PRCTICAS 7 EXTRACCION Y PURIFICACION DNA CON DNAZOL

OBJETIVOS

Extraer DNA de diversos materiales biolgicos Analizar los resultados de la extraccin por electroforesis en gel de azarosa Comparar los resultados obtenidos en el gel respecto al tamao del genoma, dependiendo de la especie de la cual se extrajo.

INTRODUCCIN
LOS ACIDOS NUCLEICOS. Es muy probable que, en la actualidad, todo mundo haya escuchado hablar de los cidos nucleicos, en particular del ADN, simplemente por los descubrimientos recientes y por las grandes innovaciones tecnolgicas en la investigacin del ADN, los cuales no dejan de aparecer casi a diario en los grandes peridicos. Las iniciales ADN significan cido desoxirribonucleico. Se encuentra en todas las clulas. Al ADN muchas veces se le llama la molcula central de la vida, ya que contienen las unidades de la herencia, que se llaman genes son un cdigo qumico que especifica el tipo de protena que un organismo puede producir y estas protenas incluyen a las enzimas que regulan la mayor parte de la actividad celular. ESTRUCTURA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS. Cada molcula de ADN est formada por dos polmeros extremadamente largos sostenidos entre s por enlaces de hidrgeno y enrollados en lo que se conoce como doble hlice. Cada uno de los dos polmeros est formado por numerosas subunidades llamadas nucletidos, enlazadas covalentemente formando las cadenas. Cada nucletido est compuesto por tres partes: un compuesto de fsforo llamado fosfato, un azcar de 5 carbonos simples y una base nitrogenada. Existen cuatro bases nitrogenadas en el ADN, por lo tanto hay cuatro diferentes nucletidos. Su ordenamiento lineal especfico dentro del polmero constituye el cdigo qumico (cdigo gentico). En otras palabras, los genes son bsicamente un ordenamiento de nucletidos. En nuestro ADN que simplemente determina como sern nuestras protenas. TCNICAS DE EXTRACCIN DEL DNA El primer paso en la purificacin del DNA consiste en homogeneizar las clulas y distar los ncleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extraccin de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar los ncleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solucin. El detergente inhibe tambin cualquier actividad nucleasa en la preparacin. El objetivo de los pasos de purificacin es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y protenas. La desproteinizacin se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de protenas que suprime la solubilidad de las protenas en la preparacin y las precipita. Puesto que el fenol y la solucin salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensin para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solucin dentro de la fase acuosa de arriba y la protena presente como un precipitado concentrado en la interfase. La fase acuosa se retira del tubo y se somete a ciclos repetidos de agitacin con fenol y centrifugacin hasta agotar toda la protena de la solucin. Aadiendo etanol fro. El etanol fro forma una capa arriba de la solucin acuosa del DNA, el cual, se enrolla sobre una varilla de vidrio conforme sale de la solucin. En la interfase el RNA sale de la solucin salina. En contraste, el RNA sale de la solucin como precipitados que se asienta en el fondo del vaso. Luego de este primer paso de purificacin, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa. Enseguida se quita la proteasa por desproteinizacin con fenol y se vuelve a precipitar el DNA. SEPARACIN DEL DNA MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL. La electroforesis en gel se utiliza ms ampliamente en la separacin de cidos nucleicos de diferente peso molecular.

Las molculas RNA o DNA pequeas, de unos pocos cientos de nucletidos o menos, por lo general se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamina. Las molculas de mayor tamao tienen problemas para desplazarse a travs de la cerrada trama de la poliacrilamina y en general se fraccionan en gel de agarosa que tiene mayor porosidad. La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas. El gel con agarosa en baja concentracin (0.34) se emplea para separar fragmentos de DNA de mayor tamao. MATERIAL

Tubos Eppendorf Micropipeta de 10 a 100 Micropipeta de 100 a 1000 Gradillas para eppendorf Puntas para Micropipetas Guantes

MUESTRAS BIOLOGICAS

Cepa de Aspergillus niger Cabello humano

REACTIVOS EQUIPO Centrfuga Cmara para corrimiento de electroforesis Voltmetro Cmara de UV PROCEDIMIENTO Extraccin de DNA con el reactivo DNAzol. 1. 2. 3. 4. 5. Para bacterias, inocular una colonia de E.coli en 10 ml de LB, crecer hasta fase log tarda u overnight en bao con agitacin 37 C, 180 a 200 r.p.m. Para sangre centrifugada 2500 r.p.m. durante 10 minutos, separar los leucocitos y lavarlos con PBS por centrifugacin. Para plantas y cualquier otro tejido, macerar el tejido y pasar al paso 5. Se tomo una asada de la cepa del hongo Aspergillus Nger (este fue nuestro caso, ya no se realizo de sangre ni de bacteria) Centrifugar por 10 min a 3000 r.p.m. descartar sobrenadante con pipeta para romper el pellet. Agregar 250 l de DNAzol. Homogenizar bien con la pipeta para romper el pellet. Centrifugar 10 minutos a 5000 r.p.m. Trasvasar el sobrenadante a otro tubo sin tocar el pelet. Agregar 250 l de isopropanol 100%. Mezclar con la pipeta. DNAzol para clulas humanas y para microorganismos Isopropanol Agua DEPC Buffer Colorantes: Azul de Bromofenol y xilencianol Azarosa (agar)

6.
7. 8.

9. 10. Centrifugar a mxima durante 1 minuto. Previamente puede dejarse en fro -20 C. 11. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 250 l de isopropanol al 70%.
12. Centrifugar a mxima por 5 minutos. 13. Dejar secar el pellet al aire. 14. Resuspender en agua DEPC. Agitar suavemente. 15. Incubar O.N. a 37 C 16. Medir concentracin de DNA extrado.

Cuantificacin de DNA El DNA se cuantifica por valoracin electrofortica, comparndolo con concentraciones conocidas de DNA de fago lambda, y por espectrofotometra UV, empleando la relacin de lectura de OD 260/280 (18). Se calcula la concentracin del DNA con base a que la concentracin del DNA de 50 g/ml equivale a una DO de 1 a 260 nm (concentracin del DNA = [DO260] x [factor de dilucin] x [50 g DNA/1 DO]). La relacin de 260/280, se considera como medida de la pureza del DNA y debe permanecer entre 1.6 y 1.9. Visualizacin del DNA con electroforesis con geles de agarosa. Electroforesis en azarosa para muestras de DNA La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromolculas en una solucin. La electroforesis en azarosa permite separar molculas de DNA, cuando estas son sometidas a un campo elctrico y atradas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de accin opuesta que determinan la velocidad de la partcula. Primero, la fuerza elctrica atrae el DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atraccin es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migracin y su intensidad depende del tamao y la forma de la partcula. Preparacin de gel de azarosa. 1. Determinar la concentracin y el volumen de gel que se necesita. Si el DNA tiene un tamao desconocido se debe usar gel de agarosa al 1.0%. 2. Preparar el gel al porciento deseado segn se indica el siguiente ejemplo. Preparar 30 ml de azarosa al 1.0% (1g/100ml) (30ml)(1g/100ml) = (Xg) El resultado es 0.3g 3. Pesar la cantidad de agarosa que se necesite y transferir a un matraz Erlenmeyer. 4. Aadir el volumen deseado de solucin amoirtiguadora Tris Borato EDTA (TBE) 0.5 X. 5. Calentar en un horno de microondas hasta que se disuelva la agarosa totalmente. 6. Enfriar la agarosa hasta 50 C. 7. Colocar el peine (comb) en la cmara de electroforesis. 8. Verter la solucin de agarosa evitando la formacin de burbujas, estas pueden ser removidas con la punta de un micropipeta. 9. Dejar que solidifique a temperatura ambiente y en una superficie nivelada para obtener un espesor uniforme del gel. Para cargar el gel de agarosa. 1. Colocar la agarosa dentro de la cmara de electroforesis. 2. Aadir suficiente TBE 0.5 X hasta cubrir completamente el gel (aprox. 0.5cm sobre el gel) 3. Cargar cuidadosamente 10 de muestra por pozo utilizando una micropipeta. Incluir un marcador de l peso molecular. 4. Conectar el equipo de electroforesis. 5. Prender el equipo, seleccionar el voltaje deseado (100V) y las muestras debern correr hacia el electrodo positivo. 6. correr la electroforesis hasta que las muestras se hayan movido. 7. Apagar el equipo. Visualizar el DNA en el gel con azul de metileno. 1. Colocar el gel en una solucin de 0.025% azul de metileno por 15 minutos. Debe quedar totalmente sumergido. 2. Desteir el gel den agua destilada por 15 minutos. Debe sumergirse de nuevo. 3. El DNA se torna visible cuando se observa en una lmpara de luz visible. 4. Fotografiar el gel Visualizacin del DNA con bromuro de etidio 1. De manera alternativa, al preparar la agarosa se le puede gregar bromuro de etidio (0.1mg/ml) al 10%. 2. Se visualiza el gel con una lmpara de luz UV. 3. fotografiar la gelatina usando una cmara. 4. fotografiar el gel usando una cmara digital o de celular.

RESULTADOS Tubos eppendorf con la muestra del hongo y el cabello

Colocacin de las muestras en el Agar

Corrimiento del DNA en el Agar, se observa la coloracin apartir de una Cmara de UV

DISCUSIN DE RESULTADOS Para poder extraer el ADN de algn organismo, se necesita una muestra biolgica, la cual en nuestro caso fue el cabello, pero tambin pudo haber sido sangre perifrica, saliva, etc. Otra muestra utilizada es la cepa del hongo Aspergillus nger la cual nos sirve para comparar resultados, se realizo el procedimiento de electroforesis para la extraccin del ADN, en la cual se separa las molculas pequeas de las molculas grandes, sabiendo que el ADN es una molcula con carga negativa, se va a separar al desplazarse hacia donde se encuentra la carga negativa, separndose de las dems molculas. El proceso consta de varios lavados con diferentes disolventes, como lo

fueron: el Isopropanol, agua DEPC (Dietilpirocarbonato), y el colorante que nos indica el corrimiento de la separacion del ADN, y el principal que fue DNAzol, el cual es el principal para extraer el ADN de la muestra. CONCLUSIONES Se extrajo el ADN para poder observar su presencia y corrimiento por medio de la tcnica de electroforesis en agarosa la cual permite separar molculas de DNA, cuando stas son sometidas a un campo elctrico y atradas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de accin opuesta que determinan la velocidad de la partcula. Primero, la fuerza elctrica atrae en DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atraccin es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migracin y su intensidad depende del tamao y la forma de la partcula. En teora dado que la fuerza impulsora es proporcional a la carga elctrica, el parmetro que rige el avance (aceleracin = fuerza/masa) de la electroforesis es realmente la relacin carga/masa. Para un cido nucleico, la carga elctrica es proporcional a la longitud en nucletidos, por lo que la relacin q/m es la misma para todas las molculas. Sin embargo, el efecto de retardo debido al gel depende del tamao molecular. Como resultado neto, la electroforesis separa los fragmentos de cido nucleico segn su tamao o longitud, expresado en nucletidos (si son de hebra sencilla) o en pares de bases (si son de doble hebra, caso comn del DNA). Es, por ello, posible establecer una curva de calibrado que relacione la movilidad con la longitud en pb. Para conseguir una recta se suele representar tamao frente a 1/movilidad o log(tamao) frente a movilidad, sin embargo esto solo se realiz cualitativamente ya que no se cuantific la movilidad del ADN a travs de la placa de agarosa, solo se observ cualitativamente al observar la coloracin del medio. REFERENCIAS A simple salting out procedure for extracting DNA from human cell. S. A. Miller, D. D. Dykes and H. F. Polesky. 1988. *Nucleid Acids Research: 16 (3): 1215. Biologa Molecular y Herencia. Robert A. Wallace, Jack L. King, Gerald P. Sanders., 1a edicin. Editorial Trillas. Mxico 1991: pgina 97, 98. www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-QPCR-protocolos.pdf biowww.net/international/detailspanish-286.html