PRCTICA No.

3 ENSAYO INMUNOENZIMTICO (ELISA) PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPOS CONTRA EL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 Y 2 INTRODUCCIN VIH es la abreviatura de virus de la inmunodeficiencia humana, el virus que causa el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La infeccin por el VIH conduce a una destruccin gradual del sistema inmunitario y a un aumento de la sensibilidad a las infecciones oportunistas. El 80 % de los pacientes infectados por el VIH mueren debido a una infeccin diferente a la producida por este virus. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus identificado en 1983 como agente etiolgico del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). El virus de VIH consiste en una molcula de RNA genmica asociada con transcriptasa reversa (TR), protegida con una cpside y una envoltura. Los 2 tipos de VIH-1 y VIH-2 exhiben diferentes pronsticos y grados de transmisin que los distinguen. VIH El VIH es un lentivirus, un tipo de retrovirus que pertenece a la categora de los virus asociados con enfermedades inmunosupresoras en mamferos que afectan a los sistemas hematopoytico y nervioso central. El VIH-1 es el responsable del tipo de infeccin ms frecuente. El VIH-2 se identific en frica occidental en 1986 y se ha aislado posteriormente en Europa, Suramrica, Canad y Estados Unidos. Mtodos de transmisin del VIH El VIH se ha encontrado en semen, sangre, liquido amnitico, pericrdico, peritoneal, pleural, sinovial, tejido del sistema nervioso, leche materna y secreciones vaginales. El VIH puede contagiarse por: Contacto sexual (p. ej., relacin sexual oral, vaginal o anal) Contacto con sangre (es decir, a travs de transfusiones de sangre, uso compartido de agujas y jeringas para administracin intravenosa de drogas, heridas y lceras abiertas) o por transplante de rganos o tejidos infectados. De las mujeres a sus hijos, durante el embarazo, el parto o la lactancia natural Infeccin El VIH busca clulas del sistema inmunitario que tengan receptores de superficie CD4, porque este receptor especial permite al virus unirse a la clula; es a los primeros que ataca. Aunque el VIH infecta a varias clulas del sistema inmunitario, tiene preferencia por el linfocito T, un leucocito que posee numerosos receptores CD4. El decremento progresivo de CD4 durante el desarrollo de la enfermedad facilita las infecciones oportunistas con fatales consecuencias. Replicacin Despus de unirse a la clula CD4+, el VIH transfiere su material gentico y enzimas vitales al interior de la clula, donde se integra con el material gentico de la clula husped, producindose una nueva generacin de VIH. En el interior del virus El VIH es una estructura muy simple constituida por material gentico y enzimas esenciales rodeados por una cubierta proteica contenida en una envoltura viral. Cpside - Cubierta proteica que protege al material gentico (ARN) y las enzimas clave del virus. Integrasa - Enzima que ayuda a integrar el material gentico del VIH en el ADN de la clula husped durante la replicacin viral.

ARN - El ARN contiene el cdigo gentico necesario para crear nuevos virus ARN (VIH). El VIH contiene dos cadenas idnticas de ARN. Protena gp 120 - Las protenas gp 120 son pequeas protuberancias en la superficie del virus (VIH). Ayudan a ste a unirse a las clulas que tienen receptores CD4. Transcriptasa reversa - Esta enzima es necesaria para convertir el material gentico del VIH (es decir, el ARN) en ADN viral, lo que permite al virus integrar su material gentico en el ADN de la clula husped. Envoltura - Capa externa del virus en la que estn incrustadas las protenas gp 120. Proteasa - Enzima que corta las cadenas de protenas para prepararlas para el ensamblaje en partculas virales. Prueba del VIH El VIH es el virus que debilita el sistema inmunitario y produce el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Existen dos pruebas que se utilizan para diagnosticar la infeccin causada por el VIH: una detecta la presencia de anticuerpos especficos frente al VIH, que el organismo produce como respuesta al virus, y la otra identifica la presencia del virus propiamente dicho. La relacin de "acoplamiento" ("llave-cerradura") entre los anticuerpos (Y) y el virus es la base del ELISA. Es fundamental que los individuos infectados por el VIH conozcan y entiendan su enfermedad y sus implicaciones, de modo que puedan reducir el riesgo de transmisin del virus a otros e iniciar el tratamiento mdico adecuado. Lamentablemente, muchas personas infectadas por el VIH no saben que padecen la enfermedad hasta que experimentan sntomas fsicos evidentes. Si usted o su mdico tienen razones para sospechar que est infectado por el VIH, se le recomendar la realizacin de una prueba llamada ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) que detecta la presencia de anticuerpos contra el VIH en la sangre (vase la ilustracin anterior). Los anticuerpos son protenas que combaten la enfermedad, creadas por el sistema inmunitario en respuesta a la infeccin. Un resultado positivo significa que el sistema inmunitario ha producido anticuerpos en respuesta a la infeccin por el VIH. Este resultado debe confirmarse con otra prueba llamada Western Blot. Sntomas fsicos VIHMuchas personas no presentan sntomas evidentes inmediatamente despus de infectarse por el VIH. Sin embargo, al cabo de tres a seis semanas, aproximadamente el 50-70 % de las personas desarrollan un sndrome agudo por VIH, cuyos sntomas duran alrededor de una semana y consisten en fiebre, dolor de garganta, cansancio, prdida de apetito, nusea, vmito y diarrea. Las personas pueden desconocer que estn infectados por el VIH, ya que estos sntomas acompaan habitualmente al resfriado comn. La historia interna Durante la etapa de infeccin primaria, la carga viral aumenta al mximo a medida que el virus (VIH) se extiende por el organismo, especialmente al tejido linfoide. Despus, la carga viral comienza a descender a medida que el sistema inmunitario responde a la infeccin. La cuenta de clulas CD4 desciende bruscamente durante la infeccin primaria porque el VIH destruye indirectamente la poblacin de clulas durante el proceso de replicacin viral. Posible causas de resultados falsos, positivos y negativos, de las pruebas EIA que se recogen en la siguiente tabla. FALSOS POSITIVOS DE LOS EIA FALSOS NEGATIVOS DE LOS EIA

Interferencia de

Anticuerpos como los que se dirigen frente antgenos de msculo liso, clulas parietales, mitocondriales, nucleares, leucocitarios y de clulas T. Presencia de anticuerpos IgM frente al core del virus B de la hepatitis y frente al virus A de la hepatitis Anticuerpos frente a antgenos leucocitarios de clase II de clulas H9 que pueden estar presentes en mujeres embarazadas multparas y sujetos politransfundidos.

Periodo de incubacin de la infeccin o enfermedad aguda antes de la seroconversin (periodo ventana)

Enfermedades del hgado como hepatopatia alcohlica grave, cirrosis biliar primaria o colangitis esclerosante Inactivacin del suero por calor o positividad a RPR (reagnas plasmticas) Procesos hematolgicos malignos, como linfomas Infeccin por VIH-2 u otros retrovirus Infecciones agudas por virus ADN Vacunacin contra la gripe Insuficiencia renal crnica y transplante renal Sndrome de Steve-Johnson Anticuerpos anti-VIH-1 adquiridos de forma pasiva, por ejemplo mediante inmunoglobulinas.

Tratamientos inmunosupresores intensivos o prolongados Procesos malignos Transfusin de reposicin Transplante de mdula sea Disfunciones de las clulas B Interferencia de factores reumatoideos Equipos que detectan principalmente anti-p24 Prdida de estabilidad de los componentes del equipo de reactivos

Sntomas generales del sndrome agudo por VIH:

Fiebre Infeccin de garganta Ganglios linfticos inflamados Cefalea Dolor articular o muscular Fatiga o prdida de energa Anorexia o prdida de peso Nusea, vmito, diarrea Trastornos cutneos, como erupcin y ulceracin, y del sistema nervioso, como meningitis y encefalitis.
INSERTO Genie II HIV-1/HIV-2 V2, es un ensayo inmunoenzimatico (EIA) de reconocimiento dual, basado en la deteccin especifica de anticuerpos anti VIH-1 y anti VIH-2 por anfgenos con inmunoreactividad mejorada que se unen a ambos sitios de unin de los anticuerpos. La prueba incorpora una combinacin de inmunocromatografia e inmunoconcentracin. El cartucho de reaccin contiene 2 compartimentos uno circular A, para la adicin de la muestra: y uno ms grande, elptico de Reaccin B. Los antgenos derivados de VIH-1 y VIH-2 son inmovilizados en dos puntos separados en la zona de reaccin del compartimento B.

Al comenzar la prueba, una muestra diluida es introducida en el compartimento A. Si estn presentes anticuerpos anti VIH en la muestra, se unen especficamente a los antgenos VIH en un paso de reconocimiento dual. El complejo resultante reacciona con el conjugado estreptavidina/fosfatasa alcalina (AP). La visualizacin de los resultados como manchas gris azul es acompaada por la reaccin de sustrato cromgeno. La solucin de paro es adicional al final de la reaccin. La aparicin de 2 o 3 manchas gris azul de reaccin en el compartimento B, indica la presencia de anticuerpos contra VIH. En un resultado negativo solo el control interno ser visible. Contenido del equipo: Equipo: 20 pruebas 20 cartuchos de reaccin Genie II HIV-1/HIV-2 V2 22 microtubos para dilucin de la muestra Componentes. Antgenos: HIV-1: protena recombinante gp41 Pptido gp41 HIV-2: protena recombinante p24 Pptido gp36 Reactivos: Numero de reactivo 1 2 3 4 5 Controles: Control positivo: 1 vial, con 0.5 ml de plasma humano diluido, positivo para VIH-1 y para VIH-2, inactivado por adicin de B-propiolactona y por tratamiento con calor. El control positivo ha sido probado y encontrado no reactivo para antgeno de superficie de hepatitis B y anticuerpos contra virus de la hepatitis C. Control Negativo. 1 vial con 0.5 ml de plasma humano, diluido inactivado por calor. El control negativo ha sido encontrado no reactivo para antgeno de superficie de hepatitis y anticuerpos contra virus de la hepatitis C, y anticuerpos contra virus de inmunodeficiencia humana. Datos: Genie HIV-1/HIV-2 Lote 200807160001; Caducidad: 06/09/09 Control positivo Lote 200907080157; Caducidad: 22/09/09 Control negativo Lote 200907080156; Caducidad: 22/09/09 Diluyente Lote 2008051600026; Caducidad: 06/09/09 Sol. Lavado Lote 20085160004; Caducidad 06/09/09 Nombre de reactivo Diluyente de muestras Conjugado estreptavidina/AP Solucin de lavado Sustrato cromgeno Solucin de paro Control positivo Control negativo Contenido frascos 20 y 40 pbas 1 fco gotero etiqueta blanca 1 fco gotero etiqueta amarilla 1 botella dispensadora etiqueta naranja 1 fco gotero etiqueta azul 1 botella dispensadora etiqueta blanca 1 vial etiqueta roja 1 vial etiqueta verde Volumen 20 y 40 pbas 7 ml 7 ml 50 ml 50 ml 5 ml 0.5 ml 0.5 ml 40 pruebas 40 cartuchos de reaccin Genie II HIV-1/HIV-2 V2 22 microtubos para dilucin de la muestra 100 pruebas 100 cartuchos de reaccin Genie II HIV-1/HIV-2 V2 22 microtubos para dilucin de la muestra

100 pbas 3 fcos goteros etiqueta blanca 3 fcos goteros etiqueta amarilla 3 botellas dispensadoras etiqueta naranja 3 fcos goteros etiqueta azul 3 botellas dispensadoras etiqueta blanca 3 viales etiqueta roja 3 viales etiqueta roja

100 pbas 3*7 ml 3*7 ml 3*50 ml 3*50 ml 3*5 ml 3*0.5 ml 3*0.5 ml

Sol. Stop Lote 20085160006; Caducidad: 29/05/09 Streptarvidina Lote 200909091049; Caducidad: 08/02/09 Cromgeno Lote 200909091051; Caducidad: 08/02/09 Placa (cartucho) Lote 200907101811; Caducidad: 09/01/09

Seguridad y precauciones Este equipo es para uso diagnstico in vitro solamente Maneje el control positivo y negativo como potencialmente infecciosos, an si han sido inactivados Dado que ningn mtodo de prueba puede ofrecer completa seguridad que los agentes infecciosos estn ausentes, manejar los reactivos y muestras de pacientes como capaces de transmitir enfermedades infecciosas. Usar guantes desechables y ropa de laboratorio. Seguir los procedimientos de laboratorios aceptados para trabajar con suero o plasma. No pipetear con la boca

Desechar todas las muestras, cartuchos de reaccin usados con el equipo, como material de desecho biopeligroso No mezclar reactivos de diferentes lotes No tocar las puntas de los goteros No usar despus de la fecha de caducidad Almacenamiento del equipo Almacenar el equipo de 2 a 8 C. No congelar. Manejo de muestras Pueden ensayarse muestras de suero o plasma. Las muestras pueden almacenarse por 7 das de 2 a 8 C, antes de probarse. Para conservarlas mas de 7 das congelar la muestra a -20C o temperatura ms baja. Despus de que las muestras han sido descongeladas, centrifugar para su clarificacin. Probar el sobrenadante. Evitar el repetido congelamiento y descongelamiento. PROCEDIMIENTO Preparacin de la prueba: Leer cuidadosamente todas la instrucciones antes de comenzar la prueba Llevar los reactivos, cartuchos de reaccin y muestras a temperatura ambiente Correr los controles positivo y negativo provisto con el kit cada da que realice la prueba, y o cuando un nuevo num. de lote se use. Tomar el nmero requerido de cartuchos de reaccin Genie II HIV-1/HIV-2 V2 de las bolsas de aluminio Realizar la prueba a temperatura ambiente Instrucciones de la prueba 1. Unin de los anticuerpos especficos Agregar 3 gotas (150 l) de reactivo # 1 al microtubo, (solucin diluyente). Adicionar 50l de muestra o control. Mezclar el contenido del tubo volviendo a llenar y dispensando repetidamente con el pipetor. Transferir inmediatamente el total del contenido del microtubo al compartimento A del cartucho de reaccin. Descartar la punta de la pipeta y el microtubo como desperdicio biopeligroso. Esperar hasta que la solucin haya sido absorbida (aproximadamente 3 minutos).

Los siguientes pasos se realizan solamente en el compartimento B de reaccin 2. 3. 4. Unin del conjugado Adicionar 3 gotas del reactivo # 2 (conjugado estreptavidina/AP) al compartimento B. Esperar hasta que la solucin haya sido absorbida (aproximadamente 3 minutos). Lavado Llenar el compartimiento B hasta arriba con reactivo #3 (solucin de lavado). Esperar hasta que la solucin haya sido absorbida (aproximadamente 1 minuto) Reaccin de color Adicionar 2 gotas de reactivo #4 (solucin de sustrato cromgeno) al compartimiento B. Esperar hasta que la solucin haya sido absorbida (aproximadamente 3 minutos).

5.

Reaccin de paro Llenar el compartimiento B con reactivo #5 (solucin de paro). Esperar hasta que la solucin ha sido absorbida; entonces examinar el compartimiento B y anotar los resultados.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS Validacin Examinar el soporte del compartimiento de reaccin B. para confirmar el correcto funcionamiento de la prueba y demostrar que los resultados son vlidos, la mancha del control interno debe aparecer en cada cartucho. La ausencia de la mancha del control interno debe ser considerado resultado invlido. La prueba debe repetirse. Resultados VIH-1 Positivo. La presencia del punto izquierdo VIH-1 junto con la del control interno, indica la presencia de anticuerpos contra VIH-1. VIH-2 Positivo. La presencia del punto medio, VIH-2 junto con la de control interno indica la presencia de anticuerpos anti VIH-2. VIH Positivo. La presencia de las 3 puntos, indican la presencia de anticuerpos anti VIH-1 y/o VIH-2. En este caso, la muestra debe probarse por mtodos adicionales, los cuales permitan mayor diferenciacin entre VIH-1 y VIH-2. Resultado negativo. La presencia del punto de control interno solo indica la ausencia de anticuerpos VIH. Cualquier punto dbil debe ser sospecha de reaccin y debe continuarse su investigacin. Limitaciones La prueba Genie II HIV-1/HIV-2 V2 es una prueba de escrutinio. Dado que la produccin de anticuerpos contra VIH puede retrasarse despus de la exposicin inicial, las pruebas de escrutinio pueden fallar para detectar estadios tempranos de la infeccin de VIH. Si no hay reactividad con esta prueba, no debe considerarse evidencia concluyente de que el paciente no ha sido expuesto o infectado por VIH. La presencia de anticuerpos contra VIH-1 y/o VIH-2 en la muestra probada debe confirmarse por un ensayo confirmatorio. Desempeo. Sensibilidad. Se realizaron estudios de sensibilidad con un panel de 151 muestras positivas, que incluan 87 muestras VIH-1 positivas (con 11 del grupo O), 64 VIH-2 positivas y paneles de seroconversin. El producto Genie II HIV-1/HIV-2 V2 present un 100% de sensibilidad en positivos verdaderos y los paneles de seroconversin. Especificidad.

La especificidad fue determinada en muestras provenientes de donadores de sangre (102 muestras estudiadas), en mujeres embarazadas (202 muestras) y en pacientes hospitalizados (270 muestras). La especificidad calculada fue de 99.8%, 100% y 100% respectivamente. Estudios adicionales de 53 muestras provenientes de personas con enfermedades que puedan interferir potencialmente con esta prueba (artritis reumatoide, enfermedades auntoinmunes o virales) no presentaron reaccin cruzada. Resumen del procedimiento de la prueba

Las instrucciones abreviadas que se presentan a continuacin, son de usuarios con experiencia con el equipo Genie II HIV-1/HIV-2 V2 Llevar los reactivos, cartuchos de reaccin y muestras a temperatura ambiente (22-26C) y realizar la prueba Paso: 1. Unin de anticuerpos Reactivo 1:muestra Adicionar: 3 gotas (150 l) 50 l A: Microtubo Trasferir Tiempo: Esperar hasta que la solucin haya sido absorbida (-3 minutos)

al

2. Unin del conjugado 3. Lavado 4. Reaccin de color 5. Paro de reaccin

2: 3: 4: 5:

Mezclar 3 gotas Llenar al ( 1ml) 2 gotas Llenar al ( 1ml) tope

compartimiento A Compartimiento B Compartimiento B Compartimiento B tope Compartimiento B

Esperar hasta que la solucin haya sido absorbida (- 3 minuto) Esperar hasta que la solucin haya sido absorbida (- 1 minuto) Esperar hasta que la solucin haya absorbida (- 3 minuto) Esperar hasta su absorcin: Leer los resultados

RESULTADOS Se realiz la prueba a 4 sujetos del equipo y todos salieron negativos. Preparacin de las muestras

Control Positivo (se observan 3 puntos) lo cual indica VIH-Positivo

Sujetos 1 y 2 (Braulio y Claudia): Negativos Un solo punto (el ltimo)

Sujetos 3 y 4 (Grisell y Diana): Negativos Un solo punto (el ltimo)

DISCUSIN DE RESULTADOS Al comenzar la prueba, la muestra diluida (en este caso plasma) es introducida en el compartimento A. Si estn presentes anticuerpos anti VIH en la muestra, se unen especficamente a los antgenos VIH en un paso de reconocimiento dual, es decir, para HIV-1 y HIV-2. El complejo resultante reacciona con el conjugado estreptavidina/fosfatasa alcalina (AP) el cual diferencia la presencia de Antgenos al unirse el complejo formado anteriormente en caso positivo con el conjugado estreptovidina/fosfatasa alcalina donde el sustrato es la paranitrofenilfosfato; despus se realizan los lavados para eliminar los anticuerpos que no son especficos para el antgeno y al ser absorbida la solucin del cromgeno, la visualizacin de los resultados se observa como manchas gris azul es acompaada por la reaccin de sustrato cromgeno; la solucin de paro es adicional al final de la reaccin para deternerla y de esta manera observar los resultados; de esta forma se pude decir que la prueba incorpora una combinacin de inmunocromatografia e inmunoconcentracin, lo cual es observado en los compartimientos del kit de la prueba. Las pruebas realizadas para los 4 sujetos de prueba se observaron con resultados negativos debido a que todos los individuos son sanos. Esto se observo en la prueba de Elisa Genie II HIV-1/HIV-2 V2 de la marca Bio-Rad al observarse que en el compartimiento B (elptico) un solo punto en su extremo inferior (control interno) lo cual indica negatividad. CONCLUSIONES La tcnica para el Genie II HIV-1/HIV-2 V2, el cual es un ensayo inmunoenzimatico (EIA) de reconocimiento dual esta basado en la deteccin especifica de anticuerpos anti VIH-1 y anti VIH-2 por anfgenos con inmunoreactividad mejorada que se unen a ambos sitios de unin de los anticuerpos( donde so inmovilizados) los cuales estn igualmente situados en el compartimiento B y si hubiese presencia de estos en la muestra se hubiesen observado 2 puntos ms (uno especfico para cada tipo de antgeno), uno en medio y otro en el extremo superior del compartimiento B lo que indica la unin del conjugado a los antgenos especficos por visualizacin del cromgeno. La prueba de ELISA es la primera que se hace porque resulta barata, sencilla y da resultados confiables. Si la prueba de ELISA sale negativa, no se hacen ms pruebas. Cuando sale positiva, es preciso practicar la IFA o la Western Blot , que son pruebas ms especficas para confirmar los resultados. REFERENCIAS

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