Profile de alterare a ADN-ului prin aciunea soarelui la diferite latitudini

Activitile industriale umane, precum i eliberarea de gaze distructive, deranjeaz echilibrul atmosferic de cteva secole. n cadrul unui scenariu de dispariie a ozonului stratosferic, compui precum clorofluorocarbonii (CFC-urile) au jucat un rol principal. Descoperirea gurii n stratul de ozon n 1980 a condus la un val de ngrijorare la nivel global, deoarece radiaiile UVB intensificate (280-315 nm), prininducerea unei alterri grave unei game largi de molecule organice, inclusiv ADN, n general sporete daunele provocate n cazul ctorva procese fizice i biologice (Takahashi i Ohnishi, 2004; Andrady et al. 2007; Caldwell et al., 2007; McKenzie et al., 2007; Zepp et al., 2007). Cele mai importante efecte la nivel celular care reies din aciunea radiaiilor UV, i anume moartea celular sau mutageneza, sunt legate n mod direct la un lan de evenimente care implic n principal inducerea de leziuni ale ADN-ului. n orice caz, natura chimic, precum i eficiena n formarea leziunilor ADN-ului, depind n mod profund de lungimea de und fotonilor accidentali de radiaie UV. Astfel, diferite lungimi de und ale luminii UV induc tipuri de leziuni la nivel de ADN. De exemplu, prin excitarea direct de ctre componentele UV ale luminii solare, i anume lungimile de und UVB, moleculele de ADN trec prin unele modificri bine cunoscute care declaneaz reacii de dimerizare ntre pirimidinele adiacente. Principalii produi care rezult din cadrul acestor reacii fotochimice sunt pirimidina ciclobutan dimeri (CPD-urile) i primidina (6-4) pirimidon fotoprodui (6-4 PPs)(Schuch et al., 2009). Pe lng asta, la o iradiere continuat cu lugimi de und UVA (315-400 nm) pe la 320 nm, izomerii normali de 6-4PPs pot fi convertii n izomerii de valen Dewar respectivi (DewarPPs)(Perdiz et al., 2000). Pe de alt parte, radiaia cu UV poate de asemenea n mod indirect s afecteze ADN-ul dup absorbia fotonilor acesteia de ctre ali cromofori, astfel genernd specii de oxigen reactive. Leziunile ADN generate prin oxidare, cum ar fi 7.8-dihidro-8-oxoguamina (8oxodG), este indus mai eficient cu UVA dect cu UVB (Schuch i Menck, 2010), a fost adesea considerat ca leziune premutagenic n cadrul mutagenezei UVA (Piette et al., 1986; Agar et al., 2004; Kozmin et al., 2005; Dahle et al., 2008). Astfel, exist cteva consecine biologice alternative ce pot reiei din aprofundarea unei leziuni prin iradieie cu UV de inciden. Din fericire, prin intermediul unor eforturi globale pentru a diminua substanele care distrug stratul de ozon, msurile luate recent au revelat o cretere constant a nivelului de ozon la nivel global. Totui, dei nivele de ozon atmosferic sunt n curs de restaurare, rmne neclar dac schimbrile climatice vor ntrzia sau accelera recuperarea (McKenzie et al., 2007). Astfel, studiile direcionate n acest sens sunt eseniale pentru ghidarea deciziilor de natur medical, precum i politicile viitoare legate de variaiile n cazul radiaiei UV cauzat de schimbrile climatice i distrugerea stratului de ozon (UNEP, 2010). Astfel, creterea de proiecte de cercetare cu abordri interdisciplinare i axarea pe evaluarea efectelor biologice induse de lumina natural a soarelui, devine o necesitate urgent, ntr-o ncercare de a evita consecine serioase n decadele ce urmeaz. n acest sens,
1

exist o serie ntreag de sisteme de testare, dezvoltate pentru a fi folosite ca dosimetre biologice ale componetelor UV din lumina solar. Majoritatea reflect n general sensitivitatea UV a principalei inte de radiaie UV la organismele vii, prin msurarea, direct sau indirect, capacitatea de lezare a ADN-ului a radiaiei UV, ca acesta fiind evenimentul declanator n cazul variatelor efecte negative asupra sntii umane i asupra vieii n general (Yagura et al., 2011). Astfel, aplicaia ecologic a unui biosenzor bazat pe ADN puternic transparent pentru lumina UV (Schuch et al., 2009) este descris dup ecpunerea la soare n cazul unor altitudini diferite n Brazilia i Chile, n paralel cu folosirea radiometrelor fizice pentru UVB/UVA. Profilele de lezare a Adn-ului induse de ctre lumina solar n cazul fiecrei locaii a fost determinat cu ajutorul enzimelor de reparare ADN (la E. Coli formaidopirimidina-ADN glicosilaz recunoate n principal bazele purine exodate; endonucleaza bacteriofag T4 recunoate n principal CPD; iar endonucleaza de lezare ultraviolet la drojdie recunoate distrorsiile mari n cazul dublul helixului de la ADN, cum ar fi CPD i 6-4PPs i DewarPPs). Exist anticorpi specifici ce au fost folosii n determinarea imunoblot pentru a confirma inducerea de CPD i 6-4PPs dup expunerea la soare. Folosirea acestui dosimetru ADN pentru msurarea impactul genotoxic zilnic al soarelui a scos n eviden variaiile ntre profilele de lezare ADN legate de incidena solar a UVB/UVA, observat la diferite latitudini. Materiale i metode Plasmida Pentru purificarea ADN cu plasmid a fost folosit E. Coli, linia DH10b, 80lac-ZM15, lacX74, deoR, recA1, endA1, ara139, galU, haiK, rpsL, nupG, tonA, STMR, fiind fcut electrocompetent (Datsenko i Wanner, 2000) i transformat cu un vector pCMUT (1,762 bp; C, resisten la cloromfenicol i MUT, gena de mtaie int supF)(Schuch et al., 2009). Purificarea mosntrelor de ADN a fost preparat prin folosirea Qiagen Plasmid Maxi Kit (Valencia, CA) i stocat ntr-un tampon TE (10 mM Tris-HCl pH=8,0) la -20C, pn la nceperea experimentelor. Expunerea mosntrelor de ADN la soare i msurarea dozelor de UV Cu excepia Sao Paolo, Brazilia, acolo unde experiemntele au fost desfurate pe toat durata anului 2008, expunerile zilnice din mediu a mosntrelor pasmide de ADN la soare s.au desfurat la un nivel triplu n alte orae din America de Sud, pe durata verii din emnisfera sudic, astfel evalundu-se impactul genotoxic al soarelui sub incidena maxim de radiaie UV. Astfel, expunerile la soare din Punta Arenas, Chile, au fost anticipate pentru primvara din emsifera sudic, pe baza apariiei fenomenului de guri n stratul de ozon la aceast latitudine. Pe scurt, locaiile studiate au fost Punta Arenas, extrema sudic din Chile (531S; 709O), acolo unde au fost efectuate trei expuneri (Octombrie 6, 8 9 , 2008); Sao Marthinho de Serra, sudul Braziliei (294S; 538O), cu trei expuneri (27 i 29 decembrie 2006 i 4 ianuarie 2007); Sao Paolo, sud-estul Braziliei (233S; 464O), cu cel mai mare numr de expuneri (25 aprilie, 3 iunie, 1 iulie, 21 iulie, 8 august, 5 decembrie i 8 decembrie, 2008 i 8
2

iulie 2010) i Natal, n nord-estul Braziliei (55S; 351O), cu dou expuneri (27 i 28 februarie, 2009). Toate expunerile, continuate de la 10 dimineaa la ora 14:00, au fost fcute numai n zile cu un cer lipsit de nori. Paralele cu expunerile biosenzorilor de ADN, dozele de lumin solar UVA i UVB au fost obinute din integrarea valorilor de iradiere msurat continuu de radiometrele pentru UVB i UVA, instalate la fiecare locaie (UVB i UVA Radiometre, EKO Instruments Trading, Tokyo, Tokyo-to, Japonia). Cuantificarea fotoproduciei ADN Pentru definirea numrului mediu de fotoprodui ADN generai de lumina solar la fiecare latitudine, numrul relativ de forme plasmide supercirculare i circulare de ADN au fost msurate cu ajutorl analizei densitometric, ilterior separrii cu 0,8% agaroz gel electrofetic (Image Quant 300, GE Healthcare, Little Chlafont, Bickinghamshire, UK). Mosntrele cu 200 de ng de ADN au fost iniial preincubate fie cu 0,8 U de proteine Fpg (New England Biolabs, Ipswitch, MA), 70 ng de T4-endo V (produs n acest laborator), sau cu 250 ng de UVDE (Trevigen, Gaithersburg, MD) asta pentru a discrene ntre diferitele tipuri de leziuni ale ADN. Acestea au fost apoi incubate timp de 60 de minute la 37C (Fpg i T-4 endo V) sau la 30C (UVDE). Enzimele, testate anterior pn la saturaie, au fost folosite n cantiti acolo unde nu s-a observat o specificitate anume. Inducia de SSB a fost de asemenea cuantificat prin intermediul aceleiai analize densitometric, dei fr ajutorul pretratrii cu enzime de reprare a ADN. Numrul de situri sensibile la enzime i SSB per kbp de plasmid ADN a fost calculat, presupunnd c distribuia de otrav s-a adaptat la aceast tehnic, cum a fost descris anterior (Schuch et al., 2009). Identificarea de CPD i 6-4PPs prin determinri imunoblot Formarea de CPD i 6-4PPs a fost de asemenea msurat imunologic dup cum urmeaz. Un total de 200 ng de vector pCMUT expus n mod anterior la soare a fost amestecat cu 800 ng de ADN din sperm de somon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), fiert timp de 10 minute la 100C, apoi imediat transferat ntr-un mediu cu ghea, iar apoi poziionat pe mebranele de nitroceluloz (BIO-RAD, Hercules, CA) folosind un aprat de slotblot (Omniphor, San Jose, CA). Membranele au fost incubate n mod subsecvenial cu 5X SSC (750 mM NaCl, 75 mM citrat de sodiu) timp de 15 minute la temperatura camerei, uscat de asemenea la temperatura camerei, i apoi copt timp de 2 ore la 80C. blocking-ul a fost realizat n 5% lapte diluat ntr-un tampon PBS 8137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 8mM Na2HPO4; 1,5 mM KH2PO4, pH=7,6) timp de 18 ore la 4C, pe cnd membranele au fost incubate cu anti-CPD i anti-6-4PP anticorpi primari (Cosmo Bio, LTDA, Tokyo, Tokyo-to, Japonia; diluat la 1:2,000 n 5% lapte diluat ntr-un tampon PBS) cu agitare constant timp de 3 ore la temperatura camerei. Toi anticorpii primari au fost eliminai iar membranele au fost splate de 6 ori (de cinci ori fiecare) cu PBST (0,1% din Twen 20 n PBS). Anticorpul secundar, Antimouse IgG HRP conjugat (R&D Systems, Minneapolis, MN) a fost diluat n 1:2,000 n 5% lapte-PBS, iar membranele incubate sub agitaie constant timp de 2 ore la temperatura camerei. Anticorpul secundar a fost eliminat prin ase splri cu PBST. Detectrile leziunilor de ADN a fost realizat prin adugarea unui reagtent de chemiluminiscen (Amersham ECL Western blotting detection reagents an analysis system, GE Healthcare, Little Chlafont,
3

Buckinggamshire, UK) urmat de o detectare a chemiluminiscenei (Image Quant 300, GE Healthcare, Litthe Chalfont, Buckinghashire, UK). Rezultate Aplicabilitatea ADN-Dosimetrului pentru msurtorile zilnice de UV Principalul motiv pentru folosirea acestui biosenzora fost determinarea i cuantificarea leziunilor produse la nivel de ADN prin aciunea soarelui pe o perioad de expunere predetrminat ntr-un loc anume. Profilul leziunilor ADN a fost mai departe definit ca fiind procentul unui anume tip de leziuni ADN induse. Astfel, expunerea din mediu folosind un ADN dosimetru a fost realizat pe o platform situat la Universitatea Sao Paolo, Sao Paolo, Brazilia, n data de 8 iulie 2010 (n timpul iernii n emisfera sudic) de la 7 dimineaa la 5 dup-masa. Unele radiometre UVB/UVA specifice au fost instalate n aceiai locaie. Cuantificarea leziunilor ADN sunt prezentate n figura 1. Figura 1. Cuantificarea leziunilor ADN induse de lumina solar n Sao Paolo

S-a artat clar c temperatura (22C) nu exercit nici un fel de influen asupra inducerii leziunilor ADN, devreme ce numrul tutror tipurilor de leziuni cuantificate n proba control (monstre neexpuse) a fost similar cu cel al numrului leziunilor ADN n proba de control neexpus pstrat la -20C n laborator. Profilele zilnice ale leziunilor ADN observate dup expunere a fost caracterizat de 2,7% de SSB, 29,4% de baze ADN oxidate (Fpg-SS), 50,2% de CPD (T4 endo V-SS) i 17,7% de 6-4PPs (UVDE-SS T4 endo V-SS). Evaluarea oricrei variaii n cadrul impactului genotoxic al UV solare a fost realizat prin expuneri scurte (numai 2 ore), n aceiai zi. Datele despre fotoproduii ADN indui direct, precum dozele de UVB/UVA solare msurate de ctre radiometrele UV, sunt prezentate n figura 2. Dei a existat o variaie clar a inducerii leziunilor ADN, conform momentului din zi a expunerii ADN, acest rspuns biologic a fost pe de-a ntregul n concordan cu datele fizice
4

oferite de radiometre, i anume cele mai ridicate doze de UV au indus cele mai numeroase leziuni ale ADN. Un sumar al profilelor de lezare a ADN i procentul de inciden a UVB/UVA sunt prezentate n Tabelul I. Dup cum se atepta, dei foarte mic dimineaa devreme i trziu dup-mas, incidena luminii UVB a atins apogeul la prnz. n acord cu aceasta, la apogeu a existat o descretere a procentului de ruperi singulare i baze de ADN oxidate, i o cretere clar a 6-4PPs. n acest caz, dei cantitatea absolut de CPD a crescut n timpul expunerii din timpul orei de prnz, frecvena relativ a acestei leziuni a ADN a rmas invariabil n restul zilei. Astfel, frecvena relativ de 6-4PPs n cadrul profilului de leziuni ale ADN este concomitent cu incidena crescut a luminii UVB. Aceste rezultate indic ADN-dosimetrul ca fiind un sistem potrivit pentru msurarea variaiilor n cadrul impactului genotoxic a luminii solare ntr-o locaie anume.

Figura 2. Variaiile n cadrul leziunilor ADN pe durata unei zile de iarn

Tabelul 1. Profilele de lezare ADN i incidena UV dup expunerea la soare n timpul unei zile de iarn

Variaiile radiaiei solare UVB/UVA la diferite latitudini Expunerile dosimetrelor ADN pe teren de asemenea a avut loc n zile nsorite n cazul altor locaii din emisfera sudic, i anume Punta Arenas, n extrema sudic a Chile (531S; 709O), Sao Martinho de Serra, n sudul Braziliei (294S; 538O) i Natal, n nord-estul Braziliei (55S; 351O) i foarte aproape de ecuator, toate n combinaiue cu msurtori ale radiaiilor solare UVB i UVA cu ajutorul radiometrelor care monitorizau continuu dozele acestora. Datele despre dozele de UVB/UVA solare sunt prezentate n tabelul 2, mpreun cu procentele incidenei UVB/UVA, i temperaturile maxime nregistrate n timpul perioadelor de expunere, precum datele obinute despre concentraiile de ozon atmosferic de la Spectrometrul De Cartografiere Total a Ozonului (NASA, 2010). Tabelul 2. Msurtori ale sozelor solare de UVB i UVA, pronetul incidenei UVB, UVA, concentraia de ozon stratosferic i temperatura maxim n perioada expunerii a dosimetrului ADN la lumina solar la latitudini diferite

Cu excepia locaiei Punta Arenas, atunci cnd expunerile s-au fcut n perioada iernii n Antarctica, pe baza descreterii concomitente a stratului de ozon stratosferic, nu s-au observat diferene apreciabile n ceea ce privete concentraiile ozonului nregistrate la celelalte locaii de studiu n acele zile. Dei subierea stratului de ozon din Punta Arenas a fost cea mai pronunat n 6 octombrie, radiometrele au euat n a nregistra o cretere local clar a UVA. Pe de alt parte, este absolut clar c aceast cretere a dozelor de UVB este dependent n mod direct de latitudine (tabelul 2). Pentru a ilustra i mai bine acest lucru, au fost calculate valorii pentru mediile dozelor de UVB i UVA msurate n timpul expunerilor dosimetrului ADN pentru fiecare locaie, cu Punta Arena ca locaie de referin pentru comparaie (figura 3). Dup cum se atepta, incidena radiaiei UVB a crescut dramatic n conformitate cu o descretere a latitudinii. Dozele de UVB au ajuns la 1,9-, 5,3- i 12,1-fold cea mai mare n Sao Martinho da Serra, sao Paolo i Natal, fa de locaia de referin. n mod interesant, aceast cretere apreciabil nu a fost observat pentru dozele de UVA, care sunt de numai 1,3i 2,3-fold mai ridicate n Sao Paolo i Natal, respectiv n comparaie cu Punta Arenas. n mod curios, dozele de UVA msurate n San Martinho da Serra au fost mai sczute dect acelea msurate n Punta Arenas. Nu am gsit nici o explicaie raional pentru acest efect observat,
6

dei ar fi putut fi o problem de calibrare n cadrul radiometrului UVA. n orice caz, i merit notat: operarea radiometrelor UVB i UVA instalate la fiecare locaie este verificat de dou ori pe an (februarie i august).

Figura 3. Valori ale mediilor UVB i UVA la fiecare latitudine

Variaii n profilele leziunilor ADN la diferite latitudini Urmrind expunerea din mediu la fiecare locaie, monstrele de ADN au fost tratate cu enzimele de reparare a ADN Fpg. T4- endo V i UDVE, pentru a putea cuantifica numrul de leziunii specifice la nivel de ADN induse prin expunerea la lumin solar. Analiza mosntrelor prin intermediul migraiei electroforetice n gel de agar a fost fcut pentru a distinge n ADN supercircular (forma 1) de ADN circular deschis care prezenta ruperi sau protuberane cauzate de aciunea enzimatic (forma 2), ori SSB-urile directe care au fost distinse fr un pretratament cu enzime. Figura 4 se refer la experiemntele realizate pentru definirea fotoproduilor ADN rezultai din expunerile din Punta Arenas (535S), Sao Paolo (233S) i Natal (55S), de vreme ce datele cu privire la expunerile realizate n Sao Martinho da Serra (294s) au fost deja publicate (Schuch et al., 2009). Prezena formei 2 de ADN numai n cadrul monstrelor expuse la lumina solar a fost o indicaie clar a neimplicrii temperaturii din mediu n cazul indicerii leziunilor ADN. Pentru a putea cuantifica i a evalua mai bine impactul genotoxic a luminii solare la aceste latitudini diferite, mediile profilelor de lezare ADN, obinute expunerile locale totale, au fost calculate (figura 5). Dup cum este prezentat n figura 5, orice cretere a latitudinii este nsoit de o cretere corespondent n inducerea att a bazelor oxidate de ADN ct i a SSB-urilor, urmat de o descretere n formarea de 6-4PPs. Pe de alt parte, o descretere a latitudinii favorizeaz formarea de dimeri pirimidinici n relaie cu bazele oxidate ADN. Merit menionat c
7

profilele de inducie ale acestora au fost similare n cadrul varietii de locaii, astfel indicnd generarea facil a acestui tip de leziune ADN de ctre soare la orice latitudine. Mai mult, dei expunerile din Sao Paolo au avut loc n cadrul a diferite anotimpuri n anul 2008, au existat relativ puine schimbri n profilele de lezare ADN observate la aceast latitudine (figura 5), dei numrul absolut de leziuni ale ADN (ruperi/kbp) pot varia printre expunerile fcute la date diferite, cu o inducie mai ridicat primvara trziu, comparativ cu toamna i iarna. n mod interesant, acest lucru se coreleaz bine cu variaia incidenei de UVA i UVB n Sao Paolo (tabelul 2). Din pcate, frecvena mare a ploilor din perioada verii n Sao Paolo, a fcut imposibil realizarea unor experimente continue (10:00 dimineaa 2:00 dupmasa) n perioada acestui anotimp la aceast locaie, din cauza condiiilor meteo de cer acoperit de nori n aceast perioad din zi. Figura 4. Exemple reprezentative de experimente pentru definirea leziunilor ADN dup expunerea la mediu a dosimetrului-ADN din locaiile menionate

Figura 5. Determinarea profilelor de lezare ADN dup expunerea la lumin solar la diferite latitudini

Confirmarea inducerii de CPD i 6-4PPs prin determinrii imunoblot Experimentele de confirmare pentru detectarea induciei CPD i 6-4PPs, folosind enzimele de reparare ADN T4-endo V i UDVE, au fost realizate cu anticorpi specifici pentru aceste leziuni ale ADN. Figurile 7 li 7 prezint aceste rezultate de detecie ale CPD i 6-4PPs, respectiv, pentru expunerile realizate n Punta Arenas, Sao Paolo i Natal. Datele despre expunerile realizate n San Martinho da Serra au fost deja publicate (Schuch et al., 2009). Aceste rezultate practic confirm inducerea att a CPD ct i a 6-4PPs prin aciunea luminii solare la latitudinile investigate. n mod surprinztor, inducia a 6-4PPs s-a dovedit a fi mult mai ridicat la cea mai joas dintre latitudini (55S), comparativ cu celelalte locaii. Totui, o diferen analoag att de mare nu a fost observat i n cazul induciei CPD, n mod notabil mult mai puin heterogen n cadrul varietii de locaii. Astfel, pe lng susinerea ideii c genotoxicitatea luminii solare se schimb n funcie de locaia geografic, exist toate indiciile pentru faptul c 6-4PPs sunt aparent o form de markeri biomoleculari a cantitii de radiaie UVB care ajunge la sol ntr-o anumit locaie. Discuii n general, un biosenzor integreaz lungimile de und incidente de UV din lumina solar, astfel cuantificndu-le conform eficacitii biologice ale acestora. Astfel, avnd n considerare c unul dintre cele mai importante criterii pentru validitatea unui biosenzor este relevana efectelor pertinente de natur fotobiologic/fotochimic, dosimetrele bazate pe ADN au un adevrat ropl biologic (Berces et al., 1999). n acest sens, grupul nostru a dezvoltat un sistem dosimetru- ADN propice mediului, bazat pe expunerea soluiei plamidice ADN la lmpi UV i la lumina solar (Schuch et al., 2009; Schuch i Menck, 2010). n prezent, aplicabilitatea acestui sistem s-a axat pe radiaiile solare UVB i UVA direct din
9

mediu. Mai mult dect att, prin folosirea radiometrelor UVB/UVA, devin posibil comparaia rspunsurilor biologice cu datele fizice despre incidena radiaiei solare UVB/UVA n cazul unor locaii geografice diferite. ntr-un experiemnt ce a durat o zi i a fost realizat n Sao Paolo (8 iulie, 2010), cuantificarea lezinuilor ADN a indicat inducia efectiv a CPD, 6-4PPs i baze oxidate de ADN, cele treitipuri principale de leziuni cauzate de lumina solar (figura 1). Comparnd aceste date biologice cu dozele fizice de UV oferite de radiometrele UVB/UVA, am observat indicaii clare ale utilitii dosimetrelor bazate pe ADN pentru evaluarea variaiilor n cazul impactului genotoxic zilnic ale radiaiei solare UV observat ntr-o anumit locaie (figura 2). Mai departe, pentru a demonstra mai bine aplicabilitatea ecologic a acestui sistem biologic, dup fiecare expunere scurt zilnic, profilele leziunilor ADN i incidena UV au fost definite i comparate (tabelul 1). A fost evident faptul c ambele tipuri de profile trec prin unle schimbri n timpul zilei, inducia de dimeri pirimidinici aprnd n mod favorabil pe la mijlocul zilei (cnd incidena UVB este cel mai ridicat), acest fenomen fiind valabil i n cazul bazelor oxidate ADN i a ruperilor singulare ns n primele i ultimele ore de lumin solar (cnd incidena UVB este cea mai sczut). Figura 6. Detecia imunologic i cuantificarea semnalelor de anticorpi CPD n monstrele de ADN expuse la soare n Sao Paolo, Punta Arenas i Natal

10

Expunerile din mediu ale dosimetrelor- ADN s-au extins n Punta Arenas (chile), sao Martinho da Serra (Brazilia) i Natal (Brazilia), pentru a putea compara profilele de lezare ADN i incidena UVB/UVA cu cele observate n Sao Paolo (Brazilia). De vreme ce expuunerile au fost fcute n zile de var, numrul acesta limitat de experimente este conform posibilitilor de a sta n fiecare ora (tabelul 2). mportant este faptul c dei a existat o variaie puternic n cazul temperaturilor din mediu n timpul diferitelor momente de expunere, leziunile ADN nu au fost dectectate n mod semnificativ n cadrul monstrelor de control, indicnd c nu a existat un efect direct al temperaturii asupra profilelor de lezare ADN. n Punta Arenas, n prima zi, a existat o reducere puternic a concentraiei la nivelul stratului de ozon (6 octombrie 2008), iar n a doua zi, o reducere mai puin accentuat (8 octombrie 2008), iar n a treia s-a nregistrat o concentraie normal a ozonului (9 octombrie 2008). Dei dozele UV au fost puin mai ridicate n zilele cu mai puin ozon, nu a fost detectat nici o cretere expresiv a nivelelor de UVB n prima zi, comparativ cu celelalte, probabil datorit incidenei naturale sczute a lungimilor de und UVB la aceast latitudine. Pe de alt parte nu a existat nici o diferen semnificativ ntre nivelele concentraiei ozonului n cadrul locaiilor din Brazilia (tabelul 2). Figura 7. Detecia imunologic i cuantificarea semnalelor de anticorpi 6-4PPs n monstrele de ADN expuse la soare n Sao Paolo, Punta Arenas i Natal

11

Prin compararea mediilor totalului dozelor de UVB/UVA msurate la fiecare locaie n relaie cu Punta Arenas, a fost clar faptul c dei dozele de UVB au crescut invers n mod dramatic odat cu descreterea n latitudine, acest lucru nefiind departe de cazul dozelor de UVA, acolo unde creterile au fost numai minore (figura3). Astfel, dat fiind incidena absolut diferit de lumin UV n cadrul fiecrei regiuni, se subnelege c soarele exercit o presiune genotoxic variabil asupra moleculei de ADN. Prin intermediul abordrii din acest caz, s-a demonstrat clar clumina solar a indus modele diferite de lezare a ADN n Punta Arenas, comparativ cu Sao Paolo i Natal. O mai bun cunatificare a acestor experimente ecologice este dat prin compararea mediilor profilelor de lezare ADN n cadrul tutror latitudinilor studiate (figura 5). Aceste rezultate indic o anumit tendin, atunci cnd inducia de baze oxidate ADN i SSB este dependent n mod direct de o cretere a latitudinii, pe cnd inducia de 6-4PPs este dependent de acest factor n mod invers. Mai mult dect att, profilele de lezare ADN i incidena UV verificate n Punta Arenas au fost destul de similare cu cele observate n cadrul expunerilor de dimineaa devreme sau trziu dup-mas, care au avut loc n Sao Paolo n data de 8 iulie 2010 (tabelul 1). n final, detectarea att a CPD ct i a 6-4PPs prin imunoblot a fost eficient, practic confirmnd formarea acestor leziuni ADN dup expunerea la lumina solar (Figura 6 i 7). Mai departe, aceste rezultate demonstreaz faptul c inducia de 6-4PPs a fost mult mai ridicat n apropierea Ecuatorului comparativ cu alte latitudini, pe cnd inducia de CPD a fost mai puin heterogen n cazul diferitelor locaii. Astfel, se sugereaz faptul c 6-4PPs sunt o form de markeri biomoleculari a incidenei radiaiei locale UVB. Astfel, dosimetrul ADN s-a dovedit un sistem foarte util pentru evaluarea cantitii i a naturii chimice a variatelor tipuri de leziuni ADN induse de lumina solar. Aplicabilitatea ulterioar a biosenzorulrui n combinaie cu alte unelte fizice i meteorologice ar trebui s ajute la mbuntirea cunotiinelor cu privire la interaciile dintre schimbrile climatice i radiaia solar UV, pentru a evidenia importana influenei luminii solare asupra moleculelor de ADN i asupra organismelor vii.

12