ViroSeq v2 - 8 - Italian - IFU

CELERA
ViroSeq
HIV-1 Genotyping System v2.0
Destinato alluso con ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici) e ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8
Istruzioni per luso
0197 4J94-26
CDx
5001503 Rev. A
Celera 1401 Harbor Bay Parkway August 21, 2008 12:55 pm, 5001503_cover_it.fm Alameda, CA 94502 *+H3764J94260W* USA
DRAFT
ABBOTT Max-Planck-Ring 2 65205 Wiesbaden Germany + 49-6122-580
DRAFT
August 21, 2008 12:55 pm, 5001503_cover_it.fm
Indice
Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1
Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Indicazioni per luso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Sintesi e spiegazione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Principi della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Ordinazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Legenda dei simboli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Preparazione e trattamento del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

Reagenti del Pack 1 (confezione 1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Avvertenze e Precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Requisiti per la conservazione ed il trattamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Prelievo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Allestimento dellarea di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Impedire la degradazione dellRNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Flusso di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Dimensione dellanalisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Controlli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Protocollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Controllo Qualit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Limitazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Analisi di sequenziamento su ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici ABI PRISM 3100/3100-Avant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
Introduzione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Protocollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0
Analisi di ViroSeq HIV -1 Genotyping System Software v2.8. . . . . . . .24

Introduzione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Requisiti del computer per eseguire il ViroSeq Software v2.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Installazione, disinstallazione e utilizzo del software. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Esempi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Modifica dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Tabelle delle mutazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 Messaggi di errore del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Software ViroSeq e risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Caratteristiche di rendimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48

Rendimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Manutenzione e calibrazione di ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici ABI PRISM 3100/3100-Avant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54
Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 Manutenzione dei 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici 3100/3100-Avant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 Schiera di capillari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 Siringhe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 Blocchi polimerici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Campionatore automatico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Unit piastra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Manutenzione del computer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Calibrazione spaziale e spettrale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66
Riferimenti citati. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
ii
ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0
Sezione 1: Introduzione
In questa sezione:
Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Indicazioni per luso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sintesi e spiegazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Principi della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ordinazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Legenda dei simboli. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 1 1 1
ViroSeq HIV-1 Genotyping System individua le mutazioni nelle regioni RT e proteasi del gene pol e fornisce un rapporto che indica levidenza genetica di resistenza virale. Si tratta di un sistema completo che fornisce reagenti per lisolamento dellRNA virale dal plasma, RT-PCR e sequenziamento.19,20 Lintero gene proteasi e due terzi del gene RT vengono amplificati per generare un amplicone di 1,8 kb. Lamplicone viene utilizzato come stampo di sequenziamento per sette primer che producono una sequenza di consenso di circa 1,3 kb. Il ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software assembla, elabora e identifica le mutazioni presenti in questa sequenza di 1,3 kb. Il software confronta la sequenza di consenso con un riferimento noto, HXB-2, per determinare le mutazioni presenti nel campione. Infine il software ViroSeq utilizza un algoritmo proprietario per analizzare le mutazioni e generare un rapporto di resistenza farmacologica.
Uso previsto
ViroSeq HIV-1 Genotyping System stato progettato per la rilevazione delle mutazioni genomiche HIV che fanno sorgere resistenza a determinati tipi di farmaci antiretrovirali e come ausilio nel monitoraggio e trattamento dellinfezione da HIV. Nello specifico, il ViroSeq HIV-1 Genotyping System pu essere utilizzato per: rilevare la resistenza virale dellHIV-1 sottotipo B nei campioni di plasma raccolti in EDTA con una carica virale compresa tra 2.000 e 750.000 copie/mL genotipizzare lintero gene della proteasi HIV-1 dai codoni 1-99 e i due terzi del gene della trascrittasi inversa (RT) dai codoni 1-335 lutente (operatore o tecnico) deve essere adeguatamente addestrato linterpretazione e lapplicazione dei risultati devono essere effettuate da un medico qualificato.
Principi della procedura

Per ottenere risultati accurati fondamentale che loperatore sia addestrato nellesecuzione dellanalisi ViroSeq HIV-1 Genotyping. Il ViroSeq HIV-1 Genotyping System si basa su sei procedure principali: Preparazione del campione Trascrittasi inversa (RT) Reazione a catena della polimerasi (PCR) Sequenziamento ciclico Rilevamento automatico della sequenza Analisi del software
Al fine di utilizzare ViroSeq HIV-1 Genotyping System:
Ordinazioni
4J94-26 ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0 Destinato alluso con ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici) e ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 Istruzioni per luso
Il kit non deve essere utilizzato come analisi di screening per lHIV o come test diagnostico per confermare la presenza di HIV.
Indicazioni per luso

Comprende le seguenti popolazioni: soggetti infetti da HIV-1 in fallimento terapeutico (con aumento della carica virale) prima del cambio di terapia soggetti infetti da HIV-1 allo stadio iniziale, non ancora sottoposti a terapia farmacologica
Legenda dei simboli

CDx
= Numero di catalogo Celera = Rischio biologico
Sintesi e spiegazione
Il virus dellimmunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) lagente eziologico responsabile della pandemia della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS).1,2 Il trattamento delle infezioni da HIV-1 con potenti farmaci antiretrovirali pu inibire la replicazione del virus HIV-1.3,4 Tuttavia, leradicazione del virus HIV-1 appare problematica perch le infezioni latenti innescano un meccanismo di persistenza e riattivazione del virus che pu durare tutta la vita.5,6 Spesso il fallimento della terapia dovuto alla scarsa aderenza agli schemi terapeutici e/o alla comparsa di ceppi virali resistenti ai farmaci.7 Questi ceppi mutanti di HIV-1 possono essere resistenti a uno o pi farmaci di ciascuna delle sei classi di farmaci antiretrovirali: inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa, inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa, inibitori della proteasi, inibitori della fusione, inibitori d'ingresso e inibitori dello strand transfer dell'integrasi dell'HIV.8,9,10 Inoltre, la resistenza a un dato farmaco pu produrre una resistenza crociata nei confronti di altri farmaci della stessa classe.7,11 Tuttavia, il fallimento terapeutico non sempre produce resistenza a tutti i farmaci di uno stesso schema.12 Determinare la migliore terapia di salvataggio per i pazienti con fallimento a pi schemi terapeutici costituisce quindi una sfida ardua. Un fattore chiave nellindividuazione di nuove strategie di trattamento la conoscenza del genotipo di resistenza virale indicato dalle mutazioni presenti nello sciame virale nel plasma del paziente.13 Studi retrospettivi e prospettici di intervento terapeutico hanno fornito evidenze che supportano lutilit clinica dei test di resistenza.14-16 Tali studi indicano che la presenza di resistenza al farmaco un fattore di rischio indipendente per il fallimento terapeutico. Attualmente il test di resistenza raccomandato per pazienti con infezione da HIV al momento di entrare in cura, indipendentemente dal fatto che la terapia venga iniziata immediatamente o meno. consigliabile ripetere il test all'inizio della terapia antiretrovirale. Il test di resistenza farmacologica dell'HIV deve essere eseguito in caso di modifica dei regimi antiretrovirali in seguito a fallimento virologico. Il test di resistenza raccomandato anche alle donne in gravidanza prima dell'inizio della terapia antiretrovirale e alle donne che intraprendono una gravidanza nel corso della terapia.17,18
ABI
= 48 48
Numero di catalogo Applied Biosystems
Limiti di temperatura
Contiene 48 analisi
Consultare le istruzioni per luso
Pericolo di scossa elettrica/incendio
Rappresentante autorizzato nella Comunit Europea
Nocivo
Dispositivo medico per la diagnostica In Vitro
Tossico
Produttore
Pericolo laser
Rischio di infezione
Fotosensibile
ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0
Pagina 1 di 68
Sezione 2: Preparazione e trattamento del campione

In questa sezione:
Reagenti del Pack 1 (confezione 1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Avvertenze e Precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Requisiti per la conservazione ed il trattamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Prelievo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Allestimento dellarea di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Impedire la degradazione dellRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Flusso di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Dimensione dellanalisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Controlli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Protocollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Controllo Qualit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Limitazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
ViroSeq HIV-1 RT-PCR Module HIV RT Mix (mix RT HIV), provetta <0,1% dATP, dCTP, dGTP, dTTP <0,1% primer oligonucleotidici sintetici non infettivi per HIV-1 RNase Inhibitor (inibitore della RNasi), provetta 20 U/L RNase Inhibitor (inibitore della RNasi) MuLV Reverse Transcriptase (trascrittasi inversa MuLV), provetta 50 U/L trascrittasi inversa del virus della leucemia murina ricombinante HIV PCR Mix (mix PCR HIV), provetta <0,1% dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP <0,1% primer oligonucleotidici sintetici non infettivi per HIV-1 AmpliTaq Gold DNA Polymerase (AmpliTaq Gold DNA polimerasi), provetta 5 U/L AmpliTaq Gold DNA Polymerase (AmpliTaq Gold DNA polimerasi) AmpErase UNG, provetta 1 U/L uracil-N-glicosilasi DTT (100 mM), provetta 1,4% ditiotreitolo DNA Mass Ladder, provetta <0,1% DNA mass ladder
Colore del tappo Blu
Quantit 1 x 384 L
Bianco
1 x 48 L
Viola
1 x 48 L
Blu
1 x 1,42 mL
Oro
1 x 24 L
Verde Giallo Chiaro Chiaro
1 x 48 L 1 x 20 L 1 x 36 L 1 x 240 L
Reagenti del Pack 1 (confezione 1)
= 48 48
Agarose Gel Loading Buffer (soluzione tampone di caricamento di gel di agarosio), provetta RNA Diluent (diluente per RNA), provetta Colore del tappo Chiaro Quantit 2 x 14,4 mL
Chiaro
1 x 1,6 mL
ViroSeq HIV-1 Sample Preparation Module HIV Viral Lysis Buffer (soluzione tampone di lisi per il virus HIV), provetta 43% guanidina tiocianato <2% ditiotreitolo <1% N-lauroilsarcosina
Contiene guanidina tiocianato A contatto con acidi o agenti sbiancanti rilascia un gas tossico.
R 20/21/22 Nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. R 32 A contatto con acidi libera un gas altamente tossico. R 36/38 Irritante per gli occhi e la pelle. S 26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. S 35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37/39 Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S 46 In caso di ingestione, consultare immediatamente un medico e mostrare questo contenitore o la sua etichetta. RNA Diluent (diluente per RNA), provetta Chiaro 3 x 1,6 mL
Pagina 2 di 68
ViroSeq HIV-1 Sequencing Module
Colore del tappo
Quantit
ViroSeq HIV-1 8E5 Control Module BIORISCHIO POTENZIALE. Materiale di origine umana. Adottare precauzioni universali. HIV-1 8E5 Positive Control (controllo positivo HIV-1 8E5), provetta Il controllo positivo stato preparato diluendo il virus HIV-1 di tipo B coltivato (8E5) in plasma umano HIV RNA-negativo, risultato non reattivo ai test approvati dalla FDA per la ricerca di anticorpi anti-HIV-1/2, HCV, HTLV-I e HBsAg. Il virus 8E5 contiene un genoma virale intatto, ma difettoso, che presenta linserimento di una singola base in corrispondenza del codone 219 del gene RT.21 La carica virale compresa tra 50.000 e 100.000 copie/mL. HIV-1 8E5 Negative Control (controllo negativo HIV-1 8E5), provetta Il controllo negativo contiene plasma umano normale risultato negativo al test HIV RNA e non reattivo ai test approvati dalla FDA per la ricerca di anticorpi anti-HIV-1/2, HCV, HTLV-I e HBsAg.
Colore del tappo
Quantit
HIV SEQ Mix A (mix A SEQ HIV), provetta BigDye Terminator Ready Reaction Mix (mix di reazione rapida per terminatore BigDye) <0,1% primer e nucleotidi oligonucleotidici sintetici non infettivi per HIV-1 <0,1% AmpliTaq DNA Polymerase (AmpliTaq DNA polimerasi), FS <0,1% cloruro di magnesio HIV SEQ Mix B (mix B SEQ HIV), provetta BigDye Terminator Ready Reaction Mix <0,1% primer e nucleotidi oligonucleotidici sintetici non infettivi per HIV-1 <0,1% AmpliTaq DNA Polymerase, FS <0,1% cloruro di magnesio HIV SEQ Mix C (mix C SEQ HIV), provetta BigDye Terminator Ready Reaction Mix <0,1% primer e nucleotidi oligonucleotidici sintetici non infettivi per HIV-1 <0,1% AmpliTaq DNA Polymerase, FS <0,1% cloruro di magnesio HIV SEQ Mix D (mix D SEQ HIV), provetta BigDye Terminator Ready Reaction Mix <0,1% primer e nucleotidi oligonucleotidici sintetici non infettivi per HIV-1 <0,1% AmpliTaq DNA Polymerase, FS <0,1% cloruro di magnesio HIV SEQ Mix F (mix F SEQ HIV), provetta BigDye Terminator Ready Reaction Mix <0,1% primer e nucleotidi oligonucleotidici sintetici non infettivi per HIV-1 <0,1% AmpliTaq DNA Polymerase, FS <0,1% cloruro di magnesio HIV SEQ Mix G (mix G SEQ HIV), provetta BigDye Terminator Ready Reaction Mix <0,1% primer e nucleotidi oligonucleotidici sintetici non infettivi per HIV-1 <0,1% AmpliTaq DNA Polymerase, FS <0,1% cloruro di magnesio HIV SEQ Mix H (mix H SEQ HIV), provetta BigDye Terminator Ready Reaction Mix <0,1% primer e nucleotidi oligonucleotidici sintetici non infettivi per HIV-1 <0,1% AmpliTaq DNA Polymerase, FS <0,1% cloruro di magnesio
Bianco
1 x 576 L
Rosso
5 x 500 L
Bianco
1 x 576 L
Chiaro
5 x 950 L
Bianco
1 x 576 L
Bianco
1 x 576 L
Rosso
1 x 576 L
Rosso
1 x 576 L
Rosso
1 x 576 L
Pagina 3 di 68
Avvertenze e Precauzioni
1. Questo test destinato a essere utilizzato esclusivamente con plasma umano raccolto in anticoagulante EDTA. Non utilizzare questa procedura con plasma raccolto in eparina perch stato dimostrato che questultima inibisce la PCR. 2. Non pipettare con la bocca. 3. Non mangiare, bere o fumare nelle aree di lavoro del laboratorio. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati per maneggiare prelievi e reagenti del kit (per es., occhiali di sicurezza, guanti e indumenti protettivi). Lavare accuratamente le mani dopo aver maneggiato i prelievi e i reagenti del kit. 4. Evitare la contaminazione microbica e ribonucleasica dei reagenti quando si prelevano le aliquote dai flaconi di reagente. Si raccomanda luso di pipette e puntali sterili monouso. 5. Non miscelare reagenti di lotti diversi o di flaconi diversi dello stesso lotto. 6. Non utilizzare questo kit dopo la data di scadenza. 7. Ridurre al minimo lesposizione alle sostanze chimiche. Per esposizione si intende contatto, ingestione o inalazione di sostanze chimiche. Non lasciare aperti i contenitori dei prodotti chimici. Usare solo in presenza di ventilazione adeguata. 8. Lo smaltimento di reagenti non utilizzati e sostanze di scarto deve avvenire nel rispetto delle buone prassi di laboratorio (GLP) e delle normative locali, provinciali o nazionali in materia di ambiente e sanit.
Requisiti per la conservazione ed il trattamento

Nota. Se le indicazioni per la conservazione del reagente vengono osservate, le provette di reagente, chiuse o aperte, rimangono stabili fino alla data di scadenza. Non usare il kit o qualsiasi componente dei reagenti dopo la data di scadenza.
Pack 1 (confezione 1)
Modulo ViroSeq HIV-1 Sample Preparation Module ViroSeq HIV-1 RT-PCR Module
Condizioni di conservazione Conservare a 15 C a 25 C In congelatore a scongelamento manuale destinato a materiale privo di ampliconi
Commenti Una volta aperti, i seguenti componenti devono essere trasferiti e conservati nellarea destinata al DNA amplificato a 2 C a 8 C: DNA Mass Ladder Agarose Gel Loading Buffer (soluzione tampone di caricamento di gel di agarosio) Nota. Tutti gli altri componenti devono essere conservati a temperature comprese tra 15 C e 25 C nellarea destinata a materiale privo di ampliconi. Cinque fiale di controllo positivo e cinque di controllo negativo del plasma. Decongelare una fiala di plasma di controllo positivo e una di plasma di controllo negativo. Utilizzare con ciascuna analisi di campioni. Non ricongelare.
ViroSeq HIV-1 8E5 Control Module
9.
PERICOLO LASER. Lesposizione alla luce diretta o riflessa del laser a 40 mW per 0,1 secondi pu bruciare la retina e produrre punti ciechi permanenti. Non fissare mai direttamente il raggio laser n permettere che un riflesso del raggio penetri negli occhi. Attenersi alle indicazioni del produttore sul tipo di indumenti e occhiali protettivi da indossare durante lutilizzo di ABI PRISM 3100 o ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici ABI PRISM 3100 o ABI PRISM 3100-Avant).
ViroSeq HIV-1 Sequencing Module
Conservare a 15 C a 25 C In congelatore a scongelamento manuale destinato a materiale privo di ampliconi
Conservare nellarea postamplificazione a: 15 C a 25 C In congelatore a scongelamento manuale destinato esclusivamente a DNA amplificato
10.
RISCHIO BIOLOGICO. I campioni biologici come tessuti e sangue possono potenzialmente trasmettere malattie infettive. Trattare tutti i prelievi come infettivi. Utilizzare procedure di laboratorio sicure, come quelle descritte in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Biosicurezza nei laboratori microbiologici e biomedici)22 e nel documento M29-T dellNCCLS.23
Questi materiali sono sensibili alla luce. Evitare lesposizione prolungata alla luce.
Pack 2 (confezione 2)
Reagente Condizioni di conservazione Conservare nellarea postamplificazione a: 15 C a 30 C Commenti Non congelare.
11.
ATTENZIONE: I controlli contengono componenti di origine umana e/o componenti potenzialmente infettivi. I componenti derivati da sangue umano sono risultati non reattivi ai test approvati dalla FDA per la ricerca di anticorpi anti-HBsAg, HCV, HIV-1/HIV-2 e HTLV-I. Nessuno dei metodi di analisi conosciuti pu offrire la sicurezza assoluta che i prodotti di origine umana non trasmettano infezioni. Tutti i materiali di origine umana devono quindi essere considerati potenzialmente infettivi. Le particelle di HIV-1 contenute nel controllo positivo sono defettive, tuttavia gli studi hanno dimostrato una limitata capacit di ritorno alla forma infettiva. Questa possibilit va tenuta in considerazione nelleventualit di unesposizione accidentale significativa.
ViroSeq HIV-1 KCl
Prelievo
A. Raccolta del prelievo
ViroSeq HIV-1 Genotyping System deve essere utilizzato esclusivamente con campioni di plasma. Raccogliere 5 mL di sangue intero in una provetta sterile di anticoagulante EDTA (provette Vacutainer PPT, Becton-Dickinson n. 362788 o equivalenti) e capovolgere immediatamente la provetta 8-10 volte per miscelare. IMPORTANTE! Lutilizzo di questo dosaggio stato autorizzato solo per campioni paziente raccolti in EDTA. I prelievi eseguiti con eparina non possono essere utilizzati per questo dosaggio. stato dimostrato che i prelievi di plasma contenenti i seguenti componenti non interferiscono con i risultati dei test: lipidi fino a 30 mg/mL bilirubina fino a 0,6 mg/mL emoglobina fino a 5 mg/mL
12. I componenti che contengono sodio azide possono provocare una reazione con il piombo ed il rame delle tubature e formare un complesso metallo-azide altamente esplosivo. Se leliminazione delle soluzioni avviene attraverso i lavelli del laboratorio, lavare gli scarichi facendo scorrere molta acqua per evitare accumuli di azide. 13. Pulire e disinfettare a fondo tutte le superfici di lavoro con una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5% in acqua deionizzata preparata al momento. NON utilizzare agenti sbiancanti (ipoclorito di sodio allo 0,5%) su oggetti di vetro o superfici che siano state esposte ad HIV Viral Lysis Buffer (soluzione tampone di lisi virale per HIV). 14. Informazione per i clienti europei: per prodotti non classificati come pericolosi ai sensi della Direttiva 1999/45/CE del Parlamento europeo la scheda di sicurezza disponibile su richiesta dellutente professionista. Per i materiali non forniti da Celera, fare riferimento alla scheda di sicurezza del produttore per ulteriori informazioni.
Pagina 4 di 68
Si raccomanda di separare il plasma dal sangue intero entro 30 minuti dalla raccolta, ma non oltre 120 minuti dalla raccolta se si utilizzano provette PPT o equivalenti. Centrifugare le provette a 1.000-2.000 x g a temperatura ambiente (15 C a 25 C) per 15 minuti. Trasferire al pi presto il plasma dalle provette PPT (o equivalenti) a provette sterili in polipropilene da 1,5 mL e conservare a temperature comprese tra 65 C e 80 C fino allutilizzo.
Articolo
ABI
3100-AVANT IMPORTANTE! Non scaricare da Internet programmi previsti a questo scopo.
B. Trasporto dei prelievi

Il trasporto dei prodotti derivati dal sangue umano intero, compreso il plasma, deve avvenire nel rispetto delle normative nazionali e locali in materia di trasporto di agenti eziologici. possibile spedire le provette con il plasma a 2 C a 8 C se la consegna prevista entro 24 ore, oppure spedire le provette con il plasma a temperature di 70 C o inferiori su ghiaccio secco.
ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100-Avant) con: Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati, v.1.0) Versione firmware 6278000-01 o 6278050-01 Computer PC con: Microsoft Windows NT v.4.0, Service Pack 6 o 6a Processore Intel Pentium IV, 2 GHz 1 GB di RAM Disco rigido, 2 da 36 GB Kit di pulizia del blocco polimerico ABI PRISM Sequencing Analysis Software v.3.7 per computer Windows NT
C. Conservazione dei prelievi

Conservare i campioni di plasma a temperature comprese tra 65 C e 80 C. Non conservare per pi di 6 mesi. Non congelare e decongelare il plasma pi di due volte.
GeneAmp PCR System 9600 Thermal Cycler (termociclatore GeneAmp PCR System 9600) o GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler (termociclatore GeneAmp PCR System 9700) MicroAmp 96-Well Tray (vassoio a 96 pozzetti MicroAmp) (per riporre le provette di reazione con tappo attaccato) MicroAmp 96-Well Support Base (base di supporto a 96 pozzetti MicroAmp) 4J94-20 Setti per recipiente Base per piastra da 96 pozzetti Fermo per piastra da 96 pozzetti ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0, Pack 2, con: YM-100 Microconcentrators (microconcentratori YM-100) MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plates with Covers (piastre di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp con coperchi) MicroAmp Reaction Tubes with Caps (provette di reazione con tappi MicroAmp) KCl (200 mM) 4J94-21 Setti per piastra da 96 pozzetti MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp) Siringa in vetro di riempimento della schiera da 250 L Siringa in vetro della riserva del polimero, 5,0 mL Articolo
4317380 Per ottenere licenze supplementari utilizzare 4310990 e specificare v.3.7 IMPORTANTE! Non scaricare da Internet programmi previsti a questo scopo. N801-0001 o N805-0001
Materiali richiesti
Articolo ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0, Pack 1, con: ViroSeq HIV-1 Sample Preparation Module ViroSeq HIV-1 RT-PCR Module ViroSeq HIV-1 Sequencing Module ViroSeq HIV-1 8E5 Control Module
N801-0541
N801-0531
4315932 4317237 4317241 4315933 N801-0560
4304470 628-3731 221102 4316357 402824 4311320
ABI
4315930
O-ring della siringa 3100 Performance Optimized Polymer 6 (POP-6) 10X soluzioni tampone per analizzatore genetico con EDTA
ABI PRISM 3100 Capillary Array (schiera di capillari ABI PRISM 3100), 50 cm ABI PRISM 3100-Avant Capillary Array (schiera di capillari ABI PRISM 3100-Avant), 50 cm ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100) con: Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati, v.1.0.1) Versione firmware 6286100-04 Computer PC con: Microsoft Windows NT v.4.0 Processore Intel Pentium III, 550 MHz 256 MB di RAM Disco rigido, 18 GB Kit di pulizia del blocco polimerico
4333466 Formammide Hi-Di, 25 mL 3100-01 IMPORTANTE! Non scaricare da Internet programmi previsti a questo scopo.
ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100) con: Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati, v.1.1) Versione firmware 6286150-01 Computer PC con: Microsoft Windows NT v.4.0, Service Pack 5 o 6a Processore Intel Pentium IV, 2 GHz 1 GB di RAM Disco rigido, 2 da 36 GB Kit di pulizia del blocco polimerico
Contiene formammide. R 61 Pu danneggiare i bambini non ancora nati. R 36/38 Irritante per gli occhi e la pelle. S 53 Evitare lesposizione procurarsi speciali istruzioni prima delluso. S 24/25 Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. S 35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37/39 Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S 45 In caso di incidente o malessere, consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli letichetta). BigDye Terminator v1.1 Sequencing Standard (standard di sequenziamento BigDye Terminator v.1.1) 4336791
Pagina 5 di 68
Materiali non forniti

Lutente deve fornire lattrezzatura, i materiali e i reagenti seguenti. (Se non altrimenti specificato, attenersi alle istruzioni per luso fornite dal produttore.) a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. Puntali con filtro ART (Aerosol-Resistant Tips), privi di RNasi, 10-1.000 L Gel di agarosio, contenente bromuro detidio Sistema di elettroforesi su gel di agarosio (box di gel di agarosio con alimentatore in grado di fornire un campo elettrico di 10 V/cm) Nastro adesivo in alluminio Cappa di sicurezza biologica, flusso laminare, cappa pulita Agente sbiancante (come detergente preparare una soluzione al 10% prima delluso) Centrifuga, microprovetta, quick-spin (2.000 x g) Centrifuga, refrigerata (21.000-25.000 x g), con rotore sigillato ermeticamente per provette da 1,5 mL Centrifuga con rotore per piastra di microtitolazione Centrifuga con pompa a vuoto (se si utilizzano piastre a 96 pozzetti CENTRISEP 96), caratteristiche richieste: capacit di creare il vuoto rotore swinging-bucket (ad angolo oscillante) k. l. m. n. o. p. q. r. s. t. u. v. w. x. y. z. aa. ab. ac. Piastre a 96 pozzetti CENTRISEP 96 Etanolo, 70% (come detergente) Etanolo, 100%, non-denaturato (di grado per biologia molecolare) Bromuro detidio ExoSAP-IT per il clean-up dei prodotti della PCR Guanti antipolvere Isopropanolo 100%, anidro (grado ACS) Tute/camici da laboratorio Panno privi di pelucchi Dispensatori, in grado di pipettare da 0 a 1.000 L Provette con tappo a vite, 1,5 mL (sterili, prive di RNasi/DNasi), in grado di resistere a 21.000-25.000 x g Acetato di sodio, 3,0 M, pH 5,2 Tampone TBE, soluzione 10X Pipette di trasferimento, puntale sottile Box con luce ultravioletta (lampada 300 nM UV) Agitatore al vortex a piattaforma (2500 rpm) Acqua sterile deionizzata, priva di RNasi/DNasi Congelatore (decongelamento manuale) in grado di soddisfare le condizioni di conservazione indicate nella documentazione relativa al prodotto Frigorifero, in grado di soddisfare le condizioni di conservazione indicate nella documentazione relativa al prodotto
Se possibile, usare uno spazio dedicato, come un mobiletto a sicurezza biologica con una sorgente UV per la preparazione dei reagenti necessari alle fasi di allestimento della RT e della PCR. Le lampade UV germicide presenti nella maggior parte dei mobiletti a sicurezza biologica danneggiano il DNA rimasto sulle superfici esposte e lo rendono inutilizzabile per successive amplificazioni. Mantenere un rigido isolamento fisico tra larea di lavoro dedicata al DNA amplificato (Area 3) e le altre due aree per evitare il trasferimento di DNA amplificato allesterno dellArea 3. Dato il tipo di apparecchiature utilizzate nellarea di lavoro dedicata al DNA amplificato (Area 3), necessario uno spazio relativamente ampio. Questa esigenza di spazio in genere superiore a quella relativa alle Aree 1 e 2.
Impedire la degradazione dellRNA

Per il successo della genotipizzazione essenziale impedire la degradazione dellRNA nei campioni del test. LRNA viene degradato dalle RNasi. Questi enzimi sono naturalmente presenti nelle cellule e vengono liberati durante la lisi cellulare. Se la purificazione non completa, nei campioni derivati dalle cellule possono essere presenti residui di RNasi. Inoltre, dal momento che le RNasi sono secrete dalla pelle, i campioni possono risultarne contaminati al contatto con le superfici toccate dalloperatore. quindi opportuno indossare sempre guanti quando si maneggiano prelievi, reagenti, apparecchiature e prodotti monouso. Le RNasi sono molto stabili e non richiedono cofattori, quindi permangono sulle superfici mantenendo la propria funzionalit in una vasta gamma di condizioni ambientali. Sono caratterizzate da unelevata attivit, quindi un livello anche minimo di contaminazione da RNasi pu causare una perdita significativa in un campione di RNA. Le fonti di contaminazione da RNasi comprendono: prodotti generici da laboratorio in vetro e plastica pelle e peli soluzioni contaminate
Flusso di lavoro
La procedura pu essere completata nellarco di due o pi giorni. Quando la procedura viene interrotta nei punti specificati, necessario conservare i campioni preparati come indicato nella tabella seguente fino al momento di continuare. IMPORTANTE! Conservare tutti i campioni, controlli e reagenti a basse temperature (2 C a 8 C) prima di preparare il mastermix. Dopo la preparazione, conservare il mastermix a temperatura ambiente e i reagenti originali su ghiaccio.
.
Ultimata la procedura di A. Preparazione del campione B. Trascrizione inversa
Conservare i campioni a... 65 C a 80 C 15 C a 25 C 15 C a 25 C 15 C a 25 C 15 C a 25 C
Per un massimo di... 2 settimane 2 settimane 2 settimane 3 giorni 1 settimana
Allestimento dellarea di lavoro

Le diverse parti della procedura di ViroSeq HIV-1 Genotyping System devono essere eseguite in diverse aree di lavoro. Ciascuna area di lavoro deve disporre di dispensatori, attrezzature e forniture per ottenere analisi di routine adeguate. Vengono indicate tre aree di lavoro consigliate: Area 1: preparazione del campione (pre-amplificazione) utilizzata per eseguire la preparazione del campione e lavorare con campioni di HIV-1. Area 2: pre-amplificazione utilizzata per eseguire le fasi di preparazione della trascrizione inversa e della PCR. Area 3: post-amplificazione (DNA amplificato) dedicata allamplificazione della PCR, al sequenziamento ciclico, al rilevamento automatico della sequenza e ad altre attivit che richiedono la manipolazione del DNA amplificato.
C. PCR D. Sequenziamento ciclico E. Sequenze purificate
Dimensione dellanalisi
Il ViroSeq HIV-1 Genotyping System Kit contiene reagenti sufficienti ad eseguire 48 test. consigliabile eseguire le singole analisi in gruppi di 12 campioni, in modo da realizzare quattro analisi per kit. Le analisi con un numero inferiore di campioni richiedono pi cicli di congelamento e decongelamento e maggiori manipolazioni dei reagenti, il che pu tradursi in riduzione dellefficacia o in contaminazione. IMPORTANTE! Non congelare e decongelare i reagenti per pi di cinque (5) volte.
Sarebbe opportuno separare le Aree 1 e 2, per evitare il potenziale trasferimento di RNA e DNA esogeno nellarea di lavoro in cui avviene la preparazione della RT e della PCR. Tuttavia, se le Aree 1 e 2 si trovano nella stessa stanza, devono essere chiaramente delimitate. Per isolare le aree allinterno della stanza si possono utilizzare mobiletti da banco a sicurezza biologica. I dispensatori e le altre apparecchiature utilizzate nellArea 1 sono regolarmente esposte a patogeni umani a trasmissione ematica e non devono essere utilizzati allesterno dellArea 1.
Pagina 6 di 68
Controlli
Nota. Ogni analisi deve includere un controllo positivo e uno negativo. Il controllo positivo (8E5) un virus HIV-1 non infettivo24 a una concentrazione di 50.000-100.000 copie per mL. Con ogni analisi necessario utilizzare una diluizione 1:10 del controllo positivo (5.000-10.000 copie/mL) per garantire ladeguata performance dei reagenti. concepito per riprodurre i campioni dei pazienti in tutte le fasi della procedura di test del ViroSeq System, da A. Preparazione del campione fino alla Sezione 4: Analisi di ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8. Il controllo negativo plasma umano normale risultato negativo al test di controllo per HIV-1 RNA. Deve essere utilizzato da A. Preparazione del campione fino a D1. Purificazione e quantificazione dei prodotti della PCR nella sezione D. Sequenziamento ciclico per garantire lassenza di contaminazione. Data la natura del sequenziamento automatico del DNA, non consigliabile eseguire un controllo negativo.
8.
Durante la centrifuga dei campioni: decongelare il Viral Lysis Buffer (soluzione tampone di lisi virale) a temperatura ambiente.
Contiene guanidina tiocianato A contatto con acidi o agenti sbiancanti rilascia un gas tossico.
Protocollo
A. Preparazione del campione
(Il tempo totale per completare 12 campioni pari a 2,5-3,0 ore; il tempo effettivo di manipolazione pari a 1,5 ore.) IMPORTANTE! Eseguire questa procedura nellArea 1 di pre-amplificazione.
A1. Preparazione
1. Pre-raffreddare una centrifuga refrigerata e relativo rotore a 2 C a 8 C, seguendo le istruzioni del produttore. Decongelare a temperatura ambiente (15 C a 25 C) i campioni di plasma, una provetta di controllo positivo e una di controllo negativo. Tenere aperta una sola provetta di reagente o di campione alla volta. 9.
R 20/21/22 Nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. R 32 A contatto con acidi libera un gas altamente tossico. R 36/38 Irritante per gli occhi e la pelle. S 26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. S 35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37/39 Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S 46 In caso di ingestione, consultare immediatamente un medico e mostrare questo contenitore o la sua etichetta. Nota. Se si osserva del precipitato, riscaldare il Viral Lysis Buffer (soluzione tampone di lisi virale) a 37 C per dissolvere il precipitato, quindi raffreddare a temperatura ambiente prima delluso. Decongelare lRNA Diluent (diluente per RNA) e conservare a 2 C a 8 C. Preparare letanolo al 70% da utilizzare nella fase 20 e conservarlo a 2 C a 8 C. Nota. Utilizzare esclusivamente etanolo al 100% (di grado per biologia molecolare) acqua priva di RNasi/DNasi. RISCHIO CHIMICO. Letanolo un liquido e vapore infiammabile. Lesposizione pu provocare irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Il contatto prolungato o ripetuto pu provocare secchezza della pelle. Lesposizione pu danneggiare il sistema nervoso centrale e provocare danni al fegato. Tenere lontano da calore, scintille e fiamme. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. Consultare la scheda di sicurezza del produttore per ulteriori informazioni. Rimuovere le provette subito dopo larresto del rotore.
2.
3.
A2. Isolamento dellRNA virale dellHIV-1

1. 2. Agitare al vortex i campioni di plasma da 3 a 5 secondi per miscelare. Centrifugare da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. Etichettare le provette secondo il protocollo del laboratorio, quindi aliquotare 0,5 mL di plasma in una provetta nuova con tappo a vite, priva di RNasi e DNasi. Preparare un controllo con basso livello di RNA virale. Miscelare in una provetta di microcentrifugazione: 50 L di HIV-1 8E5 Positive Control (controllo positivo HIV-1 8E5) 450 L di HIV-1 8E5 Negative Control (controllo negativo HIV-1 8E5) (plasma negativo) ed etichettare adeguatamente. Apporre un contrassegno di orientamento sul lato della provetta e del tappo. Inserire i campioni nel rotore con il contrassegno di orientamento rivolto verso il bordo esterno del rotore. Nota. Utilizzare un rotore sigillato ermeticamente con un O-ring per evitare schizzi e formazione di aerosol. Centrifugare a 21.000-25.000 x g per 60 min. a 2 C a 8 C.
10. Rimuovere con attenzione il surnatante dalle provette utilizzando una pipetta di trasferimento a puntale sottile. Non agitare il pellet (che pu essere non visibile). SUGGERIMENTO: iniziare laspirazione con il puntale della pipetta di trasferimento appena sotto la linea del menisco e muovere il puntale verso il basso, lungo la parete opposta al segno di orientamento, senza smettere di aspirare. Rimuovere la maggior quantit possibile di supernatante senza agitare il pellet. 11. Aggiungere 600 L di Viral Lysis Buffer (soluzione tampone di lisi virale) a ciascun pellet. 12. Agitare al vortex da 3 a 5 secondi per miscelare. 13. Centrifugare da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. 14. Lasciare riposare i campioni a temperatura ambiente (15 C a 25 C) per 10 minuti per garantire la lisi completa del virus.
3.
4.
5. 6.
7.
Pagina 7 di 68
15. Aggiungere ad ogni campione 600 L di isopropanolo a temperatura ambiente (15 C a 25 C). RISCHIO CHIMICO. Lisopropanolo un liquido e vapore infiammabile. Lesposizione pu provocare irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Il contatto ripetuto o prolungato pu seccare la pelle e causare irritazione. Lesposizione pu avere ripercussioni sul sistema nervoso centrale con sintomi quali sonnolenza, capogiri e cefalea. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. Consultare la scheda di sicurezza del produttore per ulteriori informazioni. 16. Agitare al vortex ogni provetta da 3 a 5 secondi per miscelare. 17. Inserire i campioni nel rotore con il contrassegno di orientamento rivolto verso il bordo esterno del rotore. 18. Centrifugare i campioni a 12.500-15.000 x g a temperatura ambiente per 15 min. 19. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta di trasferimento a puntale sottile. Non agitare il pellet (che pu essere non visibile). IMPORTANTE! Evitare di smaltire il surnatante insieme a residui di agenti sbiancanti perch si forma un gas tossico. 20. Aggiungere 1 mL di etanolo freddo (2 C a 8 C) al 70% (preparato alla fase 8) in ogni provetta. 21. Agitare al vortex ogni provetta da 3 a 5 secondi per miscelare.
30. Una volta ultimata la procedura: procedere con le fasi relative alla trascrizione inversa, oppure interrompere e conservare i campioni in un congelatore a temperature comprese tra 65 C e 80 C IMPORTANTE! Non congelare e decongelare lRNA per pi di due (2) volte. Non conservare lRNA per pi di due settimane.
B. Trascrizione inversa
IMPORTANTE! Eseguire questa procedura nellArea 2 di pre-amplificazione.
B1. Preparazione
1. Se necessario, decongelare i campioni di RNA. Accertarsi di decongelare anche gli RNA di controllo positivi e negativi. Agitare al vortex da 3 a 5 secondi per miscelare. Etichettare una MicroAmp Reaction Tube (provetta di reazione MicroAmp) da 0,2 mL per ogni campione di RNA. Decongelare lHIV RT Mix (Mix RT HIV) e il DTT. Agitare al vortex da 3 a 5 secondi per miscelare. Togliere dal kit lRNase Inhibitor (inibitore della RNasi) e la MuLV Reverse Transcriptase (trascrittasi inversa MuLV). Centrifugare tutte le provette di reagente e i campioni per 1-2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo. Conservare tutti i reagenti e i campioni a 2 C a 8 C o su ghiaccio fino al loro utilizzo.
2. 3.
4.
5.
6. 22. Inserire le provette nel rotore con il contrassegno di orientamento rivolto verso il bordo esterno del rotore. 7. 23. Centrifugare a 12.500-15.000 x g a temperatura ambiente per 5 min. 24. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta di trasferimento a puntale sottile. Non agitare il pellet (che ora dovrebbe essere visibile). Rimuovere la maggior quantit possibile di etanolo. 25. Centrifugare da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il fluido residuo sul fondo della provetta. 26. Rimuovere con attenzione ogni residuo di etanolo con unaltra pipetta di trasferimento a puntale sottile. Asciugare le provette allaria, con i tappi staccati, per 1-5 minuti o fino a quando letanolo non pi visibile. IMPORTANTE! essenziale rimuovere ogni traccia visibile di etanolo. Letanolo residuo inibisce la reazione RT-PCR. 27. Risospendere ogni pellet in RNA Diluent (diluente per RNA) freddo (2 C a 8 C) come indicato nella tabella seguente.
Aggiungere questa quantit di RNA Diluent (diluente per RNA)... 100 L 50 L 50 L Controlli Positivo non diluito Positivo basso Negativo 100 L 50 L 50 L
B2. Allestimento delle reazioni RT

Nota. Utilizzare esclusivamente il termociclatore GeneAmp 9600 o 9700 situato nellArea di lavoro 2. Nota. Programmare il termociclatore prima della preparazione della reazione (vedere la fase 5). Per istruzioni di programmazione dettagliate, consultare il manuale di funzionamento del termociclatore. 1. Preparare il mastermix per RT in base alla tabella seguente. Ultimata la preparazione, riportare le soluzioni stock a temperature comprese tra 15 C e 25 C.
Volume per 1 reazione (L) 8 1 1 0,4 10,4 Volume per 5 Volume per 15 reazioni (L) reazioni (L) 40 5 5 2,0 52,0 120 15 15 6,0 156,0
Reagente HIV RT Mix (mix RT HIV) RNase Inhibitor (inibitore della RNasi) MuLV Reverse Transcriptase (trascrittasi inversa MuLV) DTT, 100 mM Volume finale
Se la carica virale ... >15.000 copie per mL 2.000-15.000 copie per mL sconosciuta
Nota. Preparare un volume sufficiente per 1-2 reazioni supplementari per compensare eventuali perdite durante il pipettaggio. 2. 3. Agitare al vortex il mastermix per RT da 2 a 3 secondi per miscelare. Centrifugare da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. IMPORTANTE! Il mastermix per RT deve essere a temperatura ambiente (15 C a 25 C) quando viene aggiunta alle provette di reazione. Non lasciare il mastermix a temperatura ambiente per pi di 30 minuti.
28. Agitare vigorosamente al vortex per 10 secondi per risospendere il pellet. possibile che rimangano tracce di materiale insolubile. 29. Centrifugare da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta.
Pagina 8 di 68
4.
Aggiungere 10 L di RNA virale nelle MicroAmp Reaction Tubes (provette di reazione MicroAmp) da 0,2 mL e rimettere in ghiaccio la soluzione madre di RNA virale. IMPORTANTE! Usare un puntale pulito per ogni aggiunta.
5.
Togliere dal kit i reagenti AmpliTaq Gold DNA Polymerase (AmpliTaq Gold DNA polimerasi) e AmpErase UNG. Decongelar e agitare al vortex per 1-2 secondi. Centrifugare tutti i reagenti da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo.
6. 5. Chiudere immediatamente le MicroAmp Reaction Tubes (provette di reazione MicroAmp) con lapposito tappo, collocarle in un termociclatore impostato con i parametri sottoindicati e avviare il programma. Scaldare i campioni, insieme allo strumento, fino a 65 C. Durante il riscaldamento dellRNA, lasciare il mastermix per RT a temperatura ambiente. Nota. Interrompere lanalisi dopo la fase 42 C, 5 min. e passare immediatamente alla fase 6.
Temperatura (C) 65 42 Tempo 30 secondi 5 minuti Procedimento Rilassa la struttura secondaria dellRNA Raffredda fino alla temperatura di attivit enzimatica ottimale
C2. Allestimento della reazione PCR

1. Preparare il mastermix per PCR. Miscelare in una provetta di microcentrifugazione sterile da 1,5 mL.
Reagente HIV PCR Mix (mix PCR HIV) AmpliTaq Gold DNA Polymerase (AmpliTaq Gold DNA polimerasi) AmpErase UNG Volume finale Volume per 1 reazione (L) 29,5 0,5 1 31 Volume per 5 reazioni (L) 147,5 2,5 5 155 Volume per 15 reazioni (L) 442,5 7,5 15 465
Interrompere manualmente la procedura, eseguire la fase 6, quindi premere Resume (riprendi) 42 99 4 60 minuti 5 minuti Pausa (>10 minuti) Trascrizione inversa Inattiva la MuLV Reverse Transcriptase (trascrittasi inversa MuLV) Sospende finch loperatore non pronto a proseguire
Nota. Preparare un volume sufficiente per 1 reazione supplementare per compensare eventuali perdite durante il pipettaggio. 2. 3. Agitare al vortex il mastermix per PCR da 3 a 5 secondi per miscelare. Centrifugare da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. Aggiungere 30 L di mastermix per PCR a ogni provetta di reazione per RT contenente cDNA di HIV-1. Ora il volume finale 50 L. Trasferire i campioni al termociclatore nellArea 3. Non ritornare nellArea 2 per il resto della giornata. Nota. Utilizzare esclusivamente il GeneAmp 9600/9700 thermal cycler (termociclatore GeneAmp 9600 o 9700) situato nellArea di lavoro 3. Nota. Per istruzioni di programmazione dettagliate, consultare il manuale di funzionamento del termociclatore. Impostare il programma del termociclatore come indicato nella tabella seguente:
Temperatura (C) 50 93 93 64 66 Tempo 10 min. 12 min. 20 sec. 45 sec. 3 min. 10 min. Mantenimento 1 40 Cicli 1 1
Nota. Impostare il volume sul termociclatore su 20 L quando il sistema lo richiede. IMPORTANTE! Gli strumenti GeneAmp 9600 e 9700 rimangono in pausa solo per 10 minuti. La fase 6 deve essere eseguita entro 10 minuti. 6. Mentre lo strumento in pausa, eseguire le seguenti operazioni. a. Rimuovere immediatamente i campioni di RNA dal termociclatore. b. Aggiungere 10 L di mastermix per RT a temperatura ambiente a ogni provetta di reazione e chiudere le provette con il tappo. c. Agitare al vortex il vassoio con i campioni da 3 a 5 secondi per miscelare. d. Centrifugare il vassoio dei campioni per 1-2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo. Riporre i campioni nel termociclatore e premere Resume (riprendi). Al termine del programma di RT, lasciare i campioni nel termociclatore per almeno 10 minuti a 4 C, ma per non pi di 18 ore. Al termine del programma: procedere con le fasi relative alla PCR, oppure interrompere la procedura e conservare i campioni a temperature comprese tra 15 C e 25 C fino a quando non si pronti per eseguire la PCR; i campioni non possono essere conservati per pi di due settimane.
4.
5.
6.
7. 8.
9.
C. PCR
C1. Preparazione
IMPORTANTE! Eseguire questa procedura nellArea 2 di pre-amplificazione. 1. Se i campioni sono congelati, decongelarli a temperatura ambiente (15 C a 25 C). Centrifugare il vassoio dei campioni o le provette da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo. Decongelare lHIV PCR Mix (mix PCR HIV). Agitare al vortex da 3 a 5 secondi per miscelare. 7. 8.
72 4
Nota. Impostare il volume sul termociclatore su 50 L quando il sistema lo richiede. Trasferire le provette nel termociclatore e avviare il programma. Al termine del programma: passare alle fasi di purificazione, oppure interrompere la procedura e conservare i campioni a temperature comprese tra 15 C e 25 C. IMPORTANTE! Non lasciare le provette in attesa per pi di 24 ore. Lattivit residua dellUNG pu distruggere il DNA amplificato.
2.
3. 4.
Pagina 9 di 68
D. Sequenziamento ciclico
IMPORTANTE! Eseguire questa procedura nellArea 3 di post-amplificazione.
Preparazione del gel di agarosio per prodotti della PCR purificati con YM-100 Microconcentrator (microconcentratore YM-100): 1. Decongelare il DNA Mass Ladder a temperatura ambiente (15 C a 25 C). Questa operazione richiede almeno 30 minuti. Prima delluso, agitare al vortex da 10 a 15 secondi per miscelare. Decongelare lAgarose Gel Loading Buffer (soluzione tampone di gel di agarosio) a temperatura ambiente. Questa operazione richiede almeno 30 minuti. Nota. In caso di formazione di cristalli, riscaldare la soluzione a 65 C per 10 minuti. Prima delluso, agitare al vortex da 10 a 15 secondi per miscelare. Preparare un gel di agarosio all1% usando TBE e aggiungere 0,5 g/mL di bromuro detidio (o utilizzare uno dei gel di agarosio all1% in commercio). RISCHIO CHIMICO. Il bromuro detidio provoca irritazione degli occhi, della pelle e del tratto respiratorio ed un noto mutageno (ovvero pu indurre mutazioni nel materiale genetico di una cellula vivente ed potenzialmente cancerogeno). Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. Consultare la scheda di sicurezza del produttore per ulteriori informazioni. 4. Preparare una soluzione tampone TBE 1X di gel contenente 0,5 g/mL di bromuro detidio. Collocare il gel preparato nellapposito box. Aggiungere una quantit di soluzione tampone TBE 1X di gel sufficiente a coprire il gel. Per ogni campione, miscelare: 5 L di Agarose Gel Loading Buffer (soluzione tampone di caricamento di gel di agarosio) 5 L di prodotto della PCR purificato Caricare la soluzione di DNA Mass Ladder. a. 6 L nella corsia 1 b. 3 L nella corsia 2 Si ottengono i seguenti risultati:
Bande Posizione Superiore Seconda Terza Dimensione (kb) 2,0 1,2 0,8
D1. Purificazione e quantificazione dei prodotti della PCR

Esistono due metodi di purificazione dei prodotti della PCR.
Opzione 1: Microconcentrazione
Per concentrare e purificare i prodotti della PCR con YM-100 Microconcentrators (microconcentratori YM-100): 1. Assemblare il microconcentratore. a. Per ogni campione, applicare le etichette su: una provetta di raccolta da 1,5 mL una spin column b. Inserire in ciascuna provetta la spin column, adeguatamente etichettata, con la membrana bianca rivolta verso lalto. Pipettare con attenzione 300 L di KCl (200 mM) in ciascun serbatoio di ogni microconcentratore. Il KCl (200 mM) fornito nel Pack 2 (confezione 2). IMPORTANTE! Non toccare la membrana con il puntale della pipetta. 3. Pipettare completamente i 50-L di prodotto della PCR di ogni campione nel serbatoio riempito di KCl del microconcentratore con letichetta corrispondente. IMPORTANTE! Non toccare la membrana con il puntale della pipetta. 4. 5. 6. Chiudere saldamente ogni provetta con il tappo allegato. Centrifugare i microconcentratori preparati a 800-900 x g per 15 minuti. Aprire i tappi delle provette e pipettare con attenzione 300 L di acqua deionizzata sterile nel serbatoio di ogni microconcentratore. IMPORTANTE! Non toccare la membrana con il puntale della pipetta. 7. 8. 9. Chiudere saldamente ogni provetta con il tappo allegato. Centrifugare i microconcentratori preparati a 800-900 x g per 15 minuti. Aprire i tappi delle provette e pipettare con attenzione 35 L di acqua deionizzata sterile nel centro di ogni microconcentratore. IMPORTANTE! Non toccare la membrana con il puntale della pipetta. 10. Capovolgere i microconcentratori in provette di raccolta nuove, etichettate. a. Rimuovere i microconcentratori dalla provetta contenente filtrato. b. Posizionare il microconcentratore capovolto sopra una provetta nuova da 1,5 mL, adeguatamente etichettata, per ogni campione. c. Eliminare la vecchia provetta con il filtrato. 11. Centrifugare i microconcentratori preparati a 800-900 x g per 5 minuti. 12. Rimuovere ed eliminare i microconcentratori, lasciando i campioni nelle provette. 13. Chiudere saldamente ogni provetta con il tappo allegato e: continuare lanalisi del gel di agarosio oppure interrompere la procedura e conservare i campioni a temperature comprese tra 15 C e 25 C, per non pi di due settimane.
2.
3.
2.
5. 6.
7.
8.
Corsia da 6 L (ng) 100 60 40
Corsia da 3 L (ng) 50 30 20
9.
Caricare ognuna delle restanti corsie con 10 L dei vari campioni IMPORTANTE! Ricordare di registrare con quali campioni sono state caricate le diverse corsie.
10. Eseguire lelettroforesi a 10 V/cm fino a quando il blu di bromofenolo si spostato di almeno 5 cm nel gel. 11. Esaminare il gel con una lampada UV. 12. Fotografare il gel usando un tempo di esposizione che non saturi la pellicola e che mostri le differenze di intensit dei frammenti di mass ladder.
Pagina 10 di 68
13. Valutare la quantit di prodotti della PCR in ciascun campione confrontando lintensit di ogni banda con le intensit delle bande di DNA Mass Ladder.
4.
Preparare una soluzione tampone TBE 1X di gel contenente 0,5 g/mL di bromuro detidio. Collocare il gel preparato nellapposito box. Aggiungere una quantit di soluzione tampone TBE 1X di gel sufficiente a coprire il gel. Per ogni campione, miscelare: 5 L di Agarose Gel Loading Buffer (soluzione tampone di caricamento di gel di agarosio) 5 L di prodotto della PCR non purificato Caricare la soluzione di DNA Mass Ladder. a. 6 L nella corsia 1 b. 3 L nella corsia 2 Si ottengono i seguenti risultati:
5. 6.
7.
8. Diluire il prodotto della PCR residuo per ogni campione con acqua distillata deionizzata (ddH2O) in base alla tabella seguente.
Se lintensit della banda ... 20-40 ng 40-60 ng 60-100 ng >100 ng Allora... Regolare il volume del campione su 60 L. Eseguire una diluizione 1:2 del campione con ddH2O (1 parte di campione e 1 parte dacqua). Eseguire una diluizione 1:4 del campione con ddH2O (1 parte di campione e 3 parti dacqua). Eseguire una diluizione 1:10 del campione con ddH2O (1 parte di campione e 9 parti dacqua).
Bande Posizione Superiore Seconda Terza 9. Dimensione (kb)

2,0 1,2 0,8
Corsia da 6 L (ng)
100 60 40
Corsia da 3 L (ng)
50 30 20
Nota. La banda del prodotto della RT-PCR deve avere unintensit uguale o superiore a quella della banda di mass ladder da 20 ng per garantire una sequenza di elevata qualit. 14. Mettere il tappo e agitare al vortex ogni campione diluito da 3 a 5 secondi per miscelare. 15. Centrifugare da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. 16. Ultimata la procedura, passare al sequenziamento ciclico.
Caricare ognuna delle restanti corsie con 10 L dei vari campioni IMPORTANTE! Ricordare di registrare con quali campioni sono state caricate le diverse corsie.
10. Eseguire lelettroforesi a 10 V/cm fino a quando il blu di bromofenolo si spostato di almeno 5 cm nel gel. 11. Esaminare il gel con una lampada UV. 12. Fotografare il gel usando un tempo di esposizione che non saturi la pellicola e che mostri le differenze di intensit dei frammenti di mass ladder. 13. Valutare la quantit di prodotti della PCR in ciascun campione confrontando lintensit di ogni banda con le intensit delle bande di DNA Mass Ladder. Nota. NON diluire in questa fase. 14. Procedere alla purificazione dei prodotti della PCR con ExoSAP-IT per i campioni di cui stata stabilit unintensit uguale o superiore a quella della banda del mass ladder da 20 ng. Nota. La banda del prodotto della RT-PCR deve avere unintensit uguale o superiore a quella della banda di mass ladder da 20 ng per garantire una sequenza di elevata qualit. Purificazione dei prodotti della PCR con ExoSAP-IT per il clean-up dei prodotti della PCR: Nota. Utilizzare solo il GeneAmp 9700 thermal cycler (termociclatore GeneAmp 9700). Nota. Programmare il termociclatore prima della preparazione della reazione (vedere la fase 3). Per istruzioni di programmazione dettagliate, consultare il manuale di funzionamento del termociclatore. 1. Pipettare con attenzione 3 L di ExoSAP-IT in ogni provetta contenente 45 L di prodotto della PCR con unintensit di banda uguale o superiore a 20 ng/5 L.
Opzione 2: ExoSAP-IT per il clean-up dei prodotti della PCR

Nota. Lopzione ExoSAP-IT richiede una quantificazione del gel di agarosio, seguita dal trattamento con ExoSAP-IT, quindi la diluizione adeguata per il sequenziamento. Preparazione del gel di agarosio del prodotto della PCR non purificato per lopzione ExoSAP-IT: 1. Decongelare il DNA Mass Ladder a temperatura ambiente (15 C a 25 C). Questa operazione richiede almeno 30 minuti. Prima delluso, agitare al vortex da 10 a 15 secondi per miscelare. Decongelare lAgarose Gel Loading Buffer (soluzione tampone di gel di agarosio) a temperatura ambiente. Questa operazione richiede almeno 30 minuti. Nota. In caso di formazione di cristalli, riscaldare la soluzione a 65 C per 10 minuti. Prima delluso, agitare al vortex da 10 a 15 secondi per miscelare. Preparare un gel di agarosio all1% usando TBE e aggiungere 0,5 g/mL di bromuro detidio (o utilizzare uno dei gel di agarosio all1% in commercio). RISCHIO CHIMICO. Il bromuro detidio provoca irritazione degli occhi, della pelle e del tratto respiratorio ed un noto mutageno (ovvero pu indurre mutazioni nel materiale genetico di una cellula vivente ed potenzialmente cancerogeno). Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. Consultare la scheda di sicurezza del produttore per ulteriori informazioni.
2.
3.
Pagina 11 di 68
2.
Chiudere le provette con il tappo. Agitare al vortex le provette o il vassoio con i campioni da 3 a 5 secondi per miscelare. c. Centrifugare le provette o il vassoio dei campioni da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo. Ora il volume finale 48 L. Programmare il termociclatore con le seguenti impostazioni: Temperatura (C)
37 80 4
a. b.
D2. Preparazione del sequenziamento ciclico

Nota. Utilizzare esclusivamente il GeneAmp 9600/9700 thermal cycler (termociclatore GeneAmp 9600 o 9700) situato nellArea di lavoro 3. Nota. Programmare il termociclatore prima della preparazione della reazione (vedere la fase 7). Per istruzioni di programmazione dettagliate, consultare il manuale di funzionamento del termociclatore. Nota. Non preparare reazioni di sequenziamento per il controllo negativo. IMPORTANTE! Le mix di sequenziamento sono sensibili alla luce. Evitare di esporre le mix alla luce per periodi di tempo prolungati. 1. Decongelare le mix di sequenziamento HIV-1 a temperatura ambiente (15 C a 25 C). Preparare il formato della reazione. possibile utilizzare una delle opzioni seguenti. Una MicroAmp Reaction Tube (provetta di reazione MicroAmp) per ogni HIV SEQ Mix (mix SEQ HIV) MicroAmp 8-Tube Strip (8 strisce per provette MicroAmp) in un vassoio MicroAmp Una MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp) (inclusa nel kit) IMPORTANTE! Se si utilizza una MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp), necessario tenere in considerazione il layout dei campioni oltre alla piattaforma dello strumento utilizzata.
3.
Tempo
15 min. 15 min. Mantenimento
Cicli
1 1
2.
Nota. Impostare il volume di reazione sul termociclatore su 48 L quando il sistema lo richiede. 4. Trasferire le provette o il vassoio con i campioni nel termociclatore e avviare il programma. Terminato il programma, procedere alle fasi di diluizione.
5.
Diluizione del prodotto purificato con ExoSAP-IT per il sequenziamento ciclico: 1. Diluire il prodotto della PCR purificato con ExoSAP-IT per ogni campione con acqua distillata deionizzata (ddH2O) in base alla tabella seguente. Se lintensit della banda era...
20-40 ng 40-60 ng 60-100 ng >100 ng
Allora...
Regolare il volume del campione su 60 L. Eseguire una diluizione 1:2 del campione con ddH2O (1 parte di campione e 1 parte dacqua). Eseguire una diluizione 1:4 del campione con ddH2O (1 parte di campione e 3 parti dacqua). Eseguire una diluizione 1:10 del campione con ddH2O (1 parte di campione e 9 parti dacqua).
Illustrazione:
Una piastra di reazione a 96 pozzetti caricata con il campione 1 (S1) a partire dalla colonna 1 della piastra a 96 pozzetti, S2 nella colonna 2, e cos via. La fila H non viene utilizzata, a meno che non si intenda analizzare 13 campioni per piastra. Nota. Se si utilizza un 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant) per la fase di rilevamento automatico della sequenza, possibile analizzare solo 7 colonne di campioni alla volta. Le rimanenti colonne di campioni e 10 L da ciascuno dei pozzetti contenenti il controllo positivo devono essere trasferiti a una seconda piastra. Fare riferimento al paragrafo Preparazione di reazioni di sequenziamento purificate per lanalisi con il 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant). 3. In ogni provetta o pozzetto, miscelare come segue:
Volume per una reazione (L)
Componente Aggiungere una delle seguenti HIV-1 SEQ mix (mix SEQ HIV-1) a ogni provetta o pozzetto della piastra: HIV SEQ Mix A (mix A SEQ HIV) HIV SEQ Mix B (mix B SEQ HIV) HIV SEQ Mix C (mix C SEQ HIV) HIV SEQ Mix D (mix D SEQ HIV) HIV SEQ Mix F (mix F SEQ HIV) HIV SEQ Mix G (mix G SEQ HIV) HIV SEQ Mix H (mix H SEQ HIV) Prodotto della PCR purificato, diluito Volume finale
12
2.
Mettere il tappo e agitare al vortex ogni campione diluito da 3 a 5 secondi per miscelare. Centrifugare da 1 a 2 secondi a 2.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. Ultimata la procedura, passare al sequenziamento ciclico. 4.
3.
8 20
4.
Chiudere i tappi delle provette o posizionare sopra la piastra una copertura per MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp). Centrifugare a temperatura ambiente per 5-10 secondi. Trasferire i campioni nel termociclatore.
5. 6.
Pagina 12 di 68
7.
Impostare il programma del termociclatore come indicato nella tabella seguente:

Temperatura (C) 96 50 60 4
8.
Posizionare immediatamente un foglio di carta assorbente o un panno privo di pelucchi sopra il vassoio/la piastra e capovolgerlo/a. Collocare il vassoio o la piastra nella centrifuga in posizione capovolta, adagiato/a su un panno privo di pelucchi o su carta assorbente, e centrifugare a 700 x g per 1 minuto. IMPORTANTE! necessario eseguire lo spin inverso subito dopo la centrifugazione, altrimenti si verifica una perdita di segnale.
Se il vassoio/piastra... Allora...
9.
Tempo 10 sec. 5 sec. 4 min. Mantenimento 25 Cicli
Nota. Impostare il volume di reazione sul termociclatore su 20 L quando il sistema lo richiede. IMPORTANTE! Non lasciare i campioni in attesa per pi di 24 ore. Conservare i campioni a temperature comprese tra 15 C e 25 C. 8. 9. Avviare il termociclatore. Al termine del programma: passare alle fasi di purificazione, oppure interrompere la procedura e conservare i campioni a temperature comprese tra 15 C e 25 C. Non conservare i campioni per pi di 3 giorni a temperature comprese tra 15 C e 25 C.
attende per pi di 1 minuto prima dello spin centrifugare in posizione verticale per inverso 5 minuti a 1.500-2.000 x g prima di eseguire lo spin inverso.
10. Quando la centrifuga si arresta e lasciugatura ultimata, togliere il vassoio/la piastra e sigillarlo/a con tappi in strisce o nastro adesivo in alluminio, quindi conservare a temperature comprese tra 15 C e 25 C al buio. Analizzare i campioni entro una settimana. IMPORTANTE! Utilizzare un box scuro per la conservazione. I prodotti delle reazioni di sequenziamento sono sensibili alla luce.
D3.b Purificazione con etanolo/acetato di sodio

1. Preparare la soluzione di etanolo/acetato di sodio facendo reagire i seguenti componenti: 2 L di acetato di sodio 3,0 M a pH 5,2 50 L di etanolo al 100% RISCHIO CHIMICO. Letanolo un liquido e vapore infiammabile. Lesposizione pu provocare irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Il contatto prolungato o ripetuto pu provocare secchezza della pelle. Lesposizione pu danneggiare il sistema nervoso centrale e provocare danni al fegato. Tenere lontano da calore, scintille e fiamme. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. Preparare una soluzione sufficiente per una reazione in pi del necessario. Consultare la scheda di sicurezza del produttore per ulteriori informazioni. IMPORTANTE! Preparare una soluzione fresca per ogni serie di precipitazioni. 2. Aggiungere 52 L di soluzione di etanolo/sodio acetato a ogni reazione di sequenziamento. Sigillare le provette con tappi in strisce o la piastra con nastro adesivo in alluminio. Miscelare capovolgendo tre volte o agitando. IMPORTANTE! In questa fase miscelare a fondo. Si tratta di unoperazione essenziale per ottenere una precipitazione efficace. 5. 6. Centrifugare a 2.000 x g per 20 minuti. Non appena la centrifuga si arresta, togliere i tappi o il nastro adesivo senza agitare i pellet. Posizionare immediatamente un foglio di carta assorbente o un panno privo di pelucchi sopra il vassoio/la piastra e capovolgerlo/a. Centrifugare a 150 x g per 1 minuto. Aggiungere 150 L di etanolo al 70% a ogni pozzetto.
D3. Purificazione delle sequenze

Esistono tre metodi raccomandati per la purificazione delle reazioni di sequenza BigDye Terminator.
D3.a Purificazione delle sequenze con isopropanolo

1. Rimuovere il MicroAmp tray (vassoio MicroAmp) dal termociclatore e togliere i tappi da tutte le provette o la copertura dalla piastra. Aggiungere a ogni miscela di campioni: 20 L di acqua deionizzata 60 L di isopropanolo al 100% RISCHIO CHIMICO. Lisopropanolo un liquido e vapore infiammabile. Lesposizione pu provocare irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Il contatto ripetuto o prolungato pu seccare la pelle e causare irritazione. Lesposizione pu avere ripercussioni sul sistema nervoso centrale con sintomi quali sonnolenza, capogiri e cefalea. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. Consultare la scheda di sicurezza del produttore per ulteriori informazioni. anche possibile preparare una soluzione madre fresca miscelando: 1 parte di acqua deionizzata 3 parti di isopropanolo al 100% Quindi aggiungere 80 L a ogni miscela di campioni. 3. Sigillare le provette con tappi in strisce o la piastra con nastro adesivo in alluminio. 7. 4. 5. Agitare al vortex o capovolgere il vassoio varie volte per miscelare. Incubare le miscele di campioni: a temperatura ambiente al buio per 15 minuti Centrifugare il vassoio/la piastra a 1.500-2.000 x g per 45 minuti. Non appena la centrifuga si arresta, togliere con attenzione i tappi o il nastro adesivo senza agitare i pellet. 8. 9.
2.
3.
4.
6. 7.
10. Centrifugare a 2.000 x g per 5 minuti. 11. Posizionare immediatamente un foglio di carta assorbente o un panno privo di pelucchi sopra il vassoio/la piastra e capovolgerlo/a.
Pagina 13 di 68
12. Centrifugare a 150 x g per 1 minuto. 13. Quando la centrifuga si arresta e lasciugatura ultimata, togliere il vassoio/la piastra e sigillarlo/a con tappi in strisce o nastro adesivo in alluminio, quindi conservare a temperature comprese tra 15 C e 25 C al buio. Analizzare i campioni entro una settimana. IMPORTANTE! Utilizzare un box scuro per la conservazione. I prodotti delle reazioni di sequenziamento sono sensibili alla luce.
Successo della RT-PCR

Il successo della RT-PCR viene stabilito nella sezione D1. Purificazione e quantificazione dei prodotti della PCR. Per garantire una sequenza di elevata qualit, lintensit della banda della RT-PCR deve essere uguale o superiore a quella della banda del mass ladder da 20 ng nel gel di agarosio. In questa fase i campioni di plasma con carica virale superiore a 2.000 copie per mL devono fornire almeno 20 ng di prodotto della RT-PCR. Se la carica virale scende sotto 1.000 copie per mL, le possibilit di successo della PCR diminuiscono. Tuttavia, qualsiasi campione con una quantificazione di DNA pari o superiore a 20 ng pu essere sequenziato per fornire un genotipo, indipendentemente dalla concentrazione iniziale nel plasma. LHIV-1 8E5 Positive Control (controllo positivo HIV-1 8E5) ha una carica virale iniziale di 50.000-100.000 copie/mL; il controllo positivo basso (diluizione 1:10) ha una carica virale di 5.000-10.000 copie/mL. Il controllo negativo privo di RNA HIV-1 rilevabile. Il risultati della RT/PCR previsti per i controlli ViroSeq sono:
Controllo positivo/positivo basso Valore previsto >40 ng/5 L (positivo non diluito) >20 ng/5 L (positivo basso) Allora... lanalisi non valida. Ripetere il test. Controllo negativo Valore previsto 0 ng
D3.c Purificazione con piastre a 96 pozzetti CENTRISEP 96

IMPORTANTE! Le piastre CENTRISEP 96 sono termosensibili. Non conservare le piastre a temperature inferiori a 4 C. Prima delluso le piastre devono essere portate a temperatura ambiente. 1. 2. Accertarsi che le piastre CENTRISEP 96 siano a temperatura ambiente. Togliere la pellicola adesiva sigillante prima dal lato inferiore della piastra CENTRISEP 96 e quindi dal lato superiore. Preparare la piastra CENTRISEP 96. a. Impilare la piastra CENTRISEP 96 sopra una MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp) e fissare le due piastre a una base mediante nastro adesivo. b. Centrifugare la piastra a 700 x g per 2 minuti per impaccare la colonna. c. Rimuovere il nastro adesivo e separare le piastre. d. Eliminare il liquido residuo dalla piastra di lavaggio scuotendola vigorosamente. e. Lavare la MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp) e conservarla per usi futuri come piastra di lavaggio. Impilare una piastra di raccolta a 96 pozzetti, una base a 96 pozzetti e, infine, la piastra CENTRISEP 96. Fissare con nastro adesivo le piastre alla base a 96 pozzetti avendo cura di allineare gli indici alfanumerici su tutte le piastre. Caricare le reazioni di sequenziamento. Usando un dispensatore a canale multiplo, trasferire le reazioni di sequenziamento da 20-L nei singoli pozzetti della piastra CENTRISEP 96. Collocare con attenzione i campioni al centro degli strati di gel. Non collocare i campioni sul lato dei pozzetti. Non toccare lo strato di gel con i puntali delle pipette. Centrifugare la piastra a 700 x g per 2 minuti. Eliminare solo la piastra CENTRISEP (ogni pozzetto della piastra di raccolta dovrebbe contenere circa 20 L). Asciugare i campioni in una centrifuga con pompa a vuoto dotata di apposito rotore. Non asciugare eccessivamente i campioni.
3.
Se... lintensit di banda : positivo, non diluito: <40 ng positivo basso: <20 ng
Se... sul gel di agarosio presente qualsiasi banda
Allora... si verificata una contaminazione da campione a campione. I risultati dei campioni sono tutti non validi Ripetere da A. Preparazione del campione fino a D1. Purificazione e quantificazione dei prodotti della PCR
4.
tutte le reazioni degli altri campioni sono fallite (meno di 20 ng/5 L).
si verificato un errore di sistema. Ripetere tutti i campioni e i controlli
5.
il fallimento si verifica contattare lassistenza ripetutamente tecnica di Abbott Molecular
6.
Limitazioni
Reagenti e prodotti per la separazione
Lesecuzione del dosaggio ViroSeq consentita solo a personale addestrato. Laccuratezza e laffidabilit dei risultati dipendono dalla corretta raccolta e conservazione dei campioni prima del test. Il sangue raccolto utilizzando provette di eparina non idoneo ad essere utilizzato per la PCR e per questo dosaggio. Il test di resistenza ai farmaci antiretrovirali stato autorizzato solo su campioni di pazienti con carica virale compresa tra 2.000 e 750.000 copie per mL. Negli Stati Uniti, in una tipica popolazione di pazienti HIV positivi in terapia antiretrovirale altamente attiva (HAART), si pu prevedere che circa il 25% dei pazienti abbia cariche virali soppresse. Non sempre questi campioni producono risultati interpretabili con il ViroSeq HIV-1 Genotyping System se la carica virale inferiore a 1.000 copie/mL. Gli utenti dovrebbero testare campioni con una carica virale di 2.000 copie/mL o maggiore. Indipendentemente dal carico virale, per garantire una sequenza di elevata qualit, lintensit della banda di agarosio del prodotto della RT-PCR deve essere uguale o superiore allintensit della banda del mass ladder da 20 ng. La presenza di AmpErase UNG nel ViroSeq HIV-1 Genotyping System riduce il rischio di contaminazione solo con il prodotto precedentemente amplificato. Pu ancora verificarsi una contaminazione da campione a campione o da controllo positivo. Unattenta adesione ai protocolli e alla preparazione dellarea di lavoro riduce la possibilit di contaminazione. Con questo dosaggio possono essere utilizzati solo termociclatori e senquenziatori automatici di DNA di Applied Biosystems.
7. 8.
9.
10. Quando la centrifuga si arresta e lasciugatura ultimata, togliere il vassoio/la piastra e sigillarlo/a con tappi in strisce o nastro adesivo in alluminio, quindi conservare a temperature comprese tra 15 C e 25 C al buio. Analizzare i campioni entro una settimana. IMPORTANTE! Utilizzare un box scuro per la conservazione. I prodotti delle reazioni di sequenziamento sono sensibili alla luce.
Controllo Qualit
Il ViroSeq (8E5) Control Module, contenente controlli positivi e negativi viene fornito insieme al ViroSeq HIV-1 Genotyping System. Ogni analisi deve comprendere un controllo positivo e uno negativo. LHIV-1 8E5 Positive Control (controllo positivo HIV-1 8E5) necessario per monitorare il successo sia della RT-PCR, sia della genotipizzazione. Il HIV-1 8E5 Negative Control (controllo negativo HIV-1 8E5) necessario per monitorare solo il successo della RT-PCR.
Pagina 14 di 68
Sezione 3: Analisi di sequenziamento su ABI PRISM 3100/3100Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici ABI PRISM 3100/3100Avant)
In questa sezione:
Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Materiali richiesti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Protocollo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Per ogni analisi del 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant), le iniezioni vengono eseguite da ciascuno dei 4 pozzetti consecutivi allinterno di una colonna della piastra, a partire dalla colonna che contiene il pozzetto A1 (ad. es. pozzetti da A1 a D1, da E1 ad H1, da A2 a D2, ecc.). Sono necessarie quattro analisi per iniettare 16 pozzetti, e 24 analisi per iniettare una piastra completa a 96 pozzetti.
COLUMNS COLONNE
1
A B C
10
11
12
R R OI G W H S E
D E F G H
: Single Run on 3100-Avant Genetic Analyzer (4 capillary array)
Singola analisi su 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant) (schiera di 4 capillari)
Singola analisi su Genetic Analyzer (16 Analyzer : Single Run on 3100 3100-Avant Genetic capillary array) (analizzatore genetico 3100-Avant) (schiera di 16 capillari)
Introduzione
Il ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0 stato approvato per luso nella diagnostica in vitro con il ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 su ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100) e ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100-Avant). Entrambi gli strumenti sono piattaforme completamente automatizzate per elettroforesi capillare basata sulla fluorescenza, che analizzano simultaneamente i campioni nel corso di una singola analisi. Come sintetizzato sopra, le differenze chiave tra le due piattaforme includono il numero di piastre a 96 pozzetti che possono essere caricate sullo strumento e il numero di capillari presenti nella schiera di capillari. Nota. Il numero di capillari presenti nella schiera di capillari dello strumento determina le dimensioni dellanalisi.
Parametro Numero di piastre a 96 pozzetti Numero di capillari presenti nella schiera Numero di analisi per una piastra a 96 pozzetti 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant) 1 4 24 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100) 2 16 6
Accertarsi che lo strumento sia calibrato prima di procedere con lanalisi. Consultare la Sezione 6: Manutenzione e calibrazione di ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici ABI PRISM 3100 e 3100-Avant). Per immagini e grafici che illustrino come eseguire operazioni specifiche sullABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100), consultare lABI PRISM 3100 Genetic Analyzer User Guide (guida utente dellanalizzatore genetico ABI PRISM 3100) (PN 4334785). Per immagini e grafici che illustrino come eseguire operazioni specifiche sullABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100-Avant), consultare lABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer User Guide (guida utente dellanalizzatore genetico ABI PRISM 3100-Avant) (PN 4333549).
Linsieme di questi parametri definisce la capacit prestazionale dello strumento e consente ai siti di determinare la configurazione di sistema maggiormente compatibile con il volume di sequenziamento attuale e futuro.
Mappa della piastra a 96 pozzetti

Per ogni analisi del 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100), le iniezioni vengono eseguite da ciascuno dei 16 pozzetti di due colonne consecutive della piastra, a partire dalla colonna che contiene il pozzetto A1 (ad es. pozzetti da A1 ad H2, da A3 ad H4 ecc.). Una piastra completa richiede sei analisi per iniettare tutti i 96 pozzetti.
Pagina 15 di 68
Materiali richiesti
Articolo ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100) con: Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati, v.1.0.1) Versione firmware 6286100-04 Computer PC con: Microsoft Windows NT v.4.0 Processore Intel Pentium III, 550 MHz 256 MB di RAM Disco rigido, 18 GB Kit di pulizia del blocco polimerico
Articolo
ABI
ABI
3100-01 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico IMPORTANTE! Non ABI PRISM 3100) con: scaricare da Internet programmi Data Collection Software previsti a questo scopo. v.1.1 (software di raccolta dati, v.1.1) Versione firmware 6286150-01 Computer PC con: Microsoft Windows NT v.4.0, Service Pack 5 o 6a Processore Intel Pentium IV, 2 GHz 1 GB di RAM Disco rigido, 2 da 36 GB Kit di pulizia del blocco polimerico 3100-AVANT IMPORTANTE! Non scaricare da Internet programmi previsti a questo scopo.
Formammide Hi-Di , 25 mL
4311320
Contiene formammide. R 61 Pu danneggiare i bambini non ancora nati. R 36/38 Irritante per gli occhi e la pelle. S 53 Evitare lesposizione procurarsi speciali istruzioni prima delluso. S 24/25 Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. S 35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37/39 Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S 45 In caso di incidente o malessere, consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli letichetta). ABI PRISM 3100 Capillary Array (schiera di capillari ABI PRISM 3100), 50 cm ABI PRISM 3100-Avant Capillary Array (schiera di capillari ABI PRISM 3100-Avant), 50 cm 4315930 4333466
ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100-Avant) con: Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati, v.1.0) Versione firmware 6278000-01 o 6278050-01 Computer PC con: Microsoft Windows NT v.4.0, Service Pack 6 o 6a Processore Intel Pentium IV, 2 GHz 1 GB di RAM Disco rigido, 2 da 36 GB Kit di pulizia del blocco polimerico ABI PRISM Sequencing Analysis Software v.3.7 per computer Windows NT
Protocollo
4317380 Per ottenere licenze supplementari utilizzare 4310990 e specificare v.3.7 IMPORTANTE! Non scaricare da Internet programmi previsti a questo scopo. N801-0001 o N805-0001
Preparazione del rilevamento automatico della sequenza

Avviamento della workstation del computer
Nota. Prima di avviare lo strumento necessario avviare la workstation. 1. Accendere il monitor. Accendere il computer. Il computer si avvia e si apre la finestra di dialogo Begin Logon (avvia logon). Premere Ctrl+Alt+Delete (Ctrl+Alt+Canc) e inserire user name (nome utente) e password. Se il computer collegato in rete, non necessario accedere alla rete prima dellavvio dello strumento. OrbixWeb Daemon si avvia automaticamente. Se OrbixWeb Daemon non si avvia, fare doppio clic sul collegamento OrbixWeb Daemon sul desktop o selezionare Start > Applied Biosystems > OrbixWeb Daemon (avvio > Applied Biosystems > OrbixWeb Daemon). Nota. OrbixWeb Daemon deve essere avviato per rendere possibile lesecuzione del 3100/3100-Avant Data Collection software (software di raccolta dati per 3100/3100-Avant). IMPORTANTE! Il 3100 Data Collection software v.1.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.1) e il 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0) richiedono lavvio del AE Server oltre a quello di OrbixWeb Daemon per poter eseguire lanalisi e lestrazione dei dati. Se lAE Server non si avvia automaticamente, fare doppio clic sul collegamento AE Server o selezionare Start > Applied Biosystems > 3100 Utilities > AE Server (avvio > Applied Biosystems > utilit 3100 > AE Server).
GeneAmp PCR System 9600 Thermal Cycler (termociclatore GeneAmp PCR System 9600) o GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler (termociclatore GeneAmp PCR System 9700) MicroAmp 96-Well Support Base (base di supporto a 96 pozzetti MicroAmp) Setti per recipiente Base per piastra da 96 pozzetti Fermo per piastra da 96 pozzetti Setti per piastra da 96 pozzetti MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp) Siringa in vetro di riempimento della schiera da 250 L Siringa in vetro della riserva del polimero, 5,0 mL O-ring della siringa 3100 Performance Optimized Polymer 6 (POP-6) 10X soluzioni tampone per analizzatore genetico con EDTA
N801-0531 4315932 4317237 4317241 4315933 N801-0560 4304470 628-3731 221102 4316357 402824
2.
3.
4.
Pagina 16 di 68
Avvio dello strumento

1. Sul computer, accertarsi che: il computer sia acceso il sistema operativo Microsoft Windows NT sia caricato Nota. Prima di azionare lo strumento necessario accendere il computer e avviare il sistema operativo Windows NT. Assicurarsi che lo strumento abbia: lo sportello del forno chiuso e bloccato gli sportelli dello strumento chiusi Nota. Se gli sportelli sono aperti quando il computer viene acceso, si illumina una spia di segnalazione. Premere il pulsante on/off sul lato anteriore dello strumento. Nota. Mentre lo strumento in fase di accensione ed effettua i controlli automatici, la spia di stato gialla lampeggia. Prima di procedere, assicurarsi che la spia di stato verde sia accesa e non lampeggi. Nota. Se la spia verde non si accende, avviare il software di raccolta dati e controllare il registro degli eventi. Il percorso del registro degli eventi il seguente: D:\AppliedBio\3100\Data Collection o D:\AppliedBio\3100-Avant\Data Collection
3.
IMPORTANTE! Il 3100 Data Collection software v.1.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.1) e il 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0) richiedono lavvio del AE Server oltre a quello di OrbixWeb Daemon. Se il AE Server non stato avviato, selezionare Start > Applied Biosystems > 3100 Utilities > AE Server (avvio > Applied Biosystems > utilit 3100 > server AE).
2.
4.
Selezionare Start > Applied Biosystems > 3100 Data Collection or 3100-Avant Data Collection (avvio > Applied Biosystems > software di raccolta dati 3100 o software di raccolta dati 3100-Avant).
Preparazione dellanalisi
Nota. Dopo aver aperto lo sportello dello strumento, necessario consentire il completamento della sequenza di ritorno al punto di partenza del campionatore automatico prima di impartire ulteriori comandi. 1. Preparare e tenere a portata di mano i seguenti reagenti e consumabili: 3100 Performance Optimized Polymer 6 (POP-6) una schiera di 16 capillari da 50 cm o una schiera di 4 capillari da 50 cm 10 soluzioni tampone per analizzatore genetico con EDTA Nota. Per preparare la soluzione tampone 1X contenente EDTA per lanalizzatore genetico, diluire con acqua deionizzata la soluzione tampone 10X contenente EDTA per analizzatore genetico.
3.
4.
Software di raccolta dati

Per determinare le versioni del 3100/3100-Avant firmware e Data Collection software (firmware e software di raccolta dati di 3100/3100-Avant) far clic sul pulsante About Data Collection (informazioni sulla raccolta di dati) strumenti. IMPORTANTE! Usare solo le seguenti versioni del software: ABI 3100 Data Collection software v.1.0.1 (software di raccolta dati ABI 3100 v.1.0.1) con Firmware v.6286100-04 o ABI 3100 Data Collection software v.1.1 (software di raccolta dati ABI 3100 v.1.1) con Firmware v.6286150-01 o ABI 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software di raccolta dati ABI 3100 v.1.0) con Firmware v.6278000-01 o v.6278050-01 Non spostare n cancellare mai alcun file o cartella, a meno che questa operazione non sia specificatamente richiesta da un rappresentante di Applied Biosystems o dallABI PRISM 3100/ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer User Guide (guida utente dellanalizzatore genetico ABI PRISM 3100/ABI PRISM 3100-Avant). Tale operazione potrebbe rendere il software inutilizzabile. 4. 3. sulla barra degli 2.
RISCHIO CHIMICO. Il polimero POP-6 provoca irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Indossare occhiali, indumenti e guanti che garantiscano una protezione adeguata. Accertarsi che la quantit di polimero POP-6 sia sufficiente per lanalisi (1,5 mL per una piastra a 96 pozzetti) e aggiungere polimero, se necessario. Nota. Cambiare il polimero se stato nello strumento per 7 giorni. Non utilizzare un polimero scaduto o un polimero contenente precipitati. Riempire e/o sostituire i serbatoi di soluzione tampone e acqua prima di ogni analisi. Serbatoio dellanodo. Riempire fino alla linea di riempimento con 1 soluzione tamponata con EDTA per lanalizzatore genetico (9 mL) appena preparata. Serbatoio del catodo. Riempire fino alla linea di riempimento con 1 soluzione tamponata con EDTA per lanalizzatore genetico (16 mL) appena preparata. Serbatoi dellacqua. Riempire il tubo di riempimento con acqua deionizzata appena preparata (16 mL per ciascun recipiente). Controllare che i canali nel blocco del polimero non presentino bolle. Nel caso siano presenti bolle, spingerle lungo la siringa e fare uscire. Assicurarsi che: il blocco del polimero sia saldamente fissato sullo strumento. la presenza di polimero secco attorno al blocco del polimero ed, eventualmente, pulire. la presenza di perdite attorno alla siringa e ai dati. le estremit dei capillari non siano schiacciate o danneggiate. Eseguire una calibrazione spaziale se stata appena installata una schiera di capillari nuova o usata sullo strumento. Se necessario, eseguire una calibrazione spettrale. Vedere Esecuzione di una calibrazione spettrale.
5.
Avvio del software di raccolta dati

1. Accertarsi che lo strumento sia acceso e che la spia di stato verde sia fissa (non lampeggiante). Controllare che OrbixWeb Daemon sia in esecuzione verificando la presenza del pulsante corrispondente sulla barra delle applicazioni di Windows NT. Se OrbixWeb Daemon non in esecuzione, selezionare Start > Applied Biosystems > OrbixWeb Daemon (avvio > Applied Biosystems > OrbixWeb Daemon). IMPORTANTE! necessario avviare OrbixWeb Daemon per poter eseguire il software di raccolta dati. 6.
2.
7.
Pagina 17 di 68
Uso del software di raccolta dati

Per 3100 Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.1) e 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0) Selezionare View > Preferences (visualizza > preferenze). Nella finestra Setting Preferences (imposta preferenze), fare clic sulla scheda Data Analysis and Extraction (analisi ed estrazione dati) ed effettuare le seguenti selezioni: Selezionare Enable AutoAnalysis (attiva autoanalisi) cancellare Extract to Sequence Collector (estrai a raccoglitore sequenze) selezionare By run (per analisi) per i file dei campioni di gruppo specificare il formato per Sample File Name Format (formato del nome file campioni): Sample Name (nome campione) Well Position (posizione del pozzetto) <none> (nessuno) Fare clic su OK. Selezionare la scheda Plate View (visualizzazione piastra), quindi fare clic su New (nuovo) o selezionare Tools > Plate Editor (strumenti > editore piastra) Nella finestra di dialogo Plate Editor (editor piastra) che si apre: inserire il nome della piastra Specificare lapplicazione (Sequencing) (sequenziamento) specificare il tipo di piastra (96-Well) (a 96 pozzetti) IMPORTANTE! Utilizzare solo caratteri alfanumerici o i simboli indicati sotto. Non inserire spazi. -_(){}#.+ Fare clic su Finish (fine). Si apre il foglio di calcolo Plate Editor (editor piastra).
Uso delleditor della piastra

1. Nella colonna Sample Name (nome del campione), inserire i nomi dei campioni. IMPORTANTE! Accertarsi di utilizzare la convenzione di denominazione dei campioni indicata sotto. Perch il ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.8 Software possa assemblare correttamente i progetti dei campioni, il nome del campione deve rispettare la seguente convenzione di denominazione. Il nome del campione pu contenere un massimo di 32 caratteri. I nomi dei campioni possono contenere solo caratteri alfanumerici e i seguenti simboli: -_(){}#.+. NON INSERIRE SPAZI. Il nome del campione deve essere identico per le sequenze di tutti i sette primer di un campione. Il nome del campione e lidentificativo del primer devono essere separati da due caratteri di sottolineatura (due underscore). Lidentificazione del primer contiene il nome del primer e altre informazioni distintive della sequenza specifica. Ad esempio: Paziente196__A Paziente196__B Paziente196__C 2. Selezionare le seguenti impostazioni per ogni campione nel foglio di calcolo.
3100 Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati, v.1.0.1) Dye Set (Set di coloranti) Mobility File (File di mobilit) Comments (Commenti) BioLIMS Project (Progetto BioLIMS) Project Name (Nome del progetto) Run Module 1 (Modulo di analisi 1) Analysis Mode 1 (Modalit di analisi 1) Analysis Module 1 (Modulo di analisi 1) E E 3100 Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati, v.1.1) 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0) E
Per 3100 Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.0.1)
1.
Selezionare View > Preferences (visualizza > preferenze). Nella finestra Setting Preferences (imposta preferenze), fare clic sulla scheda Data Analysis (analisi dati) ed effettuare le seguenti selezioni: selezionare AutoAnalysis On (autoanalisi attivata) cancellare Enable BioLIMS (attiva BioLIMS) specificare il formato per Sample File Name Prefix Format (formato del prefisso del nome file campioni): Sample Name (nome campione) Well Position (posizione del pozzetto) <none> (nessuno)
2.
3. 4.
Fare clic su OK. Selezionare la scheda Plate View (visualizzazione piastra), quindi fare clic su New (nuovo) o selezionare Tools > Plate Editor (strumenti > editore piastra). Nella finestra di dialogo Plate Editor (editor piastra) che si apre: inserire il nome della piastra specificare lapplicazione (Sequencing) (sequenziamento) specificare il tipo di piastra (96-Well) (a 96 pozzetti) IMPORTANTE! Utilizzare solo caratteri alfanumerici o i simboli indicati sotto. Non inserire spazi. -_(){}#.+
DT3100POP6{BD}v DT3100POP6{BD}v DT3100POP6{BD}v 2.mob 2.mob 2.mob
inserire eventuali commenti
3100-Project1
5.
3100-Project1
3100Avant-Project1
StdSeq50_POP6Def aultModule
BC-3100SR_SeqOff FtOff.saz
6.
Fare clic su Finish (fine). Si apre il foglio di calcolo Plate Editor (editor piastra).
BC-3100POP6SR_ SeqOffFtOff.saz
BC-3100APOP6SR_ Seq OffFtOff.saz
Nota. Per facilitare linserimento del testo, selezionare limpostazione appropriata per il primo campione, quindi fare clic sullintestazione della colonna per selezionare lintera colonna. Quindi, dal menu Edit (modifica), utilizzare il comando Fill Down (ricopia in basso) o premere Ctrl + D. 3. Verificare che il record della piastra sia corretto, quindi fare clic su OK per tornare al menu principale.
Pagina 18 di 68
Preparazione di reazioni di sequenziamento purificate per lanalisi con il 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100)
Nota. Per le istruzioni sulla preparazione di reazioni di sequenziamento purificate per lanalisi con il 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant), consultare la sezione seguente. 1. Se i campioni sono congelati, portarli a temperatura ambiente. IMPORTANTE! Questa operazione deve essere eseguita immediatamente prima del caricamento dei campioni. 2. Risospendere i campioni aggiungendo 20 L di formammide Hi-Di a ogni pozzetto; utilizzare una nuova aliquota di formammide Hi-Di per ogni esperimento.
3. 4.
Agitare al vortex per 10-15 secondi. Centrifugare la piastra per 30-40 secondi a 2.000 g per raccogliere il liquido sul fondo della piastra. Nota. Non necessario denaturare a caldo i campioni. IMPORTANTE! I campioni lasciati sul 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant) per pi di 14 analisi (1 analisi = circa 2,5 ore) possono andare incontro a degradazione del segnale. Se la piastra contiene non pi di 7 colonne di campioni (compresi i controlli), preparare e installare lunit piastra come descritto nel paragrafo Caricamento dei campioni e collegamento di una piastra al record della piastra. OPPURE Se la piastra contiene pi di 7 colonne di campioni, continuare con la fase 6 descritta sotto.
5.
6. Contiene formammide. R 61 Pu danneggiare i bambini non ancora nati. R 36/38 Irritante per gli occhi e la pelle. S 53 Evitare lesposizione procurarsi speciali istruzioni prima delluso. S 24/25 Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. S 35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37/39 Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S 45 In caso di incidente o malessere, consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli letichetta). Nota. I campioni risospesi in formammide Hi-Di sono stabili a temperatura ambiente per un massimo di 35 ore. Non lasciare questi campioni a temperatura ambiente per un periodo di tempo maggiore. 3. 4. Agitare al vortex per 10-15 secondi. Centrifugare la piastra per 30-40 secondi a 2.000 g per raccogliere il liquido sul fondo della piastra. Nota. Non necessario denaturare a caldo i campioni. Preparare e installare lunit piastra.
Trasferire le restanti colonne di campioni dalla piastra 1 a una nuova MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra di reazione ottica da 96 pozzetti MicroAmp) (piastra 2). Nota. Eventuali piastre supplementari possono essere acquistate da Applied Biosystems. Vedere il paragrafo Materiali richiesti a pagina 5. Trasferire 10 L di controllo positivo (50% del volume della preparazione di sequenziamento) dalla piastra 1 alla piastra 2. Ripetere questa fase per ognuno dei 7 pozzetti che contengono il controllo positivo. Preparare e installare la piastra 1 sullunit piastra come descritto nel paragrafo Caricamento dei campioni e collegamento di una piastra al record della piastra. Sigillare la piastra 2 con nastro adesivo in alluminio e conservare al buio a temperature comprese tra 15 C e 25 C. Analizzare i campioni entro una settimana. Nota. Caricare la piastra 2 dopo il completamento della piastra 1. Eseguire le fasi 10-13 descritte sotto. IMPORTANTE! Questa operazione deve essere eseguita immediatamente prima del caricamento dei campioni.
7.
8. 9.
10. Portare la piastra 2 a temperatura ambiente.
5.
11. Agitare al vortex per 10-15 secondi. 12. Centrifugare la piastra per 30-40 secondi a 2.000 g per raccogliere il liquido sul fondo della piastra. Nota. Non necessario denaturare a caldo i campioni. 13. Preparare e installare la piastra 2 sullunit piastra come descritto nel paragrafo Caricamento dei campioni e collegamento di una piastra al record della piastra.
Preparazione di reazioni di sequenziamento purificate per lanalisi con il 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant)
1. Se i campioni sono congelati, portarli a temperatura ambiente. IMPORTANTE! Questa operazione deve essere eseguita immediatamente prima del caricamento dei campioni. 2. Risospendere i campioni aggiungendo 20 L di formammide Hi-Di a ogni pozzetto; utilizzare una nuova aliquota di formammide Hi-Di per ogni esperimento.
Contiene formammide. R 61 Pu danneggiare i bambini non ancora nati. R 36/38 Irritante per gli occhi e la pelle. S 53 Evitare lesposizione procurarsi speciali istruzioni prima delluso. S 24/25 Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. S 35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37/39 Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S 45 In caso di incidente o malessere, consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli letichetta). Nota. I campioni risospesi in formammide Hi-Di sono stabili a temperatura ambiente per un massimo di 35 ore. Non lasciare questi campioni a temperatura ambiente per un periodo di tempo maggiore.
Pagina 19 di 68
Caricamento dei campioni e collegamento di una piastra al record della piastra

1. Fissare un setto a 96 pozzetti alla piastra e far scattare questultima nel fermapiastra e nella base dellanalizzatore. Posizionare la piastra con le reazioni di sequenziamento sullo strumento. Posizionare il pozzetto A1 nellangolo in alto a destra. Fare clic sulla scheda Plate View (visualizzazione piastra). Verificare che lindicatore di posizione della piastra sia giallo. Nella tabella Pending Plate Records (record delle piastre in attesa) selezionare il Plate Record (record delle piastre) della piastra che si desidera caricare. Selezionare lindicatore di posizione della piastra relativo alla piastra che si desidera collegare al record appena selezionato. Lindicatore di posizione della piastra diventa verde. Il record della piastra si sposta dalla tabella Pending Plate Records (record delle piastre in attesa) alla tabella Linked Plate Records (record delle piastre collegate). Nota. Questa operazione richiede un tempo variabile, a seconda del numero di campioni. Fare clic sulla scheda Run View (visualizzazione analisi) per visualizzare le analisi programmate. Selezionare ciascuna analisi per verificare che siano evidenziati i pozzetti corretti. IMPORTANTE! Se il pozzetto non evidenziato, non verr analizzato. 7. Per aggiungere informazioni a un record della piastra collegato: a. Scollegare il record della piastra per riportarlo nella tabella Pending Plate Records (record delle piastre in attesa). b. Fare doppio clic sul nome del record della piastra per aprirlo. c. Aggiornare il record della piastra e far clic su OK. d. Ricollegare il record alla relativa piastra. Verificare che la piastra sia stata collegata.
Avvio dellanalisi
1. IMPORTANTE! Evitare di interrompere le analisi. Fare clic sul pulsante verde Run Instrument (avvia lo strumento) per iniziare lanalisi. IMPORTANTE! Non eseguire simultaneamente lanalisi dei dati e lavvio di altri software durante lanalisi di sequenziamento. I dati di sequenziamento devono essere trasferiti a un altro computer per lanalisi se la workstation del computer utilizzata per la raccolta dei dati. 2. Il software controlla automaticamente lo spazio disponibile nel database e sul disco D.
Se il database o il disco D sono... Pieni Allora...
2.
3.
4.
5.
Se il disco D pieno, archiviare i file dei campioni su un CD-RW o cancellare il campione originale dal disco. Quindi fare clic su Run Instrument (avvia lo strumento). Se il database pieno, utilizzare lutilit CleanUp DB (pulitura DB) per pulire il database. Quindi fare clic su Run Instrument (avvia lo strumento). Lanalisi inizia.
Non pieno
6.
3.
Una volta completate le fasi di preparazione, verificare quanto segue: Starting Electrophoresis (avvio elettroforesi) visualizzato nellangolo in basso a sinistra dello schermo EP (EF) On (in corso) Oven Temp (temperatura forno) 50,0 C Nota. Se manca corrente elettrica, si formata una bolla nel blocco del polimero ed necessario: a. cancellare lanalisi. b. eliminare la bolla dal blocco del polimero. c. riavviare lanalisi. Per monitorare landamento dellanalisi, selezionare View > Instrument Status Monitor (visualizza > monitor stato strumento).
4.
8.
Scollegamento da un record della piastra

1. Nella tabella Linked Plate Records (record delle piastre collegate) alla pagina Plate View (visualizzazione pagina), selezionare il record della piastra che si desidera scollegare. Fare clic su Unlink (scollega). Se il record della piastra ...
Completo
Non usare i dati in fase di raccolta se viene a mancare la corrente elettrica durante unanalisi.
Visualizzazione dei dati grezzi

IMPORTANTE! Uscire sempre dalle finestre Array View (visualizzazione schiera) e Capillary View (visualizzazione capillari). Durante unanalisi, non lasciare aperte queste pagine troppo a lungo. Questo potrebbe causare problemi di aggiornamento dello schermo non recuperabili. Lasciare aperta la finestra Status View (visualizzazione stato).
2.
Allora il record della piastra...

Passa alla tabella Processed Plate Records (record delle piastre analizzate) e lindicatore di posizione della piastra ritorna giallo. Torna alla tabella Pending Plate Records (record delle piastre in attesa) e lindicatore di posizione della piastra ritorna giallo.
Visualizzazione di dati non elaborati da unanalisi completata

1. Nel software Data Collection (raccolta dati), selezionare la scheda Array View (visualizzazione schiera). Selezionare Instrument > Data Acquisition > Display Run Data (strumento > acquisizione dati > visualizza dati analisi). Nellelenco a discesa, selezionare lanalisi che si desidera visualizzare e fare clic su OK. Nota. possibile visualizzare qualsiasi analisi completata presente nel database dello strumento. Recuperare i dati pu richiedere alcuni istanti, soprattutto se il database quasi pieno. Utilizzare le funzioni di scorrimento nella pagina Array View (visualizzazione schiera) per visualizzare i dati.
Non completo
2.
3.
4.
Pagina 20 di 68
5.
In alternativa, per visualizzare i dati di un elettroferogramma relativo a diversi capillari contemporaneamente, selezionare la scheda Capillary View (visualizzazione capillari) per visualizzare la pagina Capillary View (visualizzazione capillari).
Creazione delle Basecaller Settings (impostazioni Basecaller)

Le Basecaller Settings (impostazioni Basecaller) sono funzioni del programma Basecaller che consentono di definire il numero di basi da analizzare a partire dai file di dati. Durante lidentificazione delle basi il Basecaller considera sia le Basecaller Settings (impostazioni Basecaller) sia qualsiasi valore Stop Point (punto di arresto) nella finestra Sample Manager (gestione dei campioni) e si arresta in corrispondenza di uno dei criteri di endpoint o del valore Stop Point (punto di arresto), a seconda di quale si presenti per primo. 1. Nel programma per lanalisi di sequenziamento, selezionare Edit > Preferences > Basecaller Settings (modifica > preferenze > impostazioni Basecaller). Nella finestra Preferences (preferenze), fare clic su Create a set (crea un set). Selezionare la casella di controllo Set the endpoint (imposta endpoint) e inserire 580 nella casella di testo. Salvare il set come impostazione predefinita denominata HIV580.
Visualizzazione dei dati analizzati

Al termine dellanalisi, i file dei campioni analizzati vengono estratti in una cartella delle analisi, insieme a un registro dellanalisi, in un percorso specificato nelle preferenze o seguendo il percorso predefinito: D:\AppliedBio\3100\DataExtractor o D:\AppliedBio\3100-Avant\DataExtractor Se sono stati ri-estratti, i dati si trovano nel percorso specificato nelle preferenze o nel seguente percorso predefinito: D:\AppliedBio\3100\DataExtractor\Extracted Runs o D:\AppliedBio\3100-Avant\DataExtractor\Extracted Runs
2.
3.
Uso dellABI PRISM Sequencing Analysis Software v3.7 e analisi dei dati
ABI PRISM Sequencing Analysis Software
LABI PRISM Sequencing Analysis Software v3.7 viene installato sul disco rigido della workstation. Questo software viene utilizzato per: controllare le sequenze codificate mediante identificazione delle basi rianalizzare i dati
4.
Impostazione del parametro Basecaller

1. Selezionare Edit > Preferences > Sample Manager Defaults (modifica > preferenze > impostazioni predefinite gestione campioni). Selezionare il Basecaller desiderato dallelenco a discesa Basecaller: Per il 3100 Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.0.1), selezionare: 3100SR Per il 3100 Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.1), selezionare: 3100POP6SR Per il 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0), selezionare: 3100APOP6SR Nota. A questo punto il 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100 o 3100-Avant) pronto per iniziare lanalisi di sequenziamento.
2.
Modulo di analisi strumentale per analizzatori genetici da utilizzare con il ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0
Per il 3100 Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.0.1), usare: BC-3100SR_SeqOffFtOff.saz o Per il 3100 Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.1), usare: BC-3100POP6SR_SeqOffFtOff.saz o Per il 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0), usare: BC-3100APOP6SR_SeqOffFtOff.saz
Uso della finestra Sample Manager (gestione dei campioni)

La finestra Sample Manager (gestione dei campioni) consente di elencare i file dei campioni da elaborare con il software per lanalisi di sequenziamento e di selezionare i valori dei vari parametri di analisi. 1. Per aprire la finestra, selezionare Window > Show Sample Manager (finestra > mostra gestione dei campioni). Per chiudere la finestra, selezionare Window > Hide Sample Manager (finestra > nascondi gestione dei campioni).
Parametri di elaborazione
Un parametro di elaborazione una parola, frase o casella di controllo che comunica al software per lanalisi di sequenziamento le operazioni da svolgere in determinate fasi dellelaborazione dei file.
2.
Pagina 21 di 68
Uso del software per lanalisi di sequenziamento

1. Quando lanalisi completa, avviare il software per lanalisi di sequenziamento. Aggiungere tutti i file della/e cartella/e Run (analisi) a Sample Manager (gestione dei campioni). Selezionare le seguenti impostazioni per ogni campione:
3.
Aggiungere i file da inserire in Sample Manager (gestione dei campioni) allelenco Sample Files (file dei campioni) nella parte inferiore della finestra di dialogo.
Per aggiungere... Allora... Selezionare il file e fare clic su Add (aggiungi) o fare doppio clic sul nome del file. Fare clic su Add All (aggiungi tutti). Aggiungerli singolarmente o fare clic su Add All (aggiungi tutti) e usare il pulsante Remove (elimina) per eliminare i file che non devono essere aggiunti allelenco
2.
Un solo file allelenco
3.
Tutti i file allelenco Per 3100 Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.0.1): Basecaller-3100SR Per 3100 Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.1): Basecaller-3100POP6SR Per il 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0): Basecaller-3100APOP6SR Definito dallo strumento Solo alcuni dei file allelenco
Basecaller
4.
Spacing (spaziature) Basecaller Setting (impostazione Basecaller) Peak 1 Location (posizione del picco 1) Start Point (punto di avvio) Stop Point (punto di arresto) DyeSet/Primer (primer/set di coloranti) Factura settings (impostazioni Factura)
Quando tutti i file desiderati sono stati inseriti nellelenco in basso, fare clic su Finish (fine) per chiudere la finestra di dialogo e aggiungere i file a Sample Manager (gestione dei campioni).
HIV580
Impostato dal software
possibile eliminare un file dei campioni dalla finestra Sample Manager (gestione dei campioni) in qualsiasi momento, tranne durante lelaborazione di quel file da parte del programma. anche possibile modificare lordine in cui i file dei campioni vengono visualizzati nella finestra Sample Manager (gestione dei campioni).
Eliminazione di un file
1.
Fare clic sul nome del file nella colonna Sample File Name (nome del file dei campioni). Viene evidenziata lintera riga. Premere il tasto Delete (Canc) o fare clic su Remove (elimina) nella parte superiore della finestra oppure selezionare Manager > Remove Files (gestione > elimina file). Il software per lanalisi di sequenziamento elimina quel file dallelenco.
DT3100POP6{BD}v2
2.
Questa funzione non viene utilizzata con lanalisi ViroSeq
4. 5. 6. 7.
Selezionare la casella di controllo A (analizza) per ogni campione. Cancellare le colonne P (stampa) e F (Factura). Fare clic su Start (avvio). Dopo lanalisi, controllare la colonna A per verificare se ogni campione contrassegnato da una casella verde. IMPORTANTE! Se uno dei campioni contrassegnato da una casella rossa, verificare le impostazioni e rianalizzare i dati.
Eliminazione di pi file
1. Eliminare tutti i file. a. Selezionare Edit > Select All (modifica > seleziona tutto). b. Fare clic su Remove (elimina) o premere il tasto Delete (Canc). Eliminare pi file adiacenti. a. Fare clic sul Sample File Name (nome del file dei campioni) del primo file del gruppo. b. Tenendo premuto il tasto Shift (Maiusc) fare clic sul Sample File Name (nome del file dei campioni) dellultimo file del gruppo. c. Fare clic su Remove (elimina) o premere il tasto Delete (Canc). Eliminare pi file non adiacenti. a. Tenendo premuto il tasto Control, fare clic sul Sample File Name (nome del file dei campioni) di ogni file da eliminare. b. Fare clic su Remove (elimina) o premere il tasto Delete (Canc).
2.
Aggiunta di file di campioni

1. Fare clic su Add files (aggiungi file) nella finestra Sample Manager (gestione dei campioni) o selezionare Manager > Add Files (gestione > aggiungi file). La parte superiore della finestra di dialogo che si apre simile a una comune finestra di dialogo delle directory, ma visualizza solo i nomi delle cartelle e dei file dei campioni. Nella casella di riepilogo in alto, individuare e aprire la cartella contenente i file da aggiungere a Sample Manager (gestione dei campioni).
3.
Riorganizzazione dei file

1. Fare clic sul nome del file nella colonna Sample File Name (nome del file dei campioni). Viene evidenziata lintera riga. Tenendo premuto il tasto Alt, trascinare il Sample File Name (nome del file dei campioni) nella nuova posizione nella colonna.
2.
2.
Pagina 22 di 68
Stampa di dati relativi a unanalisi

1. Per modificare temporaneamente lorientamento della pagina, il tipo di carta, pannelli/pagina ecc., selezionare File > Print Setup (file > imposta stampante) per aprire unapposita finestra di dialogo Print Setup (imposta stampante). Modificare le impostazioni, se necessario. Quindi fare clic su OK per chiudere la finestra di dialogo. Aprire il file da stampare. Selezionare File > Print (file > stampa) per aprire la finestra di dialogo Printing Options (opzioni di stampa). Se si desidera lasciare un margine sinistro pi ampio per consentire la perforatura a tre fori, selezionare Allow for 3-hole punch (consenti perforatura a 3 fori). Fare clic su OK per chiudere la finestra di dialogo Printing Options (opzioni di stampa) e aprire la finestra di dialogo standard Printer (stampante) relativa alla propria stampante. Effettuare le modifiche necessarie nella finestra di dialogo Printer (stampante) poi fare clic su Print (stampa) per avviare la stampa.
Operazioni preliminari allutilizzo del ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software

Checklist per i dati dellanalisi di sequenziamento del DNA
Prima di analizzare i dati dellanalisi di sequenziamento del DNA con il ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software, controllare i file nel modo seguente:
Articolo Controllo / Azione
2.
3. 4.
5.
6.
Controllare/correggere gli Esaminare un sottoinsieme di campioni per verificare che gli Start Points (punti di avvio) Start Points (punti di avvio) siano stati posizionati correttamente. Posizionare gli Start Points (punti di avvio) dopo il blob iniziale di terminatore colorante. o Determinare lo Start Point (punto davvio) medio per un sottoinsieme di campioni e inserire questo valore sia in Start Point (punto davvio) sia in Peak 1 Location (posizione del picco 1) del primo campione, quindi Fill Down (ricopia in basso) per tutti i campioni. Controllare/correggere gli Stop Points (punti darresto) Nomi dei campioni Verificare che gli Stop Points (punti darresto) per un sottoinsieme di campioni siano in corrispondenza delle basi 580. In caso contrario, selezionare limpostazione HIV580. Verificare che i nomi dei file dei campioni siano corretti. Utilizzare lo stesso nome per tutti i campioni di uno stesso progetto. I nomi dei file dei campioni: non possono contenere pi di 59 caratteri devono includere tutte le informazioni necessarie a identificare un campione devono contenere due segni di sottolineatura (underscore) consecutivi che separino il nome del campione dal primer di sequenza. Il software ViroSeq richiede i due underscore per poter assemblare e creare progetti. IMPORTANTE! Linformazione a sinistra dei due underscore deve essere identica per tutte le sei o sette sequenze di un campione. Linformazione a destra dei due underscore riferita alla singola sequenza e deve includere la lettera relativa al primer. File DyeSet/Primer (primer/set di coloranti) appropriato per lanalisi. Controllare i numeri dellintensit del segnale per ogni base. Se il valore totale dellintensit del segnale di A, C, G e T inferiore a 400, verificare i dati non elaborati e quelli analizzati ed eliminare i dati rumorosi.
7.
File DyeSet/Primer (primer/set di coloranti) Sufficiente intensit del segnale
IMPORTANTE! Perch sia possibile procedere con lanalisi del software ViroSeq, sei dei sette segmenti devono essere sequenziati con successo. Uno dei segmenti mancanti pu essere A o D.
Pagina 23 di 68
Sezione 4: Analisi di ViroSeq HIV -1 Genotyping System Software v2.8

In questa sezione:
Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Requisiti del computer per eseguire il ViroSeq Software v2.8 . . . . . . . . . . . . . Installazione, disinstallazione e utilizzo del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Esempi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Modifica dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tabelle delle mutazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Messaggi di errore del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Software ViroSeq e risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 24 24 25 32 35 37 40 46 47
Termine File dei campioni Sequenza Ritaglio VM XML
Definizione Un file contenente i dati della sequenza campione, generati nellABI PRISM DNA Sequencing Analysis Software. Una stringa di basi di nucleotidi. Marcatura dei dati da non utilizzare nellestrazione della sequenza di consenso. Virtual Machine. Linterprete Java di Windows che consente al computer di comprendere il linguaggio Java. Extensible Markup Language. Formato di testo flessibile utilizzato nello scambio di dati su Web e altrove.
Segmento di sequenza I dati di sequenza risultanti da un primer.
Materiali richiesti
Descrizione ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 4J94-22
Requisiti del computer per eseguire il ViroSeq Software v2.8

Per eseguire il software ViroSeq offline su un computer singolo, necessario che vengano soddisfatti i seguenti requisiti minimi. Il software non pu essere installato su Windows NT. Java Runtime Environment (JRE) Microsoft Windows 2000 - JRE versione 1.4.2_10, o Microsoft Windows XP - JRE versione 1.4.2_10. Nota. JRE incluso nel CD di installazione del software ViroSeq e viene installato automaticamente con il software ViroSeq. Configurazione 1
Requisiti del sistema operativo:
Introduzione
Il software ViroSeq analizza i file relativi alle sei o sette sequenze dei primer corrispondenti a un singolo campione di plasma per generare un progetto. Un progetto un gruppo di file dei campioni contenente tutte le informazioni di sequenziamento necessarie per produrre un genotipo. Il formato del progetto supporta la revisione e modifica manuale dei dati dellelettroferogramma per generare una sequenza di consenso finale per i geni della HIV-1 proteasi e della trascrittasi inversa (RT). IMPORTANTE! Per informazioni su anomalie e limiti noti nel ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8, consultare le Release Notes (Note sulla versione) allegate al ViroSeq Software v2.8 CD (CD del software ViroSeq v.2.8).
Configurazione 2
Requisiti del sistema operativo: Microsoft Windows XP, Service Pack 2
Configurazione 3
Requisiti del sistema operativo: Microsoft Windows XP, Service Pack 2
Terminologia utilizzata in questa sezione

Termine ASCII Identificazione delle basi Cursore di modifica Elettroferogramma Definizione American Standard Code for Information Interchange. Un formato di testo semplice, riconoscibile da molte piattaforme e computer. Identit del nucleotide assegnata a un picco di segnale in un elettroferogramma. Elemento grafico che evidenzia un singolo nucleotide nella sequenza di consenso e che rappresenta il punto focale di unoperazione di modifica. I segnali di fluorescenza dei coloranti di sequenziamento analizzati e calcolati dal software di analisi e raccolta fornito con la strumentazione di sequenziamento. Un file di testo formattato ASCII contenente linformazione del nome del file e una sequenza. International Union of Biochemists (Unione internazionale dei biochimici) Linguaggio di programmazione ideato per generare applicazioni che possano essere eseguite su diversi sistemi operativi senza modifiche. Elemento grafico che visualizza le POI (posizioni dinteresse) e fornisce un mezzo per spostarsi sui dati corrispondenti. Position of interest (posizione dinteresse). Posizione di un nucleotide che garantisce il controllo da parte dellutente. Corrispondenza di una sequenza a un primer noto. Lentit software che comprende dati, cronologia delle modifiche, posizioni di taglio, sequenze assemblate ecc., associati allanalisi dei segmenti di sequenza di un singolo campione di HIV-1. Il file primario creato e utilizzato dal software ViroSeq. Contiene tutti i dati necessari per produrre unanalisi del genotipo. La sequenza fissa rispetto alla quale vengono eseguiti tutti i confronti. La sequenza di riferimento del ViroSeq basata su HXB-2 (GenBank K03455).
Microsoft Windows 2000, Service Pack 4
Piattaforma del computer Intel Pentium IV, (Single Core) 2,0 GHz o superiore 1 GB di RAM o superiore Disco rigido, 40 GB o superiore Tastiera, mouse Monitor con risoluzione schermo di 1280 x 1024
Piattaforma del computer Intel Pentium M (Single Core) 1,86 GHz o superiore 512 MB di RAM o superiore Disco rigido, 40 GB o superiore Tastiera, mouse Monitor con risoluzione schermo di 1280 x 1024
Piattaforma del computer Intel Core 2 Duo (Dual Core) 2,4 GHz o superiore 2 GB o superiore Disco rigido, 40 GB o superiore Tastiera, mouse Monitor con risoluzione schermo di 1440 x 900
Sequenza di consenso Una sequenza sviluppata a partire da varie altre sequenze allineate.
FASTA IUB Java Barra di navigazione POI Identificazione con primer Progetto
File del progetto Sequenza di riferimento
Pagina 24 di 68
Installazione, disinstallazione e utilizzo del software

Prima di installare o disinstallare il ViroSeq software v2.8, necessario accedere al sistema Windows utilizzando un account con privilegi di amministratore. Evitare qualsiasi tentativo di installare o disinstallare il software ViroSeq utilizzando un account utente standard o utente limitato.
Avvio del software

Il software pu essere avviato in tre modi: 1. Facendo doppio clic sullicona ViroSeq v2.8 sul desktop. AVVERTENZA: non aprire pi di unistanza dellapplicazione ViroSeq software v2.8 contemporaneamente. 2. Avviando il software ViroSeq dal menu Start. a. Fare clic sul menu Start. b. Selezionare Programs > ViroSeq v2.8 > ViroSeq v2.8 (programmi > ViroSeq v2.8 > ViroSeq v2.8). Avviando il software da C:\ViroSeq v2.8. a. Fare clic sulla directory C:\ViroSeq v2.8. b. Fare doppio clic sullicona ViroSeq.
Installazione del software su un computer Windows 2000 o XP

Sono necessari i privilegi di amministratore perch linstallazione avvenga in modo corretto. 1. 2. 3. Chiudere tutte le applicazioni sul desktop. Inserire il CD del ViroSeq software v2.8 nellunit CD.
3.
Accesso al software
Il programma di installazione dovrebbe avviarsi automaticamente. In caso contrario, procedere come segue: a. Fare doppio clic su My Computer (risorse del computer) sul desktop. b. Con il tasto destro del mouse, selezionare lunit che contiene il CD. c. Selezionare Explore (esplora). d. In Windows Explorer (esplora risorse), aprire la cartella del software ViroSeq. Fare doppio clic su Setup.exe. Accettare le condizioni del License Agreement (contratto di licenza). Seguire le istruzioni della schermata del programma di installazione. Nota. Il software viene installato nella directory C:. possibile selezionare una directory diversa. Licona ViroSeq v2.8 viene installata automaticamente sul desktop. Per ragioni di sicurezza, il software richiede a ciascun utente di eseguire la procedura di accesso. Allavvio del software viene visualizzata la finestra di dialogo User Login (login utente). Inserire un nome utente e una password validi, quindi fare clic su OK. Il nome utente, la data e lora del sistema vengono registrati nella finestra History (cronologia). Consultare i Messaggi di errore del software. Quando si accede al software per la prima volta, il nome utente predefinito Admin e la password hiv1.
4. 5.
Modifica della password dellamministratore

1. Digitare il nome della localit dellutente nella casella Installation Site (sito di installazione). Nota. Sono ammessi abbreviazioni e identificativi numerici. Nel campo Default Password (password predefinita), digitare hiv1. Digitare la propria password nella casella New Password (nuova password) e nella casella Re-Enter Password (reinserire la password). Nota. La password riconosce le maiuscole/minuscole e deve essere composta da un minimo di sei a un massimo di 14 caratteri. Fare clic su OK.
Disinstallazione del software da un computer Windows 2000 o XP

Il software pu essere facilmente eliminato dal computer usando il programma Uninstall (disinstalla). Il programma di disinstallazione rimuover tutti i file di programma e licona sul desktop, ma non rimuover dal sistema eventuali file modificati dallutente. 1. Dal menu Start di Windows, selezionare Start > Programs > ViroSeq v2.8 > Uninstall (start > programmi > ViroSeq v2.8 > disinstalla). Viene visualizzata la finestra di dialogo InstallShield Wizard (guida allinstallazione). Fare clic su Remove (elimina). Fare clic su Next (successivo). Viene visualizzata una finestra di conferma. Fare clic su Yes (s) per rimuovere lapplicazione.
2. 3.
4.
2.
Aggiunta di nuovi utenti

Lesecuzione dellanalisi ViroSeq consentita solo a personale addestrato. Nella finestra Navigation (navigazione), selezionare Edit > Change Passwords (modifica > cambia password). Nota. Perch venga visualizzata la finestra Navigation (navigazione) necessario che un progetto ViroSeq sia aperto. Digitare il nome del nuovo utente da aggiungere nella casella User Name (nome utente) della scheda User Information (informazioni utente). Nella casella Employee ID (ID del dipendente), digitare il nome o numero identificativo del dipendente. Digitare una password nella casella New Password (nuova password) e nella casella Re-Enter Password (reinserire la password).
3. 4. 5. 6. 7.
1.
2. Il processo di disinstallazione viene completato automaticamente, quindi viene visualizzata la finestra di dialogo Maintenance Complete (manutenzione completata).
3.
4.
Pagina 25 di 68
5.
Fare clic su Add User (aggiungi utente). Il nuovo utente viene inserito nella scheda Registered Users (utenti registrati). possibile aggiungere tutti gli utenti desiderati e infine fare clic su OK.
Verificare che le mutazioni della resistenza farmacologica corrispondano alle informazioni contenute nella tabella seguente: QA10 RT
M41L A62V T69ins V118I M184V T215Y
Proteasi
L10I L24I M46I F53L I54V A71V V82A
6.
Resistenza Mutazioni
Eliminazione di un utente
1. Nella finestra Navigation (navigazione), selezionare Edit > Change Passwords (modifica > cambia password). Si apre la finestra di dialogo Administrator Access (accesso dellamministratore). Nella scheda Registered Users (utenti registrati), selezionare il nome che si desidera eliminare. Viene attivato il pulsante Remove (elimina). Fare clic su Remove (elimina) per cancellare lutente selezionato, quindi fare clic su OK.
Descrizione del progetto

Fasi principali di un progetto
File di dati per il sequenziamento del DNA Controllare che:
2.
3.
la qualit della sequenza sia corretta i limiti siano definiti i nomi dei campioni siano corretti il file DyeSet/Primer (primer/set di coloranti) sia appropriato Trovare e selezionare i file di sequenziamento Assemblare il progetto
Modifica delle password utente

Lamministratore pu modificare le password utente nella finestra di dialogo Administrator Access (accesso dellamministratore) dopo aver selezionato Edit > Change Passwords (modifica > cambia password). Gli utenti non amministratori possono modificare le password utente nella finestra di dialogo User Access (accesso dellutente) dopo aver selezionato Edit > Change Passwords (modifica > cambia password). Quando viene visualizzata la finestra di dialogo User Access (accesso dellutente), compilare i campi Current Password (password corrente), New Password (nuova password) e Re-Enter Password (reinserire la password) e fare clic su OK. Ai nomi utente e alle password si applicano le regole seguenti: i nomi utente devono essere unici, ma non sono alle maiuscole nel nome utente e nella password sono ammessi gli spazi le password sono case sensitive i campi delle password non possono essere lasciati vuoti le password possono contenere un minimo di sei e un massimo di 14 caratteri quando vengono visualizzate sullo schermo, le password sono codificate come asterischi le password possono essere composte da lettere, numeri e caratteri speciali (stampabili) la password predefinita hiv1 non pu essere usata quando si aggiunge un nuovo utente.
Creazione di un nuovo progetto
Revisione dei dati del progetto
Verificare che:
il numero dei file di sequenziamento assemblati sia sufficiente i nomi dei campioni siano corretti i file di sequenziamento siano allineati nellordine e nellorientamento corretti Inserire le informazioni specifiche relative a paziente, laboratorio e campione Distinguere picchi e rumore Tagliare le estremit dei segmenti Verificare e riconciliare le identificazioni di basi miste e le basi discordanti Confrontare con la sequenza di riferimento Stamparlo o salvarlo in formato XML Salvare il file FASTA
Modifica dei dati
Preparazione del rapporto sulla resistenza
Creazione di un nuovo progetto

1. Avviare il software ViroSeq e fare clic su New (nuovo) nella finestra Project Status (stato del progetto). Viene visualizzata la finestra di dialogo Open (apri). Se il software ViroSeq gi aperto, selezionare File > New Project (file > nuovo progetto). Spostarsi sulla cartella contenente i file del software per lanalisi di sequenziamento e aprirla. Selezionare un file di dati di sequenza e fare clic su Open (apri). Il software assembla ed allinea i file relativi alle sequenze dei primer di un campione per generare una sequenza di consenso e crea un progetto. Mentre il software assembla il progetto, si apre la finestra Progress (avanzamento). Nota. Il software crea progetti separati per ogni nome di campione univoco attribuito ai dati nel software per lanalisi di sequenziamento. Esiste un limite al numero di progetti che possono essere assemblati contemporaneamente. Un limite ragionevole 14 progetti. Al termine delloperazione, la finestra Progress (avanzamento) si chiude e si aprono le finestre Navigation (navigazione) e View*Edit (visualizza*modifica), che visualizzano uno dei progetti assemblati.
Verifica dellinstallazione del software

Verificare che il ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 sia stato installato correttamente analizzando i file dei campioni dimostrativi QA10 (.ab1) nella directory C:\ViroSeq v2.8. 2. 1. Fare clic su New (nuovo) nella finestra Project Status (stato del progetto). Si apre la finestra di dialogo Open (apri). 3. 2. 3. Spostarsi alla cartella C:\ViroSeq v2.8 > Projects > Demo > QA10. Selezionare un file di dati di sequenza e fare clic su Open (apri). Il software raggruppa ed allinea i dati per generare una sequenza di consenso utilizzando i file .ab1 trovati nella cartella QA10. Si aprono le finestre Navigation (navigazione) e View*Edit (visualizza*modifica), che visualizzano il progetto completo assemblato per QA10. Selezionare File > Generate Resistance Report (file > genera rapporto sulla resistenza) per visualizzare lanteprima delle mutazioni della resistenza farmacologica elencate a pagina 1 dellAntiretroviral Drug Resistance report (rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali).
4.
Pagina 26 di 68
I progetti assemblati esistenti vengono visualizzati dal software ViroSeq nella finestra Project Status (stato del progetto). Per visualizzare la finestra Project Status (stato del progetto), spostarsi nella finestra Navigation (navigazione) e selezionare File > Open Project (file > apri progetto). La colonna Status (stato) indica se il software ha trovato o meno tutti i segmenti inseriti.
Se lo stato ... OK Allora... Tutti i segmenti previsti sono stati trovati e il progetto stato assemblato correttamente. Il software ViroSeq ha riscontrato problemi di assemblaggio. Le possibili cause comprendono: impossibilit di identificare uno o pi segmenti assemblaggio di un numero di segmenti inferiore a 6 Nota. Evitare di procedere se nel progetto sono stati assemblati meno di sei segmenti. Uno dei segmenti mancanti pu essere A o D.
Finestra Navigation (navigazione)

Dopo aver assemblato un progetto, il software ViroSeq presenta graficamente la sequenza di consenso nella finestra Navigation (navigazione). La finestra Navigation (navigazione) composta da due parti: barra di navigazione sezione di allineamento dei segmenti
Barra di navigazione
La barra di navigazione si trova nella parte superiore della finestra Navigation (navigazione). Fornisce una panoramica del numero e dei percorsi delle posizioni di interesse (POI). Queste vengono rappresentate come linee verticali su una barra grigia.
Apertura di un progetto esistente

1. Nella finestra Project Status (stato del progetto), selezionare il progetto desiderato. Se il progetto desiderato non visualizzato nella finestra Project Status (stato del progetto): a. Fare clic su Find (trova) per aprire la finestra di dialogo Open (apri). b. Spostarsi sulla cartella in cui archiviato il progetto. c. Selezionare il progetto desiderato. Fare clic su Open (apri). Si aprono le finestre Navigation (navigazione) e View*Edit (visualizza*modifica), relative al progetto.
I numeri sulla scala orizzontale rappresentano le posizioni dei codoni per ciascun gene. Le POI sono codificate con colori diversi, come indicato nella tabella seguente. Codifica colore per le posizioni di interesse (POI)
Colore Significato
2.
IMPORTANTE! Non consentito aprire e modificare lo stesso file di progetto in pi di unistanza del software ViroSeq. Modificare contemporaneamente gli stessi segmenti di dati in istanze multiple del software ViroSeq pu avere conseguenze impreviste sul funzionamento software.
Grigio = colore dello sfondo Nessuna differenza rispetto al riferimento Rosso Nero Verde Blu Giallo Bianco POI selezionate Discordanze tra segmenti Differenze note o sconosciute tra sequenza di riferimento e sequenza di consenso Posizione multibase Mostra le aree coperte da un solo segmento durante lassemblaggio Identificazione delle basi confermata dallutente Nota. Prima necessario salvare il progetto.
Sezione di allineamento dei segmenti

La sezione di allineamento dei segmenti viene visualizzata nella parte inferiore della finestra Navigation (navigazione). Questa parte mostra graficamente in che modo i segmenti di sequenza si sovrappongono.
Letichetta su ogni segmento composta dal nome del progetto e dal primer utilizzato. I segmenti sono rivolti nella direzione di polimerizzazione. Verificare che le sequenze siano posizionate come previsto. Direzione in avanti - primer A, D, B, C Direzione indietro - primer F, G, H
In rari casi, il segmento D pu essere allineato al percorso sbagliato. Dopo aver assemblato il progetto, controllare la posizione del segmento D. Questo dovrebbe coprire completamente il gene della protesasi e linizio del gene della RT. Se il segmento D non posizionato come specificato, riassemblare il progetto senza segmento D.
Pagina 27 di 68
Finestra View*Edit (visualizza*modifica)

La finestra View*Edit (visualizza*modifica) visualizza la sequenza di consenso generata dal software e contiene gli strumenti di navigazione e modifica.
Parti della finestra View*Edit (visualizza*modifica) e relativa descrizione

Articolo 1 Nome Pulsante spostamento a sinistra Pulsante spostamento indietro Pulsante Trim (taglia) Descrizione Si sposta sulla POI allestrema sinistra.
Si sposta sulla POI a sinistra della POI attiva.
Taglia e ricongiunge le estremit selezionate di un segmento nellelettroferogramma. Ripristina lattribuzione della base originale della POI corrente. Modifica la POI attiva. I pulsanti rappresentano i codici alfabetici delle basi e delle basi miste. Se la casella selezionata, il sistema si sposta automaticamente alla POI successiva dopo ogni modifica.
Pulsante Revert (ripristina)
Tavolozza di modifica
Casella di controllo Auto jump on edits (spostamento automatico dopo una modifica) Casella di controllo Reverse jump (spostamento indietro)
Utilizzato dopo la modifica della posizione corrente, determina uno spostamento sulla successiva POI a sinistra. Questa casella attiva solo quando selezionata la casella di controllo Auto jump on edits (spostamento automatico dopo una modifica).
Pulsante Navigation Options Apre la finestra di dialogo Navigation Options (opzioni (opzioni di navigazione) di navigazione). In questa finestra di dialogo possibile selezionare le POI attive. Le POI attive sono quelle su cui il sistema si posiziona mediante i pulsanti di spostamento. Pulsante di spostamento in avanti Pulsante di spostamento a destra Etichetta scheda Determina lo spostamento sulla POI a destra della POI attiva. Determina lo spostamento sulla POI allestrema destra.
10
11
Etichetta ogni riga della scheda di sequenza. Inoltre attribuisce il nome del primer e la direzione di polimerizzazione per ogni sequenza. Indica il numero di codoni della sequenza di riferimento. Indica il codice di una lettera per la traduzione in aminoacidi del codice per la sequenza di riferimento. Indica il codice di una lettera per la traduzione in aminoacidi del codice per la sequenza di consenso. Basi della sequenza di riferimento. Basi della sequenza di consenso. POI corrente. Elettroferogramma per un segmento di sequenza. Il software ViroSeq mostra tutti i segmenti di sequenza che si sovrappongono in una posizione. Barra di scorrimento orizzontale per la scheda delle sequenze.
12 13
Numero di codoni Reference Translation (traduzione di riferimento) Consensus Translation (traduzione di consenso) Sequenza di riferimento Sequenza di consenso Casella attorno alla base Picchi delle sequenze
14
15 16 17 18
19
Barra di scorrimento
20
Casella di informazione sulla Spiega perch una posizione stata identificata come posizione POI. Close View Edit (chiudi visualizza modifica) Chiude la finestra View Edit (visualizza modifica).
21
Pagina 28 di 68
Tavolozza di modifica
Menu File
Codici IUB
Codici IUB A = adenosina C = citidina G = guanosina T = timidina U = uracile K = G o T (Keto) (cheto) M = A o C (aMino) (amino) R = A o G (puRine) (purina) S = G o C (Strong [forte]3 legami H) W = A o T (Weak [debole]2 legami H) Y = C o T (pYrimidine) (pirimidina) B = C, G, o T D = A, G, o T H = A, C, o T V = A, C, o G N = aNy (qualsiasi) base New Project (nuovo progetto) Ctrl+N Viene visualizzata la finestra di dialogo Open (apri). Facendo clic sul pulsante New (nuovo) possibile selezionare da una cartella e aprire un file relativo allanalisi di sequenziamento; il software assembler in nuovi progetti tutte le sequenze contenute in quella cartella. Open Project (apri progetto) Aminoacidi Alanina Arginina Asparagina Aspartato o acido aspartico Cisteina Glutammina Glutammato o acido glutamico Glicina Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina Codice a tre lettere Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Codice a una lettera A R N D C Q E G H I L K M F P Voce di menu S T W Y V Edit Report Information (modifica le informazioni del rapporto) Ctrl+E Apre la finestra di dialogo Edit Report Information (modifica le informazioni del rapporto), dove possibile inserire le informazioni relative a paziente, laboratorio e tecnico per lintestazione del rapporto finale. Toggle Position Cursor (attiva/disattiva cursore di posizione) Export Resistance Report (esporta rapporto sulla resistenza) Quit (esci) Ctrl+X Consente di esportare il rapporto sulla resistenza. Save consensus (salva consenso) [FASTA] Generate Resistance Report (genera rapporto sulla resistenza) Ctrl+F Archivia la sequenza di consenso in un file di testo ASCII con estensione .fasta. Consente di visualizzare e stampare il rapporto sulla resistenza. Save (salva) Ctrl+S Ctrl+O Viene visualizzata la finestra di dialogo Project Status (stato del progetto). Selezionare un progetto dallelenco oppure, facendo clic sul pulsante Find (trova), selezionare e aprire un progetto ViroSeq gi assemblato. Salva il progetto aperto con le eventuali modifiche apportate. Voce di menu
Opzioni del menu File

Scelta rapida da tastiera Descrizione
Codici degli aminoacidi
Ctrl+G
Ctrl+Q
Esce dal software ViroSeq.
Menu Edit (modifica)
Opzioni del menu Edit (modifica)

Scelta rapida da tastiera Ctrl+T Descrizione
Attiva e disattiva la linea di posizionamento del cursore.
Pagina 29 di 68
Opzioni del menu Edit (modifica)

Voce di menu Scelta rapida da tastiera Descrizione
Revisione del progetto assemblato
Change Passwords (cambia password)
Quando lutente accede come amministratore, si apre la finestra di dialogo Administrator Access (accesso dellamministratore) dove possibile cambiare le password ed eseguire altre funzioni amministrative. Quando si accede come utenti, si apre la finestra di dialogo User Access (accesso utente) nella quale possibile cambiare la propria password.
Dopo che il software ViroSeq ha assemblato un progetto, necessario rivedere e verificare le identificazioni delle basi in corrispondenza delle POI nella sequenza di consenso. Lutente pu accettare o modificare le identificazioni delle basi nei punti in cui il software rileva differenze tra la sequenza di consenso e la sequenza di riferimento. Per stabilire se lidentificazione delle basi suggerita giustificata, necessario osservare gli elettroferogrammi. Per esempio, i blob di colorante allinizio di una sequenza di ripetizioni della stessa base, possono indurre il software a valutare erroneamente la sequenza e a suggerire una variazione che in realt non esiste.
Login As New User (accesso come nuovo utente)
Apre la finestra User Login (login utente).
POI
Una POI una base nella sequenza di consenso per la quale sono valide una o pi delle definizioni seguenti: diversa dal ceppo di riferimento HIV-1 trovata nella tabella interna delle posizioni di resistenza note identificata come base mista in almeno un segmento in quella posizione inserzione relativa alla sequenza di riferimento diversa da un segmento allaltro Nota. Per una posizione di consenso data possono essere validi uno o pi criteri POI.
Descrizione
Menu Window (finestra)
Opzioni del menu Window (finestra)

Voce di menu Scelta rapida da tastiera
Codici colore delle basi

Base Adenina Citosina Guanina Colore Verde Blu Nero Rosso Rosa
History (cronologia)
Apre il registro History (cronologia).
Menu Help (guida)
Opzioni del menu Help (guida)

Voce di menu Scelta rapida da tastiera Descrizione
Timina Basi miste
About ViroSeq (informazioni su ViroSeq)
Visualizza informazioni sul prodotto.
Impostazione delle opzioni di navigazione

La finestra Navigation Options (opzioni di navigazione) si apre con un clic sul pulsante Navigation Options (opzioni di navigazione) nella finestra View*Edit (visualizza*modifica).
Parti di un progetto assemblato

Il progetto assemblato composto da: Elettroferogrammi per segmenti di sequenza. Il software ViroSeq rappresenta le basi come picchi di un colore diverso per ciascuna delle quattro basi. Sequenza di consenso di segmenti di sequenza Con sette primer diversi, i segmenti di sequenza si sovrappongono e coprono ogni sezione del gene bersaglio almeno due volte e in entrambe le direzioni. (Fanno eccezione i codoni della RT allincirca alle posizioni 315-335.) Sequenza di riferimento Il software ViroSeq confronta la sequenza di consenso con una sequenza di riferimento, HXB-2. Traduzioni di consenso e di riferimento Il software ViroSeq mostra la sequenza di aminoacidi nel ceppo virale di riferimento e tutte le possibili traduzioni in aminoacidi della sequenza di consenso. Numero di codoni Il software ViroSeq numera i codoni in base alla sequenza di riferimento.
Pagina 30 di 68
Spiegazione delle opzioni di navigazione

Opzione Descrizione Global Settings (impostazioni globali) Additional variants from reference (varianti supplementari rispetto al riferimento) Multibase positions (posizioni multibase) Individua le mutazioni che non sono utilizzate nellalgoritmo del software ViroSeq.
I picchi di miscela devono essere distinti dai picchi di rumore. Tuttavia, quando in una sequenza sono presenti livelli elevati di rumore continuo, i dati reali possono risultare oscurati e pu essere impossibile distinguere dal rumore i picchi pi piccoli.
Sequenza degli eventi di modifica

Tagliare le estremit dei segmenti per eliminare i segmenti di sequenza di scarsa qualit. Verificare e ricomporre le identificazioni di basi miste e le basi discordanti. Confrontare le aree con problemi di mobilit con i segmenti di altre sequenze e con la sequenza di riferimento per determinare la corretta posizione dei picchi.
Consente di spostarsi sulle posizioni della sequenza di consenso derivate da segmenti che presentano miscele o pi di un nucleotide in una data posizione. Individua differenze in una posizione di una sequenza di consenso derivate da segmenti di primer forward o reverse che non corrispondono a quella posizione. Individua le basi che sono state modificate manualmente e salvate nel progetto. Individua basi extra che non fanno parte della sequenza di riferimento. Nota. Per informazioni su come il software gestisce le inserzioni, vedere il paragrafo Mutazioni per inserzione.
Modifica di un progetto
1. Fare clic su Navigation Options (opzioni di navigazione) per aprire la finestra Navigation Options. Verificare che tutte le caselle di controllo delle opzioni della finestra Navigation Options (opzioni di navigazione) siano selezionate. Selezionare e tagliare le aree con sequenza di scarsa qualit per migliorare lidentificazione delle basi. Sulla barra di Navigation (navigazione) i densi raggruppamenti di barre verticali rappresentano le aree in cui la sequenza di uno o pi primer pu risultare di scarsa qualit. Confermare o modificare le identificazioni delle basi. a. Partire dalla POI allestremit sinistra del gene della proteasi facendo clic sul pulsante per modificare o confermare lidentificazione delle basi. b. Premere la barra spaziatrice per confermare la selezione. c. Passare alla POI successiva premendo per modificare o confermare lidentificazione delle basi. Ripetere fino ad aver modificato o confermato tutte le POI nella sequenza di consenso. Nota. Se le sequenze sovrapposte non corrispondono alla maggior parte delle posizioni, verificare possibili errori di miscelazione o denominazione dei campioni. Nella finestra Navigation Options (opzioni di navigazione), deselezionare tutte le caselle di controllo eccetto Show Resistance positions (mostra posizioni di resistenza) e fare clic su OK. Ripetere la procedura di modifica/conferma partendo dallestremit sinistra e spostandosi verso destra. Nota. possibile utilizzare listruzione di modifica 1 nel riepilogo seguente per identificare le miscele che possono essere state tralasciate dal software.
Mismatches between segments (Discordanze tra segmenti)
Show saved edits (mostra le modifiche salvate) Insertions (inserzioni)
2.
3.
Features from Gene Profile (funzioni profilo del gene) Show Resistance positions (mostra posizioni di resistenza) Trasforma ogni mutazione utilizzata nellalgoritmo di resistenza farmacologica in una POI, indipendentemente dal fatto che la sequenza di consenso sia diversa o meno dalla sequenza di riferimento. Nota. A questo scopo necessario che la casella Only show if variant (mostra solo se variante) sia deselezionata. Selezionando questa casella, oltre alla casella Show Resistance positions (mostra posizioni di resistenza), vengono selezionati solo quei codoni di resistenza farmacologica della sequenza di consenso, per i quali sono state rilevate mutazioni che contribuiscono a determinare la resistenza farmacologica. Questa funzione pu essere utilizzata al momento di creare nuovi progetti. Non consigliabile attivarla per progetti salvati o modificati.
4.
Only show if variant (mostra solo se variante)
5.
Conferma o modifica delle POI

Per ogni posizione di interesse (POI) selezionata nelle Navigation Options (opzioni di navigazione) necessario confermare o modificare manualmente la posizione. Il cursore nella finestra View*Edit (visualizza*modifica) una casella che circonda il codice a lettere di una base o di una POI nella sequenza di consenso. possibile confermare o modificare eventuali discordanze tra segmenti sovrapposti o mutazioni che siano state identificate dal software. 6.
Perch utilizzare le istruzioni di modifica
Distinzione tra picchi e rumore

Un picco un segnale elettroforetico con un massimo definibile e fronti chiaramente risolti su entrambi i lati. I picchi rappresentano lintensit del segnale del colorante fluorescente legato a ogni frammento di sequenza del DNA. I picchi vengono letti e analizzati dai programmi di raccolta dati e analisi di sequenziamento.
IMPORTANTE! La coerenza da operatore a operatore nella procedura di identificazione delle basi essenziale. Le istruzioni di modifica delle sequenze forniscono un metodo per raggiungere questa coerenza. Nella maggior parte dei casi, il software ViroSeq identifica con precisione le miscele. Nei casi in cui la decisione deve essere presa dallutente, queste istruzioni vanno utilizzate per individuare le miscele effettive. IMPORTANTE! La qualit dei dati di sequenza influenza laccuratezza dellindividuazione delle basi. Quanto pi basso risulta il rumore di fondo o il rumore, tanto minore il numero di modifiche che sar necessario apportare.
Riepilogo delle istruzioni di modifica per lidentificazione delle miscele

Picchi completamente Picchi solo parzialmente risolti risolti
possibile identificare una miscela quando: 1. Due segmenti di sequenza di senso opposto contengono picchi secondari chiaramente al di sopra del rumore locale (circa il doppio del livello di rumore).
Nota. Le spalle dei picchi sono definite come picco solo se anchesse presentano un massimo definibile. Il rumore il segnale di fondo presente in un elettroferogramma. Pu essere causato dallo strumento o dalla qualit della schiera di capillari, del polimero, del campione, della soluzione tampone o della formammide Hi-Di.
Pagina 31 di 68
2. Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari almeno al 30% del picco primario con un livello di rumore triplo di quello locale. Prendere nota delle mutazioni della resistenza nelle regioni a copertura singola solo listruzione di modifica n. 2 pu essere utilizzata per identificare una mutazione della resistenza. 3. Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari almeno al 30% del picco primario e il segmento nella direzione opposta conferma la miscela.
Gerarchia per la modifica del progetto

1. Per una prima analisi dei dati, selezionare tutte le funzioni di navigazione. Questo consente di arrestare il programma in tutte le posizioni in cui stata identificata una miscela. Questo si verifica perch almeno una delle sequenze presenta un 30% di miscela. 2. Valutare se il 30% di miscela effettivo (ovvero al di sopra del livello del rumore). 3. Se i criteri del 30% sono soddisfatti, verificare se la sequenza opposta presenta un picco di conferma (Istruzione 3). Se il picco di conferma presente, identificare la miscela. 4. Se il filamento opposto non presenta un picco di conferma, stabilire se il 30% del picco (nel filamento originale) 3 rumore di fondo. Se il criterio 3 rumore di fondo soddisfatto, identificare la miscela (Istruzione 2). Questa regola valida per una miscela in una sola direzione. 5. Dopo aver eseguito unanalisi dei dati, le opzioni di navigazione dovrebbero essere modificate in modo che il programma si arresti solo in corrispondenza delle posizioni di resistenza. Attenzione necessario deselezionare la funzione Only show if variant (mostra solo se variante). 6. Eseguire una seconda analisi di tutti i dati, ricercando le miscele che soddisfano lIstruzione 1 (2 rumore di fondo in entrambe le direzioni). A questo punto, controllare anche le modifiche e le identificazioni automatiche effettuate nelle altre posizioni di resistenza.
Esempi
Esempio di dati di sequenza di buona qualit
Lesempio seguente mostra un rumore di fondo molto basso e picchi secondari.
Esempio di dati di sequenza di scarsa qualit

Lesempio seguente mostra un rumore di fondo molto elevato, con limpossibilit di identificare con certezza i picchi secondari. possibile che a causa del rumore di fondo le miscele vengano identificate in modo errato. Questo campione dovrebbe essere ripetuto.
Pagina 32 di 68
Esempi di applicazione dellIstruzione 1

Riuscita
Istruzione 1: Due segmenti di sequenza di senso opposto contengono picchi secondari chiaramente al di sopra del rumore locale (circa il doppio del livello di rumore). Il software ViroSeq identifica automaticamente le miscele al 30% del picco primario (pi grande). In alcune situazioni, si osservano miscele che non vengono identificate dal software perch inferiori al 30%.

Riuscita
Istruzione 2: Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari almeno al 30% del picco primario con un livello di rumore triplo di quello locale. In rari casi una sequenza di miscela viene osservata in una sola direzione. Per identificare questa miscela, il picco di miscela del singolo segmento deve essere ben definito e chiaramente interpretabile. Il software ViroSeq identifica questo tipo di miscela come . . . Mismatch, . . . Mixture (. . . discordanza, . . . miscela).
Per modificare unidentificazione delle basi in questa situazione (seconda posizione del codone 20), seguire lIstruzione 1 per effettuare con precisione e coerenza lidentificazione corretta delle basi. Lidentificazione corretta della base in questo esempio W.
Lesempio sopra mostra una miscela in cui un segmento di sequenza contiene un picco secondario superiore al 30% mentre laltro segmento di sequenza non presenta alcuna miscela (non ha un massimo risolvibile). La miscela presente nella sequenza in alto pari almeno al 30% del picco primario e significativamente superiore al rumore di fondo.
Fallita
Sotto riportato lesempio di una miscela (prima posizione del codone 32) che non pu essere identificata. Si tratta di una miscela apparente, causata da un blob di colorante allinizio del primer B.
Fallita
Di seguito riportato lesempio di un picco di miscela presente in entrambe le direzioni che non ha potuto essere identificato perch di dimensioni identiche a quelle dei picchi di rumore di fondo circostanti. Gli stessi picchi rappresentano condizioni di rumore.
Pagina 33 di 68

Riuscita
Istruzione 3: Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari almeno al 30% del picco primario e il segmento nella direzione opposta conferma la miscela. HIV-1 Genotyping System forniscono una I primer di sequenza del copertura doppia per lintera lunghezza del gene della proteasi e fino circa al codone 315 del gene della RT e una copertura singola a partire allincirca dal codone 315 fino al 335. La miscela osservabile in entrambe le direzioni, sia in avanti che indietro, il che rende pi affidabili le identificazioni delle miscele. ViroSeq In molti casi, la miscela maggiore del 30% del picco primario in una direzione e minore del 30% nellaltra. La sequenza inferiore (il segmento nella direzione opposta) viene usata per confermare la presenza della miscela.
Eccezioni alle istruzioni

Gli esempi seguenti mostrano posizioni anomale in corrispondenza di RT151 e RT215 che non seguono le istruzioni di modifica. Le eventuali miscele presenti in queste posizioni mostrano frequentemente un pattern uguale a quello illustrato sotto. Confrontare questi esempi con il campione. Se i pattern corrispondono, possibile identificare una miscela per queste posizioni.
Fallita
Sotto riportato lesempio di una miscela apparente (terza posizione del codone 254) causata dallelevato e continuo rumore di fondo. Lidentificazione corretta della base C.
Pagina 34 di 68
Modifica dei dati

Ritaglio con il software ViroSeq
Le sequenze allinizio o alla fine di un segmento sono spesso di scarsa qualit. Il software ViroSeq taglia automaticamente queste sequenze e consente, inoltre, il ritaglio manuale. La parte tagliata di una sequenza rimane visibile come parte di un elettroferogramma, ma viene visualizzata sullo schermo su uno sfondo grigio. Il software ViroSeq ignora le differenze tra le sequenze tagliate e la sequenza di riferimento nella determinazione della sequenza di consenso. Tuttavia, possibile utilizzare questa informazione (nellarea con sfondo grigio) quando si effettua lidentificazione delle basi.
Dopo il ritaglio
Ritaglio manuale delle estremit dei segmenti

1. Nella finestra View*Edit (visualizza*modifica), selezionare la regione di scarsa qualit facendo doppio clic su questa porzione dellelettroferogramma. La regione compresa tra il punto del doppio clic e lestremit pi vicina viene evidenziata in nero. Fare clic su Trim (taglia). La sequenza selezionata viene tagliata e visualizzata su sfondo grigio. Nota. Il ritaglio esclude luso di dati tagliati solo durante lindividuazione delle basi di consenso. Il software non esclude luso dei dati tagliati durante lassemblaggio dei dati. Se i dati rumorosi causano risultati mediocri di assemblaggio o allineamento, sar dunque necessario tagliarli utilizzando il software Sequence Analysis (software per l'analisi di sequenziamento). Per annullare il taglio di un segmento: a. Selezionare una regione di dati pi piccola e fare doppio clic per evidenziarla in nero. b. Fare clic su Trim (taglia).
2.
Sequenza tagliata
Esempio di ritaglio
Prima del ritaglio
3.
Controllare attentamente le aree con inserzioni. Queste interpretazioni influenzano i risultati dellAntiretroviral Drug Resistance Report (rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali).
Ricerca delle POI

Sono previsti quattro metodi per spostare il cursore di modifica su una nuova posizione: Fare clic sul pulsante di spostamento avanti ( ) o indietro ( ) per spostarsi sulla POI successiva, come specificato nelle Navigation Options (opzioni di navigazione). Utilizzare la barra di scorrimento nella parte inferiore della finestra View*Edit (visualizza*modifica) per spostarsi lungo la sequenza. Il cursore di modifica si trova al centro della finestra. Utilizzare i tasti freccia sinistra o destra sulla tastiera. Fare clic una sola volta sul lato sinistro o destro della sequenza di consenso per spostare la cornice della finestra Edit (modifica). La base selezionata diventa la POI centrale.
Pagina 35 di 68
Modifica di unidentificazione delle basi

Modifica di una mutazione 1. Esecuzione della modifica. a. Fare clic sul pulsante della tavolozza di editing (modifica) corrispondente al tipo di mutazione da modificare oppure inserire la lettera relativa allidentificazione delle basi (codice IUB) per la POI premendo il tasto corrispondente sulla tastiera. b. Premere la barra spaziatrice per confermare la modifica.
Revisione del progetto nella finestra History (cronologia)

La finestra History (cronologia) visualizza una registrazione permanente dei segmenti aggiunti, rifiutati e tagliati, nonch delle modifiche alle identificazioni delle basi. Visualizzazione della finestra History (cronologia) 1. Dal menu Window (finestra), selezionare History (cronologia). Si apre la finestra History (cronologia). Far scorrere il registro utilizzando la barra di scorrimento verticale sulla destra dello schermo per visualizzare le attivit.
2.
Nota. Se vengono apportate pi modifiche a una base, salvando ogni volta, la modifica finale sar registrata correttamente nella finestra History (cronologia). 2. Seguire le istruzioni di modifica per le miscele. 1. Due segmenti di sequenza di senso opposto contengono picchi secondari chiaramente al di sopra del rumore locale (circa il doppio del livello di rumore). 2. Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari al 30% del picco primario con un livello di rumore triplo rispetto a quello locale. Prendere nota delle mutazioni della resistenza nelle regioni a copertura singola solo listruzione di modifica n. 2 pu essere utilizzata per identificare una mutazione della resistenza. 3. Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari al 30% del picco primario e il segmento nella direzione opposta conferma la miscela. IMPORTANTE! Non utilizzare sequenze con livelli elevati di rumore continuo. In rari casi, le inserzioni possono provocare inesattezze nel Drug Resistance Report (rapporto sulla resistenza farmacologica). 1. Il software ViroSeq non progettato per risolvere casi in cui sono presenti due specie dominanti di virus, di cui una priva di inserzioni e laltra dotata di inserzioni. Questa situazione facilmente rilevabile quando si utilizza ViroSeq ed rappresentata di seguito. 2. Lutilizzo del sequenziamento genico per la genotipizzazione di virus con inserzioni pu produrre soluzioni non univoche, sia per la posizione delle inserzioni, sia per lesistenza di mutazioni nelle immediate vicinanze di uninserzione. Questo limite illustrato e discusso qui di seguito. 3. Nei campioni in cui presente uninserzione, sono necessarie almeno due sequenze di primer per unidentificazione corretta delle basi dellinserzione. Accertarsi che larea con linserzione abbia almeno due sequenze di primer che non sono state tagliate. Se nellarea dellinserzione disponibile una sola sequenza di primer, saranno generati risultati imprecisi. Il software ViroSeq in grado di rilevare le mutazioni per inserzione quando la mutazione presente in una popolazione omogenea. Tuttavia, il software ViroSeq non pu interpretare un campione con una miscela di due o pi popolazioni di virus, delle quali una contenga uninserzione e laltra non ne contenga. Questo limite comune a tutte le metodologie di sequenziamento. Le mutazioni per inserzione in una miscela producono traslazioni di sequenza diverse a seconda della popolazione di virus; di conseguenza le identificazioni delle basi a valle dellinserzione possono essere visualizzate come miscele. Questo fenomeno chiaramente visibile nel software ViroSeq come una serie di miscele forti che hanno inizio al termine dellinserzione e che continuano fino al termine della sequenza del campione per quel primer. Nellesempio seguente, il virus 2 presenta uninserzione di tre basi che sposta lallineamento delle due sequenze di miscela.
Consenso: GAC GAC AGT AGT rsk ACT Amw AAA wrr TGG wGr AGA ArA AAA
Mutazioni per inserzione
Conferma di unidentificazione delle basi

1. Confermare unidentificazione delle basi premendo la barra spaziatrice della tastiera. Per annullare la conferma, premere di nuovo la barra spaziatrice.
2.
Ripristino dellidentificazione originale delle basi

1. 2. Selezionare lidentificazione delle basi che si desidera modificare. Fare clic su Revert (ripristina). Viene ripristinata lidentificazione originale delle basi effettuata dal software.
Salvataggio delle modifiche

Per salvare le modifiche, selezionare Save (salva) dal menu File. Si apre la finestra Progress (avanzamento) che indica quando il file stato salvato. Viene effettuato un inserimento nella finestra History (cronologia) e il file viene salvato nella cartella Projects\Completed allinterno della directory del software ViroSeq. possibile salvare la sequenza di consenso in un formato di testo ASCII (formato FASTA) selezionando File > Save consensus [FASTA] (file > salva consenso [FASTA]) Il file viene salvato nella directory C:\ViroSeq v2.8\Projects\Completed\Reports.
Virus 1: (senza inserzione) Virus 2: (con inserzione)
GAC
AGT
GGG
ACT
AAA
TGG
AGA
LAntiretroviral Drug Resistance Report (rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali) pu essere salvato in formato XML selezionando File > Export Resistance Report (file > esporta rapporto sulla resistenza). Il file viene salvato nella directory C:\ViroSeq v2.8\Projects\Completed\Export. Nota. Non modificare i risultati dopo aver salvato una versione XML del rapporto sulla resistenza.
Lelevata incidenza di mutazioni nel genoma dellHIV-1 crea ambiguit nella determinazione delle posizioni delle inserzioni. Tale ambiguit pu rendere difficoltoso determinare leffettiva esistenza di una data mutazione della resistenza. Un primo esempio linserzione che si verifica in prossimit del codone 69. In questarea sono presenti tre importanti mutazioni della resistenza: D67N T69D K70R
Gli esempi seguenti mostrano due possibili interpretazioni dellinserzione.
Pagina 36 di 68
Esempio 1
N. codone Traduzione di riferimento Traduzione di consenso Sequenza di riferimento Sequenza di consenso 67 D 68 S 69 T 70 K 71 W
Rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali

Creazione dellAntiretroviral Drug Resistance Report (rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali)
possibile includere in un progetto le informazioni specifiche del laboratorio e del campione, selezionando la voce di menu Edit Report Information (modifica informazioni rapporto). Le informazioni specifiche del laboratorio possono essere salvate per impostazione predefinita e stampate su ogni Antiretroviral Drug Resistance Report (rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali), di modo che il documento risulti coerente per tutti gli utenti del laboratorio. Le informazioni relative a tecnico, paziente e campione, che sono univoche del singolo campione possono essere inserite per ogni progetto utilizzando la voce di menu Edit Report Information (modifica informazioni rapporto). Il programma non supporta linserimento del carattere speciale virgolette doppie () nellintestazione del rapporto sulla resistenza. Evitare di utilizzarlo nei campi della finestra Edit Report Information (modifica informazioni rapporto). Nel campo Comments (commenti) possibile inserire un massimo di cinque righe e fino a 256 caratteri, spazi inclusi. Se questo limite viene superato, il testo inserito pu non essere visualizzato sul rapporto. Nel campo Comments (commenti) evitare luso del tasto Enter (invio), perch questo determina la perdita delle informazioni. Qualora vengano modificati i campi del rapporto in un progetto esistente, si raccomanda di completare la generazione e il salvataggio del rapporto sulla resistenza prima di aprire un altro progetto nel software ViroSeq.
GAC
AGT
ACT
AAA
TGG
AAC
AGT
TCT
ACA
TCT
AGA
TGG
Lesempio 1 presenta un caso in cui linserzione risulta posizionata in K70T.
Esempio 2
N. codone Traduzione di riferimento Traduzione di consenso Sequenza di riferimento Sequenza di consenso 67 D 68 S 69 T 70 K 71
N S S T S R W
Creazione di unintestazione predefinita

GAC AGT ACT AAA TGG
1.
AAC AGT TCT ACA TCT AGA TGG
Selezionare Edit > Edit Report Information (modifica > modifica informazioni rapporto). Nella finestra Edit Report Information (modifica informazioni rapporto), digitare le informazioni che si desidera visualizzare come predefinite in tutti i rapporti sulla resistenza. Fare clic su Set As Default (imposta come predefinito) quindi fare clic su OK per chiudere la finestra di dialogo. Nota. Per modificare le informazioni predefinite, inserire le modifiche quindi fare clic su Set As Default (imposta come predefinito) e su OK.
2.
Lesempio 2 presenta un caso in cui linserzione risulta posizionata in K70R. Entrambi i posizionamenti sono ugualmente probabili e validi perch entrambi presentano lo stesso numero di differenze tra le sequenze di riferimento e quelle di consenso. Nei pazienti in terapia prolungata, linserzione al codone 69 avviene a una frequenza molto bassa, inferiore all1%.25 Un recente rapporto indica che i ricercatori non sono stati in grado di individuare miscele (wild-type e mutanti) in pazienti con virus contenente linserzione al codone 69.26 Questo risultato suggerisce che la mutazione per inserzione ha sostituito rapidamente il wild-type e che le eventuali miscele sarebbero presenti a frequenze estremamente basse.
3.
Inserimento di informazioni relative al campione

1. Dal menu Edit (modifica), selezionare Edit Report Information (modifica informazioni rapporto). Nella finestra Edit Report Information (modifica informazioni rapporto), inserire le informazioni relative alloperatore che esegue lanalisi, al paziente e al campione e/o commenti. Nota. Le voci predefinite nella finestra Edit Report Information (modifica informazioni rapporto) sono una serie di cinque trattini. Se l'utente non personalizza la finestra Edit Report Information (modifica informazioni rapporto), la serie di trattini viene inclusa automaticamente nel rapporto di resistenza farmacologica, nel file FASTA e nel file XML. Fare clic su OK per chiudere la finestra di dialogo. Fare clic su Save (salva) per salvare le modifiche.
2.
3. 4.
Nota. Le modifiche apportate alle informazioni del rapporto devono essere salvate per poter avere effetto.
Pagina 37 di 68
Visualizzazione del rapporto

.
Livelli di disclaimer
I livelli di evidenza di resistenza sono contrassegnati da unetichetta senza asterischi o con un massimo di tre asterischi. I significati degli asterischi sono descritti nella seguente tabella. Etichetta disclaimer Disclaimer Significato in termini di studi analitici e clinici
Tutte le mutazioni presenti sono state verificate in studi clinici e analitici. Tutte le mutazioni presenti sono state confermate in studi clinici, ma possono non essere state verificate in studi analitici.
1.
Selezionare File > Generate Resistance Report (file > genera rapporto sulla resistenza). Utilizzare i pulsanti nella parte superiore della finestra per ridurre o ingrandire la visualizzazione, o per sfogliare le pagine di un rapporto multipagine.
2.
Selezionare licona Save (salva) per salvare il report generato come file in formato PDF (Portable Document Format). Viene visualizzata la finestra di dialogo Save Report (salva rapporto). Selezionare la directory in cui si desidera collocare il file PDF del rapporto e fare clic su Save (salva).
(Nessuna etichetta)
Nessuno
3.
Stampa
1. Selezionare File > Generate Resistance Report (file > genera rapporto sulla resistenza) se il rapporto non gi aperto. Nella parte superiore della finestra ViroSeq Report (rapporto ViroSeq), fare clic sullicona Print (stampa). Quando si apre la finestra di dialogo Print (stampa), selezionare la stampante desiderata e fare clic su OK.
**
NOTA: almeno una mutazione utilizzata per determinare levidenza di resistenza per questo farmaco non stata completamente confermata. NOTA: almeno una mutazione utilizzata per determinare levidenza di resistenza per questo farmaco non stata verificata clinicamente. NOTA: per almeno una mutazione utilizzata per valutare levidenza di resistenza per questo farmaco, sono valide entrambe le note sopra.
Tutte le mutazioni presenti sono state verificate in studi analitici, ma possono non essere state verificate in studi clinici.
2.
***
Almeno una mutazione non stata verificata n in studi clinici, n in studi analitici.
Interpretazione dellAntiretroviral Drug Resistance Report (rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali)
Informazioni relative al laboratorio e al campione
Questa parte del rapporto definita dallutente. Nel menu Edit (modifica), lopzione Edit Report Information (modifica informazioni rapporto) apre una finestra di dialogo per linserimento delle informazioni.
La classe di farmaci inibitori della proteasi contrassegnata con un + indicante unetichetta disclaimer. Etichetta disclaimer Interpretazione
Le interpretazioni dellevidenza di resistenza degli inibitori della proteasi (PI) sono state sviluppate per valutare la risposta virologica prevista a dosi standard di inibitori della proteasi con boosting farmacocinetico mediante ritonavir. Questo diventato il metodo pi comune di somministrazione di ciascuno degli inibitori della proteasi, eccetto nelfinavir, per garantire adeguati livelli farmacologici in tutti i pazienti. In presenza di resistenza, i PI boosted sono pi attivi dei PI non boosted.
Mutazioni e resistenza
ampiamente riconosciuto che lo sviluppo della resistenza a un farmaco un processo continuo in cui alcune mutazioni conferiscono un basso livello di resistenza, altre un livello di resistenza pi elevato e le combinazioni hanno effetti additivi o sinergici.27,29 Linterazione tra mutazioni che conferiscono resistenza farmacologica ben definita per alcuni farmaci, ma non per altri. Sono necessari ulteriori studi per decifrare gli esatti contributi di ciascuna di queste combinazioni di mutazioni allo sviluppo di elevati livelli di resistenza. Nei casi in cui i dati non indicano chiaramente levidenza di un livello elevato di resistenza, le mutazioni rilevate possono indicare una resistenza incombente. Tali mutazioni vengono segnalate come marcatori di Possible Resistance (possibile resistenza). In alcuni casi le mutazioni possono causare ipersuscettibilit a un particolare farmaco.
Notazione delle mutazioni nelle posizioni di resistenza

Le mutazioni sono rappresentate per mezzo di convenzioni di stile, colore e punteggiatura che ne indicano il contributo allo sviluppo della resistenza farmacologica. {Rosso grassetto parentesi graffe} mutazioni che di per s conferiscono resistenza virale e determinano unidentificazione di Resistance (resistenza). [Blu grassetto-corsivo parentesi quadre] mutazioni che di per s conferiscono la possibilit di resistenza virale e determinano unidentificazione di Possible Resistance (possibile resistenza). (Parentesi nere) mutazioni che contribuiscono minimamente allo sviluppo della resistenza. Per determinare unidentificazione di Possible Resistance (possibile resistenza) sono necessarie pi mutazioni di questo tipo. Questa mutazione deve essere associata ad almeno unaltra mutazione per conferire la possibilit di resistenza virale. <Verde parentesi quadre> Questa mutazione contrasta la resistenza.
Resistenza antiretrovirale dellHIV-1

La resistenza antiretrovirale riportata per tre classi di farmaci: inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa inibitori della proteasi
LEvidence of Resistance (evidenza di resistenza) indicata nella prima colonna a destra a pag. 1 del rapporto. Viene indicata per ogni farmaco di una stessa classe ed basata sulle mutazioni rilevate nel campione. La presenza di una mutazione specifica o di una combinazione di mutazioni determina una delle seguenti identificazioni: Resistance (resistenza) indica un elevato livello di evidenza di resistenza. Possible Resistance (possibile resistenza) indica una possibile evidenza di resistenza. Mutazioni o combinazioni di mutazioni che non soddisfano i criteri richiesti per lidentificazione Resistance (resistenza), ma che suggeriscono una resistenza. None (nessuna) indica unevidenza di resistenza insufficiente.
Additional Mutations (mutazioni supplementari)

La sezione Additional Mutations (mutazioni supplementari) del rapporto identifica gli aminoacidi che differiscono dalla sequenza di riferimento (HXB-2, numero di accesso K03455) nelle posizioni dei codoni indicate e pu essere utile come determinazione basale del genotipo virale. Le caratteristiche di rendimento delle mutazioni supplementari non sono state stabilite. Le mutazioni supplementari sono specificate per il gene della proteasi o per il gene della trascrittasi inversa.
Chiave di notazione
Le pagine tre e quattro del rapporto contengono la chiave colore e lelenco delle mutazioni della resistenza dellHIV-1 utilizzato nellalgoritmo per la determinazione della resistenza farmacologica.
Pagina 38 di 68
Algoritmo
Linterpretazione basata su un algoritmo proprietario che determina limpatto relativo delle mutazioni nelle strutture di lettura aperte della trascrittasi inversa e della proteasi sullo sviluppo della resistenza ai farmaci antiretrovirali. Le mutazioni incluse nellalgoritmo risultavano conformi ai punti seguenti: Mutazioni definite di comprovata utilit clinica dalla FDA.28 Mutazioni elencate come primarie e secondarie nelle raccomandazioni della International AIDS Society-USA.13,30 Questo elenco viene aggiornato periodicamente e pu essere consultato sul sito web della IAS-USA ( http://www.iasusa.org/). Mutazioni elencate negli studi GART14 e VIRADAPT15 come predittive di resistenza farmacologica. Raccomandazioni del Resistance Collaborative Group (gruppo collaborativo sulla resistenza) basate sullanalisi di vari studi prospettici e retrospettivi.31 Mutazioni supplementari sono state inserite nellalgoritmo di interpretazione basato su regole in recenti rapporti pubblicati in letteratura.8,16,32-50 Il rapporto comprende sezioni separate per gli inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa (NRTI), gli inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa (NNRTI) e gli inibitori della proteasi (PI). Le mutazioni usate per determinare la resistenza sono elencate schematicamente nel rapporto accanto al nome del farmaco.
stato sviluppato un algoritmo per considerare tutte le possibili combinazioni di mutazioni che possono conferire resistenza a un dato farmaco. Abbiamo utilizzato un sistema di punteggio numerico, strutturato in modo tale che alle eventuali combinazioni di mutazioni rilevate nel dosaggio, di cui fosse nota la capacit di generare resistenza, fosse assegnato un livello di evidenza di resistenza. Per determinare il livello di evidenza di resistenza a un dato farmaco, i punteggi delle mutazioni presenti e pertinenti a quel farmaco vengono sommati, determinando un punteggio totale per quel farmaco. Per ogni farmaco, la particolare posizione di un codone viene conteggiata una sola volta, utilizzando il punteggio di mutazioni massimo fra le mutazioni presenti in quella posizione del codone. Un punteggio totale basso (inferiore a 0,5) viene interpretato come insufficiente per la resistenza. Un punteggio totale medio (tra 0,5 e 1) viene interpretato come possibile resistenza. Un punteggio totale elevato (da 1,0 in su) viene interpretato come resistenza. La tabella seguente mostra in che modo il punteggio totale viene rapportato al punteggio del livello di evidenza di resistenza. Rapporto tra punteggio totale e livello di evidenza di resistenza
Punteggio totale 1,0 da 0,5 a <1,0 <0,5 Livello di evidenza di resistenza Resistenza Possibile resistenza Nessuna
Per assegnare i punteggi alle mutazioni specifiche abbiamo utilizzato i seguenti criteri: Alle mutazioni che contribuiscono maggiormente allo sviluppo della resistenza, generalmente quelle che conferiscono resistenza quando presenti come singola mutazione, stato assegnato il punteggio massimo (1,0). Analogamente, queste mutazioni sono state associate anche ai massimi aumenti di IC50 (concentrazione inibitoria del 50%) quando introdotte in ceppi wild-type (WT) di HIV-1 e sono state chiaramente associate a resistenza in molteplici studi clinici. Alle mutazioni con effetti meno pronunciati, e che richiedono laccumulo di due o pi mutazioni per conferire resistenza, sono stati assegnati punteggi intermedi. Per esempio, considerando la resistenza allAZT, abbiamo assegnato punteggi di 0,625 alla mutazione T215F/Y , di 0,375 alla mutazione M41L e di 0,25 alla mutazione K70R. La sostituzione T215F/Y produce un aumento di IC50 di 12-16 volte per lAZT mentre le mutazioni M41L o K70R causano un aumento di 3-5 volte. La combinazione di M41L e K70R produce un aumento di IC50 di 9 volte. Alle mutazioni con il minore impatto sullo sviluppo della resistenza, ma osservate in pazienti trattati con il farmaco, e con effetti limitati sui valori di IC50 in coltura, sono stati assegnati punteggi bassi. Alcune di queste mutazioni possono rafforzare gli effetti delle mutazioni principali. I alcuni casi le mutazioni multiple di questa categoria, associate a mutazioni con punteggi intermedi, potrebbero produrre resistenza. Alle mutazioni che causano un aumento della suscettibilit ai farmaci sono stati assegnati punteggi negativi basati sul livello di suscettibilit.
Per ogni farmaco, le tabelle alle pagine seguenti elencano tutte le mutazioni relative alla resistenza al farmaco e il punteggio assegnato per ogni mutazione.
Pagina 39 di 68
Tabelle delle mutazioni

A. Resistenza agli NRTI
A1. Zidovudina, AZT, AZT RETROVIR
A2. Stavudina, d4T, ZERIT d4T Mutazione

T69ins
A3. Didanosina, ddI, VIDEX ddI
Punteggio
1,2 1,2 1,0 0,7 0,625 0,5 0,375 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 0,0625 0,0625 0,0625 0,2
Mutazione
T69ins L74I/V Q151M K65R Q151L M41L K65N T69D/N V75A/M/T V75S L210W T215C/D/E/F/I/S/Y/V D67E/G/N K70E V75I F77L F116Y K219E/N/Q/R E44D A62V V118I
Punteggio
1,0 1,0 1,0 0,75 0,5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,0625 0,0625 0,0625
Mutazione
T69ins Q151M Q151L T215F/Y T215C/D/E/I/S/V M41L D67E/G/N K70R L210W K219E/N/Q/R V75I F77L F116Y E44D A62V V118I K65N M184I/V K65R
Punteggio
1,2 1,2 0,7 0,625 0,5 0,375 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 0,0625 0,0625 0,0625 0,125 0,2 0,25
Q151M V75A/M/S/T Q151L T215F/Y T215C/D/E/I/S/V M41L K65R D67E/G/N K70R L210W K219E/N/Q/R V75I F77L F116Y E44D A62V V118I M184I/V
Pagina 40 di 68
A4. Lamivudina, 3TC, EPIVIR, emtricitabina, FTC, EMTRIVA 3TC & FTC Mutazione
M184I/V K65R T69ins K65N Q151M T215F/Y E44D K70E V75I F77L F116Y V118I Q151L A62V M41L D67E/G/N K70R L210W K219E/N/Q/R
A5. Abacavir, ABC, ZIAGEN ABC Mutazione

T69ins
A6. Tenofovir, TDF, VIREAD TDF
Punteggio
1,0
Punteggio
1,0 1,0 0,75 0,75 0,5 0,5 0,3 0,25 0,25 0,25 0,25 0,2 0,125 0,125 0,125 0,125 0,1 0,0625 0,0625 0,0625
Mutazione
T69ins K65R Q151M M41L T215Y L210W K65N K70E Y115F T215C/D/E/I/S/V D67E/G/N K70R V75I F77L F116Y Q151L T215F K219E/N/Q/R E44D A62V V118I M184I/V
Punteggio
1,2 1,0 0,375 0,35 0,35 0,3 0,25 0,25 0,2 0,15 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,0625 0,0625 0,0625 0,2
Q151M 0,5 K65R 0,5 L74I/V 0,25 Y115F 0,25 Q151L 0,25 T215F/Y 0,125 M41L 0,125 K65N 0,125 M184I/V 0,125 T215C/D/E/I/S/V 0,125 L210W 0,125 K70E 0,125 V75I 0,0625 F77L 0,05 F116Y 0,05 D67E/G/N 0,05 E44D 0,05 A62V 0,05 V118I
Pagina 41 di 68
B. Resistenza agli NNRTI

B1. Nevirapina, NVP, VIRAMUNE NVP Mutazione
K103H/N/S/T V106A/M Y181C/I/V Y188C/H/L G190A/C/E/Q/S/T/V A98G L100I K101E/P V108I E138K V179D/E/F P225H F227C/L M230L K238T Y318F K101Q K103R
B2. Delavirdina, DLV, RESCRIPTOR DLV Mutazione Punteggio

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25
B3. Efavirenz, EFV, SUSTIVA EFV Mutazione

K103H/N/S/T V106M Y188L G190C/E/Q/S/T/V L100I K101P/E V106A Y181C/I/V Y188C/H G190A P225H M230L A98G K101Q K103R V108I E138K V179D/E/F F227C K238T Y318F
Punteggio
1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Punteggio
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25
K103H/N/S/T V106M Y181C/I/V Y188L P236L Y318F A98G L100I K101E/P V106A V108I E138K V179D/E/F Y188C/H G190E/Q P225H F227C M230L K238T K101Q K103R
Pagina 42 di 68
B4. Etravirina, ETR, INTELENCE ETR Mutazione

V179F Y181C/I/V L100I K101E/P E138K Y188L G190C/E/Q/S/T/V M230L A98G K103H/N/S/T V106A/M V179D/E Y188C/H G190A P225H F227C/L
C. Resistenza agli inibitori della proteasi

C1. Indinavir, IDV, CRIXIVAN
C2. Saquinavir, SQV, FORTOVASE, INVIRASE SQV
Punteggio
0,5 0,5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125
IDV Mutazione Mutazione

V82A/F/M/S/T I84A/C/V L90M V32I M46I/L I47A G48V I54A/L/M/S/T/V N88S L24I M46V I47V F53L G73A/C/S/T L76V N88D/T L10F/I/R/V A71I/T/V I50L
Punteggio
1,0 0,5 0,5 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125
Punteggio
G48V 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,0625 0,0625 0,125 I84A/C/V L90M I54A/L/M/S/T/V G73A/C/S/T V82A/F/S/T L10F/I/R/V L24I M46I/L/V F53L A71I/T/V I50L L76V
Pagina 43 di 68
C3. Nelfinavir, NFV, VIRACEPT NFV Mutazione

D30N N88D/S/T L90M L23I M46I/L/V G48V I54A/L/M/S/T/V V82A/F/S/T I84A/C/V I47A L10F/I/R/V L24I A71I/T/V G73A/C/S/T I50L
C4. Amprenavir, APV, AGENERASE, Fosamprenavir, FOS, LEXIVA APV/FOS
C5. Lopinavir/Ritonavir, LPV/r, KALETRA LPV/r Mutazione

I47A
Punteggio
1,0
Mutazione
I50V
Punteggio
1,0
Punteggio
1,0 0,5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,0625 0,0625 0,125
1,0 I47A 1,0 I54L/M 0,5 I84A/C/V 0,5 V32I 0,5 L33F 0,5 M46I/L 0,5 I47V 0,5 L76V 0,25 V82A/F/S/T 0,125 L90M 0,125 L10F/I/R/V 0,125 M46V 0,125 I54A/S/T/V 0,125 A71I/T/V G73A/C/S/T I50L N88S 0,125 0,125 0,125 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5
I50V V32I M46I/L I54A/L/M/S/T/V V82A/F/S/T I84A/C/V L24I L33F M46V I47V G48V F53L G73A/C/S/T L76V 0,125 L90M 0,125 L10F/I/R/V 0,125 A71I/T/V 0,125 I50L
Pagina 44 di 68
C6. Atazanavir, ATV, REYATAZ ATV Mutazione

I50L N88S I84A/C/V V32I M46I/L I47A I54A/L/M/S/T/V V82A/F/S/T N88D/T L90M L10F/I/R/V M46V G48V A71I/T/V G73A/C/S/T L24I L33F F53L L76V
C7. Tipranavir, TPV, APTIVUS TPV
C8. Darunavir, DRV, PREZISTA DRV
Punteggio
1,0 1,0 0,5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,0625 0,0625 0,0625 0,125
Mutazione
V82L V82T I84A/C/V L33F M46I/L I47A/V I54A/V V82F/S V32I E35G K43T M46V I54L/M/S/T Q58E G73A/C/S/T T74P N83D L90M L10F/I/R/V A71I/T/V V82A I50L/V
Punteggio
0,5 0,375 0,375 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,0625 0,0625 0,0625 0,125
Mutazione
I50V V32I I47A/V I54L/M L76V I84A/V V11I L33F G73A/C/S/T I84C L89V M46I/L/V I54A/S/T/V V82A/F/L/M/S/T L90M I50L
Punteggio
0,375 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,0625 0,0625 0,0625 0,0625 -0,125
Pagina 45 di 68
Messaggi di errore del software

Messaggio
A unique non-blank user name must be used. Please select a different user name and try again. (Deve essere usato un nome utente unico e il campo non deve essere vuoto. Selezionare un nome utente diverso e riprovare.) Current Password incorrect. Check Caps Lock and try again. (Password attuale non corretta. Controllare il tasto Maiusc e riprovare.) Default Password incorrect. Check Caps Lock and try again. (Password predefinita non corretta. Controllare il tasto Maiusc e riprovare.) New passwords must be the same. Try entering the passwords again. (Le nuove password devono essere uguali. Provare ad inserire nuovamente le password.)
Messaggio
Selected file is invalid (Il file selezionato non valido).
Spiegazione
stato selezionato un file di campioni (ab1) mentre il software richiedeva un file di progetto (vpr). [File > Open Project + Find] (file > apri progetto + trova) Oppure stato selezionato un file di progetto (vpr) mentre il software richiedeva un file di campioni (ab1). [File > New Project/File > Open Project + New] (file > nuovo progetto/file > apri progetto + nuovo) Oppure Il tipo di file selezionato nella finestra di dialogo Open (apri) non corretto. Fare clic su OK e selezionare il file corretto richiesto dal software. stato fatto un tentativo di generare un rapporto farmacologico, un file FASTA e/o un rapporto XML quando la sequenza di riferimento non copre larea compresa tra il codone della proteasi 9 e il codone della RT 320. Il rapporto non pu essere generato senza copertura dellarea compresa tra il codone 9 della proteasi e il codone 320 della RT. stato fatto un tentativo di salvare un nuovo rapporto con il nome di un file gi esistente e aperto in MS Word (o in qualsiasi altro programma che blocca i file). Selezionare OK, chiudere il file e salvarlo di nuovo.
Spiegazione
stato selezionato il pulsante Add User (aggiungi utente) nella finestra Administrator Access (accesso dellamministratore) durante il tentativo di creare lutente gi esistente. Selezionare OK e digitare un nome utente unico.
Nella finestra User Access (accesso utente), la password attuale non corretta o non stata inserita. Selezionare OK e digitare la password attuale corretta.
La password predefinita nella finestra di dialogo Change Administrator Password (cambia password dellamministratore), al primo avvio del software, non corretta. Selezionare OK e digitare la password predefinita corretta (hiv1). Nella finestra di dialogo Change Administrator Password (cambia la password dellamministratore) o nella finestra di dialogo User Access (accesso utente) stata inserita una nuova password valida, ma la password di conferma non corrisponde. Selezionare OK e digitare nel campo Confirmatory password (password di conferma) la stessa password inserita nel campo New password (nuova password). La nuova password inserita nella finestra di dialogo Change Administrator Password (cambia la password dellamministratore), nella finestra di dialogo Administrator Access (accesso dellamministratore) o nella finestra di dialogo User Access (accesso utente) non ha un numero di caratteri sufficiente. Selezionare OK e digitare una password contenente da 6 a 14 caratteri. Nella finestra di dialogo Administrator Access (accesso dellamministratore) stata inserita una nuova password valida, ma la password di conferma non corrisponde. Oppure stato selezionato il pulsante Add User (aggiungi utente) nella finestra di dialogo Administrator Access (accesso dellamministratore) con un nome utente valido e password di conferma non corrispondente. Selezionare OK e digitare nel campo Confirmatory password (password di conferma) la stessa password inserita nel campo New password (nuova password). Nella finestra di dialogo User Login (login utente) sono stati inseriti nome utente o password non corretti. Selezionare OK e digitare il nome utente e la password corretti.
I dati della sequenza non coprono porzioni essenziali della sequenza di riferimento. ViroSeq will not generate output (ViroSeq non pu generare loutput). The file is in use by another application. You must close the file in that application before ViroSeq can output into that file. (File in uso da unaltra applicazione. necessario chiudere il file in quellapplicazione perch ViroSeq possa elaborare il file.)
Password length should be 6 to 14 characters. Please choose a longer password and try again. (La password deve contenere da 6 a 14 caratteri. Scegliere una password pi lunga e riprovare.) The passwords entered were not the same. Please enter the exact same password twice. (Le password inserite non sono uguali. Inserire esattamente la stessa password due volte.)
Unable to assemble files in stato fatto un tentativo di creare un progetto con meno di due file (impossibile assemblare file in): di segmenti con lo stesso ID del campione. <cartella> Oppure I file di campioni selezionati per essere assemblati nella finestra di dialogo Open (apri) sono danneggiati. Selezionare OK e controllare che due o pi file ab1 non danneggiati con lo stesso ID del campione siano presenti nella cartella di lavoro. Unable to load project (impossibile caricare il progetto): <nome file> Il sistema operativo della piattaforma non riesce ad aprire il file del progetto (vpr), a causa di memoria insufficiente o di disco danneggiato. Oppure stato fatto un tentativo di aprire un file di progetto danneggiato o incompleto. Selezionare OK e controllare che il file vpr non sia danneggiato o di sola lettura. stato fatto un tentativo di generare un rapporto farmacologico, un file FASTA e/o un rapporto XML quando nella sequenza di consenso sono presenti delezioni/inserzioni con slittamento del modulo di lettura/inserzioni multiple. Il rapporto di resistenza farmacologica, il file FASTA e/o il rapporto XML non possono essere generati se nella sequenza vengono rilevati delezioni/inserzioni con slittamento del modulo di lettura/inserzioni multiple.
User Name or password incorrect. Check Caps Lock and try again. (Nome utente o password non corretti. Controllare il tasto Maiusc e riprovare.) Launch failed. A file is missing or damaged. Please re-install the software. If the problem persists, please contact technical support. (Avvio non riuscito. File mancante o danneggiato. Reinstallare il software. Se il problema persiste, contattare lassistenza tecnica.) One or more q or ?s were detected in the consensus sequence. ViroSeq will not generate output. (Uno o pi q or ? sono stati rilevati nella sequenza di consenso. ViroSeq non pu generare loutput.)
Una cartella o file di sistema di ViroSeq risultano mancanti o danneggiati. Selezionare OK e reinstallare il software ViroSeq.
ViroSeq detected a deletion, frame shifting insertion, and/or multiple insertions. The software has not been validated for such mutations. Output will not be created. (ViroSeq ha individuato una delezione, uninserzione con slittamento del modulo di lettura e/o inserzioni multiple. Il software non stato autorizzato per questo tipo di mutazioni. Loutput non sar creato.) ViroSeq detected that an incorrect version of Java Runtime Environment [JRE] is being used. Please refer to installation instructions for installing the appropriate JRE. (ViroSeq ha rilevato lutilizzo di una versione non corretta di Java Runtime Environment [JRE]. Consultare le istruzioni di installazione per installare il JRE adeguato.) ViroSeq software is not supported on Microsoft NT operating system. (Il software Viroseq non supportato dal sistema operativo Microsoft NT)
installata la versione errata di JRE Selezionare OK e copiare dal CD la cartella JRE corretta. Avviare il software ViroSeq. Windows Platform/JRE version (piattaforma Windows/ versione JRE) Windows XP & 2000/JRE 1.4.2_10
stato fatto un tentativo di generare un rapporto farmacologico, un file FASTA e/o un rapporto XML dopo aver modificato la base con ? (mediante tastiera) o q (facendo clic sulla tavolozza di modifica). Il rapporto di resistenza farmacologica, il file FASTA e/o il rapporto XML non possono essere generati se nella sequenza vengono rilevati uno o pi q o ?.
stato fatto un tentativo di installare ViroSeq v2.8 su un sistema operativo Windows NT.
Pagina 46 di 68
Software ViroSeq e risultati

Lutilizzo del software ViroSeq consentito solo a personale addestrato. Laccuratezza e laffidabilit dei risultati dipendono dalla buona qualit della sequenza. Dati rumorosi e livelli elevati del rumore di fondo possono interferire con lidentificazione esatta delle basi. La comprensione e lutilizzo delle istruzioni di modifica contenute in questo documento contribuiscono a unidentificazione pi precisa delle basi e possono contribuire a identificare mutazioni che altrimenti potrebbero non essere individuate. Nel codone wild-type sono necessarie modifiche multiple dei nucleotidi per generare mutazioni come: V82T, V82S, T215Y, ecc. In questi casi, quando sono presenti miscele di wild-type e di mutanti, il rapporto del software indica la presenza di due aminoacidi, ma riporta anche gli aminoacidi corrispondenti ad altre possibili combinazioni di codoni. Per esempio, una miscela di Val (GTC) e Ser (TCC) al codone 82 produce un rapporto che indica la presenza di Val, Ser, Ala (GCC) e Phe (TTC) V, S, A, ed F. Il limite di non definire i legami dei nucleotidi di un stesso stampo comune a tutte le metodologie per il sequenziamento di una popolazione.
Successo della genotipizzazione

Il successo della genotipizzazione viene determinato qualitativamente durante lanalisi del software ViroSeq. Per genotipizzare con successo un campione, necessario che sei dei sette primer del sistema ViroSeq siano assemblati in un progetto per generare la sequenza di consenso (A o D, B, C, F, G, H). Inoltre, necessario effettuare una valutazione della qualit della sequenza per garantire laffidabilit e laccuratezza dei risultati. Un rumore di fondo elevato pu interferire con la determinazione delle miscele virali. Il ViroSeq Software v2.8 riconosce una miscela virale quando presente un picco secondario pari almeno al 30% del picco primario. I risultati della genotipizzazione previsti per i controlli ViroSeq sono i seguenti:
Controllo positivo Valore previsto Tutti i sette primer si assemblano Nessuna mutazione della resistenza farmacologica Due nuove mutazioni supplementari Proteasi V3I RT L214F Nessuna base mista Controllo negativo Non utilizzare un controllo negativo per monitorare il successo o il fallimento della genotipizzazione. I controlli negativi, che non contengono DNA, possono effettivamente contribuire al fallimento del campione a causa degli effetti elettrici avversi che i capillari vuoti esercitano sugli strumenti di sequenziamento basati sui capillari.
Conformemente al FDA Guidance document for HIV-1 genotyping (documento guida della FDA sulla genotipizzazione dellHIV-1), gli studi analitici che utilizzano il ViroSeq HIV-1 Genotyping System non sono stati completati al limite di rilevamento per le seguenti mutazioni: Gene
RT
Mutazione
E44D, K65N, D67E/G, D67N, T69N, K70E, L74I, V75A/I/M/S/T, A98G, L100I, K101E/P/Q, K103H/S/T/R, V106M, V108I, Y115F, E138K, Q151L, V179D/E/F, Y181I/V, Y188H, G190A/C/E/Q/S/T/V, T215C/D/E/F/I/S/Y/V, K219N/R, P225H, F227L/C, M230L, P236L, K238T, Y318F L10F/V, V11I, L23I, L24I, V32I, L33F, E35G, K43T, M46L/V, I47A/V, I50L, F53L, I54A/L/M/S/T, Q58E, A71I/T, G73A/C/S/T, T74P, L76V, V82L, N83D, I84A/C, N88D/S/T, L89V
Proteasi
Eseguire un esame visivo qualitativo degli elettroferogrammi per valutare la qualit della sequenza e il grado di rumore di fondo nel controllo. Esaminare i dati dellanalisi per unaccurata calibrazione dello strumento. Se lanalisi presenta picchi in salita coerenti e proporzionali (ovvero picchi pi piccoli di diverso colore) eseguire una nuova calibrazione spettrale (vedere il paragrafo Esecuzione di una calibrazione spettrale).
LHIV-1 8E5 Positive Control (controllo positivo HIV-1 8E5) un virus HIV-1 non infettivo e dovrebbe contenere un rumore di fondo molto ridotto o nullo. Qualsiasi mutazione diversa da quelle indicate sopra pu significare un errore di modifica o problemi relativi alla qualit della sequenza. Per determinare la causa dellerrore necessario un confronto con i risultati degli altri campioni. Ad esempio: Se i picchi del rumore di fondo sono responsabili dellerrore nel controllo, e se questi picchi vengono rilevati in ogni campione, e se tutti i campioni presentano un rumore dello stesso colore per una data base, eseguire una nuova calibrazione spettrale (vedere Esecuzione di una calibrazione spettrale); tutti i campioni e i controlli devono essere ripetuti da Reverse Transcription (trascrittasi inversa) fino a ViroSeq Software Analysis (analisi del software ViroSeq). Se i colori dei picchi del rumore di fondo sono casuali, tutti i campioni e i controlli devono essere ripetuti da Reverse Transcription (trascrittasi inversa) fino a ViroSeq Software Analysis (analisi del software ViroSeq).
Se si verificano errori ripetuti, contattare lassistenza tecnica di Abbott Molecular. Nota. LHIV-1 8E5 Positive Control (controllo positivo HIV-1 8E5) presenta uninserzione di una singola base al codone 219 del gene della RT che rende il virus non infettivo. La mutazione 219 non viene visualizzata durante la modifica, n nel rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali, perch si tratta di una mutazione con slittamento del modulo di lettura che non presente nei campioni virali clinici.
Pagina 47 di 68
Sezione 5: Caratteristiche di rendimento

In questa sezione:
Rendimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Tabella 1. Elenco dei rendimenti completamente verificati al limite di rilevamento (LOD) di 2.000 copie/mL.
Nella trascrittasi inversa M41L F116Y K219E A62V V118I K219Q Nella proteasi L10I K20R V82T D30N V82A M36I I84V M46I L90M G48V I54V L63P K65R Q151M T69D Y181C K70R M184V L74V L210W F77L T215Y K103N T215F
Rendimento
Le caratteristiche di rendimento del ViroSeq HIV-1 Genotyping System sono state valutate utilizzando campioni virali e clinici contenenti mutazioni definite che conferiscono resistenza virale alla terapia antiretrovirale. I campioni clinici utilizzati nellanalisi sono stati ottenuti sia prospettivamente, sia retrospettivamente, da adulti, neonati e pazienti pediatrici (da 4 mesi a 17 anni di et) in terapia antiretrovirale. I risultati presentati definiscono la sensibilit, la specificit, la riproducibilit e la correttezza del dosaggio, con riferimento alla precisione di rilevamento di mutazioni specifiche nei geni RT e proteasi dellHIV-1 che conferiscono resistenza ai farmaci approvati. Negli studi sono stati utilizzati anche prelievi clinici per determinare le percentuali di successo del sequenziamento, nonch la capacit di rilevare mutazioni nelle miscele e di definire lutilit clinica. Sono state valutate le funzioni del ViroSeq HIV-1 Genotyping System che consentono di rilevare le mutazioni specifiche in grado di conferire resistenza virale in un campione del paziente, di valutare le stime di resistenza farmacologica e di generare un Antiretroviral Drug Resistance Report (rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali) finale che si attenga precisamente a un algoritmo di interpretazione basato su regole. Luso del ViroSeq HIV-1 Genotyping System migliorer la capacit dei medici di valutare lefficacia dei farmaci e di definire strategie terapeutiche personalizzate basate anche su altri risultati clinici come presentazione clinica, marker di laboratorio e anamnesi di terapia antiretrovirale. La tabella 1 contiene un elenco di mutazioni che sono state completamente verificate a 2.000 copie di RNA/mL conformemente al documento della FDA Guidance for Industry: Class II Special Controls Guidance Document: In Vitro HIV Drug Resistance Genotype Assay. (linee guida per il settore: documenti guida sui controlli speciali: analisi del genotipo di resistenza farmacologica dellHIV in vitro). La tabella 2 contiene un elenco di mutazioni che sono state completamente verificate a 1.000 copie di RNA/mL conformemente al documento della FDA Guidance for Industry: Class II Special Controls Guidance Document: In Vitro HIV Drug Resistance Genotype Assay. (linee guida per il settore: documento guida sui controlli speciali: analisi del genotipo di resistenza farmacologica dell'HIV in vitro). La tabella 3 contiene un elenco delle mutazioni che sono utilizzate nellalgoritmo basato su regole del sistema ViroSeq. La tabella 4 contiene un elenco di farmaci per i quali stata valutata la resistenza farmacologica nel ViroSeq System Antiretroviral Drug Resistance Report (rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali del sistema ViroSeq).
A71V
Tabella 2. Elenco dei rendimenti completamente verificati ad un LOD di 1.000 copie/mL

Nella trascrittasi inversa M41L Y181C A62V M184V K65R L210W L74V T215F F77L K219Q K103N F116Y V118I
Nella proteasi L10I V82T D30N I84V M36I L90M M46I G48V I54V L63P A71V
Tabella 3. Le mutazioni utilizzate nellalgoritmo di interpretazione basato su regole per valutare la resistenza virale includono:
Nella trascrittasi inversa M41L* T69D* V75M K101Q V108I V179E Y188H G190V T215V F227L E44D T69N V75S K103N* Y115F V179F Y188L L210W* T215Y* M230L A62V* K70E V75T K103H F116Y* Y181C* G190A T215C K219E* P236L K65N K70R* F77L* K103R V118I* Y181I G190C T215D K219N K238T K65R* L74I A98G K103S E138K Y181V G190E T215E K219R Y318F D67E L74V* L100I K103T Q151L M184I G190Q T215F* K219Q* D67G V75A K101E V106A Q151M* M184V* G190S T215I P225H D67N V75I K101P V106M V179D Y188C G190T T215S F227C
Mutazione per inserzione al codone 69 (inserzione 69)
Nella proteasi L10F V32I I47V I54S G73C V82M N88S L10I* L33F G48V* I54T G73S V82S N88T L10R E35G I50L I54V* G73T V82T* L89V L10V K43T I50V Q58E T74P N83D L90M* * Mutazioni completamente verificate V11I M46I* F53L A71I L76V I84A L23I M46L I54A A71T V82A* I84C L24I M46V I54L A71V* V82F 184V* D30N* I47A I54M G73A V82L N88D
Elenco dei rendimenti completamente verificati

Come richiesto dalla FDA nel Guidance for Industry: Class II Special Controls Guidance Document: In Vitro HIV Drug Resistance Genotype Assay. (linee guida per il settore: documento guida sui controlli speciali: analisi del genotipo di resistenza farmacologica dell'HIV in vitro), vengono qui elencate le mutazioni che hanno soddisfatto il requisito sensibilit superiore al 90% in entrambe le tipologie di studio seguenti: studi analitici sui rendimenti al limite di rilevamento (2.000 copie/mL) con il 40% di campioni mutanti studi sulla validit clinica con un pannello di 50 isolati clinici (carica virale = 1.800-10.500)
Le mutazioni M184I, V82F e V82S sono state rilevate in campioni clinici facenti parte dello studio sulla validit clinica con carica virale elevata (carica virale maggiore di 10.500) e non sono incluse nellelenco verificato riportato in Tabella 1.
Pagina 48 di 68
Tabella 4. Il ViroSeq Antiretroviral Drug Resistance Report (rapporto sulla resistenza dei farmaci antiretrovirali di ViroSeq) segnala la presenza di resistenza virale nei seguenti farmaci:
Inibitori nucleosidici della RT a EPIVIR/lamivudina/3TC EMTRIVA/emtricitabina/FTC RETROVIR/zidovudina/AZT VIDEX /didanosina/ddI VIREAD/tenofovir/TDF ZERIT/stavudina/d4T ZIAGEN/abacavir/ABC
Tabella 5. Mutazioni rilevate con sensibilit del 100% nel 100% dei campioni mutanti a 1.000 copie/mL
Nella trascrittasi inversa
Inibitori non nucleosidici della RT
Inibitori della proteasi
M41L L74V F116Y L210W
A62V V75I V118I T215F/Y
K65R F77L Q151M K219E/Q
D67N K103N Y181C T69S + SS [mutazione per inserzione al codone 69 (inserzione 69)]
T69D V106A M184I/V
K70R Y115F Y188C/L
INTELENCE/etravirina/ETR AGENERASE/amprenavir/ APV RESCRIPTOR/delavirdina/ DLV SUSTIVA/efavirenz/EFV VIRAMUNE /nevirapina/NVP
APTIVUS/tipranavir/TPV CRIXIVAN/indinavir/IDV FORTOVASE/INVIRASE/ saquinavir/SQV KALETRA/lopinavir/ritonavir/ LPV/r LEXIVA/fosamprenavir/FOS PREZISTA/darunavir/DRV REYATAZ/atazanavir/ATV VIRACEPT/nelfinavir/NFV
Nella proteasi L10I/R I50V L90M K20R I54V D30N L63P M36I A71V M46I V82A/F/S/T G48V I84V
Il rapporto valuta anche la resistenza multinucleosidica dovuta alla presenza del complesso Q151M o dellinserzione 69.13 Dal rapporto si deduce anche la resistenza a COMBIVIR e TRIZIVIR.
Sensibilit analitica
Per definire la sensibilit analitica sono stati utilizzati due parametri. Determinazione della carica virale minima dellHIV-1 necessaria per rilevare le mutazioni in modo affidabile. Determinazione della quantit minima di virus mutante in una miscela, necessaria per rilevare le mutazioni in modo affidabile.
Quando una mutazione era presente in una miscela 40/60 mutante/wild-type, la sensibilit aggregata risultata maggiore di 97% e la specificit aggregata di rilevamento risultata maggiore del 99,9% per tutte le mutazioni a tutte le cariche virali maggiori di 1.000 copie/mL. Con una carica virale di sole 2.000 copie/mL e con una miscela 40/60 mutante/wild-type, la sensibilit aggregata risultata del 98,1% (4 falsi negativi [FN]/206) e la specificit aggregata del 99,9% (1 falso positivo [FP]/1422). Con una carica virale di sole 1.000 copie/mL e con una miscela 40/60 mutante/wild-type, la sensibilit aggregata risultata del 92,7% (15 FN/206) e la specificit aggregata del 99,9% (1 FP/1422). La Tabella 6 (trascrittasi inversa) e la Tabella 7 (proteasi) elencano le sensibilit delle singole mutazioni in una miscela mutante al 40% con cariche virali uguali o superiori a 1.000 copie/mL. Inoltre, ad ogni mutazione stato assegnato un valore limite di rilevamento (LOD).
Limite di rilevamento
Rilevamento delle mutazioni
Il sistema ViroSeq stato in grado di rilevare con precisione le mutazioni specifiche di resistenza farmacologica elencate di seguito a 1.000 copie/mL nel 100% di campioni mutanti e a 2.000 copie/mL nel 40% di campioni mutanti. Descrizione dello studio. Per questi studi, il limite di rilevamento definito come la carica virale minima con una sensibilit del 100%. Questo studio ha utilizzato un singolo lotto di reagenti. Dodici virus ricombinanti sono stati formulati in plasma negativo come 100% puri e 40/60 mutanti/wild-type.
Tabella 6. Sensibilit di rilevamento delle mutazioni della trascrittasi inversa a livello del 40% di miscela
Mutazione della trascrittasi inversa M41L A62V K65R Sensibilit a >1.000 copie/mL (N. di veri positivi) 98,8 (82) 100 (41) 100 (13) 91,6 (76) Sensibilit a >2.000 copie/mL (N. di veri positivi) 100 (71) 100 (35) 100 (11) 93 (66) In uno studio successivo su tre lotti, per un lotto diverso stata rilevata una sensibilit dell83% a 2.000 copie/mL, negli altri due lotti stata determinata una sensibilit del 100%. 100 (12) In uno studio successivo su tre lotti, per un lotto diverso stata rilevata una sensibilit dell50% a 2.000 copie/mL, negli altri due lotti stata determinata una sensibilit del 100%. 100 (47) 100 (12) 97,1 (34) LOD attestato (commenti) 2.000 1.000 1.000 Non determinato (1)
Risultati
Quando una mutazione era presente nel 100% della popolazione virale, il limite di rilevamento per tutte le mutazioni stato di 1.000 copie/mL ovvero una sensibilit del 100% e una specificit del 100% sono state ottenute a 1.000 copie/mL per tutte le mutazioni seguenti. In studi successivi, a 2.000 copie/mL in una miscela 40/60, la sensibilit a D67N e T69D risultata rispettivamente dell83% e del 50% per uno su tre lotti di reagenti.
D67N
T69D
92,9 (13)
2.000
K70R L74V V75I
98,2 (54) 100 (14) 97,6 (40)
2.000 1.000 6.000 (2)
Pagina 49 di 68
Tabella 6. Sensibilit di rilevamento delle mutazioni della trascrittasi inversa a livello del 40% di miscela (continua)
Mutazione della trascrittasi inversa F77L K103N V106A Y115F F116Y V118I Q151M Y181C M184I M184V Y188C Y188L L210W T215F T215Y K219E K219Q Sensibilit a >1.000 copie/mL (N. di veri positivi) 100 (41) 98,6 (68) 100 (25) 85,2 (23) 100 (41) 100 (28) 97,6 (40) 100 (54) 100 (14) 98,9 (92) 100 (14) 100 (13) 100 (53) 98,8 (82) 95,8 (23) 78,6 (11) 97,6 (40) Sensibilit a >2.000 copie/mL (N. di veri positivi) 100 (35) 100 (59) 100 (21) 95,7 (22) 100 (35) 100 (24) 100 (35) 100 (46) 100 (12) 98,7 (78) 100 (12) 100 (11) 100 (45) 100 (71) 100 (20) 83,3 (10) 97,1 (34) LOD attestato (commenti) 1.000
Tabella 7. Sensibilit di rilevamento delle mutazioni della proteasi a livello del 40% di miscela
Mutazione della proteasi Sensibilit a >1.000 copie/mL (N. di veri positivi) 100 (12) 100 (26) 91,7 (11) 96,4 (27) 100 (13) 85,7 (12) 100 (27) 100 (26) 98,8 (79) Sensibilit a >2.000 copie/mL (N. di veri positivi) 100 (10) 100 (22) 90,0 (9) 100 (24) 100 (11) 83,3 (10) 100 (23) 100 (22) 98,5 (67) LOD attestato (commenti)
I54V 2.000 1.000 6.000 (3) 1.000 V82A 1.000 2.000 1.000 1.000 V82T 1.000 (4) I84V 1.000 1.000 1.000 2.000 2.000 2.000 (5) 1.000 (6) L90M V82F L63P
1.000
1.000
A71V
1.000 (8)
2.000
1.000
V82S
1.000 (9)
1.000
1.000
1.000 (10)
Commenti: 1. La mutazione D67N della RT una mutazione che lanalisi rileva con una minore sensibilit. Sono stati ottenuti sette risultati FN su 83 rilevamenti con cariche virali >1.000 copie/mL. D67N stata rilevata con sensibilit del 100% in cinque dei pannelli virali (MC1, MC2, MC3, MC4, e MC5). Tuttavia, per uno dei componenti del pannello (GT1a) sono stati ottenuti sette risultati FN. 2. Il LOD attestato di 6.000 copie/mL per la mutazione V75I della RT (determinazione di 6 veri positivi). A partire da 2.000 copie/mL in su, stato ottenuto un FN su 42 rilevamenti previsti. A sole 1.000 copie/mL la sensibilit risultata del 100%. 3. Il LOD attestato di 6.000 copie/mL per la mutazione Y115F della RT (determinazione di 4 veri positivi). La sensibilit risultata del 100% con cariche virali di 6.000 copie/mL e superiori; a 2.000 copie/mL stato ottenuto un FN su quattro rilevamenti previsti. 4. La mutazione M184V della RT stata rilevata con sensibilit del 100% (28 rilevamenti) a 1.000 e 2.000 copie/mL. Tuttavia stato ottenuto un FN a 6.000 copie/mL (su 84 rilevamenti). Di conseguenza, il LOD per questa mutazione attestato a 1.000 copie/mL. 5. La mutazione K219E della RT ha un totale di tre risultati FN, con un FN a 1.000 copie/mL e gli altri due FN a 60.000 copie/mL. Si tratta di un risultato anomalo, dal momento che la mutazione stata rilevata con una sensibilit del 100% con altre cariche virali (6.000, 20.000, 200.000, e 750.000 copie/mL). Di conseguenza il LOD attestato a 2.000 copie/mL. 6. La mutazione K219Q della RT associata a un risultato FN a 6.000 copie/mL (su un totale di 40 rilevamenti) ed rilevata con una sensibilit del 100% a 1.000 e 2.000 copie/mL di carica virale (12/12). Di conseguenza, il LOD per questa mutazione attestato a 1.000 copie/mL. 7. La mutazione M46I della proteasi associata a un risultato FN a 2.000 copie/mL (su un totale di 40 rilevamenti) ed rilevata con una sensibilit del 100% a 1.000 copie/mL e con qualsiasi carica virale maggiore di 2.000 copie/mL. Di conseguenza, il LOD per questa mutazione in una miscela del 40% attestato a 1.000 copie/mL. 8. La mutazione A71V della proteasi associata a un risultato FN a 6.000 copie/mL (su un totale di 12 rilevamenti) ed rilevata con una sensibilit del 100% a 1.000 e 2.000 copie/mL di carica virale. Di conseguenza, il LOD per questa mutazione attestato a 1.000 copie/mL.
Tabella 7. Sensibilit di rilevamento delle mutazioni della proteasi a livello del 40% di miscela
Mutazione della proteasi Sensibilit a >1.000 copie/mL (N. di veri positivi) 100 (12) 100 (14) 91,7 (11) 100 (14) 100 (12) 97,6 (40) 100 (14) 100 (14) Sensibilit a >2.000 copie/mL (N. di veri positivi) 100 (10) 100 (12) 100 (10) 100 (12) 100 (10) 97,1 (34) 100 (12) 100 (12) LOD attestato (commenti)
L10I
1.000
L10R
1.000
K20R
2.000
D30N
1.000
M36I
1.000
M46I
1.000 (7)
G48V
1.000
I50V
1.000
Pagina 50 di 68
9. La mutazione V82S della proteasi associata a due risultati FN a 6.000 copie/mL (su un totale di 12 rilevamenti) ed rilevata con una sensibilit del 100% a 1.000 e 2.000 copie/mL di carica virale. Di conseguenza, il LOD per questa mutazione attestato a 1.000 copie/mL. 10. La mutazione L90M della proteasi associata a un risultato FP a 6.000 copie/mL (su un totale di 80 rilevamenti) ed rilevata con una sensibilit del 100% a 1.000 e 2.000 copie/mL di carica virale. Di conseguenza, il LOD per questa mutazione attestato a 1.000 copie/mL.
Virus correlati HIV-2 HTLV-I HTLV-II
Organismi coinfettanti Citomegalovirus Virus di Epstein-Barr Epatite B Epatite C
Rilevamento delle miscele

Il sistema ViroSeq in grado di rilevare con precisione: 24 mutazioni, se presenti a un livello di miscela del 40% a 2.000 copie/mL 11 mutazioni, se presenti a un livello di miscela del 30% a 2.000 copie/mL 3 mutazioni, se presenti a un livello di miscela del 20% a 2.000 copie/mL Descrizione dello studio. In questo studio sono stati sviluppati undici cloni ricombinanti con tre cariche virali (2.000, 50.000 e 750.000 copie/mL) a sei miscele virali (100, 80, 60, 40, 30, e 20% mutanti). Risultati. Alla carica virale di 2.000 copie/mL, le mutazioni sono state rilevate con sensibilit >95% ai livelli di miscela indicati sotto.
Sostanze interferenti
Le sostanze biologiche comunemente presenti e gli inibitori della trascrittasi inversa (farmaci anti-RT) presenti nel plasma dei pazienti sono stati testati tramite il ViroSeq HIV-1 Genotyping System relativamente alla loro potenzialit di interferire con il rilevamento di mutazioni che conferiscono resistenza virale. In questo studio, qualsiasi sostanza che causasse una concordanza inferiore al 90% tra il genotipo del campione testato e il genotipo previsto stata considerata come causa di interferenza con il rendimento del dosaggio. I risultati indicano che le sostanze biologiche comunemente presenti e gli inibitori della trascrittasi inversa, o farmaci anti-RT, riscontrati nei soggetti infetti da HIV-1 non hanno interferito con lanalisi. Questi comprendono: Farmaci antiretrovirali AZT, ddI, 3TC, d4T, abacavir, nevirapina, efavirenz. Nota. Le mutazioni V118I e Q151M della trascrittasi inversa sono state rilevate in 14 dei 16 campioni (88% di sensibilit). Tutte le altre mutazioni presentavano una sensibilit superiore al 94%. Lipidi (30 mg/mL), bilirubina (0,6 mg/mL), ed emoglobina (5 mg/mL).
Tabella 8. Rilevamento a 2.000 copie/mL

Livello di miscela del mutante (%) 20 Gene della trascrittasi inversa Gene della proteasi L10R D30N I50V V82F V82S V82T
Precisione e riproducibilit
Il sistema ViroSeq in grado di rilevare in modo riproducibile mutazioni specifiche di resistenza farmacologica tra siti e/o operatori diversi, lotti di produzione diversa, diversi replicati intra-dosaggio e diverse analisi del dosaggio. Questa dichiarazione supportata sia dallo studio di imprecisione analitica, sia dallo studio di riproducibilit clinica. I risultati dello studio di imprecisione indicano un range di variabilit inter-analisi (CV%) di 0,1-1,4% e un range di variabilit intradosaggio (CV%) di 0,1-5,3%. Lo studio di riproducibilit clinica ha dimostrato che il sistema ViroSeq pu rilevare in modo riproducibile mutazioni specifiche che conferiscono resistenza farmacologica in campioni di pazienti infetti da HIV-1 con basse cariche virali (1.800-10.500 copie/mL), quando la mutazione comprende il 40% o pi di quasispecie con un CV% <0,1%, ben al di sotto del livello di significanza (> 5%).
30
K65R K70R Y181C M184I Y188C T215F K219E/Q M41L T69D L74V V75I F77L K103N V106A F116Y V118I Y188L M184V L210W T215Y
40
L10I K20R M36I M46I G48V I54V L63P A71V V82A I84V L90M
Studio di imprecisione
Lo studio di imprecisione ha esaminato in duplicato sei miscele virali mutanti/wild-type con una carica virale di 2.000 copie/mL e livello di miscela del 40% in dieci analisi di dosaggio, per valutare la variabilit inter-analisi del ViroSeq HIV-1 Genotyping System (vedere i risultati riportati in Tabella 9).
Specificit analitica
Il sistema ViroSeq in grado di genotipizzare con precisione miscele di campioni virali in presenza di agenti infettivi riscontrati in pazienti infetti da HIV-1. Questo studio sulla specificit analitica ha dimostrato che la presenza di virus correlati o non correlati allHIV-1, con cariche virali superiori di circa cinque volte quella dellHIV-1, non ha alcuna conseguenza sul rendimento del dosaggio. Nei 72 campioni testati, nonostante la presenza di questi agenti infettivi, il valore di concordanza non sceso al di sotto del 90%. Questo dimostra che nessuno dei virus infettivi determina una riduzione della specificit del sistema ViroSeq nel rilevare con precisione le mutazioni specifiche (elencate in precedenza) dellHIV-1 che conferiscono resistenza virale ai farmaci. I risultati indicano che nessuno degli organismi elencati sotto ha interferito con lanalisi ViroSeq o stato rilevato dal dosaggio stesso.
Pagina 51 di 68
Tabella 9. Stime del coefficiente di variazione per gene e virus ricombinante

CV% Virus mutante Gene Inter-analisi RT GT-4 Proteasi RT MC-1 Proteasi RT MC-2 Proteasi RT MC-5 Proteasi RT MC-6 Proteasi RT MC-7 Proteasi
a
RT-PCR e percentuali di successo del sequenziamento

Il sistema ViroSeq in grado di genotipizzare con successo una porzione significativa ( 98%) di campioni della popolazione target quando disponibile una quantit sufficiente di prodotto della RT-PCR. I prelievi di 100 pazienti adulti infetti da HIV-1 sono stati esaminati per ottenere campioni che rappresentassero una sezione trasversale geografica consistente in mutazioni di resistenza e cariche virali variabili. 50 di questi campioni sono stati raggruppati in una categoria con bassa carica virale (1.800-10.500 copie/mL) e 50 in una categoria con alta carica virale (superiore a 10.500 copie/mL). Per lo studio PACTG 377, tre laboratori (Johns Hopkins, UCLA, e University of Medicine and Dentistry of New Jersey) e tre operatori hanno testato i 196 campioni con cariche virali >1.084 copie/mL.
Intra-dosaggio 2,6 <0,1 3,7 1,8 2,3 2,2 1,6 <0,1 10,9 a 3,3 5,3 2,2
<0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 1,4 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1
Rilevamento delle miscele nei campioni di pazienti

Il sistema ViroSeq in grado di rilevare con precisione le mutazioni specifiche di resistenza farmacologica nei campioni clinici di plasma EDTA in un range di bassa carica virale (1.800-10.500 copie/mL) e basso limite di miscela virale (40% mutante). Questa dichiarazione supportata dallo studio sulla validit clinica che ha confrontato la percentuale di mutazioni riscontrate in ogni campione quando il prodotto della PCR veniva clonato, rispetto alle mutazioni rilevate tramite sequenziamento della popolazione utilizzando il sistema ViroSeq. Questo studio ha dimostrato che le mutazioni rappresentanti il 40% o pi di quasispecie in campioni del range con bassa carica virale (1.800-10.500 copie/mL) possono essere rilevate in maniera riproducibile da tre siti clinici con un valore di concordanza > 98% fino al limite inferiore del livello di confidenza del 95%. Tabella 11. Le mutazioni rilevate in questo studio comprendono:
Nella trascrittasi inversa M41L E44D V75I V118I T215Y A62V F77L Q151M T215F K65R L100I Y181C K219Q D67N K101E Y181I K219E S68G K103N M184V T69D V108I G190A K70R Y115F G190S
Questo valore il risultato di un campione in cui sono state rilevate solo 3 mutazioni su 13. Per questo campione, il prodotto della RT-PCR non ha soddisfatto i requisiti il valore risultato pari a circa 10 ng, quindi inferiore al requisito di 20 ng di prodotto minimo della RT-PCR necessari per le reazioni di sequenziamento.
I dati riportati in Tabella 9 mostrano che il CV% inter-analisi rientra nel range <0,1-1,4. Cinque dei 6 valori del CV% sono <0,1 e uno pari a 1,4. Il CV% intra-dosaggio rientra nel range <0,1-5,3. I risultati di questo studio supportano la dichiarazione di Celera rispetto alla scarsa significativit ( 5%) della variabilit inter-analisi del ViroSeq HIV-1 Genotyping System.
Studio di riproducibilit clinica

La riproducibilit clinica del ViroSeq HIV-1 Genotyping System stata valutata tramite uno studio multicentrico per determinare la variazione inter-sito e inter-lotto del dosaggio. Tre siti hanno testato 11 campioni di pazienti con carica virale compresa tra 1.800 e 10.500 copie/mL. Ciascuno di questi 11 campioni stato testato in duplicato con tre lotti diversi, con un risultato di 18 punti dati per campione (3 siti x 3 lotti x 2 replicati). Il rilevamento di tutte le mutazioni presenti in un campione stato misurato e confrontato per stabilire la variabilit (CV%). I risultati riportati in Tabella 10 dimostrano che le variazioni inter-sito e inter-lotto del sistema ViroSeq sono trascurabili. Tabella 10. Risultati della riproducibilit clinica
Range del CV% Fonte della variazione Inter-sito Inter-lotto Intra-dosaggio Totale
a
L74V F116Y L210W
Nella proteasi L10I M36I A71I N88D L10F M46I A71T L90M L10V M46L A71V K20M I47V G73S K20R G48V V77I D30N F53L V82A V32I I54V V82T L33F L63P I84V
RT <0,1 <0,1 <0,1 <0,1
Proteasi <0,1 <0,1 <0,1-4,7 a <0,1
Per questo studio sono stati scelti campioni con bassa carica virale casualmente rispetto ad et (sopra i 18 anni), sesso e anamnesi clinica e di trattamento. I campioni sono stati raccolti prospetticamente da pazienti infetti da HIV-1 provenienti da molteplici localit geografiche nella popolazione target. Le mutazioni rilevate e la loro frequenza sono considerate rappresentative della popolazione target infetta da HIV-1. Allinterno di questa popolazione, la capacit del sistema ViroSeq di rilevare lelenco selezionato di mutazioni di resistenza farmacologica uniformemente elevato in tutte le mutazioni rilevate. In alcuni casi, lanalisi stata in grado di rilevare mutazioni presenti al di sotto del limite del 40%, sebbene questo risultato non sia uniforme in tutti i siti o per tutte le mutazioni. Il controllo di qualit dei dati per questo studio sulla validit clinica consistito in unanalisi filogenetica su 300 campioni (50 prelievi x 6 replicati ciascuno). Lalbero filogenetico che ne derivato non ha presentato alcuna evidenza di contaminazione da carry-over di ampliconi della PCR. Questo studio ha dimostrato che lAmpErase Uracil N-glicosilasi e le procedure di contenimento raccomandate controllano efficacemente la contaminazione da PCR. I dati sono stati analizzati anche per stabilire laccuratezza complessiva delle basi.
Per la maggior parte dei campioni analizzati, il CV% intra-dosaggio risultato <0,1. Due campioni hanno riportato valori di 1,3 e 4,7.
I risultati di questo studio supportano la dichiarazione di Celera rispetto alla scarsa significativit (<5%) della variabilit inter-sito, inter-lotto e intradosaggio del ViroSeq HIV-1 Genotyping System.
Pagina 52 di 68
Studio sullutilit clinica

Il software del sistema ViroSeq utilizza le mutazioni di resistenza farmacologica per generare valutazioni di resistenza farmacologica di comprovata utilit clinica. Questa dichiarazione supportata dal risequenziamento dei campioni dello studio GART utilizzando il sistema ViroSeq. Lo studio GART aveva precedentemente dimostrato lutilit clinica di varie mutazioni nella RT e nella proteasi elencate in Tabella 12.14 Mutazioni supplementari sono state inserite nellalgoritmo di interpretazione basato su regole in recenti rapporti pubblicati in letteratura. Tabella 12. Mutazioni supplementari rilevate nello studio GART, ma non presenti nellelenco delle mutazioni analizzate dello studio originale
Nella trascrittasi inversa M41L V75T M184V A62V F77L Y188C K65R K103N L210W D67N V106A T215Y T69D F116Y T215F K70R Q151M K219Q L74V Y181C K219E V75I Y181I
Tabella 13. Statistiche dei campioni relative alla concordanza GART per gene
Gene
RT Media Mediana Deviazione standard Errore standard della media Minimo Massimo 0,969
Proteasi 0,954
1,000
1,000
0,066
0,086
0,005
0,007
0,652
0,538
1,000
1,000
Nella proteasi L10I M36L V77I L10R M46I V82A L10V M46L V82F K20M G48V V82T K20R I54V I84V L24I L63P N88D D30N A71T L90M M36I A71V
La concordanza tra lanalisi home brew GART e il ViroSeq HIV-1 Genotyping System discreta (>95%); raggiunge infatti il livello necessario per attestare lutilit clinica del Sistema ViroSeq. Inoltre, la maggioranza dei campioni stata analizzata con successo (149/153 o 97%), il che consente di considerare valide le conclusioni, originali dellanalisi dei dati per lutilit clinica, senza ripetere lanalisi. Lo studio sopracitato, quindi, supporta la dichiarazione di Celera secondo la quale lutilit clinica dimostrata per le mutazioni rilevate e incluse nellanalisi dello studio GART quando rilevate dal ViroSeq HIV-1 Genotyping System.
Il Genotyping Antiretroviral Resistance Testing (GART) stato uno degli studi fondamentali sullutilit clinica. Ha dimostrato che se i medici avevano accesso ai dati di genotipizzazione prima di modificare la terapia, prendevano decisioni migliori riguardo al trattamento e miglioravano la risposta a breve termine del paziente alla terapia.14 Si trattava di uno studio a due bracci luno (GART) che consentiva ai medici curanti laccesso ai risultati di genotipizzazione e a raccomandazioni sul trattamento basate su tali risultati fornite da un gruppo di esperti, mentre laltro (nonGART) non consentiva laccesso a queste informazioni prima del trattamento. Questi due bracci sono stati confrontati considerando le riduzioni medie della carica virale alla quarta, ottava e dodicesima settimana. Il braccio GART presentava una riduzione significativa della carica virale rispetto al braccio nonGART, soprattutto quando i medici curanti mantenevano una stretta aderenza ai consigli di trattamento forniti dagli esperti. Grazie a questo protocollo e ad altri analoghi, il test della resistenza diventato lo standard dellassistenza medica nello sviluppo di strategie di trattamento per pazienti in fallimento terapeutico. Per dimostrare che il nostro dosaggio rileva le stesse mutazioni di resistenza individuate dal dosaggio home brew utilizzato nello studio GART, abbiamo ottenuto tutti i 153 campioni di pazienti originali dai ricercatori originali dello studio GART, come pure i risultati originali del sequenziamento dallo studio GART. La Tabella 13 mostra che il confronto dei dati di genotipizzazione dimostra unelevata concordanza.
Pagina 53 di 68
Sezione 6: Manutenzione e calibrazione di ABI PRISM 3100/3100Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici ABI PRISM 3100/3100Avant)
In questa sezione:
Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Manutenzione dei 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici 3100/3100-Avant). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Schiera di capillari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Siringhe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Blocchi polimerici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Campionatore automatico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Unit piastra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Manutenzione del computer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Calibrazione spaziale e spettrale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 55 56 58 59 61 61 61 62
Articolo ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100-Avant) con: 3100-AVANT
IMPORTANTE! Non Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati, scaricare da Internet v.1.0) programmi previsti a questo Versione firmware 6278000-01 o 6278050-01 scopo. Computer PC con: Microsoft Windows NT v.4.0, Service Pack 6 o 6a Processore Intel Pentium IV, 2 GHz 1 GB di RAM Disco rigido, 2 da 36 GB Kit di pulizia del blocco polimerico
N801-0531 4315932 4317237 4317241 4315933 N801-0560 4304470 628-3731 221102 4317380 Per ottenere licenze supplementari utilizzare 4310990 e specificare v.3.7
MicroAmp 96-Well Support Base (base di supporto da 96 pozzetti MicroAmp) Setti per recipiente Base per piastra da 96 pozzetti Fermo per piastra da 96 pozzetti Setti per piastra da 96 pozzetti MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp) Siringa in vetro di riempimento della schiera, 250 L Siringa in vetro della riserva del polimero, 5,0 mL O-ring della siringa ABI PRISM Sequencing Analysis Software v.3.7 per computer Windows NT
IMPORTANTE! Non scaricare da Internet programmi previsti a questo scopo.

3100 Performance Optimized Polymer 6 (POP-6) BigDye Terminator Sequencing Standard v.1.1 (standard di sequenziamento BigDye Terminator v.1.1) 10X soluzioni tampone per analizzatore genetico con EDTA 4316357 4336791 402824 4311320
Materiali richiesti
Per immagini e grafici che illustrino come eseguire operazioni specifiche sullABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100), consultare lABI PRISM 3100 Genetic Analyzer User Guide (guida utente dellanalizzatore genetico ABI PRISM 3100) (PN 4334785). Per immagini e grafici che illustrino come eseguire operazioni specifiche sullABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100-Avant), consultare lABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer User Guide (guida utente dellanalizzatore genetico ABI PRISM 3100-Avant) (PN 4333549).
Articolo ABI PRISM 3100 Capillary Array (schiera di capillari ABI PRISM 3100), 50 cm ABI PRISM 3100-Avant Capillary Array (schiera di capillari ABI PRISM 3100-Avant), 50 cm ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico ABI PRISM 3100) con: 4315930 4333466
Formammide Hi-Di, 25 mL
Contiene formammide. R 61 Pu danneggiare i bambini non ancora nati. R 36/38 Irritante per gli occhi e la pelle. S 53 Evitare lesposizione - procurarsi speciali istruzioni prima delluso. S 24/25 Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. S 35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37/39 Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S 45 In caso di incidente o malessere, consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli letichetta).
Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati, v.1.0.1) Versione firmware 6286100-04 Computer PC con: Microsoft Windows NT v.4.0 Processore Intel Pentium III, 550 MHz 256 MB di RAM Disco rigido, 18 GB Kit di pulizia del blocco polimerico
ABI PRISM 3100 Genetic 3100-01 Analyzer (analizzatore genetico IMPORTANTE! Non ABI PRISM 3100) con: scaricare da Internet
Data Collection Software programmi previsti a questo v.1.1 (software di raccolta scopo. dati, v.1.1) Versione firmware 6286150-01 Computer PC con: Microsoft Windows NT v.4.0, Service Pack 5 o 6a Processore Intel Pentium IV, 2 GHz 1 GB di RAM Disco rigido, 2 da 36 GB Kit di pulizia del blocco polimerico
Pagina 54 di 68
Manutenzione dei 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici 3100/3100-Avant)

Manutenzione
Attenersi ai programmi di manutenzione riportati sotto per un rendimento ottimale dello strumento. IMPORTANTE! I 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici 3100/3100-Avant) devono essere installati da un tecnico qualificato del servizio assistenza clienti di Applied Biosystems. Collocare lo strumento in un locale con temperatura ambiente di 15 C a 30 C (59 F a 85 F). Temperature al di fuori di questo range, o un elevato tasso di umidit, possono causare condensa, calo del rendimento e danni allo strumento. Nota. Dopo aver aperto lo sportello del 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100/3100-Avant) necessario consentire il completamento della sequenza di ritorno al punto di partenza del campionatore automatico prima di impartire ulteriori comandi.
Operazioni da eseguire una volta alla settimana

Pulire le siringhe. Pulire il blocco del polimero superiore e il blocco inferiore. Sostituire il polimero. Controllare le condizioni di conservazione delle schiere usate.
Operazioni da eseguire al bisogno

Procedure di manutenzione Pulire le vaschette di gocciolamento. Cambiare la schiera di capillari. Sostituire le siringhe. Calibrare il campionatore automatico. Frequenza Quando necessario Dopo 100 analisi Una volta ogni 3 mesi Quando necessario
Operazioni da eseguire prima di ogni analisi

Accertarsi che i setti per piastra siano fissati correttamente e in piano.
Pulizia dello strumento

Accertarsi che lunit piastra sia stata assemblata correttamente. IMPORTANTE! Verificare che i setti per piastra siano collocati in piano sopra la piastra. I fori nel fermapiastra devono essere allineati ai fori dei setti per evitare che le estremit dei capillari vengano danneggiate. Assicurarsi che il gruppo della piastra sia assemblato in posizione corretta sul portapiastra. La piastra deve inserirsi saldamente sul portapiastra. IMPORTANTE! Non usare mai piastre deformate. Riempire nuovamente i serbatoi con acqua deionizzata e soluzione tampone 1X contenente EDTA per analizzatore genetico. Controllare che non siano presenti bolle daria nel blocco del polimero e nei rispettivi canali; eliminare le eventuali bolle daria presenti. Controllare che i puntali dei capillari non siano schiacciati o danneggiati. Accertarsi che il livello del polimero nella siringa di riserva del polimero sia sufficiente per le analisi previste. Controllare che il blocco del polimero sia saldamente inserito sullo strumento. Pulire le superfici dello strumento. Controllare che non vi sia polimero essiccato intorno al blocco del polimero; se necessario, pulire. Verificare che non vi siano perdite attorno alle siringhe e stringere il dado. Verificare lo spazio disponibile del database. Eliminare i record delle piastre dal database dello strumento e archiviare i file dei campioni. 3. 1. Premere il pulsante Tray (vassoio) sul lato anteriore dello strumento per spostare il campionatore automatico nella posizione di avanzamento. Asportare ogni traccia di liquido sopra e intorno al campionatore automatico con un panno privo di pelucchi. Pulire le vaschette di gocciolamento con acqua deionizzata e un panno privo di pelucchi. Asportare eventuali incrostazioni di polimero (cristalli) dallo strumento e dalla piastra per stripper con acqua deionizzata e un panno privo di pelucchi. IMPORTANTE! In nessun caso utilizzare solventi organici per pulire lo strumento.
2.
4.
Reimpostazione dello strumento

Casi in cui necessario reimpostare lo strumento
Si verificato un errore irreversibile, come indicato dalla spia di stato rossa Lo strumento non risponde allABI PRISM 3100 o 3100-Avant Data Collection software (software di raccolta dati di ABI PRISM 3100 o 3100-Avant)
Sono previste due procedure di reimpostazione dello strumento.
Reimpostazione con il pulsante Reset (reimposta)

1. 2. Chiudere gli sportelli dello strumento. Utilizzando uno strumento lungo e stretto, come per esempio una graffetta raddrizzata, premere il tasto Reset (reimposta) sul lato anteriore dello strumento.
Pagina 55 di 68
Reimpostazione tramite spegnimento

1. 2. Chiudere gli sportelli dello strumento. Spegnere lo strumento premendo il pulsante on/off sul lato anteriore dello strumento. Riavviare il computer. a. Selezionare Start > Shutdown (avvio > arresto) b. Nella finestra di dialogo Shutdown Windows (arresto di Windows), selezionare Restart (riavvia) e fare clic su OK. IMPORTANTE! Attendere che il computer abbia completato la procedura di riavvio prima di procedere. 4. Accendere lo strumento e attendere la spia verde fissa. Nota. In caso di arresto dello strumento, il firmware non viene salvato. Al riavvio, lo strumento carica nuovamente una copia del firmware e del file di calibrazione dal computer. Aprire il software di raccolta dati.
Procedura di arresto a lungo termine

1. Seguire la procedura indicata per rimuovere e conservare la schiera di capillari separatamente dallo strumento. Rimuovere dallo strumento: siringhe dal blocco polimerico superiore; blocco polimerico superiore; blocco polimerico inferiore. Rimuovere lunit piastra e i serbatoi dal campionatore automatico. Pulire il campionatore automatico e le vaschette di gocciolamento con un panno privo di pelucchi inumidito con acqua. Chiudere gli sportelli dello strumento. Arrestare il computer e spegnere lo strumento. Lavare le siringhe, i blocchi polimerici e i serbatoi con acqua calda. Sciacquare con acqua deionizzata. IMPORTANTE! Accertarsi che tutte le parti siano completamente asciugate allaria prima della conservazione a lungo termine a una temperatura di 15 C a 25 C.
2.
3.
3. 4.
5. 6. 7.
5.
Arresto dello strumento

Se lo strumento rimane inutilizzato per... Non pi di una settimana, con un serbatoio pieno di soluzione tampone Eseguire la seguente procedura di arresto...
Sostituire il polimero settimanalmente

Il polimero si conserva a 25 C per 7 giorni.
A breve termine. IMPORTANTE! Il segreto del successo di una procedura di arresto a breve termine consiste nel tenere la schiera di capillari in una soluzione tampone 1X contenente EDTA per analizzatore genetico. Questo impedisce lessiccazione del polimero nei capillari.
Sostituzione del polimero

RISCHIO CHIMICO. Il polimero POP-6 provoca irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. 1. Selezionare Tools > Change Polymer Wizard (strumenti > procedura guidata per la sostituzione del polimero). Seguire le istruzioni fornite dalla procedura guidata per sostituire il polimero usato con polimero fresco
Per pi di una settimana A lungo termine.
Procedura di arresto a breve termine

2. 1. Riempire la schiera di capillari con polimero fresco usando Change Polymer Wizard (procedura guidata per la sostituzione del polimero) o i comandi di controllo manuali. Premere il pulsante Tray (vassoio) per far avanzare il campionatore automatico. Riempire lapposito serbatoio con la soluzione tampone 1X contenente EDTA per analizzatore genetico fin quasi al bordo. Fissare un setto sul serbatoio e spostare il serbatoio nella posizione 1 sul campionatore automatico. Riempire gli altri serbatoi con acqua deionizzata fresca, quindi fissare i setti e spostare i serbatoi nelle rimanenti posizioni sul campionatore automatico. Chiudere gli sportelli dello strumento. Il campionatore automatico si sposta sulla posizione 1, lasciando le estremit dei capillari immerse nel serbatoio della soluzione tampone. Arrestare il computer e spegnere lo strumento.
2.
Schiera di capillari
Installazione e rimozione
Quando modificare una schiera di capillari
La schiera di capillari ha una durata prevista di circa 100 analisi. Una nuova schiera di capillari pu essere necessaria in caso di: scarsa precisione di dimensionamento scarsa risoluzione e/o ridotta intensit del segnale
3.
4.
5.
6.
Operazioni da effettuare prima di installare una schiera di capillari gi usata precedentemente

Pulire la parte anteriore della cella di rilevamento Verificare che la barra catodica sia asciutta
7.
Pagina 56 di 68
Pulizia della cella di rilevamento

Nota. Questa procedura non necessaria per le nuove schiere a meno che la cella di rilevamento non sia stata toccata inavvertitamente dalloperatore.
Pulizia della schiera di capillari

RISCHIO CHIMICO. Il polimero POP-6 provoca irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. 1. Riempire la schiera di capillari di polimero fresco, come indicato nel paragrafo seguente Riempimento della schiera di capillari con polimero utilizzando il controllo manuale. Asportare eventuali incrostazioni di polimero (cristalli) dallo strumento, compresi gli elettrodi dei capillari e la piastra per stripper, con acqua deionizzata e un panno privo di pelucchi. Nota. Attenzione a non piegare e spostare gli elettrodi dei capillari durante le operazioni di pulizia. IMPORTANTE! In nessun caso utilizzare solventi organici per pulire lo strumento. 3. Pulire la cella di rilevamento.
RISCHIO CHIMICO. Il metanolo un liquido e vapore infiammabile. Lesposizione pu causare irritazione a occhi, pelle e tratto respiratorio, depressione del sistema nervoso centrale e cecit. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. Consultare la scheda di sicurezza del produttore per ulteriori informazioni. 1. Collocare una goccia di metanolo sulla superficie anteriore della cella di rilevamento. Lasciare asciugare allaria la cella. Nota. Non utilizzare aria pressurizzata per asciugare la cella di rilevamento.
2.
2.
Controllo della barra catodica

Prima di ricollocare una schiera usata sullo strumento, accertarsi che la barra catodica sia asciutta. Una barra bagnata potrebbe innescare un arco elettrico. PERICOLO DI SCOSSA ELETTRICA/INCENDIO. Eliminare qualsiasi traccia di liquido dalla barra catodica. Eventuali residui di liquido sulla barra possono provocare una scossa elettrica o addirittura un incendio.
Riempimento della schiera di capillari con polimero utilizzando il controllo manuale

1. Selezionare Instrument > Manual Control (strumento > controllo manuale). Nellelenco a discesa Command Category (categoria di comando) selezionare Capillary (capillare). Nellelenco a discesa Command Name (nome comando) selezionare Fill (riempi). Nel menu a discesa Value (valore), selezionare 50 cm per la lunghezza della schiera e POP-6 per il polimero. Fare clic su Send Command (invia comando). Attendere la comparsa del messaggio Command complete (comando completato), prima di continuare.
Installazione o rimozione della schiera di capillari utilizzando la procedura guidata

IMPORTANTE! Indossare guanti per eseguire la procedura seguente e ogni volta in cui si manipolano schiere di capillari, siringhe di vetro, setti o serbatoi di soluzione tampone. RISCHIO CHIMICO. Il polimero POP-6 provoca irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. IMPORTANTE! Per lanalisi ViroSeq, utilizzare una schiera di capillari da 50 cm. La lunghezza della schiera di capillari utilizzata deve corrispondere alla lunghezza della schiera di capillari nel database dello strumento. 1. Chiudere gli sportelli del forno e dello strumento, quindi premere il pulsante Tray (vassoio). Selezionare Tools > Install Capillary Array Wizard (strumenti > procedura guidata per linstallazione della schiera di capillari). Seguire le istruzioni fornite nella procedura guidata per sostituire o installare una schiera. Nota. necessario inserire le informazioni corrette relative alla schiera di capillari (es.: lunghezza della schiera di capillari e numero di lotto). Controllare la testina dellestremit di caricamento per accertarsi che le estremit dei capillari non siano schiacciate o danneggiate.
2.
3.
4.
5.
Conservazione di una schiera di capillari sullo strumento

Conservare la schiera di capillari sullo strumento solo quando la schiera di capillari rimarr inutilizzata per meno di una settimana. Per conservare la schiera di capillari sullo strumento, eseguire la procedura di arresto a breve termine.
2.
3.
Conservazione di una schiera di capillari separatamente dallo strumento

Conservare la schiera di capillari separatamente dallo strumento quando si prevede di non utilizzarla per pi di 1 settimana. Conservare a 15 C a 25 C. IMPORTANTE! Prima di conservare la schiera di capillari per periodi prolungati, raccomandiamo di riempire i capillari con polimero fresco. RISCHIO CHIMICO. Il polimero POP-6 provoca irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. IMPORTANTE! Indossare guanti per eseguire la procedura seguente e ogni volta in cui si manipolano schiere di capillari, siringhe di vetro, setti o serbatoi di soluzione tampone.
4.
Manutenzione
Manutenzione della schiera di capillari
Indossare guanti e manipolare la schiera di capillari con delicatezza. Non toccare la cella di rilevamento. Qualora la cella sia sporca, vedere il paragrafo Pulizia della cella di rilevamento. Mantenere costantemente umide le estremit della schiera di capillari. Allentare sempre il dado della schiera di capillari prima di estrarre il blocco polimerico superiore. Non serrare eccessivamente il dado della schiera di capillari.
Pagina 57 di 68
1.
Riempire la schiera di capillari con polimero fresco usando Change Polymer Wizard (procedura guidata per la sostituzione del polimero) o i comandi di controllo manuali. Rimuovere la protezione delle siringhe. Rimuovere entrambe le siringhe dal blocco polimerico superiore ed eliminare adeguatamente qualsiasi residuo di polimero. Lavare le siringhe. Rimuovere la schiera di capillari dallo strumento utilizzando la Install Capillary Array Wizard (procedura guidata per linstallazione della schiera di capillari). Per istruzioni, vedere il paragrafo Installazione o rimozione della schiera di capillari utilizzando la procedura guidata.
Pulizia delle siringhe

IMPORTANTE! Indossare guanti per eseguire la procedura seguente e ogni volta in cui si manipolano schiere di capillari, siringhe di vetro, setti o serbatoi di soluzione tampone. 1. 2. 3. Rimuovere la protezione delle siringhe. Rimuovere le siringhe. Pulire le siringhe sciacquando linterno e lesterno del corpo e la punta della siringa con acqua calda. Per pulire linterno, immergere la punta della siringa in acqua calda e aspirare lentamente con lo stantuffo. IMPORTANTE! Accertarsi che non vi siano tracce residue di polimero essiccato allinterno. 4. Sciacquare il corpo e la punta della siringa con acqua deionizzata. Lasciare asciugare allaria.
2. 3.
4. 5.
6. 7.
Riposizionare la copertura sopra la cella di rilevamento. 5. Riempire uno degli appositi serbatoi con soluzione tampone 1X contenente EDTA per analizzatore genetico. Inserire le estremit dei capillari nella soluzione tampone. Riempire la fiala per il trasporto con soluzione tampone 1X fresca contenente EDTA per analizzatore genetico e inserire lestremit di rilevamento della schiera di capillari. Conservare la schiera di capillari in posizione verticale. 2. 3.
Controllo di una siringa

IMPORTANTE! Se la siringa perde, controllare che non vi siano O-ring danneggiati o mancanti. 1. Controllare che la siringa sia dotata di due O-ring ( ABI 221102): uno dietro il puntale e uno intorno al puntale. Verificare che il puntale sia fissato fermamente allestremit della siringa. Usare un panno privo di pelucchi per asciugare la siringa.
8.
9.
10. Controllare ogni settimana il livello della soluzione tampone 1X contenente EDTA per analizzatore genetico nel serbatoio e nel tubo.
Siringhe
Manutenzione delle siringhe
Utilizzare esclusivamente le seguenti siringhe:
siringa in vetro della riserva del polimero da 5,0 mL ( ABI 628-3731) e siringa in vetro di riempimento della schiera da 250 L ( ABI 4304470)
Preparazione e riempimento delle siringhe

Siringa della riserva del polimero
Seguire questa procedura dopo aver pulito la siringa della riserva del polimero o se il polimero contenuto nella siringa da pi di 1 settimana.
RISCHIO CHIMICO. Il polimero POP-6 provoca irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. IMPORTANTE! Indossare guanti per eseguire la procedura seguente e ogni volta in cui si manipolano schiere di capillari, siringhe di vetro, setti o serbatoi di soluzione tampone. 1. Aspirare circa 0,3 mL di polimero a temperatura ambiente in una siringa della riserva del polimero pulita. Tirare lo stantuffo verso lalto fino alla tacca corrispondente a 5 mL. Capovolgere la siringa circa sei volte per rivestire di polimero le pareti. Eliminare questo polimero nei rifiuti acquosi. Nota. La preparazione della siringa garantisce che il polimero utilizzato per lanalisi abbia la concentrazione desiderata e non risulti diluito da acqua residua. Riempire la siringa della riserva del polimero con un massimo di 4,5 mL di polimero. Nota. Ogni analisi iniettata richiede 80 L di polimero nella siringa della riserva. IMPORTANTE! Evitare lintroduzione di bolle daria nel polimero tenendo la punta della siringa appena sommersa nel polimero e aspirando lentamente.
Gestione delle siringhe

IMPORTANTE! Per prolungare la durata dello stantuffo della siringa, evitare di rimuoverlo dal corpo della siringa. IMPORTANTE! Per preparare la siringa, aspirare le soluzioni lentamente. IMPORTANTE! Indossare guanti durante la manipolazione delle siringhe di vetro.
Sostituzione delle siringhe

Sostituire le siringhe ogni 3 mesi.
2. 3.
Quando pulire le siringhe

Tutte le volte in cui vengono rimosse dallo strumento, o almeno una volta alla settimana Ad ogni sostituzione del polimero, compreso il passaggio a un nuovo lotto di polimero
4.
Pagina 58 di 68
5.
Rimuovere eventuali bolle daria capovolgendo la siringa e facendo uscire una piccola quantit di polimero dalla punta. Nota. Non rimettere nel flacone la porzione inutilizzata di polimero.
Rimozione
1. 2. Rimuovere la protezione delle siringhe. Afferrare la siringa della riserva del polimero appena sopra il raccordo o alla base (evitare di toccare il corpo di vetro) e ruotarla in senso antiorario. IMPORTANTE! Fare attenzione a non rimuovere il raccordo per evitare la fuoriuscita dei diversi anelli e valvole di controllo.
Siringa di riempimento della schiera

RISCHIO CHIMICO. Il polimero POP-6 provoca irritazione agli occhi, alla pelle e allapparato respiratorio. Proteggere gli occhi, indossare indumenti protettivi e guanti adatti. IMPORTANTE! Indossare guanti per eseguire la procedura seguente e ogni volta in cui si manipolano schiere di capillari, siringhe di vetro, setti o serbatoi di soluzione tampone. 1. Aspirare un piccolo volume di polimero a temperatura ambiente in una siringa pulita di riempimento della schiera. Tirare lo stantuffo verso lalto fino alla tacca corrispondente a 250 L. Capovolgere la siringa circa sei volte per rivestire di polimero le pareti. Eliminare questo polimero nei rifiuti acquosi. Nota. La preparazione della siringa garantisce che il polimero utilizzato per lanalisi abbia la concentrazione desiderata e non risulti diluito da acqua residua. Per evitare bolle daria, aspirare delicatamente e lentamente il polimero nella siringa fino a raggiungere il volume desiderato. Puntare la siringa verso lalto e premere leggermente lo stantuffo per far uscire leventuale aria intrappolata. Nota. Non rimettere nel flacone la porzione inutilizzata di polimero.
3.
Afferrare la siringa di riempimento della schiera e ruotarla in senso antiorario. Eliminare leventuale polimero residuo conformemente alle norme.
4.
Blocchi polimerici
Rimozione dei blocchi polimerici
Blocco polimerico superiore
1. 2. 3. Rimuovere la protezione delle siringhe. Rimuovere le siringhe. Staccare la schiera di capillari dal blocco polimerico: a. Premere il pulsante Tray (vassoio). b. Aprire gli sportelli dello strumento, del forno e del blocco di rilevamento. c. Allentare il dado della schiera di capillari. d. Estrarre parzialmente il blocco polimerico. e. Rimuovere la cella di rilevamento dal blocco di rilevamento. f. Rimuovere il manicotto della schiera di capillari dal blocco polimerico. Nota. Se la schiera di capillari deve essere riutilizzata, conservarla secondo le istruzioni. Staccare il tubo del blocco polimerico dal blocco polimerico inferiore. Afferrare il blocco polimerico superiore con entrambe le mani ed estrarlo completamente. Il blocco polimerico superiore scorre su due perni di acciaio e si estrae facilmente una volta che la molla supera il punto di arresto.
2. 3.
4.
5.
Installazione e rimozione delle siringhe

Installazione
4. 1. Attenersi alle procedure relative alla rimozione, pulizia e asciugatura del blocco polimerico superiore. Introdurre la punta della siringa della riserva del polimero nella porta sinistra, sopra il blocco polimerico superiore e avvitarla in senso orario nel blocco polimerico. IMPORTANTE! Durante lavvitamento nel blocco, tenere la siringa appoggiando le dita sul manicotto metallico mai sul vetro. Serrare la siringa nel blocco manualmente. 3. Introdurre la punta della siringa di riempimento della schiera nella porta destra, sopra il blocco polimerico superiore e avvitarla in senso orario nel blocco polimerico. IMPORTANTE! Durante lavvitamento nel blocco, tenere la siringa appoggiando le dita sul manicotto metallico mai sul vetro. Serrare la siringa nel blocco manualmente. 4. 5. Spingere il blocco polimerico completamente contro lo strumento. Sostituire la protezione delle siringhe. 5.
2.
6.
Blocco polimerico inferiore

1. Rimuovere il serbatoio dellanodo ed eliminare la soluzione tampone conformemente alle norme. Afferrare il blocco polimerico inferiore ed estrarlo completamente.
2.
Pulizia dei blocchi polimerici

Quando pulire le siringhe
Prima di sostituire il polimero nello strumento Quando il polimero si trova nello strumento da pi di 1 settimana Nota. Un polimero caricato da oltre 1 settimana pu provocare un aumento transitorio della corrente durante lelettroforesi, a causa della decomposizione dellurea. possibile utilizzare il kit di pulizia dei blocchi polimerici:
ABI 4322931 Kit di pulizia del blocco polimerico
Pagina 59 di 68
Blocco polimerico superiore

IMPORTANTE! Non esporre i blocchi polimerici allazione di solventi organici. 1. Sciacquare tutti i raccordi con acqua calda ed effettuare un ultimo risciacquo con acqua deionizzata. Lasciare a bagno i raccordi che presentano incrostazioni di polimero. IMPORTANTE! Non usare acqua bollente per sciacquare i raccordi e il blocco polimerico. 2. Immergere il blocco polimerico superiore in acqua calda ed effettuare un ultimo risciacquo con acqua deionizzata. Montare ladattatore per siringa da 6 mm sulla siringa priva di silicone da 20 mL del kit di pulizia dei blocchi polimerici. Introdurre ladattatore per siringa da 6 mm nella valvola di controllo in acciaio inossidabile. Utilizzando una siringa caricata con acqua calda, lavare pi volte i canali chiudendone le aperture con le dita ed effettuare un risciacquo finale con acqua deionizzata. Nota. Spruzzare lacqua deionizzata anche attraverso i tubi dei blocchi polimerici. Controllare visivamente i canali per individuare eventuali residui bianchi di polimero essiccato. Lavare i canali parzialmente ostruiti con acqua calda fino alla completa eliminazione del polimero essiccato ed effettuare un ultimo risciacquo con acqua deionizzata. IMPORTANTE! Eliminare lostruzione con acqua calda pu richiedere molto tempo. Non utilizzare strumenti appuntiti e affilati per pulire il canale, neppure in caso di ostruzione completa con polimero essiccato. 7. Liberare e asciugare i canali dei blocchi polimerici. a. Rimuovere ogni residuo dacqua dal blocco polimerico superiore e dai raccordi per garantire che il polimero non risulti diluito. A questo scopo, immettere aria nei canali usando la siringa priva di silicone. b. Introdurre aria nei canali finch questi non siano completamente asciutti. IMPORTANTE! Non utilizzare la siringa di vetro della riserva del polimero da 5,0 mL per introdurre aria nei canali. Questo pu danneggiare lo stantuffo e causare perdite nella siringa di vetro della riserva del polimero.
7.
Introdurre ladattatore della siringa da 6 mm nel blocco polimerico in cui era stato collocato inizialmente il raccordo del tubo del blocco polimerico. Lavare il canale pi volte con una siringa di acqua deionizzata. Controllare visivamente i canali per individuare eventuali residui bianchi di polimero essiccato. Lavare i canali parzialmente ostruiti con acqua calda deionizzata, fino alla completa eliminazione del polimero essiccato ed effettuare un ultimo risciacquo con acqua deionizzata. IMPORTANTE! Eliminare lostruzione con acqua calda pu richiedere molto tempo. Non utilizzare strumenti appuntiti e affilati per pulire il canale, neppure in caso di occlusione completa con polimero essiccato.
8. 9.
3.
10. Sciacquare a fondo il blocco polimerico inferiore e tutti i raccordi con acqua deionizzata. 11. Rimuovere ogni residuo dacqua dal blocco polimerico inferiore e dai raccordi per garantire che il polimero non risulti diluito. 12. Introdurre aria nei canali finch questi non siano completamente asciutti usando la siringa priva di silicone. IMPORTANTE! Non utilizzare la siringa di vetro della riserva del polimero da 5,0 mL per introdurre aria nei canali. Questo pu danneggiare lo stantuffo e causare perdite nella siringa.
4.
5.
6.
Connessione dei blocchi polimerici allo strumento

1. 2. Se necessario, pulire i blocchi polimerici e i tubi. Spingere il blocco polimerico superiore sui due perni guida sullo strumento. Lasciare uno spazio di circa 2,5 cm tra il blocco e il retro dello strumento. Installare il blocco polimerico inferiore. Accertarsi che il blocco sia completamente contro lo strumento. Collegare i tubi tra i due blocchi. a. Inserire un puntale nel blocco polimerico superiore e ruotare in senso orario fino a serrare manualmente. b. Inserire laltro puntale nel blocco polimerico inferiore e ruotare in senso orario fino a serrare manualmente. IMPORTANTE! Non serrare eccessivamente. 5. Installare vaschette di gocciolamento pulite se queste non sono gi presenti sullo strumento.
3.
4.
Blocco polimerico inferiore

1. Verificare che la valvola a perno del tampone anodico sia aperta (posizione verso lalto). Rimuovere i tubi del blocco polimerico e il raccordo dal blocco polimerico superiore, se questa operazione non gi stata effettuata in precedenza. Rimuovere il blocco polimerico inferiore dallo strumento. Sciacquare tutti i raccordi con acqua deionizzata. Lasciare a bagno i raccordi con incrostazioni di polimero ed effettuare un risciacquo finale con acqua deionizzata. IMPORTANTE! Non usare acqua bollente per sciacquare i raccordi e il blocco polimerico. 2. 5. Mantenere il blocco polimerico inferiore sotto acqua deionizzata. Usando le dita, inserire ed estrarre la valvola a perno del tampone anodico nel relativo canale di guida, per accertarsi che non siano presenti incrostazioni di polimero, ed effettuare un risciacquo finale con acqua deionizzata. IMPORTANTE! Non rimuovere alcun componente dal blocco polimerico inferiore. 6. Montare ladattatore per siringa da 6 mm sulla siringa priva di silicone da 20 mL.
2.
3. 4.
Rimozione di bolle daria dal blocco polimerico superiore

1. Abbassare la siringa della riserva del polimero per convogliare le bolle daria verso la parte inferiore destra del blocco. Nota. Spingere lentamente (o picchiettare) per utilizzare la quantit minima di polimero. Abbassare lentamente la siringa di riempimento della schiera per convogliare le bolle lungo in canale. Lo bolle si raccolgono nel punto di congiunzione dei canali.
Pagina 60 di 68
3.
Espellere le bolle. a. Tenendo premuta la valvola a perno del tampone anodico, abbassare la siringa di riempimento della schiera per creare pressione nei canali. b. Rilasciare la valvola a perno del tampone anodico (continuando ad abbassare la siringa di riempimento della schiera) per espellere le bolle nel tubo del blocco polimerico. Ripetere la fase 3 secondo la necessit. IMPORTANTE! Prima di procedere, verificare che tutte le bolle daria siano state espulse dai tubi e convogliate nel serbatoio inferiore della soluzione tampone. Nei tubi o canali del blocco polimerico inferiore non deve essere presente alcuna bolla.
Posizionamento della piastra sul campionatore automatico

1. 2. Premere il pulsante Tray (vassoio). Posizionare lunit piastra sul campionatore automatico. Utilizzare le posizioni A o B per il 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100) o la posizione B per il 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant). Nota. La piastra pu essere orientata in una sola direzione: con la tacca sullestremit della base rivolta in direzione opposta rispetto alloperatore. IMPORTANTE! Accertarsi che lunit piastra sia posizionata in piano sul campionatore automatico. In caso contrario le estremit dei capillari potrebbero sollevare lunit piastra rispetto al campionatore automatico. 3. Quando la piastra posizionata correttamente, lindicatore di posizione della piastra sulla pagina Plate View (visualizzazione piastra) cambia da grigio a giallo. Verificare che questo sia accaduto, prima di procedere. Chiudere gli sportelli dello strumento. Nota. La chiusura degli sportelli determina il ritorno al campionatore automatico nella posizione di partenza e il posizionamento delle estremit di capillari nella soluzione tampone.
4.
Campionatore automatico
Calibrazione
Calibrare il campionatore automatico in caso di: 1. iniezione non perfettamente riuscita per un numero ridotto di capillari bassa intensit del segnale nessuna traccia del campione Selezionare Tools > Autosampler Calibration Wizard (strumenti > procedura guidata per la calibrazione del campionatore automatico). Seguire le istruzioni del wizard (procedura guidata).
4.
Manutenzione del computer

Controllo dello spazio disponibile sul disco rigido
2.
Unit piastra
Assemblare i componenti dellunit piastra.
1.
Fare doppio clic sullicona My Computer (risorse del computer) sul desktop per visualizzare le unit disponibili. Da My Computer (risorse del computer) fare clic con il tasto destro del mouse sullunit D e selezionare Properties (propriet). Usare la finestra di dialogo Properties (propriet) per visualizzare lo spazio utilizzato e lo spazio libero. Utilizzare la tabella seguente per calcolare lo spazio libero necessario.
Tipo di file Spazio approssimativo richiesto per file (kB)* 250
2.
Preparazione di ununit piastra

3. 1. Fissare un setto pulito e asciutto sulla piastra dei campioni. IMPORTANTE! Non usare mai piastre deformate. IMPORTANTE! Verificare che i setti per piastra siano collocati in piano sopra la piastra. I fori nel fermapiastra devono essere allineati ai fori dei setti per evitare che le estremit dei capillari vengano danneggiate. 2. 3. Collocare la piastra dei campioni sulla base della piastra. Far scattare il fermapiastra sulla piastra dei campioni e sulla base della piastra. Accertarsi che i fori del fermapiastra siano correttamente allineati con quelli della striscia di setti. IMPORTANTE! In caso contrario le estremit dei capillari potrebbero risultare danneggiate. 5. 4.
File di campioni analizzati per il sequenziamento del DNA File di campioni non analizzati
100
4.
* I valori forniti sono semplici stime. Le dimensioni effettive dei file dipendono dal modulo di analisi selezionato.
Se necessario, liberare spazio: archiviando i file di campioni su un CD-RW o altro supporto cancellando i file originali dallunit
Pagina 61 di 68
Archiviazione dei dati

Installazione di una periferica di archiviazione SCSI
Linstallazione di una periferica di archiviazione SCSI sulla workstation non unopzione consigliata. Tuttavia, se necessario installarne una temporaneamente, seguire la procedura descritta sotto. IMPORTANTE! Non installare una periferica SCSI sulla workstation prima di aver installato il 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100 o 3100-Avant) con il 3100 or 3100-Avant Data Collection software (software di raccolta dati del 3100 o 3100-Avant). Questo infatti determinerebbe una diversa assegnazione delle lettere alle unit, con la conseguente impossibilit di installare correttamente lo strumento e il software. 1. 2. 3. 4. Arrestare il sistema operativo della workstation. Collegare la periferica alla porta esterna SCSI. Riavviare il sistema operativo della workstation. Accertarsi che lassegnazione delle lettere non sia cambiata.
Calibrazione spaziale e spettrale

Esecuzione di una calibrazione spaziale
Casi in cui eseguire la calibrazione
La calibrazione spaziale deve essere eseguita ogni volta in cui viene installata sullo strumento una schiera di capillari nuova o usata, dopo aver rimosso temporaneamente la schiera dal blocco di rilevamento o quando lo strumento stato spostato. Nota. I 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici 3100/3100-Avant) devono essere spostati da un tecnico qualificato del servizio assistenza clienti di Applied Biosystems. La calibrazione spaziale effettua una mappatura della posizione di ciascun capillare rilevato dalla camera CCD (charge-coupled device) (ossia dispositivo ad accoppiamento di carica). Le analisi di calibrazione spaziale durano 2 minuti (6 min. per le analisi di riempimento dei capillari e di calibrazione spaziale). In questo periodo di tempo, vengono raccolte e sommate varie frame di dati. I dati raccolti vengono analizzati e salvati sotto forma di mappa spaziale.
Nota. Prima di unanalisi o di un gruppo di analisi, il software di raccolta dati controlla automaticamente che lo spazio disponibile sia sufficiente per memorizzare i dati che verranno creati. Se lo spazio nel database non sufficiente (circa il 75% di spazio occupato), utilizzare lutilit Cleanup Database (pulitura database) per eliminare dati e record della piastra.
Procedura di calibrazione
1. Selezionare Tools > Perform Spatial Calibration (strumenti > esegui calibrazione spaziale). Nella finestra di dialogo Perform Spatial Calibration (esegui calibrazione spaziale), selezionare Fill capillaries (riempi capillari) solo se i capillari non contengono polimero. Non necessario riempire i capillari ogni volta in cui si esegue una calibrazione spaziale. Fare clic su Start (avvio). La calibrazione dura circa: 2 min senza riempimento dei capillari 6 min con riempimento dei capillari
Se la calibrazione ... Riuscita Allora... Si apre la finestra di dialogo Perform Spatial Calibration (esegui calibrazione spaziale) e si procede nel modo seguente: a. Fare clic su Details (dettagli) per visualizzare la finestra Spatial Calibration Profile (profilo di calibrazione spaziale). b. Procedere con Valutazione e salvataggio dei dati (paragrafo seguente). Viene visualizzata una casella con un messaggio di errore che fornisce alcune informazioni sul motivo del fallimento; a questo punto: a. Fare clic su Details (dettagli) per visualizzare la finestra Spatial Calibration Profile (profilo di calibrazione spaziale). b. Effettuare una delle seguenti procedure: Far clic su Cancel (annulla) e quindi su Start (avvio) per ripetere la calibrazione. Eseguire le opportune azioni di correzione.
2.
Eliminazione dei record dal database

Lutilit Cleanup Database (pulizia database) elimina tutti i dati delle analisi e dei record della piastra contenuti nel database. Prima di avviare lutilit, assicurarsi che tutte le analisi siano state estratte dal database. 1. 2. 3. Accertarsi che OrbixWeb Daemon sia in esecuzione. Uscire dal software di raccolta dati. Utilizzare Windows NT Explorer, per spostarsi su: D:\AppliedBio\3100\Bin o D:\AppliedBio\3100-Avant\Bin Trovare e fare doppio clic su CleanUpDB (pulitura database). Viene avviata lutilit Cleanup Database (pulitura database) che richiede alcuni secondi per essere completata. Arrestare e riavviare OrbixWeb Daemon. Se questa operazione non viene eseguita, i nuovi dati dellanalisi non vengono salvati nel database. Nota. Non necessario re-importare i metodi di calibrazione spaziale, spettrale e di analisi o i dati di calibrazione ottenuti dalle ultime analisi di calibrazione. 3.
4.
4.
Fallita
5.
Pagina 62 di 68
Valutazione e salvataggio dei dati

1. Esaminare il profilo della calibrazione spaziale. Quando viene visualizzato il profilo di calibrazione della finestra di dialogo Details (dettagli) utilizzare i seguenti criteri per valutare i dati:
Attributo picco Altezza Crocette rosse Criterio Altezze simili per tutti i picchi. Il vertice di ogni picco contrassegnato da una crocetta rossa. Nessuna croce posizionata in modo errato. Per spostare una crocetta: a. Modificare il valore di una casella Capillary Position (posizione del capillare). b. Fare clic allesterno di quella casella. c. Fare clic su OK per accettare il nuovo valore. Un solo picco appuntito per ogni capillare. Piccoli picchi secondari sono accettabili.
Sostituzione della mappa di calibrazione spaziale corrente

Se i dati di analisi non sono soddisfacenti quando viene utilizzata la mappa corrente, possibile sostituire i dati di calibrazione con: i dati raccolti durante unanalisi precedente sulla stessa schiera di capillari, se la cella di rilevamento non stata spostata una mappa di calibrazione spaziale utilizzata per elaborare eventuali analisi precedenti dei campioni ancora memorizzate nel database
IMPORTANTE! La sostituzione dei dati di calibrazione consentita solo se n la schiera di capillari, n la cella di rilevamento sono state spostate. Non utilizzare i dati di calibrazione raccolti da unaltra schiera di capillari. 1. Selezionare File > Override Spatial Calibration (file > sostituisci calibrazione spaziale). Selezionare il file di calibrazione spaziale da utilizzare e fare clic su OK. Visualizzare il profilo spaziale e accettarlo o rifiutarlo.
Se il profilo ... Fare clic su... OK Cancel (annulla) Ripetere le fasi 1 e 2.
Forma Spaziature
2. 3.
La spaziatura teoretica tra i capillari 15.
2.
Se il profilo di calibrazione spaziale ... Soddisfacente Insoddisfacente
Allora... Fare clic su OK e procedere alla fase 3. Eseguire una o pi delle operazioni seguenti: Far clic su Cancel (annulla) per chiudere la finestra Details (dettagli), quindi su Start (avvio) per ripetere la calibrazione. Riposizionare una o pi crocette rosse. Per spostare una crocetta, modificare il valore nella casella Capillary Position (posizione del capillare), quindi fare clic al di fuori della casella. Sostituire i dati con i dati dellanalisi precedente.
Accettabile Non accettabile
4.
Quando si apre la finestra di dialogo Question (domanda), fare clic su Yes (s). Questa finestra di dialogo diventa la mappa di calibrazione spaziale corrente e la finestra di dialogo Question (domanda) si chiude.
3.
Quando si apre la finestra di dialogo Question (domanda), fare clic su Yes (s). I dati diventano la calibrazione spaziale corrente e vengono salvati nello strumento e nel database.
Esecuzione di una calibrazione spettrale

Casi in cui eseguire la calibrazione
La calibrazione spettrale va effettuata: ogni volta che si usa una nuova serie di coloranti sullo strumento ogni volta in cui un tecnico dellassistenza riallinea/sostituisce laser, ottiche o telecamera CCD quando si comincia a notare una riduzione della separazione spettrale (picchi in salita e/o in discesa)
In caso di fallimento della calibrazione

Ripetere la calibrazione. Riempire i capillari di polimero, quindi ripetere la calibrazione. Pulire la cella di rilevazione e ripetere la calibrazione. Riposizionare la finestra della schiera nella cella di rilevamento, quindi ripetere la calibrazione. Provare con unaltra schiera di capillari.
Procedura di calibrazione
Una calibrazione spettrale unanalisi che produce una descrizione matematica della sovrapposizione di una data serie di coloranti negli spettri di emissione. Questa descrizione matematica chiamata matrice ed richiesta per ogni capillare. Il processo di applicazione di una matrice ai dati dei campioni definito multicomponenting.
Visualizzazione del profilo di calibrazione spaziale

1. Selezionare Tools > Display Spatial Calibration (strumenti > visualizza calibrazione spaziale). Selezionare il profilo della schiera desiderato nella finestra di dialogo Question (domanda).
Per visualizzare il profilo di... La schiera corrente
Per la calibrazione spettrale del sistema ViroSeq

Utilizzare:
ABI 4336791 BigDye Terminator Sequencing Standard v.1.1 (standard di sequenziamento BigDye Terminator v.1.1)
2.
Allora... Fare clic su Current Array (schiera corrente) Si apre la casella Spatial Calibration Profile (profilo di calibrazione spaziale) per i dati di calibrazione correnti. Nota. La barra del titolo viene ora visualizzata come Current Spatial Calibrations (calibrazioni spaziali correnti). a. b. c. Fare clic su Previous run (analisi precedente). Selezionare lanalisi desiderata nella finestra di dialogo Select the source to display (selezionare la fonte da visualizzare). Fare clic su OK.
Unanalisi precedente
Pagina 63 di 68
Preparazione e caricamento del BigDye Terminator Sequencing Standard (standard di sequenziamento BigDye Terminator) sui 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici 3100 o 3100-Avant)
1. Preparare in una provetta una nuova sospensione di BigDye Terminator Sequencing Standard (standard di sequenziamento BigDye Terminator) con 170 L di formammide Hi-Di.
3.
Compilare il foglio di calcolo Plate Editor (editor piastra) per i pozzetti caricati.
a. Digitare il nome da attribuire ai campioni.
b. Selezionare Dye Set E (set di coloranti E). c. Selezionare il modulo di analisi: Spect50_POP6DefaultModule d. Selezionare il file di parametri spettrali: SeqStd{Sequencing-SetE}.par e. Fare clic su OK. IMPORTANTE! Controllare di aver selezionato il file di parametri spettrali corretto. La selezione di un file di parametri non corretto determina il fallimento della calibrazione spettrale. Questa procedura crea un record della piastra per lanalisi di calibrazione nel database. Dopo qualche secondo, i dati inseriti per il record della piastra vengono visualizzati nella tabella Pending Plate Records (record delle piastre in attesa) della pagina Plate Setup (impostazione piastra).
Contiene formammide. R 61 Pu danneggiare i bambini non ancora nati. R 36/38 Irritante per gli occhi e la pelle. S 53 Evitare lesposizione - procurarsi speciali istruzioni prima delluso. S 24/25 Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. S 35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37/39 Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S 45 In caso di incidente o malessere, consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli letichetta). 2. Agitare al vortex la soluzione standard 10-15 secondi, per miscelare a fondo. Centrifugare la miscela per 10-15 secondi a 2.000 g in una microcentrifuga. Prelevare 10 L di soluzione standard per la MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra a reazione ottica da 96 pozzetti MicroAmp) e caricare i pozzetti da A1 a H2 per il 3100 Genetic Analyzer (analizzatore generico 3100) o i pozzetti da A1 a D1 per il 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant). Coprire la piastra e centrifugare per 5-10 secondi a 2.000 g. Riscaldare la piastra a 95 C per 2 minuti per denaturare le soluzioni standard. Raffreddare velocemente la piastra con ghiaccio per 2 minuti. Caricare immediatamente la piastra nel 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100 o 3100-Avant). IMPORTANTE! Non conservare la piastra.
Avvio della calibrazione

1. Far clic su Run Instrument (avvia strumento) sulla barra dei menu per avviare lanalisi. La durata dellanalisi di circa 65 minuti.
Finestra Spectral Calibration Result (risultati della calibrazione spettrale)

Un capillare che ha superato la calibrazione rappresentato da un . (punto). Un capillare che non ha superato la calibrazione rappresentato da una X. Per confermare che lanalisi di calibrazione stata completata, fare clic su OK. IMPORTANTE! Rivedere e valutare il profilo di calibrazione spettrale per ogni capillare, anche quando la finestra Spectral Calibration Results (risultati della calibrazione spettrale) indica che tutti i capillari hanno avuto esito positivo.
3.
4.
Capillari con risultato negativo

Ad un capillare non accettato viene automaticamente assegnato il profilo spettrale del capillare pi vicino, sulla sinistra, che stato accettato. Se non sono presenti capillari accettati sulla sinistra, verr assegnato il profilo spettrale del capillare pi vicino, sulla destra, che stato accettato. Questi capillari vengono contrassegnati in giallo anzich in verde nella finestra Array View (visualizza schiera). IMPORTANTE! Per lanalisi ViroSeq, in cui i picchi in salita e in discesa possono causare errori critici, ripetere la calibrazione spettrale e utilizzare un unico spettro per ogni capillare.
5. 6.
7. 8.
In caso di fallimento della calibrazione

Provare una o pi delle procedure seguenti: verificare che siano stati selezionai il file dei parametri e il modulo di analisi corretti. In caso contrario, correggere la selezione e ripetere lanalisi; verificare quando sono stati preparati i reagenti. Se i reagenti sono vecchi, conservati impropriamente, o scaduti, preparare del nuovo reagente e ripetere lanalisi; verificare che tutti i picchi siano stati rilevati. La lentezza del sistema pu causare lesclusione parziale o totale del picco blu. Prolungare la durata dellanalisi o cambiare i reagenti, se sospetti, e ripetere lanalisi.
Creazione di un record della piastra

1. Nella pagina Plate View (visualizza piastra) del software di raccolta dei dati, fare clic su New (nuovo). Attribuire un nome e una categoria alla piastra:
a. b. c. d. Inserire un nome. Selezionare Spectral Calibration (calibrazione spettrale). Selezionare 96-Well (96 pozzetti). Fare clic su Finish (fine).
2.
Pagina 64 di 68
Visualizzazione del profilo della calibrazione spettrale

Verifica del profilo corrente
1. Selezionare Tools > Display Spectral Calibration (strumenti > visualizza calibrazione spettrale). Nella finestra di dialogo Question (domanda), fare clic su Dye set (set coloranti). Nella finestra di dialogo che si apre, usare il menu a discesa per selezionare il set di coloranti E, quindi fare clic su OK. Nella finestra Matrix (matrice) per il set di coloranti, usare i pulsanti freccia o la barra di scorrimento per rivedere i dati relativi a ogni capillare. Per una calibrazione di buona qualit, ciascun capillare deve avere: Valore Q maggiore di 0,95 Numero di condizione compreso nel range 3,0-5,0 Per ingrandire limmagine: a. Tenendo premuto il tasto Shift (Maiusc) fare clic con il mouse su un punto dellarea di interesse e trascinare il puntatore per creare una casella tutto intorno. b. Rilasciare il puntatore per visualizzare limmagine ingrandita. c. Per tornare alla visualizzazione precedente, premere R. Fare clic su Cancel (annulla) per chiudere la finestra di dialogo.
2.
3.
4.
5.
6.
Verifica dei profili utilizzati per analisi precedenti

1. Selezionare Tools > Display Spectral Calibration (strumenti > visualizza calibrazione spettrale). Nella finestra di dialogo Question (domanda), fare clic su Previous run (analisi precedente). Nellelenco a discesa, selezionare lanalisi che si desidera visualizzare e fare clic su OK. Nel file di calibrazione spettrale, utilizzare la barra di scorrimento per esaminare ogni capillare. Dopo aver esaminato tutti i dati, fare clic su Cancel (annulla).
2.
3.
4.
5.
Pagina 65 di 68
Sezione 7: Bibliografia
Riferimenti citati
1. Barre-Sinoussi, F., et al. 1983. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Science 220: 868-871. Popovic, M, et al. 1984. Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 224: 497-500. Hammer, S. M., et al. 1997. A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less. N Engl J Med 337: 725-733. Palella, F. J., Jr., et al. 1998. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. N Engl J Med 338: 853-860. Furtado, M. R., et al. 1999. Persistence of HIV-1 transcription in peripheralblood mononuclear cells in patients receiving potent antiretroviral therapy. N Engl J Med 340: 1614-1622. Zhang, L., et al. 1999. Quantifying residual HIV-1 replication in patients receiving combination antiretroviral therapy. N Engl J Med 340: 1605-1613. Condra, J. H., et al. 1995. In vivo emergence of HIV-1 variants resistant to multiple protease inhibitors. Nature 374: 569-571. Shafer, R. W., et al. 1998. Multiple concurrent reverse transcriptase and protease mutations and multidrug resistance of HIV-1 isolates from heavily treated patients. Ann Intern Med 128: 906-911. Little S. J., et al. 2002. Antiretroviral-drug resistance among patients recently infected with HIV. N Engl J Med 347:385-394. U.S. Food and Drug Administration, Drugs Used in the Treatment of HIV Infection. January 2008. Available at http://www.fda.gov/oashi/aids/virals.html. Richman, D., et al. 1991. Human immunodeficiency virus type 1 mutants resistant to nonnucleoside inhibitors of reverse transcriptase arise in tissue culture. Proc Natl Acad Sci USA 88:11241-11245. Havlir, D. V., et al. 2000. Drug susceptibility in HIV infection after viral rebound in patients receiving indinavir-containing regimens. JAMA 283: 229234. Johnson, V. A., et al. 2007. Update of the Drug Resistance Mutations in HIV-1:2007. Top HIV Med 15(4):119-25. Baxter, J. D., et al. 2000. A randomized study of antiretroviral management based on plasma genotypic antiretroviral resistance testing in patients failing therapy. AIDS 14: F83-93. Durant, J., et al. 1999. Drug-resistance genotyping in HIV-1 therapy: the VIRADAPT randomized controlled trial. Lancet 353: 2195-2199. Zolopa, A. R., et al. 1999. HIV-1 genotypic resistance patterns predict response to saquinavir-ritonavir therapy in patients in whom previous protease inhibitor therapy had failed. Ann Intern Med 131: 813-821. Panel on Antiretroviral Guidelines for Adult and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. Department of Health and Human Services. January 29, 2008; 1-128, Available at http://www.aidsinfo.nih.gov/ContentFiles/AdultandAdolescentGL.pdf. The European HIV Drug Resistance Guidelines Panel. In collaboration with the European AIDS Clinical Society. European HIV Drug Resistance Guidelines 2006 update. Available at http://www.rega.kuleuven.be/cev/fileadmin/ guidelines/GuidelinesPocketGuide2006.pdf. Mukaide, M., et al. 2000. Evaluation of ViroSeq-HIV version 2 for HIV drug resistance. Jpn J Infect Dis 53: 203-205. Cunningham, S., et al. 2001. Performance of the Applied Biosystems ViroSeq human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) genotyping system for sequence-based analysis of HIV-1 in pediatric plasma samples. J Clin Microbiol 39:1254-1257.
2.
3.
4.
5.
6. 7. 8.
9. 10. 11.
12.
13. 14.
15. 16.
17.
18.
19. 20.
21. Quillent, C., Dumey, N., Dauguet, C., and Clavel, F. 1993. Reversion of a polymerase-defective integrated HIV-1 genome. AIDS Res Hum Retroviruses 9(10):1031-1037. 22. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Stock no. 017-04000547-4. U.S. Department of Health and Human Services. 23. Protection of Laboratory Workers from Infections Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue, specifically dealing with all aspects of this issue. NCCLS, M29-T. 24. Folks, T. M., et al. 1986. Biological and biochemical characterization of a cloned Leu-3 cell surviving infection with the acquired immune deficiency syndrome retrovirus. J Exp Med 164(1):280-290. 25. Winters, M. A., et al. 1998. A 6-basepair insert in the reverse transcriptase gene of human immunodeficiency virus type 1 confers resistance to multiple nucleoside inhibitors. J Clin Invest 102:1769-1775. 26. Lukashov, V., et al. July 2000. Selection by AZT and rapid replacement in the absence of drugs of HIV-1 resistant to multiple nucleoside analogs. AIDS Res Hum Retroviruses 17(9):807-818. 27. Richman, D. D. 1998. How drug resistance arises. Scientific American, July:8889. 28. Guidance for Industry: Class II Special Controls Guidance Document: In Vitro HIV Drug Resistance Genotype Assay. August 2007 (Tables A and B). 29. Moyle, G. J. 1997. Viral resistance patterns selected by antiretroviral drugs and their potential to guide treatment choice. Exp Opin Invest Drugs 6(8):943-964. 30. DAquila, R. T., et al. 2003. Drug Resistance Mutations in HIV. Topics in HIV Medicine 11(3):92-96. 31. DeGruttola, V., et al. 2000. The relation between baseline HIV drug resistance and response to antiretroviral therapy: re-analysis of retrospective and prospective studies using a standardized data analysis plan. Antivir Ther 5(1):41-48. 32. Demeter, L., and Haubrich, R. 2001. Phenotypic and genotypic resistance assays: Methodology, reliability, and interpretations. J Acquir Immune Defic Syndr 26, Suppl 1:S3-9. 33. Deeks, S. G., et al. 2001. Virologic and immunologic consequences of discontinuing combination antiretroviral-drug therapy in HIV-infected patients with detectable viremia. N Engl J Med 344:472-480. 34. Harrigan, P. R., and Ct, H. C. F. 2000. Clinical utility of testing human immunodeficiency virus for drug resistance. Clin Infect Dis 30, Suppl 2:S117122. 35. Pellegrin, I., et al. 1999. Emergence of zidovudine and multidrug-resistance mutations in the HIV-1 reverse Transcriptase gene in therapy-naive patients receiving stavudine plus didanosine combination therapy. STADI Group. Aids 13:1705-1709. 36. Rhee, S. Y., M.J. Gonzales, et al. 2003. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase and protease sequence database. Nucleic Acids Res 31(1):298-303. 37. Parkin N. T., et al. 2004. Natural variation of drug susceptibility in wild-type HIV-1. Antimicrob Agents Chemother 48:437-43. 38. Kempf D. J., et al. 2001. Identification of genotypic changes in human immunodeficiency virus protease that correlate with reduced susceptibility to the protease inhibitor lopinavir among viral isolates from protease inhibitorexperienced patients. J Virol 75:7462-9. 39. Colonno R. J., et al. 2003. Activities of Atazanavir (BMS-232632) against a Large Panel of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Clinical Isolates Resistant to One or More Approved Protease Inhibitors. Antimicrob Agents Chemother 47: 1324-33. 40. Rhee S. Y., et al. 2004. Distribution of human immunodeficiency virus type 1 protease and reverse transcriptase mutation patterns in 4,183 persons undergoing genotypic resistance testing. Antimicrob Agents Chemother 48:3122-6. 41. Doyon, L., et al. 2005. Selection and characterization of HIV-1 showing reduced susceptibility to the non-peptidic protease inhibitor tipranavir. Antiviral Res. 68(1):27-35. 42. Larder B. A., et al. 2000. Tipranavir inhibits broadly protease inhibitor-resistant HIV-1 clinical samples. AIDS 14(13):1943-8.
Pagina 66 di 68
43. Parkin N., et al. 2005. Protease mutations associated with higher or lower than expected Tipranavir (TPV) susceptibility based on the TPV mutation score [poster 637]. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Denver, CO. 44. Katlama, C., et al. 2007. Efficacy and safety of TMC114/ritonavir in treatmentexperienced HIV patients: 24-week results of POWER 1. AIDS. 21(4):395-402. 45. Clotet, B., et al. 2007. Efficacy and safety of darunavir-ritonavir at week 48 in treatment-experienced patients with HIV-1 infection in POWER 1 and 2: a pooled subgroup analysis of data from two randomised trials. Lancet. 369:11691178. 46. De Meyer, S., et al. 2005. TMC114, a Novel Human Immunodeficiency Virus Type 1 Protease Inhibitor Active against Protease Inhibitor-Resistant Viruses, Including a Broad Range of Clinical Isolates. Antimicrob Agents Chemother. 49(6):2314-2321. 47. Lambert-Niclot, S., et al. 2007. Factors associated with the selection of mutations conferring resistance to protease inhibitors in PI-experienced patients displaying treatment failure on darunavir. Antimicrob Agents Chemother. http://aac.asm.org/cgi/content/abstract/AAC.00909-07v1. 48. Andries, K., et al. 2004. TMC125, a Novel Next-Generation Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor Active against Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor-Resistant Human Immunodeficiency Virus Type 1. Antimicrob Agents Chemother. 48(12):4680-4686. 49. Lazzarin, A., et al. 2007. Efficacy and safety of TMC125 (etravirine) in treatment-experienced HIV-1-infected patients in DUET-2: 24-week results from a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 370:39-48. 50. Vingerhoets, J., et al. 2005. TMC125 Displays a High Genetic Barrier to the Development of Resistance: Evidence from In Vitro Selection Experiments. J Virology. 79(20):12773-12782.
Pagina 67 di 68
Pagina 68 di 68
2001-2008 Celera. Tutti i diritti riservati. NOTA PER LACQUIRENTE: LICENZA LIMITATA La vendita di questo prodotto regolata dagli accordi di licenza stipulati tra Celera, un'azienda Applera Corporation, e Invitrogen Corporation. Il prezzo di acquisto di questo prodotto comprende diritti non trasferibili e limitati protetti dai brevetti US 5,035,996; 5,683,896; 5,945,313 e 6,287,823 e dagli equivalenti brevetti stranieri di propriet di Invitrogen Corporation al fine di usare solo la quantit di prodotto stabilita per gli scopi indicati dal brevetto con uso esclusivo da parte dellacquirente nel campo della diagnostica umana. Per ulteriori informazioni sullacquisto di licenze protette dai brevetti citati sopra, contattare il Licensing Department, Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, CA 92008. Brevetti statunitensi numero 6,806,046 Brevetti statunitensi numero 6,531,588 Brevetti statunitensi numero 6,379,957 MARCHI DI FABBRICA ABI PRISM e i suoi Design, Applied Biosystems, BigDye, MicroAmp, AB (Design), Applera, Celera e il suo logo Spirit, POP-6, Hi-Di, e ViroSeq sono marchi di fabbrica e marchi registrati di Applera Corporation o delle sue affiliate negli Stati Uniti e/o in altri paesi. AmpErase, AmpliTaq, AmpliTaq Gold, e GeneAmp sono marchi registrati di Roche Molecular Systems, Inc. CENTRISEP 96 un marchio di fabbrica di Princeton Separations, Inc. ExoSAP-IT un marchio registrato di USB Corporation. Intel, Pentium e Core sono marchi di fabbrica e marchi registrati di Intel Corporation. Java un marchio di fabbrica di Sun Microsystems, Inc. Microsoft, Windows e Windows NT sono marchi registrati di Microsoft Corporation. Oracle un marchio registrato di Oracle corporation. OrbixWeb un marchio di fabbrica di IONA Technologies, Inc. Tutti gli altri marchi di fabbrica sono di propriet esclusiva delle rispettive societ ogo.
DRAFT
March 14, 2007 4:54 pm, ViroSeq IFU Back.fm
Celera 1401 Harbor Bay Parkway Alameda, CA 94502 USA
Vendite e assistenza a livello internazionale Per gli indirizzi degli uffici vendite e assistenza tecnica, telefonare al distributore Abbott Molecular locale.
CELERA
Applera Corporation leader mondiale nella fornitura di tecnologie e informazioni nel settore delle scienze biologiche. Applera Corporation comprende le aziende Applied Biosystems e Celera. Stampato negli USA, 03/2008

ViroSeq v2 - 8 - Italian - IFU

Caricato da

Informazioni sul documento

Titolo originale

Copyright

Formati disponibili

Condividi questo documento

Condividi o incorpora il documento

Opzioni di condivisione

Hai trovato utile questo documento?

Questo contenuto è inappropriato?

Copyright:

Formati disponibili

ViroSeq v2 - 8 - Italian - IFU

Caricato da

Copyright:

Formati disponibili

CELERA

Istruzioni per luso

ABBOTT Max-Planck-Ring 2 65205 Wiesbaden Germany + 49-6122-580

Preparazione e trattamento del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0

Analisi di ViroSeq HIV -1 Genotyping System Software v2.8. . . . . . . .24

Caratteristiche di rendimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48

ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0

Principi della procedura

Al fine di utilizzare ViroSeq HIV-1 Genotyping System:

Indicazioni per luso

Legenda dei simboli

Numero di catalogo Applied Biosystems

Consultare le istruzioni per luso

Pericolo di scossa elettrica/incendio

Rappresentante autorizzato nella Comunit Europea

Dispositivo medico per la diagnostica In Vitro

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

Sezione 2: Preparazione e trattamento del campione

Colore del tappo Blu

Verde Giallo Chiaro Chiaro

Reagenti del Pack 1 (confezione 1)

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

ViroSeq HIV-1 Sequencing Module

Colore del tappo

Colore del tappo

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

Requisiti per la conservazione ed il trattamento

ViroSeq HIV-1 8E5 Control Module

Conservare a 15 C a 25 C In congelatore a scongelamento manuale destinato a materiale privo di ampliconi

ViroSeq HIV-1 KCl

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

B. Trasporto dei prelievi

C. Conservazione dei prelievi

4315932 4317237 4317241 4315933 N801-0560

4304470 628-3731 221102 4316357 402824 4311320

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

Materiali non forniti

Impedire la degradazione dellRNA

Ultimata la procedura di A. Preparazione del campione B. Trascrizione inversa

Conservare i campioni a... 65 C a 80 C 15 C a 25 C 15 C a 25 C 15 C a 25 C 15 C a 25 C

Per un massimo di... 2 settimane 2 settimane 2 settimane 3 giorni 1 settimana

Allestimento dellarea di lavoro

C. PCR D. Sequenziamento ciclico E. Sequenze purificate

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

A2. Isolamento dellRNA virale dellHIV-1

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

B2. Allestimento delle reazioni RT

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

C2. Allestimento della reazione PCR

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

D1. Purificazione e quantificazione dei prodotti della PCR

Corsia da 6 L (ng) 100 60 40

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

Bande Posizione Superiore Seconda Terza 9. Dimensione (kb)

Opzione 2: ExoSAP-IT per il clean-up dei prodotti della PCR

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

D2. Preparazione del sequenziamento ciclico

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

Impostare il programma del termociclatore come indicato nella tabella seguente:

D3.b Purificazione con etanolo/acetato di sodio

D3. Purificazione delle sequenze

D3.a Purificazione delle sequenze con isopropanolo