CRECIMIENTO Y MULTIPLICACIN BACTERIANA, MEDICIN DEL CRECIMIENTO: APLICACIONES EN LA INDUSTRIA.

CRECIMIENTO: El crecimiento de cualquier sistema biolgico es el incremento ordenado de todos los componentes de un ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es un aumento de la poblacin. Por lo que, el aumento de tamao que resulta cuando una clula capta agua o deposita lpidos o polisacridos, no es un crecimiento verdadero. CRECIMIENTO BACTERIANO El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: Los eventos de crecimiento en el mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de ste podemos abordar los siguientes temas: Inicio y transcurso de la replicacin cromosmica y de plsmidos.

Segregacin de cromosoma y plsmido a las clulas hijas.

Sntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular. Seales que coordinan la replicacin genmica con la divisin celular. El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tpicos: I. Cintica del crecimiento. Factores que afectan al tiempo medio de generacin (g) Factores ambientales que limitan el crecimiento.

A escala individual:

1. Ciclo celular procariota. Hasta hace unos 20 aos se pensaba que los ciclos bacterianos carecan de eventos clave. Ello se deba a que en bacterias no existe mitosis y porque en los medios de cultivo ricos empleados entonces la sntesis de ADN pareca continua durante todo el ciclo.

Pero hoy sabemos que s existen fenmenos clave, que se pueden poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en medios menos ricos que permiten slo crecimientos lentos. Lo perodos del ciclo procariota son: Fase C (equivalente a la S eucaritica): replicacin del ADN cromosmico. Fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminacin coincide con el final de la divisin celular. Fase innominada, equivalente a la G1 eucaritica. Lo caracterstico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generacin (g), lo hace a expensas de la fase G1. Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 minutos, y D = unos 20 minutos. 2. Ciclo celular en funcin del tiempo de generacin. El ejemplo de E. coli generacin. que ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de

3. Control de la replicacin del ADN cromosmico.

De lo anterior se deduce que debe de existir algn tipo de acoplamiento entre las ondas de replicacin y l divisin celular. Contar C + D minutos a parir de g, y entonces se puede prever que la ronda de replicacin tendr lugar g (C+D) minutos antes de la prxima divisin celular. Pero, la clula no es tan lista (no sabe contar hacia atrs en el tiempo) ni ten el don d la prediccin (los humanos tampoco, para la mayor parte de de las cosas importantes). La bacteria tampoco sabe contar hacia adelante, ya que el tiempo de inicio de una ronda de replicacin no guarda una relacin sencilla con la divisin celular previa Entonces, cmo se acoplan divisin celular y replicacin cromosmica? Una clave hacia la respuesta a esa pegunta es que la razn (proporcin) entre orgenes de replicacin y masa celular en el inicio (inmediatamente antes de la replicacin) es igual para todas las tasas de crecimiento. Este es un modelo hipottico sobre el mecanismo de coordinacin entre ambos eventos del ciclo celular. E sistema de coordinacin detecta la concentracin de orgenes de replicacin; conforme la bacteria crece, esta concentracin va decreciendo, hasta que se alcanza un valor umbral crtico que desencadena una nueva onda de replicacin. Ello hace que se doble el nmero de orgenes. Una ulterior ronda no se pone en marcha hasta que el crecimiento haga de nuevo descender la concentracin de orgenes. Se tratara, de un especie de reloj biolgico y oscilador que usara como medida del tiempo el parmetro d masa celular, volumen, u otro equivalente, de tal modo que la concentracin crtica de un factor iniciador o la dilucin de un represor serviran para disparar la replicacin a una concentracin determinad. 4. Relaciones entre velocidad de crecimiento y tamao celular. Es fcil comprobar en los cultivos bacterianos que cuanto ms rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generacin (g), mayor es el tamao medio de las clulas. 1. Bacterias en crecimiento en un medio relativamente pobre (supongamos que en este medio g = 60min, C+D = g). 2. Si transportamos una clula recin dividida procedente del cultivo anterior a un medio ms rico (por ejemplo, que permite un tiempo de generacin g = 35 min) podemos observar que: a. La primera divisin ocurre C+D (60 minutos) despus; es decir, con un tiempo idntico al que tena en el medio anterior.

b. Pero como en este medio g = 35 min, la iniciacin de una nueva ronda de replicacin ocurre antes de dicha replicacin celular (es decir, C y D se superponen). c. Se observa que se alcanza u nuevo equilibrio, con un tamao celular mayor que en el medio pobre, y una masa de inicio (tras la divisin celular) mayor, alterndose igualmente el tiempo de inicio. 5. Segregacin de cromosomas y plsmidos. Existe un mecanismo eficiente que asegura la segregacin de los cromosomas bacterianos a las clulas hijas. El cromosoma se encuentra unido a la membrana citoplasmtica, al parecer a travs de un mesosoma. Existen indicios de que durante la replicacin, el vrtice de la horquilla de replicacin va pasando por ese punto de anclaje. La replicacin cromosmica se inicia en una regin especial oriC, a partir de la cual se efecta una replicacin bidireccional, hasta que ambas horquillas se encuentran en un punto situado a 180 respecto a oriC. Cuando el mesosoma llega a ese trmino de replicacin se escinde en dos mesosomas, cada uno de los cuales constituye el punto de anclaje de cada copia del cromosoma. Cuando se forme el septo transversal, cada mesosoma va a parar a cada clula hija, de modo que las copias de los cromosomas quedan segregadas. Parece ser que algunos plsmidos se segregan por este mismo mecanimo. As pues, el mesosoma parece actuar como un anlogo primitivo del aparato mittico. 6. Productos anmalos de la divisin celular. Existen diversos tipos de mutantes cuyos fenotipos implican serias alteraciones del proceso de divisin celular y de replicacin o segregacin del material gentico a las clulas hijas. Algunos de estos mutantes han encontrado tiles aplicaciones en estudios genticos y moleculares. Clulas sin cuerpos nucleares (maxiclulas). Determinados mutantes termosensibles son incapaces de iniciar la replicacin a temperaturas elevadas, de modo que siguen creciendo en tamao y se dividen mucho despus de que se haya completado la ltima replicacin cromosmica (iniciada a una temperatura ms baja, permisiva). El resultado de la divisin celular a la temperatura no permisiva es que se producen clulas de tamao normal, pero sin cromosomas, aunque poseen los dems componentes celulares, incluyendo copias de plsmidos. Por estos mutantes se puede deducir que no existe una relacin directa entre la septacin (la fase D de divisin celular) y la replicacin cromosmica anterior (fase C).

 Miniclulas. Se producen en ciertos mutantes que forman septos anmalos acntricos (asimtricos, cerca de un extremo y no en el centro). En las miniclulas tampoco se segrega cromosomas, pero pueden heredar copias de plsmidos. De estos mutantes se deduce otro rasgo del ciclo celular: el lugar habitual donde se produce la septacin est programado genticamente, y esta programacin se puede alterar por mutaciones. Usos de maxiclulas y miniclulas en estudios moleculares y genticos. Un empleo habitual de estas clulas anmalas en el laboratorio se deriva del hecho de que durante cierto tiempo pueden sintetizar protenas codificadas por los nicos genes presentes: los del plsmido o plsmidos que alberguen. Por marcaje radiactivo y electroforesis en gel de protenas, se detectan unas pocas bandas, correspondientes slo a las protenas de los pocos genes existentes con la ventaja de que no hay interferencia de los cientos de miles de protenas de la clula normal.

7. Mtodos para el estudio y medicin del crecimiento a escala individual. Por microscopa Se basan en la observacin microscpica de microcultivos a temperaturas constantes Seguimiento de clulas individuales por microfotografa secuencial. Por inmunoflourescencia: se observan en microscopio de fluorescencia la incorporacin de materiales de pared celular o de membrana marcados con algn colorante fluorescente. Por obtencin de cultivos sincrnicos. En el cultivo bacteriano habitual, las distintas clulas se encuentran en fases distintas del ciclo celular, es decir, no estn sincronizados. Por lo tanto, del estudio de la poblacin no es posible sacar conclusiones sobre eventos del ciclo celular. Sin embargo, por una serie de procedimientos, es factible producir cultivos sicrnicos, en l que durante cierto tiempo todas las clulas estn en la misma fase, de modo que tienen la misma edad, el mismo tamao, y se dividen y replican el cromosoma al mismo tiempo. Entonces, el comportamiento de la poblacin es una imagen ampliada del individual. Los principales mtodos de obtencin de cultivos sincrnico se basan en seleccionar, a partir de un cultivo estndar no sincrnico, aquellas clulas que o

bien son del mismo tamao, principales son:

o bien son de la misma edad. Las tcnicas

Seleccin por tamaos: se suele recurrir a gradientes de densidad, sobre todo los formaos por mezclas de agua normal y agua deuterada (H2O/D2O) Seleccin pro edades: el mtodo ms empleado es la seleccin pro filtracin (tcnica d Helmstetter-Cummings), aunque slo se puede aplicar a ciertas cepas (E. coli funciona con la cepa B/r, pero no con la K12). Procedimiento: se filtra un cultivo asincrnico que est en fase exponencial a travs de una membrana de nitrocelulosa: las clulas se adhieren al filtro. Se invierte el filtro. Se va pasando medio fresco (nuevo) precalentado. Cada clula unida al filtro se nutre y crece, y finalmente se divide: una de las clulas hijas queda unida al filtro y la otra pasa al eluato, que se recoge. En cada momento concreto de esta operacin, las clulas hijas eluidas y recogidas corresponden a clulas recin nacidas. Las clulas eluidas en cada momento concreto (y por lo tanto, de la misma edad) sirven como fundadoras de un cultivo sincrnico. Observar la cintica de un cultivo sincrnico individuos en funcin del tiempo: expresada como nmero de

Durante unas pocas generaciones el cultivo es ms o menos sincrnico. Las mesetas indican las fases en que el nmero de clulas no vara, porque todas estn creciendo en tamao ates de dividirse. Las subidas bruscas (casi verticales) en el nmero de individuos nos indican que todas las clulas del cultivo se estn dividiendo al mismo tiempo. La sincrona se va perdiendo paulatinamente, de modo que al cabo de unas generaciones la grfica se convierte en una recta con pendiente. La explicacin estriba en que el tiempo exacto de divisin, o ms concretamente C y D no duran exactamente lo mismo en los distintos individuos. Estas pequeas variaciones estadsticas se van acumulando, generando desfases cada vez mayores entre clulas, hasta que la sincrona se pierde irreversiblemente.

II.

A escala poblacional:

1. Cultivo en sistemas cerrados. En los sistemas cerrados (que pueden ser lquidos o slidos), no existe continuo de nutrientes, ni drenaje de clulas ni de sustancias de desecho. En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura slo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulacin de desechos. En la naturaleza no es normal ver crecimientos balanceados indefinidos. Para hacer una idea de lo que es el crecimiento exponencial indefinido de una bacteria a travs de los siguientes datos: si una sola bacteria (que pesa 10-12g) pudiera crecer nada menos que 2.2x1031 g, equivalentea 4000 veces el peso de nuestro planeta. A. Curva de crecimiento en un sistema cerrado en medio lquido.

El crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar: Fase de latencia o retardo (fase lag): Es el perodo de tiempo durante el que el inculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un perodo de ajuste metablico. Cuando se introducen microorganismo en una medio de cultivo fresco, normalmente no se produce un aumento inmediato del nmero de clulas o de masa y, por ello, este periodo se denomina fase de latencia. Aunque la divisin celular no se produce inmediatamente y no hay un crecimiento neto de masa, la clula est sintetizando nuevos componentes. Una fase de latencia previa al comienzo de la divisin celular puede ser necesaria por varias razones. Las clulas pueden ser viejas y poseer una cantidad reducida de ATP, cofactores esenciales y ribosomas; estas sustancias

deben sintetizarse antes que se inicie el crecimiento. El medio puede ser diferente al anterior donde crecan los microorganismos. En este caso, necesitar nuevas enzimas para usar otros nutrientes. Quizs los microorganismos hayan sido alterados y necesiten un tiempo de recuperacin. Cualquiera que sea el motivo, finalmente, las clulas se equipan de nuevo, replican su DNA, comienzan a incrementar su masa y por ltimo, se dividen. La duracin de la fase de latencia vara considerablemente segn la condicin de los microorganismos y la naturaleza del medio. Esta fase puede ser bastante larga si el inculo procede de un cultivo viejo o de uno que haya sido refrigerado. La inoculacin de una cultivo en otro qumicamente diferente provoca tambin una fase de latencia mayor. Por otra parte, cuando se transfiere un cultivo en fase de crecimiento exponencial vigoroso a un medio nuevo de la misma composicin, la fase de latencia se acorta o no se produce. Fase de transicin de crecimiento acelerado: que conduce a la siguiente fase, aunque algunos autores la consideran dentro de la fase exponencial. Fase de crecimiento exponencial (fase logartmica). Durante la fase exponencial o logartmica, los microorganismos crecen o se dividen hasta el nivel mximo posible, en funcin a su potencial gentico, el tipo de medio y las condiciones en que crecen. La velocidad de crecimiento es constante durante la fase exponencial; es decir, los microorganismos se dividen y se duplican en nmero de intervalos regulares. Como cada clula se divide en un momento ligeramente diferente del resto, la curva de crecimiento aumenta suavemente, en lugar de realizar discretos saltos. Durante esta fase, la poblacin es ms uniforme, qumica y fisiolgicamente, por ello, los cultivos en fase exponencial se utilizan normalmente en estudios bioqumicos y fisiolgicos. Durante la fase logartmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generacin (g) es caracterstico para cada especie o cepa, en cada medio concreto. El valor de tiempo de generacin (g) depende de: Composicin del medio. Temperatura. pH.

Osmolaridad (tonicidad), etc.

Los microorganismos hetertrofos suelen crecer ms rpidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintticos, y dentro de estos ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono. Fase de aceleracin negativa: de crecimiento desequilibrado, conduce a la siguiente fase. De igual modo que la fase de transicin de crecimiento acelerado, algunos autores no la consideran como tal, sino dentro de la fase estacionaria. Fase estacionaria: Finalmente, el crecimiento de la poblacin cesa y la curva de crecimiento se vuelve horizontal. Las bacterias llegan normalmente a esta fase estacionaria cuando el nivel de poblacin es de aproximadamente 109 clulas por mL. El tamao final de la poblacin depende, por supuesto, de la disponibilidad de los nutrientes y otros factores, as como del tipo de microorganismo que se cultive. En la fase estacionaria el nmero total de microorganismos viables permanece constante. Este hecho puede ser resultado del equilibrio entre divisin y muerte de la clula o, simplemente, que la poblacin deje de dividirse, aunque siga activa metablicamente. Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo ( = 0), o an existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares. Las poblaciones microbianas entran en fase estacionaria por varias razones. Un factor obvio es la limitacin de nutriente, si se reduce intensamente la concentracin de un nutriente esencial la poblacin crecer lentamente. Los organismos aerbicos estn limitados a menudo por la disponibilidad de O2. El no es muy soluble y puede reducirse tan rpidamente que slo la superficie del cultivo tenga una concentracin de O2 adecuada para el crecimiento. En este caso, las clulas situadas por debajo de la superficie del cultivo no podrn crece, salvo que el cultivo se agite o airee de otra manera. El crecimiento de una poblacin puede tambin cesar debido a la acumulacin de productos residuales txicos. Parece que este factor limita el crecimiento de muchos cultivos anaerbicos (cultivos que crecen en ausencia de o2). Por ejemplo, los estreptococos pueden producir tanto cido lctico y otros cidos orgnicos a partir de la fermentacin de azucares que acidifican su medio, inhibiendo el crecimiento.

Los cultivos de estreptococos pueden tambin entrar en fase estacionaria debido a la reduccin del suministro de azcar. En definitiva, un cultivo entra en fase estacionaria como consecuencia de varios factores que actan conjuntamente. En este perodo se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho, incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular. Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transicin (de aceleracin negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas, puede recurrir a aminocidos como fuentes de C una vez agotados los hidratos de carbono. En la fase estacionaria an existen reacciones metablicas, pero el metabolismo general es diferente al de la fase logartmica: Las clulas son ms pequeas, debido a que existe divisin celular despus de que se haya detenido el incremento de masa. El citoplasma se condensa. En las bacterias Gram-negativas aumenta el volumen relativo del periplasma. El nucleoide se condensa, por sustitucin de ciertas protenas que se unen a ADN. La membrana citoplasmtica se hace menos fluida. Suelen ser ms resistentes a los cambios fsicos (temperatura, estrs osmtico) y qumicos. Existe un cambio en el patrn de expresin gentica: se desconectan cientos de genes que haban estado expresndose durante la fase exponencial, mientras que se inactivan unos 50 100 genes que antes estaban reprimidos (genes de fase estacionaria); estos genes se transcriben mediante la holoenzima de la ARN-polimerasa dotada de la subunidad 38. Existe reciclado de ciertos materiales intracelulares. Baja el crecimiento en ARN.

Fase de muerte exponencial. Cambios ambientales perjudiciales, como privacin de nutrientes y acumulacin de residuos txicos, originan la disminucin de clulas

viables, hecho que caracteriza la fase de muerte. La muerte de una poblacin microbiana, al igual que su crecimiento durante la fase exponencial, es normalmente logartmica (es decir, una cantidad constante de clulas que mueren a cada hora). Este modelo es vlido an cuando el nmero total de clulas permanece constante, simplemente porque las clulas no se lisen despus de morir. A menudo, la nica forma de decidir si una bacteria es viable consiste en incubarla en un medio fresco; si no crece ni se multiplica, se considera que est muerta. Se debe a agotamiento de reservas de energa. Algunas veces las clulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas fantasmas, ghost). La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en bacterias entricas es suave, mientras que en Bacillus es ms acentuada). Aunque la mayor parte de una poblacin microbiana normalmente muere en forma logartmica, la velocidad de la mortalidad puede disminuir despus de reducirse drsticamente la poblacin. Esto se debe a la supervivencia prolongada de algunas clulas particularmente resistentes.

EXPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO Durante la fase exponencial, cada microorganismo se divide en intervalos constantes. Por ello, la poblacin duplicar su nmero durante un periodo determinado de tiempo, denominado tiempo de generacin o de duplicacin. Por ejemplo supongamos que se inocula un tubo de ensayo con una clula que se divide cada 20 minutos. La poblacin ser de 2 clulas cada 20 minutos, de 4 clulas a los 40 minutos y as sucesivamente. Como la poblacin se duplica en cada generacin, el aumento de poblacin ser siempre de 2n donde n es el nmero de generaciones. El aumento de poblacin resultante es exponencial o logartmica. Estas observaciones pueden expresarse en ecuaciones para calcular el tiempo de generacin. Supongamos que N0= nmero inicial de la poblacin Nt= nmero final de clulas en un tiempo t n = nmero de generaciones en un tiempo t A partir de los resultados de la siguiente tabla podemos inferir que:

Nt = N0 x 2n Despejando n, nmero de generaciones, donde todos los logaritmos son de base decimal, Log Nt = log N0 + n.log 2 y n = log Nt log N0 = log Nt log N0 log 2 0.301 Ejemplo de crecimiento exponencial Tiempo Nmero de divisione s 0 1 2 3 4 5 6 2n Poblaci n (No x 2n) 1 2 4 8 16 32 64 Log10 Nt

0 20 40 60 80 100 120

20 = 1 21 = 2 22 = 4 23 = 8 24 = 16 25 = 32 26 = 64

0.000 0.301 0.602 0.903 1.204 1.505 1.806

El cultivo hipottico comienza con una clula con un tiempo de generacin de 20 minutos. La velocidad de crecimiento en un cultivo discontinuo puede expresarse por la constante de velocidad media de crecimiento (k). Equivale al nmero de generaciones por unidad de tiempo, expresado a menudo como generaciones por hora.

K= n/t = log Nt log N0 0.301t A partir de las formulas anteriores se puede calcular el tiempo que tarda una poblacin en duplicar su nmero (n=1), es decir, el tiempo medio de generacin o tiempo medio de duplicacin (g). Si la poblacin se duplica, entonces, Nt = 2N0 Se sustituye 2N0 en la ecuacin de velocidad media de crecimiento y se despeja k. K= log (2N0) log N0 = log2 + log N0 log N0 0.301g 0.301g K= 1/g El tiempo medio de generacin es la inversa de la constante de velocidad media de crecimiento. g= 1/k El tiempo medio de generacin (g) puede determinarse directamente a partir de una grfica semilogartmica con los datos de crecimiento y la constante de velocidad de crecimiento, a partir del valor g. El tiempo de generacin puede tambin calcularse directamente a partir de las ecuaciones anteriores. Por ejemplo, supongamos que una poblacin bacteriana aumenta de 103 a 109 clulas en 10 horas. K= log109 log 103 = 9 3 = 2.0 generaciones/h (0.301)(10h) 3.01 h

g=

1 = 0.5h/gen. o 30 min/generacin 2.0 gen/h

Los tiempos de generacin cambian notablemente segn la especie microbiana y las condiciones. Los valores varan desde menos de 10 minutos (0.17 horas) en unas pocas

bacterias.

2. Crecimiento dixico.

Supongamos que inoculamos una bacteria en un medio lquido provisto de dos fuentes de carbono (glucosa y lactosa), de las cuales una (por ejemplo, la glucosa) es usada preferentemente. Se darn dos fases de crecimiento exponencial separadas por una breve fase intermedia estacionaria. Esta modalidad de crecimiento con dos fases exponenciales s conoce con el nombre d crecimiento diuxico. Bases del crecimiento diuxico: La bacteria usa en primer lugar slo la fuente preferencial de C (en este caso, la glucosa, que suele ser la fuente preferencial en muchos hetertrofos), sin usar la otra fuente. Una vez que agota la primera fuente, se dispone a usar la segunda (por ejemplo la lactosa), pero tarda un tiempo hasta que sintetiza las enzimas catablicas necesarias para degradar esa segunda fuente. 3. Crecimiento en sistemas cerrados en medio slidos. Un medio slido es una solucin nutritiva (como el lquido), pero incorporado a un gel, que le da consistencia. Los tipos de gelificantes usados para medios slidos: Agar-agar (o simplemente agar): es el ms comnmente empleado. Gelatina (inconveniente de que se lica a temperaturas bajas). Silicagel (o gel de slice): tedioso de preparar. Uso casi exclusivo para quimioauttrofos.

Los medios slidos se suelen inocular mediante asa de siembra o esptula, diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes adecuados, como las placas de Petri. Tas la inoculacin a la temperatura y condiciones pertinentes, cada bacteria o agrupacin de bacterias que ha quedado en un punto determinado del medio da origen, por crecimiento a una acumulacin de clulas, visibles a simple vista, denominada colonia. L densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 107 clulas para un colonia de unos5 mm). Esto se debe a que en el medio slido, las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este slido permite un aporte continuo de nutrientes (por difusin desde el entorno de la colonia, hacia ella), y eliminacin continua de productos de desecho (por difusin dese la colonia hacia afuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de clulas.

Con vistas a la determinacin taxonmica, se suele tomar nota de una serie de caractersticas de las colonias (caractersticas culturales): Tamao (relativo). Forma general. Forma d los bordes de la colonia. Aspecto de la superficie y elevacin sobre el sustrato. Color. Consistencia, etc.

4. Cultivo continuo. Se basa en el cultivo de microorganismos en un sistema abierto, en el que se mantiene las condiciones ambientales constantes a travs de un suministro continuo de nutrientes y de la retirada de los residuos. En este tipo de cultivo se puede mantener una poblacin microbiana en fase de crecimiento exponencial, a una concentracin constante de biomasa durante un periodo largo de tiempo. Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema de flujo que se compone de: Una cmara de cultivo de volumen constante, a la que llega un suministro de nutrientes. De la que se eliminan o separan los productos txicos de desecho (por un dispositivo de rebosadero).

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el nmero de clulas y la concentracin de nutrientes en la cmara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema est en estado estacionario, con las clulas creciendo exponencialmente. Mayormente se utilizan dos clases de sistemas de cultivo continuo: 1) quimiostato y 2) turbidostato. Quimiostato y Turbobidostato.

Un quimiostato se construye de forma que se alimenta un recipiente de cultivo con un medio estril a la misma velocidad con que se gasta el medio que contiene a los microorganismos. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en cantidades limitadas. Debido a la presencia del nutriente limitante, la velocidad del crecimiento se determina por la velocidad a la que se incorpora ms cantidad de medio en la cmara de cultivo y la densidad

final celular depende de las concentraciones del nutriente limitante. La velocidad de recambio del nutriente se expresa como velocidad de dilucin (D), velocidad a la que el medio fluye en el recipiente del cultivo, respecto del volumen del mismo, donde f es la velocidad de flujo (mL/h) y V es el volumen del recipiente (mL). D = f/V Por ejemplo, si f es 30 mL/h y V, 100 mL, la velocidad de dilucin ser de 0.30 h1 . Tanto el nivel de poblacin microbiana como el tiempo de generacin estn relacionados con la velocidad de dilucin. La densidad de permanece inalterada a lo largo de un amplio rango de velocidades de dilucin. El tiempo de generacin disminuye (es decir, la velocidad de crecimiento aumenta), al aumentar la velocidad de dilucin. El nutriente limitante quedar casi completamente agotado en estas condiciones de equilibrio. Si la velocidad de dilucin aumenta con demasiada rapidez. Los microorganismos pueden incluso desaparecer del cultivo antes de que se multipliquen la eliminarse por el rebosadero, porque la velocidad de dilucin es superior a la mxima de crecimiento. La concentracin de nutriente limitante es mayor a velocidades de dilucin elevadas, porque en esas condiciones habr pocos microorganismos presentes para utilizarlo. A velocidad de dilucin muy baja, un aumento D causa un aumento tanto de la densidad celular como la velocidad de crecimiento. Esto se debe al efecto de la concentracin del nutriente sobre la velocidad de crecimiento, a veces denominada relacin de Monod. A velocidades de dilucin bajas, solo hay disponible una cantidad limitada de nutriente. Gran parte de la energa disponible debe utilizarse para el mantenimiento celular, no para el crecimiento ni la multiplicacin. A media que aumenta la velocidad de dilucin, se eleva la cantidad de nutrientes y la densidad celular resultantes, porque la energa est disponible tanto para el mantenimiento como el crecimiento. La velocidad de crecimiento aumenta cuando la energa total disponible supera la energa de mantenimiento.

El segundo sistema de cultivo continuo, el turbobidostato, tiene una fotoclula que mide la absorvancia o turbidez de un cultivo en el recipiente de un cultivo. La velocidad de flujo del medio a travs del recipiente de regula automticamente para mantener una turbidez o densidad celular predeterminada. El turbidostato se deferencia del quimiostato por varias razones. La velocidad de dilucin en un turbidostato es variable, en lugar de permanecer constante y el medio de cultivo no contiene un factor limitante. Un turbidostato funciona mejor a velocidades de dilucin altas; un quimiostato es ms estable y eficaz a velocidades de dilucin bajas. Los sistemas de cultivo continuo son muy tiles porque ofrecen un aporte constante de clulas en fase exponencial, que crecen a una velocidad conocida. Estos sistemas permiten el estudio del crecimiento microbiano con niveles muy bajos de nutrientes, concentraciones prximas a las existentes en los medios naturales.

5. Determinacin del crecimiento de poblaciones bacterianas. El crecimiento de una poblacin o cultivo bacterianos se puede expresar en funcin de: Aumento de masa del cultivo. Aumento del nmero de clulas.

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn en crecimiento balanceado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporcin por unidad de tiempo). Medida de masa bacteriana. El aumento de la masa celular total, as como el del nmero de clulas, acompaa al crecimiento de una poblacin. Por ello, las tcnicas empleadas para medir los cambios de masa pueden utilizarse para medir el crecimiento. Existen los siguientes mtodos: 1. Mtodos directos: En estos mtodos se requieren preparaciones limpias sin partculas extraas. Determinacin del peso hmedo. Se tara un tubo de centrfuga. Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante. Se determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc. Determinacin del peso seco. Como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105C, toda una noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo. Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores; es difcil pesar meno de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio, 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias. Determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN, ARN, protenas, etc. Se suele usar en bateras para las que otros mtodos ms fciles dan errores debido a que forman grupos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimiento en ambientes naturales. 2. Mtodos indirectos.

 Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por unidad de tiempo Consumo de oxgeno (QO2) y consumo determinados por el respirmetro de Warburg. Mtodos turbimtricos (pticos). La base de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad e luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. Recordemos que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua. La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a l masa del cultivo. Medicin de luz transmitida A. Escala de MacFarland. Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio hermticamente cerrados que contienen: 1% de BaCl2 +cantidades crecientes de H2SO4 al 1%, por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de BaSO4, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentracin de bacterias (en cel/ml) que genera una turbidez similar. Inconveniente: es un mtodo poco preciso, que slo se emplea cuando no hace falta exactitud. Ha sido desplazado por los mtodos espectrofotomtricos. B. Espectrofotmetro. Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O) es decir la absorbancia. D.O = A = -log T/100 Donde: T = transmitancia Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana. La cantidad de luz dispersa es proporcional a cociente entre el tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la tcnica aumenta pues a longitudes de onda corta. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana slo es vlida para > 107 cel/ml. C. Nefelmetro. Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en ngulo recto respecto de la direccin de la de carbnico (QCO2),

luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro. Medida del nmero de individuos. La forma ms obvia de determinar el nmero de clulas es por recuento directo. La utilizacin de una cmara de recuento es fcil, econmica y relativamente rpida; ofrece tambin informacin acerca del tamao y morfologa de los microorganismos. Se presenta los siguientes mtodos: 1. Mtodos directos Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Se cuentan bacterias en varios cuadrados centrales, normalmente, a un aumento de 400x a 500x. El nmero medio de bacterias en estos cuadrados sirve para calcular la concentracin de clulas en la muestra original. Hay como 25 cuadrados en un rea de 1mm2, el nmero de total de bacterias en 1mm2 de la cmara es la suma de las bateras presentes en los 25 cuadrados. La cmara tiene una profundad de 0.02 mm y por ello, Bacterias/mm3 = (bacterias/cuadrado) (25 cuadrados) (50). El nmero de bacterias por cm3 es 103 veces este valor. Por ejemplo, supongamos que el recuento medio por cuadrado es de 28 bacterias: Bacterias/cm3 = (28 bacterias) (25 bacterias) (50) (103) = 3.5 x 107. Esta tcnica posee algunos inconvenientes. La poblacin microbiana tiene que ser bastante grande para que el resultado tenga precisin, debido al pequeo volumen de la muestra. Es tambin difcil o imposible distinguir entre clulas vivas y muertas en las cmaras de recuento. Las cmaras de recuento y los contadores electrnicos permiten contar todas la clulas, vivas o muertas. Existen tambin otras tcnicas factibles de recuento, que son procedimientos especficos para contar clulas capaces de crecer y multiplicarse. En la mayora de estos mtodos de recuento, se siembre una muestra diluida de bacterias u otros microorganismos sobre una superficie de agar slido. Cada microorganismo o grupo de microorganismos desarrolla una colonia clara. El original de microorganismos viables en la muestra puede calcularse a partir del nmero de colonias formadas y la dilucin de la muestra. Por ejemplo: Si 1.0 mL de una dilucin de 1 x 10-6 produce 150 colonias, la muestra original contendra alrededor de 1,5 x 108 clulas por mL.

Normalmente, el recuento es ms exacto si se utiliza un contador especial de colonias.

Recuento en preparaciones teidas. Se dispone de un porta con una excavacin circular (de rea At) con un volumen conocido (v). Sobre esta excavacin se extiende la muestra con asa de siembra o con micropipeta, y se fija y tie por algn colorante. Se observa con un microscopio dotado de un juego de ocular y objetivo que delimitan un rea de campo (Ac). Si en dicho campo se cuentan n bacterias, la concentracin de bacterias por mililitro ser: n. At/Ac . 1/V Recuento proporcional de Wright. Se mezcla la suspensin bacteriana problema con una cantidad conocida de bolitas de ltex o de hemates. La concentracin bacteriana se deduce de la proporcin de bacterias y partculas observadas en el mismo campo microscpico. Este mtodo se emplea ms frecuentemente en Virologa. Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter).

Se hace pasar una suspensin bacteriana pro un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente elctrica. Cada vez que por un orificio (30 m de dimetro) pasa una partcula (bacteria) interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que van pasando. El tamao detectado es funcin de la intensidad dl pulso de voltaje a paso de la partcula. Recientemente se ha introducido la citometra de flujo activada por fluorescencia (FACS). Es una sofisticada modificacin en la que partculas a contar se marcan previamente con un anticuerpo monocional u otro ligando especfico hacia alguna molcula de superficie, unidos a su vez un fluorocromo, una molcula que emite fluorescencia al incidir sobre ella una haz de luz lser.

Contador de colonias Quebec. El contador ilumina una placa de Petri uniformemente desde un lado, y se amplifica la imagen para mostrar ms fcilmente las colonias pequeas. Con este modelo sofisticado, se toca con una sonda elctrica cada colonia para anotar el recuento.

Contador automtico. La cmara forma una imagen amplificada de la placa; todos los objetos del rango de tamao deseado se cuentan

con este instrumento. El contador puede estar conectado a un ordenador independiente. Las tcnicas de siembra en placa con sencillas, sensibles y se utilizan ampliamente para contar bacterias en muestras como alimentos, agua y suelo. Sin embargo, existen varios problemas que pueden provocar recuentos inexactos. Se pueden obtener recuentos si no se separan las agrupaciones de clulas y no se dispersan bien los microorganismos. Como no es posible estar totalmente seguro de que la colonia proceda de una clula individual, los resultados pueden ser expresados en unidades formadoras de colonias (CFU, colony forming units), en lugar de nmero de microorganismos. Las muestras deben producir entre 25 y 250 colonias para obtener resultados significativos. Por supuesto, el recuento ser tambin bajo si el medio con agar empleado no puede mantener el crecimiento de todos los microorganismos viables presentes. El agar caliente que se utiliza en la siembra en profundidad puede daar o matar clulas sensibles, por ello, la siembra en placa por extensin ofrece a veces recuentos superiores que con la tcnica de siembra en profundidad. El nmero de microorganismos se determina tambin con frecuencia a partir de colonias que crecen sobre filtros especialmente pequeos para retener bacterias. En esta tcnica, se pasa una muestra a travs de un filtro de membrana especial. Luego, el filtro se coloca sobre un medio con agar y se incuba hasta que cada clula forme una colonia separada. Un recuento de colonias permite obtener el nmero de microorganismos presentes en la muestra filtrada y pueden emplearse medios especiales para seleccionar microorganismos especficos. Sistema de filtro de membrana Millipore. Primero, se filtra la muestra a travs de un filtro de membrana policarbonatado que se ha teido de negro para crear un fondo oscuro que permita observar objetos fluorescentes. Luego, se tien las bacterias con un colorante fluorescentes, como naranja de acridina, y se observa con el microscopio. Los microorganismos teidos con naranja de acridina brillar con un color naranja (clulas muertas) o verdes (vivas) y pueden contarse fcilmente con un microscopio de epifluorescencia. Normalmente los recuentos obtenidos mediante este

mtodo son muchos ms elevados que con las tcnicas del cultivo. Actualmente se dispone de equipos comerciales que emplean otros reactivos fluorescentes para teir diferencialmente clulas vivas y muertas. Esto permite contar directamente el nmero de microorganismos vivos y muertes en una muestra.

Rendimiento del crecimiento y efectos de un nutriente limitante. Cuando el crecimiento microbiano est limitado por una concentracin baja de un nutriente esencial, el crecimiento neto final o rendimiento celular aumenta con la cantidad inicial del nutriente limitante. sta es la base de los bioanlisis para cuantificar vitaminas y otros factores de crecimiento. La velocidad de crecimiento aumenta tambin con la concentracin del nutriente, pero de manera hiperblica. La forma curva parce que refleja el grado de captacin de un nutriente por las protenas microbianas transportadas. A niveles de nutrientes suficientemente altos, los niveles de transporte se saturan y la velocidad de crecimiento no sigue aumentando con la concentracin del nutriente. La cantidad de masa microbiana producida a partir de un nutriente puede expresarse cuantitativamente como rendimiento del crecimiento. (Y, yield) Y = masa de microorganismos formada Masa de sustrato consumido El valor Y se expresa a menudo en gramos de clulas formadas por gramos de sustrato utilizado, o como rendimiento molar del crecimiento (gramos de clulas por mol de nutrientes consumido). Se trata de un ndice de eficacia de conversin de nutrientes en material celular. Microorganismos aerbicos cultivados en un medio rico pueden asimilar entre un 20 y

un 50% del carbono de los azucares que captan. En medios diluidos, algunas bacterias parecen que son capaces de aumentar su eficacia y asimilar hasta el 80% del azcar adquirido. Los rendimientos del crecimiento de bacterias fermentadoras se han estudiado extensamente. Cuando crecen en medios ricos en nutrientes, las bacterias pueden utilizar la fermentacin de hidratos de carbono solo para generar energa y emplear otras sustancias. La eficacia de la utilizacin de ATP durante la fermentacin queda reflejada en el valor ATP. YATP = gramos de clulas formadas Mol de ATP producido Aunque los valores de YATP pueden variar a concentraciones muy bajas de azcar, YATP para la mayora de las bacterias es aproximadamente 10.5g/mol, a niveles elevados de azcar. Por ello, parece que las bacterias utilizan generalmente energa en la biosntesis con una eficacia bastante constante. Adems el valor de YATP es mucho ms pequeo que le mximo terico de 332, que es el esperado si se emplease todo el ATP en la biosntesis, que es el esperado si se emplea todo el ATP en la biosntesis. Gran parte del ATP se utiliza en el transporte, en el metabolismo mecnico y probablemente, de otras formas. 2. Mtodos indirectos. Son mtodos que miden el nmero de bacterias viables, que no equivale al de totales. Mtodo del nmero ms probable. Su fundamento estriba en la distribucin de Poisson: una distribucin aleatoria de partculas en una serie de muestras iguales, en funcin del nmero medio de partculas presentes en una suspensin:

Px = Donde: x = nmero real de partculas en cada muestra m = concentracin (n de partculas por volumen)

La tcnica cosiste en sembrar alcuotas de la suspensin original problema sobre un medio lquido o slido adecuado; tras el tiempo de incubacin adecuado se anota la proporcin obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P0 (x=0). Entonces, segn la distribucin de Poisson: P0= e-m Y por lo tanto es fcil calcular el valor de m: m = -ln P0 Recuento de viables en placa: Es una de las tcnicas de recuento ms usadas en la rutina de laboratorio de Microbiologa. Perecuaciones: Para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 palcas de cada dilucin. Hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin. Contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.

Determinacin de la proporcin de clulas viables/clulas totales. Si se est interesado en conocer esa proporcin se recurre a una tcnica de microcultivos en cubreobjetos: hay que seguir peridicamente la evolucin del crecimiento de clulas individuales y determinar la proporcin de aquellas clulas no viables (visibles al microscopio, pero incapaces de crecer). Recuento sobre filtros de nitrocelulosa. Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa estril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro y se cuentan, deducindose la concentracin original en funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

MEDIOS DE CULTIVO Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO Una gran cantidad d microorganismos sin requerimientos, como por ejemplo muchos pseudomonas del suelo y del agua, pero tambin Escherichia coli, se desarrollan perfectamente en un caldo de cultivo con una composicin. Muchos

organismos necesitan adems de uno u otro de los oligoelementos, vitaminas o suplementos antes indicados. Si el medio de cultivo est compuesto por sustancias qumicas definidas, se habla de un medio de cultivo sinttico o definido. Se pretende conseguir definir para cada microorganismo los nutrientes mnimos para establecer un medio mnimo, que contenga nicamente los componentes necesarios para el crecimiento. Las especies ms exigentes requieren un gran nmero de complementos. Para Leuconostoc mesenteroides se ha desarrollado un medio sinttico que contiene ms de 400 componentes. Medios de cultivos complejos: Para muchos microroganismos exigentes no se conocen an suficientemente bien los requerimientos nutritivos. Se cultivan en disoluciones que contienen extracto de levadura, autolisado de levadura, peptona o extracto de carne. Par algunos grupos de organismos son tambin corrientes: mosto (extracto de malta), infusin de heno, jugo de ciruelas, jugo de zanahoria, leche de coco, y para hongos coprfilos incluso extracto de excremento de caballo. Debido a los costos, a los medios de cultivo se les aade en lugar de sustancias puras otras complejas, como lactosuero, melazas, agua de maz o extracto de soja, que son productos de desecho baratos. Los medios de cultivo de este tipo se denominan complejos o no definidos. Medios de cultivo slidos: Para obtener medios de cultivo slidos se aade a los caldos de cultivo sustancias solidificantes, que dan a los disoluciones acuosas una consistencia gelatinosa. La gelatina ya solo se utiliza en casos aislados, porque licua ya a 26-30C y muchos microorganismos son capaces de licuar la gelatina. Un solidificante casi ideal es el descubierto en 1883 por HEESE, un colaborador de R. KOCH, al introducir el agar en la tcnica bacteriolgica. Es un polisacrido extrado de algas marinas, intensamente ramificado y entrelazado, de composicin compleja. Se aade a las disoluciones acuosas en una concentracin de 15-20 g/l. El agar funde a 100C, pero se mantiene lquido al enfriarse hasta 15C de temperatura. Es atacado tan solo por pocas bacterias. Cuando se necesitan medios sin componentes orgnicos se utiliza el gel de slice como solidificante. Concentracin de iones hidrogeno: Los iones H+ y OH- son los iones ms mviles de todos; por ello, pequeas modificaciones en su concentracin tienen grandes consecuencias. El establecimiento de un pH inicial ptimo y el mantenimiento del pH durante el crecimiento es por ello de gran importancia. La mayora de los organismos se desarrolla ptimamente cuando los iones H+ y OH- estn aproximadamente en igual concentracin (pH 7,0). Muchas bacterias prefieren valores de pH superiores, un medio ligeramente alcalino, p. ej. Los nitrificantes, los rizobios, los actinomicetos, las bacterias degradadoras de la urea. Tan solo pocas son acidotolerantes (lactobacilos, Acetobacter, Sarcina ventriculi) los hongos prefieren valores de pH bajos, si se inocula con tierra

medios complejos a distintos valores de pH, aparecern preferentemente hongos a pH 5,0, y preferentemente bacterias a pH 8,0.

hongos

bacterias

pH 2

3 acidfilos

7 neutrfil os

10

1 1

Thiobacillus Alcaligenes thiooxidans Pseudomon Sulfolobus as acidocaldarius Pyrodictium occultum Acetobact er Lactobacill us Mrgenes de pH tolerados o preferenciales para el crecimiento tiene El mantenimiento de un determinado valor de pH durante hongos y bacterias gran importancia sobre todo para aquellos microorganismos que a pesar de

alcalfilo s Natronobacteriu Rhizobium m Nitrificante Ectothiorhodospi s ra Actinomice Especies de tos Bacillus ureolticos

producir cidos, no lo toleran (lactobacilos, Enteronacterceas, muchos pseudomonas). La autodestruccin por los cidos formados se combate utilizando sustratos no fermentables (para cultivos de larga duracin) o tamponando el medio. Los fosfatos inorgnicos tienen ya un cierto efecto tampn, aunque leve a pH superior a 7,2. Si se da una excrecin mas fuerte de cidos, se recomienda la adicin de carbonato clcico, y si no se quieren componentes insolubles, de carbonato sdico. En el ultimo caso, hay que tener en cuenta que los iones bicarbonato estn en equilibrio con el CO2 disuelto fsicamente, y por tanto con el contenido en anhdrido carbnico de la atmosfera gaseosa (p. ej. El aire): CO2(gas) + HCO3CO2(disuelto) CO2 + H2O H 2CO3 H+

La relacin entre el pH, concentracin de bicarbonato y presin parcial de CO2 de la atmosfera gaseosa viene dada por la ecuacin de HENDERSON- HASSELBACH; la concentracin de acido carbnico es igual al producto de la presin parcial de acido carbnico y el coeficiente de solubilidad :

Por lo dems, muchas bacterias son poco sensibles a pequeas oscilaciones del pH entre 6 y 9. No obstante, las modificaciones rpidas determinan brevemente

una leve alteracin del valor del pH intracelular, aunque al cabo de 30 minutos se reinstaura el valor anterior de pH interno. Las lesiones que aparecen a valores desfavorables de pH no se deben a los iones H+ y OH-; los ltimos elevan nicamente el porcentaje de cidos o bases dbiles no disociados, que en estado no cargado penetran mucho ms fcilmente en las clulas que sus productos de disociacin. Los fisiolgicamente activos son siempre los cidos no disociados. El succinato, bibsico, o el acido ctrico, tribsico, penetran tanto mas rpidamente en la clula cuanto mas bajo sea el valor de pH del medio. Anhdrido carbnico: Un medio especfico para el crecimiento de microorganismos auttrofos fijadores de CO2 contiene generalmente bicarbonato sdico, y se incuba bajo una atmsfera que contenga anhdrido carbnico en un recipiente cerrado. Tambin puede hacerse pasar aire o aire enriquecido en CO2. Siempre hay que tener en cuenta la relacin anteriormente indicada entre el pH, la concentracin de bicarbonato y la presin parcial de CO2 en la atmsfera. Pero tambin los microorganismos heterotrficos, los que asimilan fuentes de carbono orgnicas, necesitan anhdrido carbnico. Muchas bacterias que viven de forma parasita en la sangre, los tejidos o el canal intestinal estn adaptadas a atmosferas con un contenido elevado en anhdrido carbnico. Para ello se incuba a dichas bacterias con una mezcla de aire o gas que contenga en volumen un 10% de anhdrido carbnico. Hay que considerar adems, que la eliminacin del anhdrido carbnico, por ejemplo por absorcin con hidrxido potsico, impide el crecimiento de casi todas las bacterias. Contenido hdrico y presin osmtica: Los microorganismos se diferencian ampliamente entre si con respecto al contenido en agua. Para poder comparar las disoluciones acuosas y las sustancias solidas desde el punto de vista del agua disponible, se recurre al parmetro actividad del agua (aw) o humedad relativa. Este parmetro hace referencia a la fase de vapor de agua que se encuentra en equilibrio con un material slido o una disolucin. Indican el cociente entre la concentracin de agua en la fase gaseosa en el espacio areo por encima del material, y la concentracin de agua en el espacio areo por encima de agua pura a una temperatura determinada. Los microorganismos pueden crecer a actividades hdricas entre 0,998 hasta 0,6. La menos exigente es la levadura Saccharomyces rouxii, que tolera altas presiones osmticas; crece a aw= 0,6. Aspergillus glaucus y otros mohos crecen a aw = 0,8. La mayora de las bacterias necesitan actividades hdricas de ms de 0,98. La nica excepcin la constituyen las bacterias halfilas, con un aw = 0,75. Temperatura: Los microorganismos presentan distintos comportamientos en cuanto a las temperaturas de incubacin que requieren. La mayora de las bacterias del suelo o del agua son mesfilas; tienen su tasa mxima de

crecimiento entre los 20C y los 42C. Los microorganismos termotolerantes son los que todava pueden crecer a 50C (Methylococcus capsulatus). Las bacterias termfilas crecen a temperaturas superiores a los 40C con una tasa mxima y tienen el lmite superior a los 70C (Bacillus stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris). Se denominan organismos termfilos extremos a aquellos que tienen su optimo de crecimiento por encima de los 65C (Thermus aquaticus, Sulfolobus); algunos de ellos pueden crecer a temperaturas por encima de los 70C (varias especies del genero Bacillus y Clostridium) o incluso por encima de los 80C (Sulfolobus acidocaldarius) o incluso a 105C (Pyrodictium occultum, una bacteria reductora de sulfato anaerbica estricta). A las bacterias que crecen por encima de los 80C y 100C se las denomina organismos hipertermfilos. Al otro extremo de la escala de temperaturas se encuentran los psicrfilos (o crifilos), organismo entre los que predominan algunas bacterias marinas (bacterias luminiscentes) y las bacterias del hierro (Galliomella); tienen su tasa ptima de crecimiento por debajo de los 20C.

C 0

1 0

2 0

3 0

4 0

50

6 0

7 0

8 0

9 0

10 0

110

psicrfilos mesfilos
Escherichia coli Alcaligenes Pseudomonas Staphylococc us

termfilos
termfilos extremos

hipertermfil os
Thermococcu s Thermotoga Sulfolobus Thermoproteu s Desulfurolobu s Acidianus

Gallionella Leptothrix Bacillus Flavobacteriu m islandicum

Rango de temperaturas que permiten el crecimiento de diversas bacterias

Bacillus stearothermophil us Thermoactinomyc es vulgaris Thermus aquaticus

Pyrodictium occultum Pyrodictium brockii Methanophyrus Pyrobaculum

Aireacin: El oxigeno es el aceptor de electrones imprescindibles para todos los microorganismos aerbicos estrictos. Para la mayora de las bacterias que crecen sobre placas de agar o en medios lquidos poco profundos es suficiente el oxigeno del aire. No obstante, incluso en el interior y por debajo de una colonia bacteriana puede bajar hasta cero la presin parcial de oxigeno. En la figura explica esta situacin y aclara el hecho conocido desde antiguo de que, por ejemplo, la bacteria Escherichia coli, anaerbica facultativa, cuando crece sobre un sustrato fermentable como la glucosa, incluso en presencia de aire pasa de respirar a fermentar, produce entonces cidos orgnicos, y se suicida.

En los cultivos lquidos de mayor profundidad las bacterias aerbicas solo crecen en la superficie; por debajo las condiciones se van haciendo cada vez ms anaerbicas. Para permitir el crecimiento de microorganismos aerbicos tambin en las capas profundas de un cultivo lquido es necesaria la aireacin. Los microorganismos solo pueden utilizar el oxigeno disuelto. Mientras que las sales minerales y los nutrientes orgnicos pueden estar en los medios de cultivo a concentraciones que permitan el crecimiento bacteriano durante horas o das, la solubilidad del oxigeno es baja. Un litro de agua que est en equilibrio con el aire a la presin atmosfrica a 20C contiene tan solo 6,2 ml o 0,28 mmol de oxigeno. Esta cantidad es nicamente suficiente para oxidar 0,046 mmol o 8,3 mg de glucosa (aproximadamente la milsima parte de la glucosa que se encuentra en un medio de cultivo normal). Por tanto, el oxigeno no puede almacenarse en el medio liquido, sino que hay que ir proporcionndolo continuamente. Afortunadamente los microorganismos estn adaptados a una concentracin muy baja de oxigeno disuelto; no obstante, no puede sobrepasarse una cantidad mnima, la concentracin critica de O2 sin perjudicar la respiracin celular.

Distribucin del oxigeno en el interior de una colonia de Escherichia coli, y por debajo de ella, tras crecimiento sobre agar complejo. Las presiones parciales se midieron al cabo de tres das se incuban a 30C mediante un microelectrodo de O2. Los valores se dan en porcentajes de la presin parcial medida en el agar saturado de aire.

La velocidad con la que se disuelve el oxigeno se incrementa estableciendo grandes superficies entre las fases gaseosas y liquidas, y elevando la presin parcial de oxigeno en la fase gaseosa. La aireacin de cultivos lquidos se realiza generalmente con el aire o mezclas de oxigeno, nitrgeno y anhdrido carbnico. Se intenta por distintos medios establecer una gran superficie de contacto entre las dos fases. 1. Cultivo en capas finas. 2. Movimiento del lquido por agitacin (alternativa o circular). 3. Rotacin de frascos planos a lo largo de su eje longitudinal. 4. Burbujeo de la columna liquida mediante aire a presin a travs de difusores (placas porosas, frascos de KLUYVER). 5. Percolacin. 6. Agitacin mecnica. En los cultivos sumergidos de microorganismos aerbicos se utiliza frecuentemente la combinacin de la aireacin forzada con difusores (placas porosas, tuberas) y agitacin mecnica. El fermentador sin difusor y el sistema Waldhof emplean la turbulencia ocasionada por una fuerte agitacin. La figura representa algunos frascos de cultivo en los que se procur obtener a travs de la forma una superficie mxima del lquido, y tambin algunos frascos para el cultivo sumergido. Hay que considerar que, incluso un fermentador bien aireado o en las aguas naturales, la distribucin del oxigeno no es siempre homognea. Ya los mismos grumos de bacterias establecen microambientes en los que reina una presin parcial de O2 reducida. Estos microambientes semianaerbicos se forman en las aguas naturales por la materia en suspensin que contienen. Experimentalmente pueden simularse estas condiciones aadiendo partculas solidas (arcilla, celulosa, quitina) a una suspensin bacteriana; en este caso las bacterias crecen como un crecimiento masivo denso alrededor de la superficie de las partculas y sufren igualmente una deficiencia de O2. Para la demostracin de este efecto resultan idneas las bacterias anaerbicas facultativas, que en condiciones de deficiencia de oxigeno pasan a fermentar (Escherichia coli) o a respirar nitratos (Pseudomonas denitrificans).

Aparato de percolacin para hacer fluir una solucin nutritiva y aire a travs de un material de soporte (suelo, bolas de vidrio, etc.). Si por el tubo aspirador (As) se extrae continua y lentamente el aire, en la entrada de aire (Lu) ste penetra y conduce la solucin nutritiva (NL) hacia la parte superior a travs del tubo ascendente (Sr); la solucin

Recipientes para el cultivo superficial y sumergido de microorganismos aerobios Cultivo anaerbico: Para el cultivo de bacterias anaerbicas estrictas es imprescindible la exclusin del oxigeno del aire. La tcnica anaerbica emplea medios de cultivo a los que se elimina el aire: hervidos, frascos cerrados sin que queden burbujas, atmosferas sin oxigeno en desecadores o frascos de WITT, sustancias para la absorcin del oxigeno (pirogalol alcalino, ditionito, cloruro de cobre I), y otros medios auxiliares. La adicin de sustancias reductoras (acido ascrbico, tioglicolato, cistena si es posible- o tambin sulfuro) a los caldos de cultivo permite reducir o eliminar los efectos txicos del oxigeno del aire. Las bacterias extremamente sensibles al oxigeno pueden subcultivarse tambin en el aire cuando se procura, mediante una corriente continua de nitrgeno libre de oxigeno en el frasco de cultivo, que el medio no entre en contacto con el aire (tcnica de HUNGATE). Alternativamente, puede trabajarse en cabinas de siembra llenadas con nitrgeno, argn o hidrogeno libres de oxigeno. Como indicador coloreado de las condiciones anaerbicas se aade resazurina al medio de cultivo (en presencia de oxigeno es azul, anaerbicamente incoloro, despus de reoxidacin rojo) o bien se aade a los frascos de incubacin anaerbica un frasco con una disolucin de glucosa y azul de metileno (anaerbica: incoloro). Radiacin. Muchas formas de radiacin electromagntica son muy perjudiciales para los microorganismos. Estos es especialmente cierto en caso de la radiacin ionizante, de longitud de onda muy corta o de energa alta, que puede provocar que los tomos pierdan electrones, es decir, que se ionicen. Dos formas de radiacin ionizante son. 1) Los rayos x, que se producen artificialmente, y 2) los rayos gamma, que se emiten durante la desintegracin de radioistopos. Niveles bajos de radiacin bajo de radiacin ionizante producirn mutaciones y pueden causar indirectamente la muerte, mientras que niveles superiores son directamente letales. Aunque los microorganismos son ms resistentes a la radiacin ionizante que los organismos superiores, pueden ser destruidos con

una dosis suficientemente grande. Algunas bacterias (Deinococcus radiodurans) y las endosporas bacterianas pueden sobrevivir a dosis elevadas de radiacin ionizante. La luz visible es enormemente benefiosa porque es la fuente de energa de la fotosntesis. Sin embargo, incluso la luz visible, cuando est presenta a un cierta intensidad, puede daar o destruir clulas microbianas. Normalmente se precisan O2 y pigmentos denominados fotosensibilizadores. Todos los microorganismos poseen pigmentos como la clorofila, bacterioclorofila, citocromos y flavinas, que pueden absorber energa lumnica, excitarse o activarse, y actuar como fotosensibilizadores. El fotosensibilizador excitado (F) transfiere su energa al O2 generando un O2 en estado de singlete (1O2). El oxgeno en estado de singlete es muy reactivo y un agente con gran poder oxidante, que destruye rpidamente una clula. Es probablemente el agente principal empleado por los fagocitos para destruir las bacterias fagocitadas.

RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO MICROORGANISMO TEMPERATURAS CARDINALES MNIMA PTIMA MXIMA

BACTERIAS NO FOTOSINTTICAS Bacillus psychrophilus Micrococcus cryophilus Pseudomonas fluorescens Straphylococcus aureus Enterococcus faecalis Escherichia coli Neissseria gonorrhoeae Thermoplasma acidophilum Bacillus stearothermophilus Thermus aquaticus Sulfolobus acidocaldarius Pyrococcus abyssi Pyrodictium occultum Pyrolobus fumarii BACTERIAS FOTOSINTTICAS Rhodospirillum rubrum Nostoc muscorum Anabaena variabilis Anacystis nidulans Oscillatoria tenuis Synechococcus lividus Synechococcus eximius SD SD SD SD SD SD 70 30-35 32.5 35 41 SD SD 79 SD SD SD SD 45-47 74 84 -10 -4 4 6.5 0 10 30 45 30 40 60 67 82 90 23-24 10 25-30 30-37 37 37 35-36 59 60-65 70-72 80 96 105 106 28-30 24 40 46 44 45 38 62 75 79 85 102 110 113

EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO MICROORGANISMO LMITE INFERIOR PH PTIMO LMITE SUPERIOR

BACTERIAS Picrophilus oschimae Thiobacillus thiooxidans Sulfolobus acidocaldarius Lactobacillus acidophilus Staphylococcus aureus Proteus vulgaris Escherichia coli Clostridium sporogenes Pseudomonas aeruginosa Chlorobium limicola Especies de Nitrosomonas Bacillus pasteurii Nostoc muscorum Anabaena variabilis Microcystis aeruginosa Bacillus alcalophilus =0 0.5 1.0 4.0-4.6 4.2 4.4 4.4 5.5-5.8 5.6 6.0 7.0-7.6 8.5 SD SD SD 8.5 0.7 2.0-3-5 2.5 5.8-6-6 7.0-7.5 6.0-7.0 6.0-7.0 6.0-7.6 6.6-7.0 6.8 8.0-8.8 SD 6.9-7.7 6.9-9 10 10.6 SD 6.0 4.0 6.8 9.3 8.4 9.0 8.5-9.0 8.0 7.0 9.4 SD SD SD SD 11.5

USOS Y APLICACIN EN LA INDUSTRIA Propiedades de un microorganismo con valor de inters industrial Un microorganismo que pueda que pueda usarse en la industria debe producir, por supuesto, la sustancia de inters, pero se trata de mucho ms. El organismo debe ser capaz de crecer y sintetizar el producto en cultivo a gran escala. Adems preferiblemente, el organismo debe producir esporas o alguna otra forma de clula reproductiva de modo que pueda ser fcilmente inoculada en grandes fermentadores. Otra caracterstica importante de un organismo industrial es que debe crecer rpidamente y sintetice el producto deseado, en un periodo relativamente coro de tiempo. El microorganismo tambin debe ser capaz de crecer en un medio de cultivo lquido relativamente barato, que se obtenga en grandes cantidades. Muchos procesos micro0biolgicos industriales utilizan productos de desecho carbonados provenientes de otras industrias, para los medios de cultivo a gran escala. Por ejemplo, el licor de maceracin del maz (un producto de la industria del molino y maceracin del maz mojado humedecido que es rico en nitrgeno y factores de crecimiento), suero de leche (un lquido residual de la industria lctea que contiene lactosa y minerales), y otros materiales residuales de la industria con elevado contenido en carbono orgnico. Adems, un microorganismo industrial no debe ser patgeno, especialmente para el hombre, o para animales o plantas. Debido al enorme tamao de la poblacin bacteriana

de un fermentador industrial y que es prcticamente imposible evitar la contaminacin del ambiente fuera del fermentador, la presencia de un patgeno supondra un problema desastroso. Por ltimo, un microorganismo debe ser susceptible a ser manipulado genticamente. En microbiologa industrial, a menudo se ha incrementado genticamente el rendimiento, mediante mutacin y seleccin. Por tanto, disponer de un microorganismo productor estable y fcilmente manipulable es una clara ventaja. Ejemplos de productos industriales Los productos microbianos con inters industrial son de varios tipos principales (Fig. 30.1). Estas son las clulas propiamente dichas, por ejemplo, las levaduras cultivadas para alimentos, panadera o cerveza y sustancias producidas por las clulas. Ejemplos de estas ltimas son la glucosa isomerasa, agentes farmacolgicamente activos como los antibiticos, esteroides y alcaloides, particularmente productos qumicos y aditivos alimentarios tales como el popular aspartamo, edulcorante de alimentos y bebidas; y productos qumicos comunes como el etanol. En la Figura 30.1 se resumen de algunos de los productos industriales importantes, muchos de los cuales se comentarn con ms detalle posteriormente.

En el captulo anterior explicamos el proceso de crecimiento microbiano en varias fases: de latencia, exponencial y estacionaria. Aqu describimos el crecimiento microbiano y la formacin del producto en un contexto industrial y nos preguntamos: Cundo se produce el metabolito industrialmente til en el ciclo celular?. Metabolitos primarios y secundarios Hay dos tipos bsicos de metabolitos microbianos: primarios y secundarios. Un metabolito primario es el que se forma durante la fase exponencial de crecimiento, mientras que un metabolito secundario es el que se forma casi al final de la fase exponencial de crecimiento, con frecuencia muy cerca de o ya en

la fase estacionaria de crecimiento. La diferencia entre un metabolito primario y un metabolito secundario se ilustra en la figura (30.2).

Relacin entre metabolismo primario y secundario La mayora de los metabolitos secundarios son molculas orgnicas complejas que requieren un gran nmero de reacciones enzimticas especficas para su sntesis. Por ejemplo, se sabe que al menos 72 reacciones enzimticas distintas estn implicadas en la sntesis del antibitico tetraciclina, y unas 25 reacciones en la sntesis de la eritromicina; ninguna de ellas tiene lugar durante el metabolismo primario. No obstante las rutas metablicas de estos metabolitos secundarios provienen del metabolismo primario, porque las molculas precursoras para el metabolismo secundario se forman en las principales rutas

biosintticas primarias. Esto se resume en la figura 30.3, que muestra la relacin entre la principal ruta metablica primaria para la sntesis de aminocidos aromticos con las rutas del metabolismo secundario para una serie de antibiticos. Como puede observarse, muchos metabolitos secundarios estructuralmente complejos se originan a partir de molculas precursoras con una estructura muy similar.

Metabolitos primarios

Los metabolitos primarios son molculas de bajo peso molecular que intervienen, bien como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anablicas y catablicas. Productos de inters industrial: Alcoholes: etanol Aminocidos: cido glutmico, lisina, ornitina cidos orgnicos: actico, ctrico, glutnico Vitaminas: cianocobalamina (B12), riboflavina (B2) Polioles: glicerol Nucletidos: 5guanlico, 5 inosnico Las caractersticas de los metabolitos primarios son las siguientes: Son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. Se producen como productos nicos. Estos productos son producidos por todos los microorganismos (son universales). La produccin no puede perderse fcilmente por mutacin espontnea. Metabolitos secundarios A diferencia de lo que hemos visto para la produccin de etanol por levaduras, en algunos procesos biocatalticos el producto deseado no se sintetiza durante la fase activa de crecimiento sino durante la fase estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos ms comunes e importantes desde el punto de vista industrial. Las caractersticas de los metabolitos secundarios son las siguientes: Los metabolitos secundarios no son esenciales para el crecimiento y la reproduccin. La formacin de metabolitos secundarios depende fundamentalmente de las condiciones de cultivo, sobre todo de la composicin del medio. A menudo los metabolitos secundarios se producen como un grupo de estructuras muy relacionadas. Por ejemplo, se han encontrado que una

nica sepa de una especie de Streptomyces produce alrededor de 30 antibiticos antraciclina diferentes pero relacionados. Se puede incrementar enormemente la sobreproduccin de los metabolitos secundarios, mientras que los metabolitos primarios, asociados al metabolismo primario, habitualmente no pueden sobreproducirse en la misma medida.

Relaciones entre trofofase idiofase En el metabolismo secundario las fases de crecimiento se denominan trofofase, fase de crecimiento logartmico donde normalmente no se producen los metabolitos secundarios, e idiofase, fase estacionaria donde normalmente se producen los metabolitos secundarios. Aunque es una simplificacin pensar slo en dos fases, esta simplificacin nos permite comprender mejor la fermentaccin industrial de los metabolitos secundarios. Es decir, si nosotros queremos producir un metabolito secundario primero debemos asegurar las condiciones apropiadas durante la trofofase para un buen crecimiento y despus, debemos alterar esas condiciones en el momento adecuado para asegurar una excelente produccin del metabolito secundario. Este retraso en la formacin de metabolitos secundarios es uno de los principales mecanismos mediante el cual los microorganismos productores de antibiticos evitan el suicidio, puesto que al comienzo de la fase logartmica de crecimiento son sensibles a su propio antibitico, para posteriormente, durante la idiofase, volverse resistentes al antibitico que estn produciendo. Los factores que ponen en marcha la produccin de metabolitos secundarios al final de la trofofase no se conocen; nicamente se sabe que este mecanismo se dispara normalmente cuando algn nutriente del medio se ha agotado. En algunas ocasiones el nutriente responsable es una fuente de Carbono, en otras, sin embargo es el Nitrgeno o el Fsforo. La explicacin puede ser que al faltar nutrientes se alteren los metabolitos primarios y se originen inductores de los enzimas encargados de la sntesis de los metabolitos secundarios. Otra explicacin puede ser que al faltar la fuente de Carbono cesa la represin por catabolito, sintetizndose a partir de este momento los enzimas necesarios para la biosntesis de estos metabolitos secundarios. Cualquiera que sea el mecanismo general por el que se dispara el metabolismo secundario al final de la trofofase, es un hecho que en este punto hay unos cambios muy fuertes en la composicin enzimtica de las clulas, apareciendo los enzimas que estn especficamente relacionados con la formacin de metabolitos secundarios. Sin embargo, e independientemente de este aspecto general del metabolismo secundario, se ha puesto de manifiesto la existencia de

sistemas de regulacin que juegan un papel importante en la sntesis de determinados productos industriales. Efecto de los precursores Las manipulaciones, tanto del medio de cultivo como de las condiciones ambientales que se llevan a cabo durante el screening secundario de una forma sistemtica, incluyen la adicin de centenares de aditivos en los medios de cultivo que puedan actuar como posibles precursores del producto que estamos investigando. Ocasionalmente se encuentra un precursor que incrementa de forma notable la produccin de este metabolito secundario. El precursor puede incluso dirigir la sntesis de un determinado producto de entre varios que se producan anteriormente; es lo que se conoce como biosntesis dirigida. Como ejemplos de precursores estn el cido fenilactico en el caso de la produccin de bencil penicilina; determinados aminocidos especficos en la produccin de actinomicinas y tirociclinas; cidos benzoicos sustituidos en la formacin de novobiocinas. En muchas fermentaciones, sin embargo, los precursores no muestran ninguna actividad. Esto es debido a que su sntesis por el microorganismo no es el factor limitante de la produccin del metabolito secundario. En estos casos, la adicin de aditivos ha revelado efectos dramticos, tanto estimuladores como inhibidores en la produccin del metabolito secundario por parte de una molcula no precursora. Este efecto se debe normalmente a la interaccin de estos compuestos con los mecanismos reguladores del microorganismo productor. Precisamente, estudiando estos efectos se puso de manifiesto que los mecanismos reguladores de los microorganismos ejercen un efecto notable en la produccin de los metabolitos secundarios.. Principales productos de la microbiologa industrial Consideramos ahora la produccin industrial de productos microbianos, comenzando con los antibiticos. La produccin de antibiticos es una de las ms potentes industrias a nivel mundial y donde se desarrollaron inicialmente muchos principios importantes de los cultivos microbianos a gran escala. Antibiticos: aislamiento y caracterizacin De los productos de origen microbiano que se fabrican comercialmente, probablemente los antibiticos son los ms importantes. El desarrollo de los antibiticos como agentes para el tratamiento de las enfermedades infecciosas ha sido el que, sin ningn gnero de duda, ha tenido el mayor impacto en la prctica de la medicina, mucho ms que cualquier otro descubrimiento. Los antibiticos son los metabolitos secundarios tpicos. Aquellos que se usan comercialmente son producidos inicialmente por hongos filamentosos y por bacteria del grupo de los actinomicetos. En la tabla 30.2 se

recoge una lista de los fermentacin a gran escala.

antibiticos

ms

importantes

producidos

por

Bsqueda antibiticos Aunque las

de

nuevos

compaas farmacuticas actualmente realizan gran parte de la bsqueda y descubrimiento de nuevos medicamentos por modelizacin computarizada, la forma tradicional por la que se descubren nuevos antibiticos consiste en el rastreo (screening). Con este tipo de aproximacin se asla de la naturaleza, en cultivo axnico (puro), un gran nmero de microorganismos productores de antibiticos (Figura 30.7a), y en estos aislamientos se ensaya la produccin de antibiticos viendo si producen cualquier sustancia difusible que inhiba el crecimiento de ciertas bacterias usadas como control en el test. Dichas bacterias se seleccionan entre varios tipos bacterianos de modo que representen a, o estn relacionados con, patgenos bacterianos. El procedimiento clsico para ensayar la produccin de antibiticos en los aislamientos microbianos nuevos es el mtodo de siembra en estra en superficie (en placa), utilizado por primera vez por Fleming en sus estudios pioneros sobre la penicilina. Aquellos aislamientos que sean candidatos en la produccin de antibiticos se estudian posteriormente, a fin de saber si los antibiticos que producen son nuevos o no. La mayora de los aislamientos que se obtienen producen antibiticos conocidos, por lo que el bilogo industrial ha de identificar rpidamente dichos microorganismos para no perder tiempo ni medios estudindolos. Cuando se descubre un microorganismo que produce un nuevo antibitico, ste se produce en cantidades suficientes para proceder al anlisis de su estructura, y despus determinar su toxicidad y actividad teraputica en animales infectados. Por desgracia, la mayora de los nuevos antibiticos fallan el test en animales de experimentacin, y slo unos pocos tienen eficacia teraputica en medicina y se producen comercialmente. No obstante ya que el nmero de tipos de antibiticos diferentes producidos por especies del gnero

Streptomyces se estima en unos 100 000, la investigacin orientada al descubrimiento de nuevos antibiticos ocurre continuamente. Produccin industrial de penicilinas y tetraciclina Una vez que el antibitico se ha caracterizado estructuralmente, se ha probado su eficacia teraputica y bajo grado de toxicidad ensayndolos en animales de experimentacin y, por ltimo, ha pasado las diferentes fases de los ensayos clnicos (triales)(esta secuencia de ensayos puede durar varios aos segn los protocolos actuales), est listo para producirse comercialmente y venderse. Para antibiticos como la penicilina y la tetraciclina, hace aos que superaron estos obstculos; en la actualidad se fabrican, literalmente, toneladas de estos antibiticos para uso en medicina y veterinaria. Aqu nos centramos en la produccin industrial de estos dos antibiticos, como ejemplo de la produccin de antibiticos en general (metabolitos secundarios).

Antibiticos -lactmicos: penicilinas y compuestos relacionados Las penicilinas son una clase de antibiticos que se caracterizan por tener un anillo -lactmico y son producidos por varios hongos de los gneros Penicillium y Aspergillis, y por algunos procariotas. Entre las penicilinas con utilidad en clnica se conocen varias formas, y estos derivaos pueden proceder de las reacciones biocataltica de sntesis y posterior modificacin por el qumico orgnico, para producir la penicilina con propiedades clnicas especficas. La estructura bsica de todas las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico (6APA). El 6-APA lleva una cadena variable en la posicin 6. Si la sntesis de la penicilina se realiza si la adicin de precursores de la cadena lateral, se producen las penicilinas naturales (Fig. 30.9).

La fermentacin tambin puede ser ms especfica, suplementando al medio de cultivo con los precursores de la cadena lateral, de modo que slo se produzca la

penicilina deseada. Los productos que se forman en estas condiciones se denominan penicilinas biosintticas. Sin embargo, con el fin de producir las penicilinas ms tiles, aquellas con actividad frente a bacterias Gram negativas, suelen utilizarse una fermentacin combinada con un procedimiento qumico, lo cual conduce a una produccin de penicilinas semisintticas. En este caso, una penicilina natural producida microbiolgicamente es escindida, qumica o enzimticamente para dar 6-APA, y posteriormente modificada qumicamente por adicin de una cadena lateral (Fig. 30.9). Las penicilinas semisintticas tienen muchas ventajas dese el punto de vista clnico, en trminos de su espectro de accin y del hecho de que muchas de ellas, por ejemplo la amplicina, pueden administrase por va oral y, por tanto no requieren una inyeccin. Por estas razones, las penicilinas semisintticas representan la mayora de las penicilinas comercializadas en la actualidad. Mtodos de produccin de antibiticos -lactmicos La penicilina G, se produce en fermentadores de 40 000 a 200 000 litros de capacidad. La produccin de penicilina es un proceso aerbico, por lo que se necesita una aireacin muy eficiente. La penicilina es un metabolito secundario, durante la fase de crecimiento, se produce muy poca penicilina, pero una vez que la fuente de carbono se ha consumido as completamente, empieza la fase de produccin de penicilina. Alimentando al fermentador con diversos componentes del medio de cultivo, la fase de produccin de produccin de penicilina se puede alargar por varios das. Uno de los principales ingredientes en la mayora de los medios de produccin de penicilina es el licor de maceracin de maz. Esta sustancia constituye la fuente de nitrgeno y contiene otros factores de crecimiento. Generalmente la fuente de carbono es la lactosa. La penicilina se excreta al medio, y una vez que las clulas se han separado del medio por filtracin, se baja el pH del medio, y se extrae el antibitico con un disolvente orgnico. Despus de concentrarse en el solvente, el antibitico se vuelve a extraer en un medio acuoso a pH alcalino, posteriormente se concentra y se cristaliza. Rpidamente puede obtenerse penicilina altamente purificada con este mtodo. Produccin de tetraciclinas La biosntesis de una tetraciclina requiere un gran nmero de reacciones enzimticas. En el caso de la clortetraciclina (30.11), pueden estar implicados hasta 72 productos intermediarios, la mayora de los cuales slo se conocen de forma general. Estudios realizados sobre la gentica de Streptomyces aureofaciens, la bacteria productora de la tetraciclina, han mostrado que estn implicados ms de 300 genes. Con tal elevado nmero de genes, la regulacin de la biosntesis de este antibitico es muy compleja. No obstante, se conoce

una serie de seales reguladoras y programas de produccin que funcionan bien. Por ejemplo se sabe que la glucosa y fosfato reprimen la sntesis de clortetraciclina. La represin por fosfato es especialmente significativa, y por ello el medio de cultivo usado en la produccin comercial contiene una baja concentracin de fosfato. En la figura 30.11 se muestra un esquema de produccin para la clortetraciclina, como en la produccin de penicilina, el licor de maceracin del maz se emplea en la produccin a gran escala de la clortetraciclina, pero la fuente de carbono, en este caso, es la sacarosa (no la lactosa). Se evita la glucosa porque causa una represin por catabolito en la produccin de antibitico.

Aminocidos y vitaminas Las vitaminas y los aminocidos son factores de crecimiento que frecuentemente se usan con fines farmacolgicos o se aaden a los alimentos. Varias vitaminas importantes y aminocidos se producen comercialmente por procesos biocatalticos Aminocidos Los aminocidos tienen muchos usos en la industria alimentaria, como aditivos alimentarios, como aditivos en la alimentacin, en medicina, y como precursores en la industria qumica (Tabla 30.3). El aminocido ms importante es el cido glutmico, que se utiliza para aumentar el sabor (glutamato monosdico). Otros dos aminocidos importantes son el cido asprtico y la fenilalanina, que son los ingredientes en las bebidas bajas en caloras y otros productos sin azcar. La lisina, un aminocido esencial para el hombre y algunos animales de granja, se produce comercialmente a partir de la bacteria Brevibacterium flavum, para utilizarse como aditivo alimentario, aqu nos centraremos en este ltimo.

Dado que los microorganismos utilizan los aminocidos como unidades fundamentales para sintetizar protenas, su sntesis sigue una regulacin celular estricta. Sin embargo para producir industrialmente un aminocido, es necesario evitar estos mecanismos reguladores a fin de obtener una cepa que sobreexpese dicho aminocido y sea capaz de producirlo de forma econmica. La produccin de lisina por Brevibacterium flavum se controla bioqumicamente a nivel de la enzima aspartoquinasa, en la que el exceso de lisina retroinhibe la actividad de esta enzima (Fig. 30.13a). Sin embargo la sobreproduccin de la lisina puede obtenerse aislando mutantes de Brevibacterium flavum en los que la aspartoquinasa ya no est sujeta a

reroinhibicin. Esto se logra con el aislamiento de mutantes resistentes al anlogo de la lisina S-aminoetilcistena (AEC), que se une al sitio alostrico de la aspartoquinasa e inhibe la actividad de la enzima. Los mutantes resistentes a la AEC, que se obtienen fcilmente por sleccin positiva, producen una forma modificada de la aspartokinasa con un sitio alostrico que ya no reconoce a la AEC o a la lisina, por lo que la retroinhibicin por lisina est muy reducida. Dichos mutantes de Brevibacterium flavum pueden producir hasta 60g de lisina por litro en fermentadores industriales, una concentracin lo suficientemente elevada como para que el progreso sea viable.

Vitaminas Las vitaminas se usan como suplementos para ala alimentacin humana y ciertos animales, y la produccin en vitaminas sigue en importancia a la de los antibiticos slo en trminos de ventas totales de productos farmacuticos. La mayora de las vitaminas se obtienen comercialmente por sntesis qumica. Sin embargo, algunas son demasiado complicadas para sintetizarlas a bajo costo, pero pueden obtenerse por biocatlisis. La vitamina B12 y la riboflavina son las ms importantes dentro de este tipo de vitaminas. Para la produccin industria de vitamina B12 se usan las cepas microbianas que se han seleccionado especficamente por su alto rendimiento en la produccin de esa vitamina. Especies bacterians del gnero Propionibacterium y seudomonas son las principales productoras comerciales.

El cobalto es un importante componente de la estructura de la vitamina B12 y el rendimiento en la produccin de la vitamina se incrementa mucho mediante la adicin de cobalto al medio de cultivo. La riboflavinaes el compuesto parental de las flavinas, FAD y FMN, coenzimas que tienen importantes funciones en las enzimas implicadas en las reacciones de oxidacin-reduccin en casi todos los organismos. La riboflavina es sintetizada por muchos microorganismos, como bacterias, levaduras y hongos. Enzimas: Cada organismo produce una gran variedad de enzimas, muchas de las cuales se sintetizan en pequeas cantidades y estn implicadas en procesos celulares. No obstante, algunas enzimas se producen en cantidades mucho mas grandes en algunos organismos y, en ves de quedarse en el interior de la clula, se excretan al medio de cultivo. Las enzimas extracelulares (exoenzimas) son capaces de dirigir polmeros insoluble como la celulosa, las protenas y el almidn; posteriormente, los productos de de digestin son transportado al interior de la clula donde se utiliza como nutrientes para el crecimiento. Algunas de estas exoenzimas se utilizan en las industrias alimentarias, lcticas, farmacuticas y textiles, y se producen en grandes cantidades por sntesis microbiana. Las enzimas son biocatalizadores especialmente tiles porque a menudo actan en grupo funcionales qumicos que son nicos, distinguen fcilmente entre grupos funcionales similares en una misma molcula y, en muchos casos, canalizan reacciones de forma estereoespecifica, produciendo solo uno de los dos posibles enantimeros. Proteasas, amilasas y jarabes ricos en fructosa: Tanto los hongos como las bacterias producen enzimas. Las enzimas microbianas producidas en mayores cantidades desde el punto de vista industrial, son las proteasas, que se usan como aditivos en el detergente para lavar ropa. La mayora de detergentes para lavar la ropa actan contienen enzimas, principalmente proteasas, pero tambin amilasas, lipasas, reductasas y otras. Muchas de estas enzimas se aslan en bacterias alcalfilas, sobre todo de especies de gnero Bacillus, como bacillus lichemiformis. Esta enzima que tiene un pH optimo entre 9 y 10, permanecen activas al pH alcalino de las soluciones de los detergentes. Otras enzimas importantes fabricadas comercialmente son las amilasas y las glucoamilasas, que se emplean en la produccin de glucosa partir del almidn. La glucosa as producida puede entonces convertirse en fructuosa por accin de la enzima glucosa isomerasa, lo que da como resultado la produccin final de un edulcorante rico en fructosa a partir del maz, trigo o almidn de patata. En la

industria alimentaria este proceso es muy importante y un gran negocio, sobre todo en la produccin de bebidas no alcohlicas. Extremo enzimas: enzimas de procariotas que viven en ambientes extremos Algunas procariotas, llamados hipertermfilos, crecen ptimamente a temperaturas muy altas e incluso, en algunos casos, a temperaturas superiores a las de ebullicin del agua. Los hipertermfilos crecen a estas temperaturas tan elevadas porque producen macromolculas termoestables, por ejemplo: enzimas como las que se resumen en la Tabla 30.4 pero que funcionan a temperaturas muy altas. El trmino extremoenzimas se refiere a enzimas que funciona a temperaturas extremadamente altas (o enzimas que funcionan de forma ptima en cualquier ambiente extremo; por ejemplo, en el frio, con altas concentraciones de sal, o a pH muy cidos o muy alcalinos (Fig. 30.15). Los organismos que producen extremoenzimas se denominan extremfilos para indicar que crecen en condiciones que no son viables para la mayora de los microorganismos. Debido a que muchos procesos industriales operan mejor a temperaturas elevadas, las extremoenzimas de los hipetermfilos estn siendo utilizadas, cada vez ms, como biocatalizadores en las aplicaciones industriales que se recogen en la Tabla 30.4 y tambin en muchas tcnicas en la investigacin que requieren enzimas. Adems de la taq y la pfu polimerasas para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), se han aislado y caracterizado proteasas, amilasas, celulasas, pelulanasas (Fig. 30.15b) y xilanasas extremadamente termoestables de varios hipertermfilos. Dichos catalizadores termoresistentes y extremoenzimas crioactivas activas en fro- (de psicrfilos), activas en presencia de altas concentraciones de sal (de halfilos), o activas a pH alto o bajo (de alcalfilos y acidfilos, respectivamente), sin ningn gnero de duda sern cada ve ms utilizados en la industria, en situaciones en las que se requiera una actividad cataltica en condiciones extremas. Por lo tanto, la gran especificidad de las enzimas y su capacidad para distinguir entre ismeros quirales hacen que aquellas que funcionan en ambientes extremos, sean particularmente importantes para la industria qumica.

Vinagre

El vinagre es el producto resultante de la conversin del alcohol actico por la accin de las bacterias del cido actico, que son miembros de los gneros Acetobacter y Gluconobacter. El vinagre puede producirse a partir de cualquier sustancia que contenga etanol, aunque el material de partida es el vino, la cerveza o el zumo alcohlico de manzana (la sidra). El vinagre puede tambin producirse a partir de una mezcla de alcohol puro en agua. En este caso recibe el nombre de vinagre destilado, en donde el trmino destilado se refiere ms al alcohol del que se fabrica el producto que al vinagre en s mismo. El vinagre se utiliza como ingrediente aromatizante para ensaladas y otros alimentos, as como para el encurtido de ciertas carnes y las hortalizas que, de este modo (si el proceso se ha llevado a cabo de forma adecuada) se pueden almacenar sin refrigeracin durante aos. Las bacterias de cido actico representan un grupo interesante de procariotas. Se trata de bacterias estrictamente aerobias que se diferencian de la mayor parte de otros microorganismos aerobios en el hecho de que algunas de ellas, como la especie Gluconbacter, no oxidan completamente sus donadores de electrones orgnicos hasta CO2 y agua. De esta manera, cuando disponen de alcohol etlico como donador de electrones, lo oxidan a travs de quinonas slo hasta cido actico, que se acumula en el medio. Las bacterias del cido actico son muy tolerantes a los cidos, por lo que no se destruyen mediante la acidez que producen. En todo caso, existe una lata demanda de oxgeno durante el crecimiento, por lo que el problema principal en la produccin del vinagre consiste en garantizar una aireacin suficiente del medio.