ANALISIS BASICO DE SEMEN

I.- FASE PREANALITICA: La informacin que tiene que recibir el paciente debe suministrarse por escrito. ( Normas de recogida de muestras de semen). En el momento de recoger el frasco con la muestra en el laboratorio este deber rotularse con el nombre del paciente. Proceder a dar un nmero de identificacin de la muestra, poniendo dicho cdigo en el bote y volante. Dar el volante a las administrativas para que proceda a su registro. Deber anotarse das de abstinencia, fecha y hora de recogida, si la muestra es completa, toma de frmacos y fiebre. Es fundamental anotar el tiempo que transcurre entre la recogida y el inicio del anlisis de semen. Estos datos se registrarn en la hoja de trabajo. 2.- EXAMEN MACROSCOPICO: Licuefaccin: El manejo de la muestra de semen desde su recepcin en el laboratorio debe ser como sigue. Cuando recibimos una muestra recin eyaculada debemos dejarla incubar a 37 C durante 20-25 min ( estufa de microbiologa). Durante este tiempo lo ideal es que est en rotacin continua, sino es posible debemos agitarla de vez en cuando durante unos 20-30 segundos. Transcurrido este tiempo determinamos si esta licuada o no. De estarlo procederemos al anlisis de la muestra y de no estarlo la dejaremos incubar hasta una hora. Si transcurrido este tiempo no esta licuada, hay presencia de grumos, cogulos o hebras, lo anotaremos como licuefaccin anormal. Las muestras de semen deben ser agitadas suavemente para que se homogenicen pero no debe utilizarse el vortex. Si una muestra es recogida fuera del laboratorio, antes de comenzar con su anlisis debe ser atemperada durante 5-10 min. Ante muestras con dficit de licuefaccin o elevada viscosidad se diluye 1:1 con tampn fosfato (PBS) y posterior homogeneizacin con pipeta Pasteur. En ste caso el volumen debe ser determinado previamente y referir los resultados de concentracin al volumen original.

Aspecto: Debe inspeccionarse visualmente despus de la licuefaccin pero nunca despus de trnascurridos 60 minutos desde la eyaculacin. Su color suele ser nacarado o gris-opalescente pudiendo parecer ms claro en caso de baja concentracin de espermatozoides. Si presenta color rojizo o marrn nos indicar la presencia de hemates, un color amarillento suele aparecer en pacientes con ictericia, alta ingestin de vitamina B (riboflavina) o elevados niveles de flavoprotenas oxidadas de vesculas seminales que suelen reflejar una elevada abstinencia. Volumen: Este se medir utilizando un tubo graduado. Se considera normal un volumen superior a 2 mL. Cuando existe un orgasmo y no eyaculacin tras una masturbacin nos encontramos ante una aspermia (ausencia de eyaculado). A la eyaculacin de menos de 2 mL se puede denominar hipospermia u oligospermia. Estas dos situaciones y en especial la aspermia, deben hacernos sospechar una eyaculacin retrgrada. Viscosidad: Para evaluar la viscosidad cargaremos una pipeta Pasteur con semen y dejaremos caer su contenido, si este no cae a gotas o formando hilos de menos de 2cm, consideraremos una viscosidad aumentada. Los resultados se anotan como normal o anormal. El tratamiento de muestras muy viscosas ser el mismo que el usado para la muestras con licuefaccin anormal. Ph: Lo mediremos utilizando tiras reactivas de rango 6,5 a 10,0. Tras depositar una gota en dicha tira esperamos 30 segundos y comparamos el color de la tira con la escala. Dado que las secreciones de vesculas seminales son alcalinas, cuando stas no se producen (infeccin o agenesias) el ph del semen ser cido. Cuando el ph sea menor de 7.2 en una muestra azoosprmica puede indicarnos una obstruccin a nivel de conductos eyaculadores o una agenesia bilateral de deferentes. Un ph menor de 7.2 pero con espermatozoides puede sugerir infeccin en tracto genital.

III.- MOVILIDAD ESPERMTICA: Los diferentes tipos de movilidad espermtica son: Tipo a: movilidad rpida y progresiva, mayor o igual 25 micrometros/sg a 37 C, o mayor o igual 20 micrmetros/seg a 20 C (equivalente el primero a 5 veces la cabeza en 1 segundo o a la mitad de la longitud de la cola). Tipo b: movilidad progresiva lenta o perezosa. Tipo c: movilidad no progresiva, < 5 micromtros/seg (equivalente a 1 vez la cabeza por segundo). Tipo d: inmvil. Un eyaculado humano deber tener a los 60 minutos de la eyaculacin: Mayor o igual 50% de los espermatozoides con movilidad tipo a + b, o bin Mayor o igual 25% con movilidad tipo a. As un eyaculado que posea valores inferiores a los mostrados ser clasificado como: Astenozoospermia. Material necesario: Portaobjetos y cubreobjetos de 22x22mm que deben estar atemperados previo manejo a 37 C. Microscopio con contraste de fases, y objetivos de 10, 20 y 40x. Pipeta automtica de 10 microlitros. El laboratorio debe permanecer a temperatura estable, de 20-24 C. Sobre un porta atemperado a 37 C se dispensan 10 microlitros de la muestra bien mezclada. Sobre esta se pone un cubre de 22 x 22 mm, sin apretar y sin dejar burbujas. Se deja estabilizar, y si a los 60 segundos no se estabiliza, se debe preparar otra muestra. Se realiza una primera observacin a 100 aumentos para asegurarnos de una distribucin lo ms homognea posible, teniendo en cuenta que debemos evitar los bordes de la preparacin. Si no fuera homognea se debe preparar otra muestra, asegurndonos que el eyaculado est completamente licuado. Si no se pudiera licuar, se debe anotar que la valoracin de la movilidad se ha realizado con dicho inconveniente, que podra dar lugar a una falsa astenozoospermia. A continuacin pasamos a 400x , y comenzamos nuestra valoracin de la movilidad.
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Se deben contar en una zona determinada primero los espermatozoides tipo a y tipo b que existen, para contar a continuacin los de tipo c y tipo d en esa misma zona. Se contarn 200 espermatozoides en un porta, con la ayuda de un contador de laboratorio. Se debe realizar en sucesivos campos siempre alejados de los bordes del porta. Seguidamente se repetir el contaje en otro porta y seguidamente se valora si la diferencia entre los dos contajes estn dentro del 95% de intervalos de confianza de error debido al azar. Para esto calculamos la diferencia y la media de los porcentajes del tipo de movilidad con ms presencia en ambos portaobjetos. A continuacin llevamos el valor de la media de los porcentajes a la curva ofrecida por la OMS (Figura 1). En dicha curva encontramos definidas las diferencias entre los porcentajes admisibles por el azar para cada valor de la media, si nuestra diferencia real es mayor o igual a la diferencia entre los dos porcentajes se debe repetir la estimacin de la movilidad. Si a pesar de todo sigue ofreciendo valores inadmisibles, se debe repasar el procesado de la muestra para descartar errores. En el momento de la valoracin podemos encontrar varios inconvenientes, debiendo anotar la existencia de stos en el seminograma, y actuando de la siguiente manera: o En la valoracin de la movilidad las colas sueltas no se cuentan. o Presencia de agregaciones o aglutinaciones. La presencia de stas puede interferir en la valoracin, ya que podramos interpretar como tipo c a un elevado nmero de espermatozoides tipo a o b que se encuentran capturados. De esta manera, si el porcentaje de espermatozoides atrapados es mayor de 10%, la valoracin de la movilidad se realizar exclusivamente con espermatozoides libres, debindose anotar que espermatozoides se encuentran atrapados. o Si la muestra est muy concentrada, puede interferirse la evaluacin, tanto por la dificultad que conlleva el seguimiento de los espermatozoides, como por el entorpecimiento entre estos. Para
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solventar este inconveniente contaremos en reas mucho ms reducidas. o Si la muestra posee una viscosidad elevada pueden producirse falsas astenozoospermias, adems de valoraciones muy dispares; si tal eventualidad se solventa mediante la dilucin con medio, en el seminograma se deber anotar que la valoracin se ha realizado con la muestra diluida. o Elevado nmero de clulas redondas en el eyaculado. En este caso se puede observar que espermatozoides de tipo a, al chocar con clulas redondas, pueden permanecer un tiempo parados, interpretndose errneamente como espermatozoides de tipo d o tipo c. Solventaremos este inconveniente contando slo en reas donde la densidad de clulas redondas se menor y, si esto no es posible, se debern valorar con ms exactitud los espermatozoides tipo d. IV: AGLUTINACIONES Y AGREGACIONES: La visualizacin de la aglutinacin se define por la visualizacin de espermatozoides mviles unidos por las cabezas, colas, o cabeza-cola. Agregacin se define por la unin de espermatozoides a espermatozoides inmviles ( en general muertos), otras clulas, restos, fibra mucosa, etc. La valoracin se realiza en el portaobjetos preparado para el contaje de la movilidad, observndose como mnimo 10 campos diferentes. La cantidad de aglutinaciones observadas en el examen se anotan en el informe del seminograma con una escala semicuantitativa, desde la no presencia de aglutinaciones (-), hasta la prctica totalidad de los espermatozoides aglutinados(+++). Teniendo en cuenta que la presencia de un pequeo nmero de aglutinaciones o pequeas agregaciones puede ser habitual en seminogramas normales. Segn autores, no se considera patolgica si no se observa en ms del 10% de los espermatozoides. La presencia de aglutinaciones sugiere, aunque de forma no definitiva, posibles alteraciones causadas por la presencia de Anticuerpos. Tambin se presentan con ms frecuencia en eyaculados hiperconcentrados, o incluso en infecciones de va seminal.

V.- MORFOLOGA ESPERMATICA Preparacin de la extensin: Deben realizarse dos extensiones del semen fresco. Los portas deben limpiarse en alcohol de 70% durante 15 minutos para asegurarnos que estn perfectamente limpios y secarse antes de aplicar el semen. Si la concentracin de espermatozoides es superior a 20 millones/ml, se aplican 5 microlitros de semen, si es inferior, debe aplicarse de 10 a 20 microlitros. En semenes con oligozospermia severa se debe concentrar la muestra. La tcnica que se usa para extender la muestra es la de arrastrar la gota con el canto de otro porta pero teniendo en cuidado de no dejar la extensin demasiado espesa. Si tenemos un semen muy espeso o con baja concentracin de espermatozoides, proceder: una alcuota de 0.2 a 0.5 ml se diluyen con 10 ml de suero fisiolgico. El tubo se centrfuga a 800g durante 10 minutos, se tira el sobrenadante y el botn se resuspende en el suero salino remanente. Se toma de 5 a 10 microlitros y se hace la extensin. Las dejamos secar al aire . Tincin : utilizamos el Panptico rpido ( Dic-Quick) que consta de tres pasos: Colorante 1: Introducir el porta mantenindolo 15 seg. Sacarlo e Colorante 2: Introducirlo mantenindolo durante 15 seg. Lavarlo en una cubeta con agua Colorante 3: Introducirlo mantenindolo durante 15 seg. Lavarlo en una cubeta con agua y poner a secar al aire. Estudio morfolgico: Deben evaluarse 200 espermatozoides. Se evaluarn dos extensiones y se valorar si la diferencia entre los dos contajes est dentro del 95% de intervalo de confianza de error debido al azar, procediendo del mismo modo que se describi para movilidad espermtica. Llevamos el valor de la media de los porcentajes a la curva ofrecida por la OMS. En dicha curva encontramos definidas las diferencias entre los porcentajes admisibles por el azar para cada valor de la media de dichos porcentajes, si nuestra diferencia real es mayor o igual a la diferencia entre los dos porcentajes segn la curva se debe repetir la estimacin de la morfologa. Si a pesar de todo sigue ofreciendo valores inadmisibles, se debe repasar el procesado de la muestra para descartar errores.
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Criterios de normalidad: Para que un espermatozoide sea considerado normal deben serlo la cabeza, cuello, pieza intermedia y cola. 1.-Cabeza normal: forma oval, 4.0-5.0 micras de longitud, 2.5-3.5 micras de ancho, la relacin longitud/ anchura debe ser 1.5-1.75, la regin acrosmica debe estar bien definida y suponer el 40-70% del rea de la cabeza. 2.- Pieza intermedia normal: debe ser delgada, con un ancho inferior a 1 micra, una longitud de aproximadamente una vez y media la longitud de la cabeza, unida axialmente a la cabeza y puede tener restos citoplsmicos siempre que el rea que ocupen sea inferior a la mitad del rea de la cabeza. 3.- Cola normal: debe ser recta, uniforme, de aproximadamente 45 micras de longitud. En la clasificacin no se incluyen las cabezas solas ni las colas solas, pero si se observan, deben ser anotadas y comentadas en el informe. Otros elementos celulares: Pueden encontrarse y deben ser identificadas otras clulas tales como leucocitos, clulas de espermatognesis, clulas de trnsito o clulas de origen urinario. Tabla 3 se pueden ver los criterios para definir a un espermatozoide como morfolgicamente normal y dibujos esquemticos de alteraciones de espermatozoides. VI. VITALIDAD ESPERMTICA Las tcnicas de determinacin de Vitalidad Espermtica nos permiten evaluar el porcentaje de espermatozoides vivos. Para ello se usa una medida indirecta, el estudio del estado de la membrana plasmtica. Las tcnicas de Vitalidad Espermtica medirn, por lo tanto el estado de la membrana plasmtica, ya que un espermatozoide vivo debe tener la membrana plasmtica intacta y otro muerto la debe tener daada. Para el estudio del estado de la membrana plasmtica vamos a utilizar la tcnica de la tincin con eosina. La membrana plasmtica intacta es impermeable a los colorantes vitales ( como Eosina), pero es atravesada fcilmente cuando se encuentra alterada y desorganizada. Estas sustancias se unirn especficamente al DNA celular y la observacin microscpica nos permitir distinguir entre espermatozoides teidos y no teidos. Los primeros seran no viables y por tanto con membrana estructuralmente daada y los segundos viables, con membrana estructuralmente intacta. Segn OMS-99 el estudio de
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vitalidad debera de ser desarrollado cuando la movilidad espermtica sea menor del 50%. Tincin con Eosina-Nigrosina: Se mezcla una gota de semen con dos gotas de Eosina Y ( 10 g/l en agua destilada). Despus de 30 seg. Se aaden 3 gotas de Nigrosina ( 100g/l en agua destilada). Despus de mezclar se hace una extensin y se observa bajo aceite de inmersin (1000x). Cuando se utilizan colorantes vitales se debe informar el porcentaje de espermatozoides no teidos, espermatozoides vivos. El valor de normalidad es mayor del 75% de espermatozoides no teidos. Hay que evaluar al menos 200 espermatozoides en muestras duplicadas. Los contajes deben ser cotejados mediante su media y diferencia y comparados con los esperados en la grfica 1. La vitalidad puede servir adems de chequeo de la movilidad porque el nmero de espermatozoides teidos no debera exceder el nmero de espermatozoides inmviles. La presencia de espermatozoides vivos e inmviles, es decir cuando el porcentaje de espermatozoides teidos es inferior al de espermatozoides inmviles, podra indicar alteraciones estructurales en el flagelo, como ocurre en el Sndrome de Kartagener. Por otra parte la presencia de espermatozoides muertos en un porcentaje del 100% puede indicar algn problema en la obtencin y/o transporte de la muestra, posiblemente por contaminacin con sustancias citotxicas ( detergentes, espermicidas, etc). VII.- CONCENTRACIN DE ESPERMATOZOIDES Y OTRAS CLULAS El semen es una suspensin de espermatozoides en liquido seminal. Adems del componente testicular un eyaculado se compone de secreciones procedentes de prstata, de vescula seminal y glndulas uretrales y bulbouretrales. La medida de la concentracin espermtica indicar el estado de la espermatogenesis del individuo. La OMS considera los valores de normalidad de concentracin por encima de 20 millones/ml, cifras inferiores se denominan oligozoospermia.

Procedimiento: Situar un volumen de muestra de 10 microlitos entre un porta y un cubre de dimensiones 22x22. Estabilizar la muestra durante un minuto a 37C y observar a 400x. Segn el nmero de espermatozoides por campo que se observen habr que realizar un determinado grado de dilucin con el diluyente de Weigman ( solucin de 50 g de bicarbonato sdico y 10 ml de formalina al 35% en un litro de agua) para la medida definitiva de la concentracin espermtica. Si se observan : < 15 espermatozoides por campo se realiza una dilucin 1:5. Entre 15-40 espermatozoides una dilucin 1:10 Entre 40-200 espermatozoides por campo una dilucin 1:20 >200 espermatozoides por campo una dilucin 1:50. Cuando el nmero de espermatozoides por campo es < 1-2 habr que centrifugar la muestra a 300 g durante 15 minutos. En este caso es suficiente con fines clnicos informar de una concentracin espermtica de < 2 millones/ml, anotando si se observan espermatozoides mviles o no. Todas las muestras en las cuales no son detectadas espermatozoides deben ser centrifugadas para detectar espermatozoides en el sedimento. Centrifugacin a ms de 3000g durante 15 minutos es recomendado. Solamente cuando no se observan espermatozoides en el precipitado resuspendido es cuando podemos clasificar a una muestra como azoospermica. Transferir aproximadamente 10 microlitos a la cmara de Neubauer Improved. Dejar durante 5 minutos en cmara hmeda para evitar que se seque. Una vez sedimentados los espermatozoides se cuentan al microscopio, solo se cuentan espermatozoides enteros. El procedimiento para contar los espermatozoides en la cmara es: la cmara posee 25 cuadrados grandes y cada cuadrado grande posee 16 cuadrados pequeos. Si la muestra posee < 10 espermatozoides en cuadrado grande deben ser contados los 25 cuadrados. Si posee entre 10-40 espermatozoides en cuadrado grande se deben contar 10 cuadrados.

 Si posee > 40 espermatozoides en un cuadrado grande se debe contar 5 cuadrados. Si es espermatozoide cae en una lnea dividiendo 2 cuadros adyacentes. Debe ser contado solo si est en la lnea superior o el lado izquierdo del cuadro asignado. Se deben realizar contajes duplicados de unos 200 espermatozoides para obtener un bajo error de contaje. Como chequeo se calcula la suma y diferencia de los contajes y se comparan con la grfica 2. Si la diferencia es mayor que la dada en la curva, se repite la dilucin y se vuelve a realizar el duplicado. Es necesario agitar bien la muestra antes de realizar la dilucin. Si la muestra es muy viscosa, pasarla la muestra por aguja fina mediante jeringa. El eyaculado contiene adems otras clulas, llamadas genricamente clulas redondas, que incluyen clulas epiteliales, clulas prostticas, clulas de la espermatognesis, y leucocitos. Un eyaculado normal no debera tener ms de 5 millones/ml de clulas redondas. Un excesivo nmero de leucocitos puede ser indicativo de infecciones y pobre calidad espermtica. El Nmero no debera exceder de 1 milln por mililitro. Un nmero elevado de clulas inmaduras en el eyaculado es indicativo de desordenes de la espermatognesis, tales como hipoespermatognesis, varicocele y alteracin de clulas de Sertoli. La concentracin de estas clulas se puede medir indirectamente a partir de la siguiente frmula: C=(NxS)/100 N= nmero de clulas S= Concentracin espermtica.

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Tabla: diluciones y factores de conversin para una Cmara de Neubauer. Factor conversin N cg contados Esp.x400 Dilucin 25 10 5 ______________________________ ________________________ <15 15-40 40-200 >200 1:5 1:10 1:20 1:50 20 10 5 2 8 4 2 0.8 4 2 1 0.4

Recomendaciones de cuadros grandes (cg) que hay que contar en funcin de los espermatozoides que hay en un cuadro grande. N esp cg < 10 10.40 >40 N cuadros a contar 25 10 5

VIII.- DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTIESPERMATOZOIDE Antecedente previos de patologa androlgica parecen relacionarse con la presencia de estos anticuerpos, derivados de la posible ruptura de la barrera hematotesticular y toma de contacto sistema inmune clulas germinales. Por tanto, ante criptorquidias, varicoceles, infecciones recidivantes del tracto genitourinario, intervenciones quirrgicas, etc, son circunstancias a considerar en la exploracin de este factor. Vamos a utilizar el MAR Test o reaccin mixta de la antiglobulina. Nos va a permitir identificar la presencia de AEE, caracterizar los isotipos presente y cuantificar la respuesta inmunolgica existente, expresada como porcentaje de espermetazoides mviles que tiene adheridos anticuerpos en sus superficie. Se considera que un factor inmunolgico tiene importancia clnica en aquellos casos en que se observan ms del 50% de espermatozoides mviles con anticuerpos adheridos a su superficie. Debido a que dicha tcnica es de deteccin directa de los anticuerpos que se encuentran adheridos a los espermatozoides mviles, de forma que en caso de elevada astenozoospermiay/o necrozoospermia, no podremos explorar la presencia de factor masculino inmunolgico concomitante empleando estas tcnicas.
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Principio del test: La presencia de anticuerpos antiesperma reacciona con antigenos en los espermatozoides es considerado como tpico y especifico de infertilidad inmunolgica. Los anticuerpos antiesperma son de dos clases: IgA e IgG. Los anticuerpos IgA son ms importantes clnicamente que los IgG. Sin embargo los anticuerpos IgA raramente ocurren sin los IgG, por lo tanto, testando los anticuerpos IgG son suficiente como mtodo de escrining. El Mar Test directo se realiza mezclando semen fresco con partculas de latex a las que se las ha unido Ig G. Despus se4 mezcla con antisuero humano IgG. La formacin de aglutinaciones entres las partculas y espermatozoides mviles indica la presencia de Ig G anticuerpos en los espermatozoides. Procedimiento: 1.- Poner los reactivos y la muestra a temperatura ambiente. 2.- En un porta poner: 10 microlitros de semen fresco sin tratar. 10 microlitros de partculas de latex de SpermMar. 10 microlitros de antisuero SpermMar. Mezclar la muestra y el reactivo de Ltex 5 veces con la punta de la pipeta. Tambin mezclar el antisuero con la mezcla de la muestra y el reactivo de ltex. Poner un cubre de 24 x40 mm y observar al microscopio a 400X o 600x con luz intensa o en contraste de fases. Leer el resultado despus de 2-3 minutos. Observar las particulas de latex unidas a los espermatozoides mviles. Contar 100 espermatozoides para determinar el porcentaje de esperma reactivo. Si no se observan bolas unidas a los espermatozoide, leer otra vez a los 10 minutos.Guardar la preparacin en una cmara hmeda. Si existen anticuerpos contra los espermatozoides, las particulas de ltex se adherirn a los espermatozoides mviles. Al principio se ven los espermatozoides mviles que se mueven de un sitio para otro con unas pocas y hasta con muchas partculas adheridas, pero eventualmente estos aglutinados se tornan tan masivos que los espermatozoides slo pueden moverse en su sitio si estn adheridos a las partculas.

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CONTROL DE CALIDAD INTERNO La distribucin aleatorioa de los espermatozoides, incluso cundo la muestra est muy bien homogenizada, es en gran parte responsable de la falta de precisin en los resultados del anlisis de semen. La medicin de concentracin, movilidad y morfologa se realiza con un limitado nmero de espermatozoides que suponemos representativos de la muestra, lo cual provoca un error aleatorio que se denomina error de contaje. La magnitud de ste error est inversamente relacionada con la raz cuadrada del nmero de espermatozoides contados. Teniendo en cuenta que el error de contaje puede ser reducido examinando un mayor nmero de espermatozoides, debe tambin evaluarse la posible prdida de exactitud debida al cansancio del tcnico que realiza la medicin, por lo que es necesario establecer un equilibrio entre ambos factores. El control de calidad llevado a cabo: a) A nivel intra- individual: todas la mediciones que realiza un observador se hacen por duplicado y, si las diferencias superan el error de contaje, se rechace la medicin comenzndose de nuevo. La medicin duplicada se realiza desde el comienzo del procedimiento, ya que si lo limitamos a la lectura al microscopio no podremos detectar errores de preparacin.

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