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Sumrio
Breve introduo histrica Mecanismo de separao Classificao dos mtodos cromatogrficos
Escala da separao Suporte do leito cromatogrfico Mecanismo de separao Estado fsico da fase mvel
Biblio
Tpico Harris, 5 ed (biblioteca) Cap. 23 Skoog 7 ed (biblioteca) Cap. 28
Introduo s Separaes Analticas Cromatografia gasosa (GC) Cromatografia Lquida de Elevada Eficincia (HPLC)
Cap. 24
Cap. 29
Cap. 25
Cap. 30
Mtodos de separao
Os detalhes moleculares de um processo bioqumico no podem ser totalmente elucidados at todas as molculas participantes terem sido isoladas e caracterizadas
Classe
Separaes mecnicas
Fora da separao
Gravidade Fora centrfuga Presso Gradiente de concentrao Presso Campo elctrico Gradiente de concentrao
Exemplo
Filtrao Centrifugao Filtrao sob presso Dilise Ultrafiltrao Electrodilise Tcnicas cromatogrficas Tcnicas electroforticas
Campo elctrico
Cromatografia
1946
1965 1969
A emerge
B emerge
temperatura
Sst
Sm
M st Vst Kd = = Cm M m Vm
Cst
Cst, Cm: concentrao de soluto na fase estacionria/ mvel Mst, Mm: massa de soluto na fase estacionria/ mvel Vst, Vm: volume da fase estacionria/ mvel
Coeficiente de distribuio efectivo (K) quantidade total de soluto em cada fase Quanto > KD o soluto permanece mais tempo na fase estacionria
1
A B C D E 32
16 16
2
16 16
8 8 8 8
3
8 16 8
4 8 4 4 8 4
4
4 12 12 4
2 6 6 2 2 6 6 2
5
2 8 12 8 2
Aps 5 equilbrios, o composto distribui-se ao longo da coluna mas est mais concentrado no seu centro
Separao cromatogrfica
KD (A)>1
Pico de concentrao acima do centro da coluna
KD (A) = 1
KD (A) < 1
Quanto maior o nmero de equilbrios, maior ser a concentrao do soluto numa parte da coluna.
SEPARAO CROMATOGRFICA
Factores que influenciam o padro de separao duma mistura de compostos Resoluo
situao real coluna normal
n de equilibrios
n = 100 n=6
Cromatografia preparativa
pretende-se purificar e colectar um ou mais componentes de uma amostra em grande quantidade (g a g), num grau de pureza elevado
colunas com um dimetro interno (ID) mximo de 10 mm; velocidade do fluxo 0.1 30 mL/min
colunas com um dimetro interno (ID) tipicamente entre 7 - 50 mm; velocidade do fluxo 20 1 200 mL/min
Cromatografia planar
a fase estacionria tem a forma ou suportada por uma superfcie plana (cromatografia em papel ou em camada fina)
Voet, Biochemistry, 3e
Cromatografia de partio
a separao tem por base as diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionria (cromatografia gasosa) ou nas fases mvel e estacionria (cromatografia lquida)
Harris, 7e
Harris, 7e
Harris, 7e
Fase estacionria
Lquido adsorvido num slido Espcie orgnica ligada covalentemente a uma superfcie slida Slido Resina de troca inica
Tipo de equilbrio
Partio entre lquidos imiscveis Partio entre a fase lquida e a fase ligada Adsoro Permuta inica Excluso estrea
Excluso Molecular Lquido nos interstcios de um gel Gs - lquido Lquido adsorvido num slido Espcie orgnica ligada covalentemente a uma superfcie slida Slido
Gs - slido
Coluna
Detector UV = 280nm
Colector
Registador
Colunas
- Tubos de vidro ou seringas com l de vidro na parte inferior
camisa para circulao de lquido termostatizado tubagem capilar vlvulas e torneiras de vrias vias
Enchimento da coluna
a fase estacionria (mistura semi-slida) deve ser adicionada coluna com a sada fechada, de preferncia de uma s vez a fase estacionria vai-se depositando por aco da gravidade
- abrir a coluna e iniciar o fluxo da fase mvel se for necessrio repetir este procedimento, evitar a criao de interfaces entre as vrias etapas
- proteger a superfcie da coluna para no se formarem poos durante a aplicao da amostra - nunca deixar secar a coluna
- Bomba peristltica
Presso operativa em A e B: presso (em cm de gua) medida em termos da distncia que separa a superfcie de lquido: (A) na coluna ou (B) no reservatrio da soluo tampo e a sada do tubo capilar
a densidade da
amostra pode ser aumentada por adio de sacarose a 1%
no sobrecarregar a
coluna com amostra (separaes irregulares)
Desenvolvimento da coluna
Definies: eluente: fase mvel eluio: migrao do analito na coluna devido ao movimento da fase mvel eludo: fase mvel que vai saindo da coluna Desenvolvimento da coluna: Separao isocrtica Eluio por gradiente pH I polaridade
Processo muito selectivo devido ao grande nmero de combinaes possveis de fases mveis e estacionrias Permite separar misturas muito complexas: glcidos, protenas, produtos farmacuticos, drogas, enantimeros .... Os componentes separados podem ser colectados individualmente ou analisados posteriormente por outras tcnicas (tcnicas hfenadas) que auxiliam a sua identificao No caso de separaes analticas so necessrias amostras de tamanho muito reduzido As anlises podem ser muito exactas e precisas Em geral, trata-se de uma tcnica simples e rpida