durante todo el tiempo de muestreo del cultivo fed-batch

Biomasa vs tiempo
30 25 20 15 10 5 0 0 10 Tiempo (hr) 20 Biomasa (g/L)

Biomasa (g/L)

Figura 15- Perfil para la fermentacin fed-batch (ya que se dice que la alimentacin se conecta cerca de 7.7 horas despus de iniciado el muestreo). Para el clculo del flujo que ingresa se usa la frmula:

(ecuacin 18) 22

En el que los valores vienen dados y son:

Siendo M el volumen correspondiente a las muestras tomadas antes de la conexin del flujo de entrada. Con esto nos queda que Fin es:

Para tener el volumen a cada instante es necesario saber cul es el volumen que ha ingresado por Fin hasta cierto instante, esto lo podemos obtener al integrar la ecuacin de en el tiempo (se resta 7,7 pues es tiempo en el que comienza el fed-batch):

En esta situacin el volumen estar dado en cada instante por:

Con M(t) el volumen para realizar el muestreo (aunque es un valor marginal al considerar el tamao total, a la postre puede influir en el resultado). As, tenemos que el y el volumen del reactor en funcin del tiempo es de:

Tabla 10 - Flujo de alimentacin y volumen en el cultivo fed-batch. Tiempo (hr) Volumen (L) (L/hr) 8,48333333 0,02019841 0,00288319 0,32718319 8,96666667 0,02134921 0,00504209 0,32234859 10,05 0,02392857 0,01118445 0,33419795 10,7 0,02547619 0,01595076 0,34145854 11,35 0,02702381 0,0217433 0,34764859 12,4333333 0,02960317 0,03429944 0,35790434 12,9666667 0,03087302 0,04215113 0,36715832 13,4666667 0,03206349 0,05074509 0,37415088 14,0166667 0,03337302 0,06181319 0,38622059 14,7166667 0,03503968 0,07881691 0,4032233 23

15,2333333 15,7333333 16,2666667 16,8833333

0,03626984 0,03746032 0,03873016 0,04019841

0,09386745 0,11083089 0,13196161 0,16100436

0,41687384 0,43383868 0,4542694 0,48281286

Para el clculo de la tasa de crecimiento es necesario dibujar un grfico ln(XV) vs tiempo en el cual es posible estimar segn la correspondencia entre el ajuste lineal y el logaritmo de la ecuacin de biomasa en funcin del tiempo (ecuacin 3) (ecuacin 19) ln(XV)t = ln(XV)0 + *t y = b + m*x En este caso el ajuste a los datos queda como en la figura 16.

Ln (XV) vs tiempo (hr)


3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 20 y = 0,1977x - 0,6592 R = 0,9592 Ln (XV) vs tiempo (hr) Lineal (Ln (XV) vs tiempo (hr))

Figura 16 Grafico de ln(XV) en el tiempo para el cultivo batch Tabla 11 valores de ln(XV) calculado en cultivo fed-batch Tiempo (hr) 8,48333333 8,96666667 10,05 10,7 11,35 12,4333333 12,9666667 13,4666667 14,0166667 14,7166667 15,2333333 15,7333333 Ln (XV)t 0,86235025 1,00847369 1,27166353 1,48859793 1,68173692 1,93495995 2,03471581 2,12973517 2,20889212 2,28278755 2,35970194 2,40844416 24

16,2666667 2,44560871 16,8833333 2,49221739 Luego, de la figura 16 se obtuvo que el valor de (la pendiente) es 0.1977 (1/hr). Finalmente se grafica XV por el tiempo para el proceso batch completo (Fig. 15)
14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 XV vs tiempo XV batch previo Lineal (XV vs tiempo) y = 1,2355x - 8,4457 R = 0,995

Figura 17 - Grfico VX vs tiempo para el cultivo fed-batch. Cuadrados rojos: gr. de biomasa del cultivo batch previo, rombos celestes: gr. de biomasa del fed-batch.

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Discusin
Segn la ley de Lambert-Beer, las mediciones de biomasa solo sirven dentro un cierto rango de OD. En este caso, el rango en que la curva de calibrado es vlido es entre 4.2 y 31.3 OD600. Cuando se produce el lavado, el OD es 0 lo cual queda debajo del rango mencionado. Por esta razn, la curva de calibracin no se puede utilizar para calcular biomasa cuando ocurre el lavado. Esto explica la cantidad positiva de biomasa para OD600 = 0 en el quimiostato, cuando debera ser 0 g/L.

Cultivo continuo
De los datos de cultivo continuo se obtuvo un coeficiente de mantencin 0.032 y un rendimiento real en glucosa variable a travs del tiempo que promediaba 0.728. El coeficiente de mantencin es despreciable ya que la tasa a la que se reproduce el microorganismo es elevada implicando un consumo de sustrato mucho mayor. El coeficiente demantencion pasa a ser relevante cuando la velocidad de crecimiento es pequea Los valores de max y Ks resultaron 0,532 y 0,0810 respectivamente. Ks o constante de saturacin corresponde a la concentracin de sustrato para la cual se crece a max/2. La constante de saturacin es inversa a la afinidad del organismo por el sustrato, es decir que a mayor Ks el organismo es menos afn al sustrato por lo que se debe poner en contacto con el organismo una mayor cantidad de sustrato para que este la perciba. Podemos dar mayor razn a este hecho mediante a la ecuacin de Monod; Para una determinada concentracin de sustrato, a Ks bajo nos aproximamos cada vez ms a max, mientras que si aumentamos Ks, Mu disminuye, en fin, mientras Ks<<S tenemos que Mu ser igual a max. Los valores tpicos Ks de Escherichia coli para glucosa varan entre 0.07 y 2 mg/L ( nuestro Ks calculado estara dentro de esyos rangos) por lo que bastaran concentraciones relativamente bajas de sustrato para hacer crecer nuestra coli a max. Respecto a max los valores tpicos para Escherichia coli varan segn cepa y medio de cultivo, pero estos oscilan entre 0.14 y 0.82 [1/h] por lo que estaramos dentro de los rangos aceptados. Tenemos que para cultivo quimiostato/batch; max= 0,532 /0.324 , Yxs=0.728/0.573 En definitiva los valores no son iguales, y confiaremos ms en los parmetros obtenidos en el quimiostato ya que en este sistema, al trabajar en estado estacionario los valores a obtener para el clculo de max son independientes del tiempo en que uno los tome. Mientras que en el batch, los valores medidos dependen todos del tiempo. Ms an debido a esta diferencia somos capaces de tomar muchas mediciones en el quimiostato y luego sacar un promedio mientras que en el batch tendremos una sola posibilidad. Cuando D=0.4 se comienza a producir acetato, tenemos que a esta tasa de dilucin estamos muy cerca de la tasa a la que comienza a lavarse el reactor. Cabe decir que el reactor termina por lavarse a D=0.6 donde obviamente tenemos biomasa nula y mximos niveles de glucosa. Como se puede observar de la figura 8, en la dilucin 0.5 1/hr comienza a disminuir la cantidad de biomasa en el reactor porque el sistema est comenzando el lavado. Como hay menos microorganismos, hay menos consumo de glucosa y menos produccin de acetato. Esto explica los cambios de las pendientes para acetato y glucosa en las figuras 9 y 10 respectivamente. Adems en esta misma dilucin ocurre un aumento en la cantidad de oxigeno disuelto en el medio y una disminucin en la cantidad de CO2 disuelto (Fig. 11). Esto es porque hay menos E. coli que puede consumir oxigeno y producir CO2. 26

En D=0.6 1/hr se produce el lavado completo del sistema. Es decir que no quedan microorganismos en el reactor. Esto explica que la concentracin del acetato sea 0 g/L (no hay E. coli para producirlo) y que la concentracin de salida de glucosa sea la misma que la entrada (no hay E. coli para consumirla). Una inconsistencia es que la densidad ptica sea 0 cuando D=0.6 1/hr. Dado que el espectrofotmetro se calibro con NaCl 0.9%, lo cual es menos turbio que el medio de cultivo que se utilizo para E. coli, el OD para el sistema lavado (solo medio de cultivo) debera ser un numero positivo. Esto se puede explicar con Lambert-Beer. Como esta ley solo es vlida dentro de cierto rango (para concentraciones de biomasa entre 4.19 g/L 16.51 g/L, el rango en el cual se construy la curva de calibracin) Otra inconsistencia es la cantidad positiva de CO2 en el lavado. Como no hay E. coli para producirlo, el valor debera ser 0 g/L. Una explicacin es que quizs una pequea cantidad de CO2 se haya disuelto bien en el medio y por ende se va a demorar ms en eliminarlo del sistema. Otra explicacin es que el flujo de alimentacin de aire contiene pequeas cantidades de CO2. Para estimar las tasas especficas de produccin de Co2 y consumo de O2 podemos realizar balances de masa. Balance fase gaseosa oxgeno: 0 = C02*Ff - C02*F Kla(O2*-O2) Balance fase gaseosa oxgeno: 0 = CC02*Ff - CC02*F Kla(CO2*-CO2) Balance fase lquida oxgeno: 0= Kla(O2*-O2)*V-ro2*X*V => = ro2 //Asumiendo um X promedio de 0,14 y O2 =0,023 y Kla=140 ro2=0.4508 Balance fase lquida dixido de carbono: 0= Kla(CO2*-CO2)*V-rco2*X*V => = rCo2

Respecto a la produccion de acetato se tienen variadas teoras, que El flujo de carbono se va hacia acetato porque el ciclo de Krebs ya est funcionando a su mxima capacidad o que se produce debido a la falta de oxigeno por mencionar solo dos. Si tomamos la produccin de acetato desde el ltimo punto de vista podremos modelar la produccion de acetato em funcin de la incorporacion de oxigeno al microorganismo. Y diremos que se produce acetato cuando la tasa especfica esperada de consumo de oxigeno del organismo es menor a la incorporacin posible debido a limitaciones de solubilidad.

27

Cultivo fed-batch
Debemos considerar que para el caso batch anterior se calcul la mxima tasa, siendo el promedio seguramente de menor magnitud, ya que luego del periodo lag y antes de la fase estacionaria hay un descenso de la tasa de crecimiento con respecto al mximo. Si observamos la cantidad de biomasa al alcanzarse el estado estacionario del proceso batch (6 horas aproximadamente) tenemos que la concentracin es de 7.1 g/L. En este caso se observa una etapa de crecimiento exponencial, que seguramente debe ajustar a una cintica como la que describe Monod (ecuacin 3). Si vemos los grficos de para el cultivo por lotes alimentados vemos que ajusta bastante bien a una curva lineal (R > 90), en la que la tasa de crecimiento () se mantendra constante durante el proceso. Por lo tanto, en este caso el crecimiento no depende de la concentracin de sustrato como en batch sino que es constante durante el proceso. La variable del proceso que diferencia el caso batch del fed-batch es la presencia de alimentacin, por lo tanto es esperable que ah este la causa de las diferencias que se puedan esperar entre los cultivos. Gracias a esta alimentacin podemos fijar a un valor especfico, el cual se calcul y se presenta en los resultados. Cabe destacar, que a pesar de que la aproximacin lineal es buena para este caso, la tasa presenta un ligero pero sostenido descenso a medida que va pasando el tiempo. Sin embargo, la tasa de crecimiento que se fij no corresponde a la que se observa experimentalmente. En el cultivo el microorganismo crece ms lentamente de lo presupuestado, = 0.3 [1/h] y [1/h] es el experimental. Una de las posibles causas es la aparicin de un crecimiento restringido desde el punto de vista limitante, como se present en la clase 7 del profesor Agosin. El siguiente grfico representa esta situacin:

Figura 18 - Crecimiento del microorganismo en cultivo por lotes alimentados (CLA) en condiciones de crecimiento no restringido (exponencial) y de crecimiento restringido (limitado) desde el punto de vista del nutriente limitante. Notamos que hacia el final el crecimiento de la biomasa (VX) deja su comportamiento exponencial (y constante) para llegar a un crecimiento lineal (y decreciente). La primera condicin se da cuando S >> Ks, es decir estamos alimentado al microorganismo con sustrato mayor a la tasa de saturacin (Ks), as no ver su crecimiento afectado por la falta de glucosa. En el caso restringido tenemos que S es despreciable frente a X/Y X/S, lo cual corresponde al S consumido por L de reactor. Es decir, est consumiendo ms rpido de lo que alimentamos, lo que lleva a que se limite el crecimiento de la bacteria. En nuestro caso si graficamos VX (Fig. 15).

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Vemos que ajusta todo muy bien a una funcin lineal lo cual correspondera a un cultivo de crecimiento restringido. Lo mismo se obtiene de la tasa calculada en resultados. Se observa un decrecimiento con el tiempo en vez de ser lineal. Una explicacin para esto es que E. coli aumenta tanto su biomasa que empieza a estresarse a concentraciones muy altas. Debido a este estrs E. coli disminuye su tasa de crecimiento. Tambin empieza a producir acetato bajo condiciones de estrs, lo cual es un inhibidor de crecimiento. Con respecto al muestreo, en este caso, el volumen de muestra que se saca del reactor para realizar el estudio de absorbancia y el de desecho puede ser un factor que incida en el crecimiento, quizs no en una magnitud importante, pero an as considerable. Por ejemplo, en la primera parte del cultivo batch, se comienza con 0.4 L y producto del muestreo se queda (al momento en el que se conecta la alimentacin) con 0.33 L. En total, se retiran 0.17 L de muestra lo cual es casi la mitad del volumen total con el que comenzamos en el reactor. Si se desprecian, el cambio que generan en las otras variables es considerable, ms no crtico. Por ejemplo, la tasa de crecimiento aumentara a 0.19 [1/h] pero no hay valores q cambien de signo, o que cambie la condicin de crecimiento (sigue observndose como restringido). Por lo tanto, la limitacin en el muestreo tiene como fundamento no interferir en el crecimiento normal del cultivo fed-batch. Entre las posibles causas de la limitacin de la biomasa hasta 50 OD, podemos encontrar la ya nombrada restriccin ligada al crecimiento del nutriente limitante, en la que al hacia el final (cuando se queda estancado el valor de OD) se hace cada vez ms insuficiente el sustrato alimentado para la biomasa presente. Oxigeno: puede ser que se estn quedando sin lo necesario al aumentar en tal proporcin la biomasa, mejorar alimentacin. La otra medicin posible de realizar es la del acetato. Segn Yee et al. (8) el acetato inhibe el crecimiento celular y reduce la produccin de protenas recombinantes, en este caso solo la primera consecuencia es la que observamos. El volumen del sistema va aumentando con el tiempo (Tabla A2 en Anexos) lo cual es consistente con un cultivo fed batch. Dado que hay flujo de entrada y no de salida y que el volumen de muestras y desecho (8mL aproximadamente) no es tan grande en comparacin con el volumen del medio (400mL), el flujo de entrada es mayor que el volumen retirado y por esta razn aumenta el volumen en el tiempo. Para alcanzar valores de biomasa mayores se puede regular el de modo tal que no se produzca tanto acetato, podemos mejorar las condiciones de aireacin y agitacin para obtener una transferencia de oxigeno ms eficiente y aumentar la alimentacin de glucosa a valores mayores para que no se vea afectado el crecimiento por su carencia.

Cultivo Batch
El lag-time corresponde a la fase en la que la biomasa no presenta un aumento observable en su concentracin. Esto se puede deber a que las clulas estn preparndose para la divisin, recolectando nutrientes o aumentando su tamao, crecimiento celular (como se observa en Wade (2)). En el grfico y en la tabla de los resultados no se observa ningn intervalo en el que la cantidad de biomasa se mantenga constante. Entre 0 y 1.8 hrs. se produce un aumento de biomasa (2.3 g/L a 2.69 g/L). En consecuencia, lo que podemos decir de la duracin del lag es que es menor a 1.8 hrs, pero no se distingue debido a que no se realiz muestreo ms exhaustivo. Sin embargo, debido a la baja tasa de crecimiento que se observa en este primer intervalo, podramos decir que puede ser un valor cercano a esas 1,8 horas. La duracin del lag time est determinada por factores como el tamao del inculo, tiempo necesario para recuperarse de dao fsico o 29

shock en la transferencia, tiempo requerido para la sntesis de enzimas (que pueden ser inducidas por el medio en el que se encuentra) o cofactores esenciales para metabolizar los nutrientes especficos presentes en el medio (7). En consecuencia, un modo de acortar el periodo lag puede ser manteniendo las clulas, previo a la inoculacin, en un cultivo de caractersticas similares a las que se encontrarn en el medio batch definitivo y de este modo evitar el shock de las clulas y la necesidad de sintetizar nuevas enzimas para el metabolizar los nutrientes del nuevo cultivo. Acetato es una producto lateral que produce Escherichia coli cuando est realizando fermentacin aerbica. La tasa en la que se produce acetato es directamente dependiente de la tasa en la que clula crece, consumiendo su sustrato glucosa. La produccin se produce especficamente cuando hay overflow metabolism en E. coli. Esto es, se llega a un punto en la saturacin de la tasa de captura de oxigeno por parte de la clula, pasando a fermentacin como su metabolismo (5).

Fig 19 - Tasas de captura de oxigeno (azul) y de formacin de acetato (rojo) cuando E. coli pasa a overflow metabolism En el caso de la presente experiencia, se mantiene en niveles muy reducidos a lo largo de todo el cultivo, pero cuando la biomasa de la clula est comenzando a detener su crecimiento (estado estacionario) el acetato presenta un sbito peak para luego decaer nuevamente. El bajo nivel remanente en el primer tramo puede indicar que algunas bacterias a) tienen menos oxigeno del requerido y estn realizando fermentacin anaerobia, o b) tienen ms oxigeno del que soportan y hacen fermentacin en condiciones aerbicas. Esta diferencia en las concentraciones de oxigeno es debido a que el medio no es homogneo y no todas las zonas reciben la misma transferencia de oxgeno. Para remediar esto medidas como aumentar la velocidad de la agitacin pueden ayudar. Al estar cercano a las 6 horas la tasa de captura de oxigeno se eleva por sobre los niveles de soportables por la clula a nivel ms generalizado lo cual provoca un aumento en los niveles de acetato (la tasa de crecimiento comienza a disminuir por lo tanto la cantidad de oxigeno disponible para cada bacteria aumenta repentinamente), sin embargo, al pasar este estado de transicin (de crecimiento exponencial a estado estacionario) ya se readecuan los sistemas a los nuevos niveles, evitando la produccin de acetato. Parmetros a considerar para la cintica de crecimiento? Puede ser el consumo de oxigeno, pues nos indica que tan rpido crece en funcin de lo rpido q baja el oxigeno (o generacin de CO2 cuando hay mas biomasa). Tambin la tasa de consumo de glucosa nos permite ver cmo va variando el crecimiento celular (el consumo es como una exponencial invertida al crecimiento de la biomasa). Supuestos? Que solo tenemos una bacteria 30

por lo tanto lo que se consuma ser lo que E. coli consume. Adems no hay ni entrada ni salida, as que es ms fcil de determinar, no hay alteraciones externas.

Conclusiones y Recomendaciones
En conclusin se observo que los 3 cultivos se comportaron de manera esperada. Los datos obtenidos eran similares a los valores obtenidos a partir de los balances de masa y la ecuacin de Monod (modelo). Para mejorar los clculos en el cultivo batch se necesitara tener ms datos para la fase lag para as poder calcular Ks de manera ms precisa. Para el cultivo continuo, se podra hacer diluciones ms pequeas para poder ver y analizar mejor el efecto del coeficiente de mantencin. Para el cultivo batch se podra haber tomado muestras ms seguidas (tiempo de intervalo menor) para tener ms puntos en los grficos y de esa manera calcular una tasa de crecimiento ms preciso.

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Nomenclatura
A: absorbancia c: concentracin del material (g/cm3) C02: concentracion de O2 (g/L) Cc02: concentracion de CO2 (g/L) D: tasa de dilucin (1/hr) F = flujo de salida (L/hr) F = flujo de salida (L/hr) FD: factor de dilucion Ff = flujo de alimentacin (L/hr) Ff = flujo de alimentacin (L/hr) I: intensidad de luz transmitida I0: intensidad de luz incidente KLa: coeficiente de transferencia de oxigeno (1/hr) Ks : medida inversa de la afinidad entre el microorganismo y el sustrato limitante (Tambin se describe como el valor de S(t) cuando ) l: la distancia que viaja la luz (cm) m: coeficiente de mantenimiento celular OD600 = densidad ptica a longitud de onda 600nm qS=tasa volumtrica de generacin de sustrato qX=tasa volumtrica de generacin de biomasa S (t): concentracin de sustrato dado en un tiempo Sf = concentracin de sustrato en el flujo de alimentacin (g/L) t: tiempo (hr) V= volumen (L) X (t) o X: concentracin de sustrato dado en un tiempo X0 concentracin inicial de biomasa (g/L). Xf = concentracin de sustrato en el flujo de alimentacin (g/L) YSX rendimiento de sustrato para producir biomasa (g/g) : coeficiente de absorcin molar (M/cm) : tasa de crecimiento celular (1/hr) max: tasa de crecimiento celular mxima (1/hr) set: tasa de crecimiento celular fija para el sistema (1/hr)

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Bibliografa
1. 2. 3. 4. Agosin, E. Clase 4- Cultivo batch. 2012. Agosin, E. Clase 5- Cultivo continuo. 2012. Agosin, E. Clase 7- Cultivo por lote alimentado. 2012. Beer-Lambert Law. Stage 2 Chemistry Social Relevance Projects. The University of Adelaide. http://www.chemistry.adelaide.edu.au/external/socrel/content/beerslaw.htm Eiteman , Mark A. , Altman,Elliot. Overcoming acetate in Escherichia coli recombinant protein fermentations. TRENDS in Biotechnology 2006 Vol.24 No.11 http://mic.sgmjournals.org/content/7/1-2/18.full.pdf Wade H.E, Observations on the Growth Phases of Escherichia coli, American Type ' B '. J . gen. Microbiol. 7. 1952 , 1823 http://textbookofbacteriology.net/growth_3.html Yee, L. Blanch HW. Recombinant protein expression in high cell density fed-batch cultures of Escherichia coli. 1992, Dec;10(12):1550-6.

5. 6.

7. 8.

33

Anexos
Tabla A1 Condiciones de cultivo batch Volumen Reactor 600 mL Agitacin 800 rpm Flujo Aire 2 VVM Kla 202 1/h Temperatura 37 C pH 6.7 -

Tabla A2 Condiciones del quimiostato Volumen Reactor 400 mL Agitacin 500 rpm Flujo Aire 1.5 VVM Kla 140 1/h Temperatura 37 C pH 6.7 Glucosa feed 10 g/L Tabla A3 Condiciones de cultivo fed-batch Volumen Batch 400 mL Agitacion Max 800 rpm Flujo Aire Max 2 VVM Flujo Oxigeno Max 0.5 VVM Kla max 202 1/h Temperatura 30 C pH 6.7 Glucosa Batch 10 g/L Glucosa feed 300 g/L mu_set 0.3 hr-1 Ysx 0.42 gDCW/gGlucosa

34

Tabla A4 Datos de muestras de cultivo fed-batch

Hora OD600 Volumen Desecho Volumen Muestra


2:00 4:00 5:04 5:56 6:50 7:37 8:19 9:06 10:29 10:58 12:03 12:42 13:21 14:26 14:58 15:28 16:01 16:43 17:14 17:44 18:16 18:53 0.35 0.37 0.77 1.22 1.97 2.9 4.26 5.86 11.2 14 18.8 23.9 29.4 38 41.3 44.95 47.37 49 51.4 51.9 51.4 50.6 3.5 3 5.5 3 4 4 4 2.7 7 2 1.8 1.5 2.4 1 1.9 2.6 2.5 2.8 2.5 2 3 3 6.5 8.5 5 7.5 4.5 3.5 3.7 3.8 6.5 5.8 3.5 3.4 4.8 4.8 5.5 3.8 3.9 5 5.3 6.5 6

Tabla A5 Clculos para Cultivo fed-batch gramos F in tiemp ln biomas acumula Volu concentrac XV o (XV) a Fin do (L) men ion teorica M (t) 0.928 5016 0 0.074 2 18316 0.397 0.908 6098 2 0.095 2 83951 0.387 0.949 3.066 4551 6666 0.051 0.375 3 7 86701 5 0.997 3.933 0975 3333 0.002 1 3 90671 0.365 1.088 4.833 5096 3333 0.084 0.354 2 3 80944 5 35

1.207 7579 8 1.389 5228 7 1.596 9905 9 2.368 7212 4 2.741 4135 7 3.566 7810 7 4.430 8787 5 5.374 8836 2 6.923 7667 7 7.650 0777 3 8.412 6385 9 9.105 6228 3 9.803 9714 2 10.58 7795 2 11.11 6652 11.53 7570 5

5.616 6666 7 6.316 6666 7

0.188 76573 0.328 96043

0.346 0.338 5 0.330 8 0.327 1831 9 0.322 3485 9 0.334 1979 5 0.341 4585 4 0.347 6485 9 0.357 9043 4 0.367 1583 2 0.374 1508 8 0.386 2205 9

Suma volumen muestras antes de q comience batch

0.0692

0.468 7.1 12098 8.483 0.004 3333 0.862 1.75741 1843 0.002883 3 35025 365 2 19 8.966 0.004 6666 1.008 2.03163 8372 0.005042 7 47369 972 4 09 0.006 1.271 2.81185 6948 0.011184 10.05 66353 163 8 45 0.008 1.488 3.41727 1363 0.015950 10.7 59793 418 7 76 0.009 1.681 4.15305 8882 0.021743 11.35 73692 085 2 3 12.43 0.013 3333 1.934 5.74794 6855 0.034299 3 95995 965 9 44 12.96 0.016 6666 2.034 6.74528 0601 0.042151 7 71581 141 9 13 13.46 0.018 6666 2.129 7.83689 6592 0.050745 7 73517 891 8 09 14.01 0.022 6666 2.208 9.24278 0066 0.061813 7 89212 465 3 19 14.71 6666 2.282 11.4026 0.027 0.078816 7 78755 206 1491 91 15.23 0.031 3333 2.359 13.3143 7008 0.093867 3 70194 608 6 45 15.73 0.036 3333 2.408 15.4690 8311 0.110830 3 44416 803 4 89 16.26 0.043 6666 2.445 18.1531 2217 0.131961 7 60871 338 5 61

5.3713445 4 6.3026170 8

-0.0065

-0.0134935

8.413731 10.007874 3 11.946117 3 16.060016 8

-0.00778651

-0.00529221

-0.00489471

-0.00719511

18.371588 20.945824 9 23.931361 9

-0.0057928

-0.00739421

-0.00639261

0.403 28.278674 2233 7 0.416 8738 31.938585 4 3 0.433 8386 35.656295 8 7 0.454 39.961163 2694 8

-0.00639361

-0.00779361

-0.00779221

-0.00849221 36

12.08 16.88 0.482 8050 3333 2.492 21.8421 0.052 0.161004 8128 45.239444 3 3 21739 854 0052 36 6 4

-0.00899151

Gramos biomasa al inicio del fedbatch 1.38936

37

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