UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA FACULDADE DE FARMCIA DEPARTAMENTO DE CINCIAS FARMACUTICAS AULA PRTICA 2 COLETA, TRANSPORTE E PREPARO DE AMOSTRAS

PARA ANLISES MICROBIOLGICAS A coleta, transporte e preparo da amostra constituem-se partes integrantes do processo de anlise de alimentos, devido alta correlao entre estes procedimentos e os resultados das anlises. Estas etapas devem ser realizadas de forma criteriosa e seguindo as recomendaes estabelecidas por rgos competentes para que os resultados obtidos na anlise microbiolgica sejam confiveis e condizentes com as reais caractersticas do produto avaliado. Objetivos: - Fornecer noes bsicas sobre os procedimentos de coleta, transporte e estocagem de amostras para anlise microbiolgica. - Fornecer noes bsicas sobre a importncia dos procedimentos de recepo e preparo de amostras para anlise microbiolgica de maneira a obter resultados laboratoriais vlidos.

1. DEFINIES Lote: quantidade de alimento de mesma composio, produzida e manuseada em mesma batelada, sob as mesmas condies. Amostra: frao de alimento do total produzido, retirada ao acaso, que representa o lote (todo). Plano de amostragem: plano estatstico adequado que determina o nmero de amostras a serem coletadas e analisadas segundo critrios microbiolgicos de avaliao. Unidade analtica: quantidade de alimento efetivamente utilizada na realizao dos ensaios microbiolgicos. O nmero de unidades analticas depende do nmero e tipos de ensaios a serem realizados na amostra.

2. COLETA DE AMOSTRAS PARA ANLISES MICROBIOLGICAS 2.1 Alimentos acondicionados em embalagens individuais Coletar e encaminhar o alimento ao laboratrio para anlise em sua embalagem comercial original, fechada e intacta; A embalagem unitria dever conter quantidade de alimento maior que duas vezes o peso ou volume da unidade analtica, no mnimo. Se no, recomenda-se coletar vrias embalagens unitrias, como parte de uma mesma unidade de amostra. No momento da anlise juntar o contedo

das diversas embalagens em um nico frasco estril, misturando-se bem e retirar a unidade analtica da mistura. Se o produto no permitir mistura, deve-se tomar, de cada uma das embalagens unitrias, pores de peso aproximadamente igual, para compor a unidade analtica daquela unidade de amostra. Acondicionamento da amostra: ao ser retirada da embalagem original, deve ser colocada em recipiente previamente esterilizado e identificado, para resguardar de qualquer alterao, utilizando um fechamento que no possa ser violado. 2.2 Alimentos acondicionados em embalagens no individuais Promover uma mistura de toda a massa de alimento antes de iniciar a coleta das unidades de amostra. Se no for possvel a mistura, compor a unidade de amostra com pores de diferentes partes do contedo; Transferir pores representativas da massa total para frascos de coleta ou sacos estreis (material aprovado para contato com alimentos, autoclavvel, tampa a prova de vazamento, tamanho adequado quantidade recomendvel 200 g de alimentos slidos ou 300-500 mL de produtos lquidos), sob condies asspticas; Utilizar no mximo da capacidade do frasco de coleta na tomada da unidade analtica (facilitar posterior mistura da amostra na tomada da unidade analtica); Frascos e utenslios utilizados na coleta devem ser previamente esterilizados (mais comum: autoclavar 121C/15min ou estufa 170C/2h); No introduzir o frasco de coleta diretamente no produto.

2.3 Alimentos envolvidos em surtos de doenas de origem alimentar Coletar a amostra o mais cedo possvel; Se no houver sobras do alimento suspeito deve-se coletar: - Vasilhames onde o mesmo foi preparado ou acondicionado; - Amostras de ingredientes e matria-prima utilizados no preparo; - Amostras de refeies preparadas sob as mesmas condies. 2.4 Informaes que devem acompanhar as amostras Tipo de amostra e processo utilizado na fabricao; Fabricante, data de fabricao, cdigo do lote; Solicitante da anlise; Data e local de coleta da amostra; Razo da anlise.

3. TRANSPORTE E ESTOCAGEM Regra geral: transportar e estocar amostras de alimentos da mesma forma como o produto normalmente transportado e estocado na sua comercializao;

Tabela. Tipos de alimento e condies de transporte e estocagem

Recomendaes especficas para alguns grupos de micro-organismos: Bactrias lticas Vibrios patognicos Clostridium perfringens Campylobacter

Sensveis refrigerao e/ou congelamento.

Psicrotrficos analisar em at 6h.

4. RECEPO DA AMOSTRA Deve-se observar a integridade das embalagens e as condies de transporte antes da aceitao do pedido de anlise. Documentar todas as informaes pertinentes sobre a amostra.

5. PREPARO DE AMOSTRAS PARA ANLISES MICROBIOLGICAS Envolve trs etapas: Homogeneizao e retirada da unidade analtica; Preparao da primeira diluio; Preparao das diluies seriadas. Recomendaes para manter as condies asspticas Assegurar-se de que a rea de trabalho esteja limpa e as portas e janelas fechadas (evitar corrente de ar); Desinfetar todas as superfcies de trabalho com etanol 70% ou desinfetante equivalente; Assegurar que todo material necessrio esteja disponvel nas bancadas; Lavar as mos e desinfetar com etanol 70%; Trabalhar em capela de fluxo laminar ou prximo a chama do bico de Bunsen Evitar a formao de aerossis ao abrir tubos e frascos; Antes de abrir as embalagens, desinfetar a rea externa com etanol 70%, mantendo o contato at a evaporao do lcool; Depois de usados, acomodar pipetas e utenslios em bandejas de descarte; Todos os instrumentos utilizados na abertura das embalagens e retirada da unidade analtica dever ser esterilizados ou flambados.

5.1 Homogeneizao e retirada da unidade analtica As unidades analticas so retiradas com os objetivos de avaliar a presena/ausncia de um micro-organismo especfico, ensaios de quantificao de determinados grupos de micro-organismos e/ou ensaios de tratamento diferenciado da amostra. Normalmente a unidade analtica de 25g de amostra para maioria dos ensaios. Alimentos lquidos: deve-se garantir a homogeneizao agitando o recipiente 25 vezes em um arco de 30 cm. Os frascos devem ter um espao livre de 1/3 para permitir correta homogeneizao. O intervalo entre a homogeneizao e a retirada da unidade analtica no deve ultrapassar 3 min. Alimentos slidos ou lquidos concentrados: alimentos lquidos concentrados, pastosos ou ps deve-se revolver a amostra para homogeneizar e retirar a unidade analtica em at 15 min. Alimentos slidos deve-se cortar pedaos de diferentes pontos para compor a unidade analtica. Amostras congeladas recomenda-se o descongelamento sob refrigerao a 4C por at 18 horas. Alimentos com contaminao superficial: deve-se utilizar as tcnicas de esfregao de superfcie (swabs ou esponjas) ou rinsagem, abordadas em aula especfica. 5.2 Preparo da primeira diluio Na escolha do diluente deve-se levar em considerao as condies de osmolaridade e pH para manter a integridade da clula microbiana, e o tipo de alimento e micro-organismo pesquisado. Os diluentes comumente utilizados so gua peptonada 0,1% (p/v), tampo fosfato pH 7,2, soluo salina 0,85% (p/v), soluo salina peptonada e caldos de pr-enriquecimento especficos. Normalmente, a primeira diluio realizada uma diluio 10 -1, em que so misturados 25 g ou ml de amostra (unidade analtica) com 225 mL do diluente. Para outras diluies diferentes de 10-1, pode-se calcular o volume de diluente a ser utilizado pela equao V = (unidade analtica x diluio) unidade analtica, onde V o volume de diluente. A unidade analtica e o diluente podem ser homogeneizados em aparelho de stomacher por 1 a 2 min, liquidificador a 8000-15000 rpm, ou agitao simples 25x com arco de 30 cm (alimentos lquidos ou de fcil dissoluo). A homogeneizao e as diluies posteriores no devem exceder 30 min. 5.3 Diluies seriadas A preparao de diluies seriadas da amostra requerida nos ensaios quantitativos, para reduzir o nmero de micro-organismos por unidade de volume e permitir a contagem. O nmero de diluies necessrias depende do nvel de contaminao esperado no alimento.

Esquema de diluies seriadas

Recomendaes para transferncia de volumes entre as diluies: Usar sempre uma pipeta diferente para cada diluio. Homogeneizar as diluies antes de transferir o volume (25 vezes ou agitador tipo vortex). Escolher pipetas que tenham capacidade no mximo 10 vezes superior ao volume que vai ser coletado. A pipeta deve ser completamente preenchida e o volume descarregado a partir da marca superior. Liberar o volume com a ponta da pipeta encostada na parede interna do tubo ou frasco, de forma que o lquido escorra pela parede; No flambar pipetas. Caso a ponta da pipeta venha tocar qualquer superfcie no estril, descart-la e substitu-la por outra. 6. REFERNCIAS DOWNES, F. P.; ITO, K. Compendium of methods for the microbiological examination of foods (4aed.). Washington: American Public Health Association, 2001. 676p. SILVA, N.da; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A.; TANIWAKI; SANTOS, M. H.; R. F. S. dos; GOMES, R. A. R. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos e gua. So Paulo: Livraria Varela, 2010. 630p.