PRCTICA 8 DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA PARA INGENIEROS UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE INGENIERA DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA

PRACTICA N 8 FERMENTACION ALCOHOLICA CON LEVADURAS

Objetivo General Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentacin Batch y en continuo realizada por la levadura de Sacharomyces cerevisiae (Ethanol Red).

Objetivos Especficos Estudiar la cintica de crecimiento de un cultivo Batch con clulas libres Determinar y comparar los rendimientos a partir del crecimiento, el consumo de sustrato y la formacin de producto, para dos fuentes de carbono (jarabe glucosado y glucosa) Evaluar los efectos de dos sustratos (glucosa y el jarabe glucosado) sobre la produccin de etanol Comparar los rendimientos en formacin de producto al utilizar un reactor de tanque agitado en operacin batch y un reactor de lecho empacado en operacin continua

Marco Terico La variedad de materias primas usadas en la manufactura de etanol va fermentacin son clasificadas en tres tipos principalmente: azcares, almidones y materiales celulsicos. Los azcares (de caa de azcar, remolacha de azcar, melazas y frutas) pueden ser convertidos a etanol directamente. Los almidones (de maz, yuca, papas y races de plantas) deben ser primero hidrolizados a azcares fermentables por tratamiento con cidos o por la accin de enzimas. La celulosa (de madera, residuos agroindustriales, desechos de licor de sulfito de pulpa de las industrias de papel) debe ser igualmente convertida a azcares fermentables, por la accin de cidos o de enzimas. Una vez los azcares simples son formados, los microorganismos pueden rpidamente fermentarlos a etanol. La fermentacin de etanol es un proceso metablico de carcter anaerbico en el cual los azcares simples (glucosa, sacarosa, xilosa, etc.) son parcialmente oxidados a compuestos como etanol y CO2. En este proceso los compuestos intermedios actan como aceptores finales de electrones. La Fermentacin alcohlica de define como el proceso bioqumico por el cual las levaduras transforman los azcares del mosto en Etanol y CO2. Para que la fermentacin se realice de manera eficiente, el mosto debe hallarse en condiciones anaerobias. En condiciones aerobias las levaduras se multiplican abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se

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consiguen 1g de levadura por cada 4g de azcar consumidos, pero los productos obtenidos son muy poco etanol, agua y CO2. En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentacin; es decir degradan los azcares de forma incompleta generando Etanol, CO2 y energa. En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan solo 1g de levadura por cada 100g de azcares consumidos. Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la produccin de etanol. Saccharomyces cerevisiae es la levadura ms comnmente utilizada. El Etanol es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia al alcohol de las levaduras es crtica para obtener rendimientos altos En la actualidad, ha surgido un inters creciente en la inmovilizacin de clulas para la produccin de alcohol, debido principalmente a las numerosas ventajas que ofrece. La inmovilizacin celular permite el aumento en la productividad, la factibilidad del proceso en continuo, la estabilidad celular y los bajos costos de recuperacin y reciclo en los procesos de separacin. Sin embargo, su implementacin en los procesos industriales es aun limitada y su aplicacin depender de los futuros desarrollos en los procedimientos de inmovilizacin que puedan ser fcilmente escalables. Una de las tecnologas contemporneas que son ms promisorias para la fermentacin de etanol, es la fermentacin en continuo usando clulas de levaduras inmovilizadas. Los sistemas de fermentacin en continuo con clulas inmovilizadas aunque inicialmente exitosos, fueron condenados a fallar por varias razones. Estas incluyen problemas de ingeniera (como biomasa en exceso, problemas con la remocin de CO2, optimizacin de las condiciones de operacin, obstrucciones y generacin de canales de flujo en el biorreactor), inalcanzables costos (en los precios de los soportes) y desventajas (en operacin inestable y procesos complejos). Sin embargo, recientes desarrollos en el diseo de biorreactores y la comprensin de la fisiologa de las clulas inmovilizadas, junto con la aplicacin de materiales de soporte novedosos, proporcionan un nuevo estmulo en la investigacin y la aplicacin de esta promisoria tecnologa. La mayor parte del etanol es producido mediante fermentaciones por lotes. La concentracin de sustrato al inicio del proceso es de 15-25% (p/v) y el pH se ajusta a un valor de 4-5 para disminuir los riesgos de infeccin. El proceso se lleva a cabo a 30-35C. Generalmente el rendimiento es del 90% del mximo terico. El resto de sustrato es convertido en biomasa y otros metabolitos. La concentracin de etanol al trmino de la fermentacin es de 80-100 g/L. En la mayora de las destileras, el tiempo de fermentacin es de 24 horas, aumentndose 6 horas para la sedimentacin de las levaduras en los tanques. Los procesos por lotes tienen mayores costos del biorreactor, mayores requerimientos de mantenimiento y operacin, bajo control del proceso y menores productividades que los procesos continuos. Sin embargo, a nivel industrial, aunque la productividad es importante, es ms relevante la conversin de sustrato considerando que la mayor parte de los costos de produccin corresponden a la materia prima.

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Factores que influyen en la fermentacin alcohlica. Existen factores tanto fsicos como qumicos que inciden positiva o negativamente en el transcurso de la fermentacin alcohlica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia fermentacin. Los ms relevantes son los siguientes: Temperatura: A mayor temperatura la fermentacin transcurre ms rpidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y ms cantidad de compuestos secundarios. Las levaduras a 30C tienen su temperatura ptima de desarrollo. Por encima de 35C la actividad disminuye rpidamente y mueren antes de 45C. Oxigeno: Aunque la fermentacin es un proceso anaerbico, las levaduras mantienen una leve respiracin utilizando para ello el oxgeno disuelto en el mosto. Nutrientes: Los azcares son fuente de energa para las levaduras. PROCEDIMIENTO INMOVILIZACION DE CELULAS DE LEVADURA (Este procedimiento es previamente realizado por los monitores del laboratorio) 1. Preparacin de inoculo Activar la levadura S. cerevisiae (Ethanol Red), incubndola en medio de cultivo (Tabla 1) a una concentracin de 3 g/L, a 30C y 150 rpm por 30 minutos. Tabla 1. Medio de cultivo Componente Cantidad por litro Fuente de carbono 50.0 g KH2PO4 2.0 g (NH4)2SO4 3.0 g MgSO4 7 H2O 1.0 g Extracto de Levadura 4.0 g Peptona Universal 3.6 g Agua destilada 1.0 L Realizar centrifugacin (10 minutos a 5000 rpm) para obtener la biomasa para la inmovilizacin. 2. Soluciones para la inmovilizacin Para realizar la inmovilizacin de las clulas de S. cerevisiae se emplean soluciones estriles de: 200 ml de solucin isotnica al 0.9% (p/v) (solucin acuosa de NaCl) 200 ml de solucin acuosa de alginato de sodio al 3% (p/v) 400 ml de solucin acuosa de CaCl2 al 2% (p/v)

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3. Materiales para la inmovilizacin Jeringa estril de 5-10 ml 4. Inmovilizacin de clulas de S. cerevisiae en alginato de sodio como membrana porosa Despus de tener una cantidad suficiente de clulas para inmovilizar, se descarta el sobrenadante del medio de cultivo en el que han crecido. Las clulas que quedan se centrifugan para obtener la biomasa libres de medio de cultivo y se re suspende en una solucin de NaCl al 0.9% estril (solucin isotnica). La inmovilizacin se realiza mezclando una suspensin de levaduras al 1% en 25 ml de solucin isotnica estril con una solucin estril al 3 % de Alginato de sodio. Se hace gotear esta mezcla con una jeringa estril (sin aguja) sobre una solucin previamente esterilizada de CaCl2 al 2 %. Con una altura de goteo de 1-3 cm se pueden obtener esferas homogneas de menos de 0.5 cm de dimetro. FERMENTACION ALCOHOLICA EN MODO BATCH Y CONTINUO REACTIVOS Agua destilada 3 gr de Levadura Saccharomyces cerevisiae Ethanol RED MATERIALES Y EQUIPOS 1 bao de mara Centrifuga y accesorios 2 Beakers estriles de 400 mL 2 Erlenmeyer estriles de 500 mL Medio de cultivo para realizacin de las fermentaciones Para las fermentaciones se emple el siguiente medio (valores por litro): 50g o 30 g de azcares totales reductores (ATR) (glucosa o jarabe glucosado de almidn de maz), 1g de MgSO4.7H2O, 2g de KH2PO4, 3g de (NH4)2SO4, 4g de extracto de levadura y 3,6g de peptona. Se ajusta pH a 5 y se esteriliza durante 15 minutos a 15 psi (121C). Montaje para el cultivo en Batch. Esterilizar dos erlenmeyers de 500 mL, para las fermentaciones. Esterilizar el medio de cultivo y realizar el montaje en Batch en erlenmeyers de 500 mL con un volumen de fermentacin de 400 mL, se adiciona 380 mL de medio de cultivo y 20 mL de biomasa libre de levadura. Incubar los erlenmeyers a 30C y 150 rpm durante 8 - 10 horas. Fermentacin 1: Fuente de carbono: Jarabe Glucosado Concentracin: 50 g/L

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Fermentacin 2: Fuente de carbono: Glucosa Concentracin: 50 g/L Fermentacin 3: Fuente de carbono: Jarabe Glucosado Concentracin: 30 g/L Fermentacin 4: Fuente de carbono: Glucosa Concentracin: 30 g/L Montaje para la determinacin de etanol La cantidad de etanol producido se cuantifica de manera indirecta a partir del CO2 liberado durante la fermentacin, apoyados en la relacin estequiomtrica:

La cantidad de CO2 que se libera no slo proviene de la reaccin de fermentacin sino tambin de la reproduccin del microorganismo gracias al oxgeno disponible inicialmente en el reactor. Debido a que la cantidad de oxgeno es relativamente baja comparada con la cantidad de azcares presentes en el medio, puede suponerse que la liberacin de CO2 es proporcional a la concentracin de alcohol en el medio. As, tras una medicin en el cambio de peso en intervalos sucesivos durante el proceso fermentativo, se puede establecer el perfil de concentracin de etanol en el medio como una funcin del tiempo. El equipo utilizado para tal fin, fermentmetro, consiste en un sistema de vidrio que es conectado al reactor por medio de un tapn que evita el intercambio de aire con los alrededores. Este dispositivo se llena con una cantidad de agua para evitar el ingreso de otras sustancias hacia el medio de fermentacin y permitir slo el escape de CO2 al ambiente. Adems, luego de consumirse la cantidad de oxgeno disponible en el medio durante el crecimiento del microorganismo, se garantizan condiciones anaerbicas favorables para la produccin de etanol. Figura 1. Fermentmetro (Trampa de agua)

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Mediante la relacin estequiomtrica de la reaccin de fermentacin se sabe que por cada mol de CO2 (44,01g) que se libera, se produce 1 mol de etanol (46,07g); lo que permite determinar la cantidad de etanol equivalente (g/L), conociendo el volumen de lquido en el interior del reactor, as:

Donde:

Concentracin de etanol equivalente en el reactor en g/L Cantidad en gramos de CO2 liberado Volumen de lquido en el reactor en litros Figura 2. Montaje de fermentometro con reactor para fermentacin alcohlica

Fermentacin 1: Fuente de carbono: Jarabe Glucosado Concentracin: 50 g/L Fermentacin 2: Fuente de carbono: Glucosa Concentracin: 50 g/L Fermentacin 3: Fuente de carbono: Jarabe Glucosado Concentracin: 30 g/L Fermentacin 4: Fuente de carbono: Glucosa Concentracin: 30 g/L Toma de muestra Se debe tomar muestra cada hora, en los cuales se realizar el siguiente procedimiento: 1. Tomar el cultivo del agitador y llevarlo a la cmara de flujo laminar. 2. Tomar dos muestras de 1 ml cada una con una micro pipeta. 3. Tomar una de la muestras y medir absorbancia a 600 nm para determinar concentracin de biomasa (Esta absorbancia se relaciona con la concentracin de biomasa segn la Figura 1).

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Figura 1. Curva estndar biomasa Con la otra muestra (previa centrifugacin) realizar la dilucin pertinente y realizarle el procedimiento descrito en el Anexo 1 para determinar la cantidad de azucares reductores. Concentracin (g/L) = 0,5948*Absorbancia + 0,0708 5. Al montaje del fermentometro se le registra el peso, con el fin de determinar la cantidad de CO2 producido
4.

Fermentacin en Biorreactor Esterilizar el biorreactor de 250 mL, realizar las conexiones de las mangueras para la alimentacin y la descarga del medio desgastado y sellar con algodn y aluminio para la esterilizacin del equipo completo. Despus de esterilizar el medio de cultivo y el biorreactor, en la cmara de flujo llenar hasta un 70% del volumen total del reactor con las esferas de levadura inmovilizada. Llenar la columna con el medio de cultivo preparado y mantener durante 8 12 horas el proceso en batch, operar el reactor a 30 C y tomar muestra de 2mL al inicio (tiempo 0, correspondiente al lunes 5:00 pm) del proceso de fermentacin y al final (tiempo 6, correspondiente al martes 6:00 am), para realizar anlisis de azcar y determinacin de la concentracin de etanol. Luego del tiempo 6, poner el reactor en funcionamiento en continuo a una caudal de alimentacin de 0.83 mL/min. Hacer seguimiento tomando 2 ml de muestra cada 90 minutos en el puerto de salida para realizar anlisis de azcar y determinacin de la concentracin de etanol. Nota: La fuente de carbono utilizada ser jarabe glucosado.

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ANLISIS DE RESULTADOS Para cada conjunto de datos: 1. Grafique el comportamiento en el tiempo de la concentracin de sustrato, biomasa y producto. 2. Identifique cada una de las etapas de la curva de crecimiento. 3. Halle: a. Rendimientos de producto y de biomasa. b. Productividad volumtrica. c. Porcentaje de rendimiento con relacin al terico. (C12H22O11+ 4 Pi + 4 ADP+H2O 4 CH3-CH2OH + 4CO2 + 4ATP) 4. Compare los resultados obtenidos en las fermentaciones hechas con los datos reportados. Determine posibles causas de error. 5. A partir de los objetivos planteados, cules son sus conclusiones?

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ANEXO 1 Procedimiento para determinar el % de azcares reductores utilizando DNS Reactivos: cido 3-5 dinitrosaliclico DNS Tartrato de sodio y potasio tetra hidratado Hidrxido de sodio Agua destilada Hidrxido de potasio

Procedimiento 1. Preparacin del reactivo DNS a. En un vaso de precipitado de 200 ml disolver 1,6g de NaOH con 50ml de agua destilada. b. A la solucin anterior adicionar 43,8g de tartrato de sodio y potasio tetra hidratado, y disolver perfectamente. c. Adicionar 1g de DNS lentamente agitando hasta disolucin total. Esta etapa debe realizarse protegida de la luz. d. Completar a 100ml con agua destilada y guardar en botella mbar en la oscuridad. e. Se puede utilizar despus de 24 horas. Determinacin de Glucosa Curva patrn glucosa a. Preparar 100 ml del medio de cultivo sin jarabe glucosado y esterilizarlo en autoclave b. Adicionar 0.1 g de glucosa al medio estril para obtener una concentracin de 1g/l (Stock 1) c. Realizar disoluciones con agua destilada en tubos de ensayo como se ve en la siguiente tabla: 1 0,75 0,5 0,25 0,125 0 Conc. g/l 1 0,75 0,5 0,25 0,125 0 Stock(ml) 0 0,25 0,5 0,75 0,875 1 Agua(ml) d. e. f. g. Tomar 0,5 ml y adicionar 0,5ml de reactivo DNS. Tapar los tubos con papel para film y ponerlos en bao a ebullicin por 5 minutos. Pasar los tubos a un bao de hielo, dejarlo por 5 minutos. Adicionar 5 ml de agua destilada a cada tubo y leer Absorbancia de todas las soluciones a 540 nm.

Para analizar las muestras problema, seguir el procedimiento anterior desde el literal d., a partir de la muestra centrifugada (5min a 5000 rpm) y diluida, segn sea necesario.

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PROGRAMACION PARA MONTAJES Y TOMAS DE MUESTRA LUNES27 DE FEBRERO (2:00 p.m.) Montaje de Biorreactor Tubular, toma de muestra inicial y anlisis de muestra 1. 2. 3. 4. David Ocampo Marcela Zuleta Daniel Hoyos - Laura Elizabeth Gaviria

MARTES 28 DE FEBRERO (8:00 a.m.) 1. Montaje de Inoculo y 4 fermentaciones A. Fermentacin 1. Anglica Alzate Sara Castro B. Fermentacin 2. Jaime Arango Lorena Santa C. Fermentacin 3. Daniel Hoyos - Laura D. Fermentacin 4. Elizabeth Gaviria 2. Puesta en marcha del continuo y toma de muestra 3. Toma de muestra cada 90 minutos y anlisis de muestra Hora toma de muestra 10:00 am Responsables A. Juliana Henao B. Luis Javier C. Carolina Ramirez D. Wilmer Tubular A. David Ocampo B. Santiago Vasquez C. Juan Camilo Tangarife D. Jorge Luis Tubular A. Elizabeth Nio B. Julio C. Maria Isabel D. Erika Tubular A. Juan Guevara B. Karol Yepes C. Leandro Mauricio D. Ana Maria Tubular A. Juan Guevara B. Lucia Velasco C. Juan Daniel

11:30 am

1:00 pm

2:30 pm

4:00 pm

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5:30 pm

8:00 am

9:30 am

D. Marcela Tubular A. Edison Vargas B. Marcela Olarte C. Melissa D. Mara Claudia - Alvaro Tubular A. Silvana B. Natalia Ballesteros C. Diego Perez D. A. Ana Maria Palacio B. Paula Giraldo C. Camilo D. Ana Maria