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Anti-HBs
La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada fila contiene una solucin reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una fila a otra, con un perodo de incubacin en cada etapa. Para comenzar la prueba, las muestras de suero o plasma son agregadas al diluyente en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo. Luego se inserta el Peine en los pocillos de la fila A. Los anticuerpos anti-HBs, en caso de estar presentes en las muestras, se unirn con el HBsAg en los puntos inferiores del diente del Peine (Figura 1). Los componentes no unidos son lavados en la fila B. En la fila C, los anticuerpos anti-HBs capturados en los puntos inferiores del diente reaccionarn con el HBsAg biotinilado. En la fila D el complejo antgeno biotinilado/anticuerpo en los puntos inferiores del diente, y la albmina de suero bovino biotinilada de los puntos superiores (Control Interno) reaccionarn con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (FA). En la fila E, los componentes no ligados son eliminados mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reaccionar con un sustrato cromognico. Los resultados pueden verse como puntos azul grisceos en la superficie del diente del Peine.
Formacin del complejo HBsAg-anticuerpo; 120 min/37C
anti-HBs
Cdigo: 60453002
Formato: 3 x 12 pruebas
B B
Uso Previsto
HBsAg biotinilado
FA B SA B SA FA
El kit ImmunoComb II Anti-HBs es una prueba semicuantitativa rpida para la deteccin de anticuerpos contra el antgeno de superficie de la Hepatitis B en suero o plasma humano.
Introduccin
El vrus de la hepatitis B (HBV) pertenece a una nueva familia de vrus de ADN llamados Hepadnaviridae. Se caracteriza por un marcado hepatotropismo y un singular medio de replicacin a travs de un mecanismo de transcripcin inversa. El virin completo, o partcula Dane, consiste de una molcula de ADN circular protegida por un antgeno nucleocspide/nuclear (HBcAg) y rodeada por un envoltorio de lipoprotena conocido como antgeno de superficie (HBsAg). El HBsAg tambin se encuentra en la sangre en forma de partculas incompletas esfricas o filamentosas no infecciosas. Un componente menor del nucleocspide HBV, el antgeno HBe (HBeAg), tambin puede detectarse en la sangre durante la fase replicativa del virus. El vrus de la hepatitis B es un vrus ubicuo de distribucin global. Las principales rutas de trasmisin viral son horizontales, a travs de la contaminacin sexual y parenteral, y vertical, a travs de la trasmisin prenatal de la madre infectada al feto. Las consecuencias clnicas de la infeccin de HBV varan entre las totalmente inaparentes (70% de los casos) a la hepatitis ictrica aguda. La mayora de los pacientes se recuperan completamente seis meses despus del comienzo de la enfermedad. Una pequea proporcin de la poblacin infectada (<1.5%) puede desarrollar hepatitis fulminante, a menudo con consecuencias fatales. En una proporcin sustancial (hasta 10%) de los pacientes adultos, el HBV puede persistir, progresando eventualmente hasta la hepatitis crnica con desarrollo final de cirrosis y hpatocarcinoma. Los portadores crnicos de hepatitis B (200 millones en todo el mundo) constituyen la principal reserva del virus y contribuyen a la diseminacin de la enfermedad. Los anticuerpos contra HBsAg (anti-HBs) son los principales anticuerpos neutralizadores de HBV, que usualmente persisten durante toda la vida y protegen contra la reinfeccin. El nivel de anti-HBs, por lo tanto, sirve como un indicador para evaluar la recuperacin de la infeccin de HBV, o el xito de la vacunacin utilizando partculas de HBsAg. Concentraciones de anticuerpos de 10 IU/L indican inmunidad al HBV.
B SA
estreptavidina (SA) - FA
FA
Figura 2. Peine
Los Peines son suministrados en empaques de aluminio que contienen una bolsa desecante.
Principio de la Prueba
La prueba ImmunoComb II Anti-HBs es un inmunoensayo enzimtico de fase slida (EIA), basado en un principio de reconocimiento doble. La fase slida es un Peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente est sensibilizado en dos reas reactivas: punto superior albmina de suero bovino biotinilada (Control Interno) punto inferior HBsAg recombinante
Bandejas de Desarrollo
El kit contiene 3 Bandejas de Desarrollo, cubiertas con papel de aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesarios para la prueba. La Bandeja de Desarrollo consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una.
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Los contenidos de cada fila son los siguientes: Fila A diluyente de la muestra Fila B solucin de lavado Fila C HBsAg biotinilado Fila D estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina Fila E solucin de lavado Fila F solucin de sustrato cromognico que contiene 5-bromo4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT)
Preparacion de la Bandeja de Desarrollo 1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37C por 45 minutos. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, a ser desechado como desecho biocontaminante al concluir la prueba. 3. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo. Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo; rmpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador, slo cuando las instrucciones de la prueba as lo indiquen. Preparacin del Peine Precaucin: para asegurar el funcionamiento apropiado de la prueba, no toque los dientes del Peine. 1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el Peine. 2. Es posible utilizar todo el Peine y la Bandeja de Desarrollo o solamente una parte. Para utilizar parte del Peine: a. Determine cuantos dientes va a necesitar para analizar las muestras y los controles. Se necesita un diente para cada prueba. Cada diente tiene impreso el nmero de cdigo del kit, "53", para permitir la identificacin de los dientes sueltos. b. Doble y rompa verticalmente el Peine, o crtelo con tijeras (ver Figura 4) para separar el nmero requerido para las pruebas (Nro. de pruebas mas 2 controles). c. Vuelva a meter la porcin no utilizada del Peine en el empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien el envoltorio (con un clip, por ejemplo) a fin de mantenerlo seco. Almacene el Peine en la caja original del kit a temperaturas de 2 a 8C para su uso posterior.
ImmunoComb II
53 53 53 53 53 53 53 53 53 53 53 53
Seguridad y Precauciones
Todos los materiales de origen humano usados en la preparacin del kit pasaron pruebas que demostraron que no son reactivos a HBsAg, as como a anticuerpos de HIV o el virus de la hepatitis C. Ya que ningn mtodo de prueba puede garantizar por completo la ausencia de contaminacin viral, todas las soluciones de referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas. Use guantes quirrgicos y ropas de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o plasma humano. No use la pipeta aspirando con la boca. Deseche todas las muestras, Peines* usados, Bandejas de Desarrollo y otros materiales usados con el kit como desechos biocontaminantes. No mezcle reactivos de lotes diferentes. No use este kit luego de la fecha de caducidad. El kit es enviado a 2-8 C. Durante el transporte el kit puede ser conservado a menos de 30 C durante cortos perodos de tiempo que no excedan de 48 horas. Los controles internos indican que el kit no ha sido daado durante el transporte. Conservar el kit en su caja original a 2-8 C. No congelar el kit. Despus de abrir el kit inicialmente, los componentes deben ser conservados a 2-8 C. El funcionamiento del kit despus de su apertura inicial, es estable hasta la fecha de caducidad del mismo si se conserva a 2-8 C. Despus del uso inicial, el peine y la bandeja de reactivos no pueden ser utilizados ms de tres veces.
Instrucciones de la Prueba
Es posible usar suero o plasma en la prueba. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 das a temperaturas de 2 a 8C antes de la prueba. Para almacenar las muestras por ms de 7 das, conglelas a -20C o a temperaturas ms bajas. Despus de descongelar las muestras de suero, centrifguelas. Use el sobrenadante para la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sdico no han mostrado tener efecto sobre los resultados del test.
Procedimiento de la Prueba
Equipo Necesario
Pipetas de precisin ajustables con puntas desechables con capacidad de 100 l. Tijeras Cronmetro de laboratorio o reloj.
Ponga todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura 37C.
* A menos que sea archivado para consulta posterior
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Segundo Lavado (Fila E) 7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila E. Agite repetidamente durante 2 minutos, como en el paso 4. Mientras tanto, perfore el papel aluminio de la fila F. Despus de 2 minutos, retire el Peine y absorba el lquido adherido. Reaccin de Color (Fila F) 8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle. Incube la Bandeja de Desarrollo con el Peine por exactamente 10 minutos (use el cronmetro) a 37C. Despus de 10 minutos, retire el Peine. Detencin de la Reaccin (Fila E) 9. Inserte de nuevo el Peine en la fila E. Despus de un minuto, retire el Peine y djelo secar al aire.
Orgenics CombScale
ANTI-HBs IU/L 5 10 C+ 25 50 100
Figura 7. CombScale
Documentacin de los Resultados Debido a que el color que aparece en los Peines es estable, es posible archivar los Peines para consulta posterior.
Limitaciones
Como ocurre con otras pruebas ideadas para ser usadas en diagnsticos in vitro, los resultados de esta prueba deben ser evaluados en relacin con todos los sntomas, historial clnico y otras pruebas de laboratorio del paciente. La sensibilidad y especificidad del kit ImmunoComb II Anti-HBs fueron evaluadas en un panel de 170 muestras de suero, en comparacin con dos ensayos de referencia EIA. Los resultados combinados son resumidos en la Tabla 2. Tabla 2. Resultados de la Prueba Ensayo de Referencia Positivo Negativo ImmunoComb II Anti-HBs Positivo 50 2 Negativo 0 118
Resultados de la Prueba
Validacin
Para confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar la validez de los resultados, deben cumplirse las siguientes tres condiciones (ver Figura 5): 1. El Control Positivo debe producir dos puntos en el diente del Peine. 2. El Control Negativo debe producir un punto superior (Control Interno). El punto inferior no aparece o aparece muy tnuemente, sin afectar la interpretacin de los resultados. 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior (Control Interno). Si cualquiera de las tres condiciones no se cumple, los resultados de la prueba no son vlidos y las muestras y controles deben ser reexaminados.
Se calcularon las caractersticas del ensayo, encontrndose los siguientes reultados: Sensibilidad 100 % Especificidad 98.3 %
Control Positivo
Control Negativo
Resultados Invlidos
Repetibilidad
Cada uno de 6 sueros fue evaluado 12 veces en un solo peine, y los resultados fueron cuantificados en lectura de absorbancia. El CV de la medida de los valores no excedi el 10 %.
Reproducibilidad
Seis sueros fueron evaluados por duplicado en 10 kits separados, y los resultados fueron cuantificados en lectura de absorbancia. El coeficiente de variacin (% C.V.) de los resultados no excedi el 10%.
Reaccin cruzada
Reaccin cruzada con muestras positivas para agentes tales como el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis C, citomegalovirus y toxoplasma no fueron significativas.
Interferencia
No se observ interferencia en muestras hemolisadas (hemoglobina hasta 10 mg/ml), lipmicas (Colesterol hasta 281.6 mg/dL; Triglicridos hasta 381.0 mg/dL) y bilirubina alta (hasta 20 mg/dl).
1.
2.
Calibre el CombScale. Coloque el punto inferior en el diente del Control Positivo bajo la intensidad de color ms similar en la escala de colores. Ajuste la regla hasta que aparezca la lectura "10; C+" en la ventanilla sobre la intensidad de color seleccionada. Lea los resultados sin cambiar la posicin calibrada de la regla. Compare la intensidad de color de cada punto inferior con la intensidad ms similar en la escala de colores. Registre el valor indicado en la ventanilla sobre esa intensidad como el ttulo aproximado de anti-HBs para la muestra correspondiente.
Follet EAC. 1988. Diagnosis of hepatitis B infection. In: Hugh Y, McMillan A, eds. Immunological diagnosis of sexually transmitted diseases. Marcel Dekker, New York. pp. 433-450. Herrera JL. 1994. Serological diagnosis of viral hepatitis. S Med J 87:677-684. Hollinger FB. 1991. Hepatitis B virus. In: Viral Hepatitis. (Hollinger FB, Purcel RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York. pp 73-138. Kiyasu PK, Caldwell SH. 1993. Diagnosis and treatment of the major hepatotropic viruses. Am J Med Sci 306:248-261. Krugman S, Overby LR, Mushawar IK, Ling C-M, Frsner GG, Deinhart F. 1979. Viral hepatitis, type B: studies on natural history and prevention re-examined. N Engl J Med 300:101-106.
* Datos detallados disponibles
Bibliografa
60453002/S12/OR
Ogra PL, Beutner KR. 1981. Hepatitis viruses. In: Milgrom F, Abeyounis CJ, Kano K, eds. Principles of immunological diagnosis in medicine. Lea & Febiger, Philadelphia. pp 247-259. Robinson WS. 1991. Hepadnaviridae and their replication. In: Viral Hepatitis. (Hollinger FB, Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York.pp 39-71. Swenson PD. 1991. Hepatitis viruses. In: Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. pp 959-983. Fabricante: Representante Autorizado en EU: Orgenics France S.A. 19, rue Lambrechts 92400 Courbevoie, France Tel: +33-1 41 99 92 90 Fax: +33-1 41 99 92 95 Version: 60453002/S12/OR (04/2007)
Orgenics Ltd., part of the Inverness Medical Innovations Group. P.O.B 360 Yavne 70650, Israel Tel: ++ 972 8 942 92 01 Fax: ++ 972 8 943 87 58
ImmunoComb tarjeta Bandejas de Desarrollo Control positivo Control negativo Perforador Consulte las instrucciones de uso Atencin,ver instrucciones de uso
PERFORATOR
IVD
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Perforacin de la Fila B
10
Resultados
2
Manera de romper el Peine
60453002/S12/OR