Aspectos Tericos 29

3 Aspectos Tericos
3.1.Espalhamentos Inelsticos
Os sinais de interesse detectados em um espectro de um LIF-LIDAR so,
basicamente, decorridos de espalhamentos inelsticos, isto , interaes onde h
transferncia de energia da radiao para a matria ou, mais raramente (e,
conseqentemente, com menor intensidade), da matria para a radiao. Neste
captulo esto descritos os dois espalhamentos inelsticos que sero determinantes
na construo da instrumentao realizada: a fluorescncia e a linha Stokes do
espalhamento Raman da molcula de gua.

3.1.1.Fluorescncia
A absoro de um fton por uma molcula, levando excitao de um
eltron a um estado eletrnico mais elevado , em geral, acompanhada de uma
transio de estado vibracional.
Como a massa dos ncleos muito maior que a dos eltrons, aqueles podem
ser considerados estticos na escala do tempo da transio eletrnica (princpio de
Frank-Condon). Com o eltron em um nvel eletrnico mais energtico, os
ncleos iro reagir a esta nova configurao situando-se em um estado vibracional
diferente (Figura 1). Formalmente temos
' ' '
vv
if
f
v
i
v if
f
v
f
el
i
v
i
el if
S
r
; Equao 1
Onde
2 2
' '
f
v
i
v
vv
S so chamados de fatores de Frank-Condon,
representa a funo de onda dos estados vibracionais, representa a funo de
onda dos estados eletrnicos e momento de dipolo associado.




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Aspectos Tericos 30

Figura 1 - A funo de onda vibracional no estado eletrnico excitado com maior
coincidncia com a funo de onda vibracional anterior, no estado fundamental, ter
maior probabilidade de ocorrer.

Aps a excitao a um estado vibracional mais excitado, a molcula tende a
relaxar por meio da interao com o meio circundante.
A relaxao de um nvel vibracional mais alto para o nvel vibracional de
mais baixa energia de um certo estado eletrnico pode ocorrer em 10
-12
s (ou
menos) em meios condensados. Processos de converso interna, isto , a
passagem da molcula de um estado eletrnico de mais alta energia com nvel
vibracional de mais baixa energia para um estado eletrnico de mais baixa
energia, mas com nvel vibracional excitado, ocorrem tambm na escala de tempo
de 10
-12
s.
Decaimentos no-radiativos podem continuar a ocorrer at o estado
fundamental (tambm por converso interna). Esses decaimentos ocorrem em
tempos que variam de 10
-12
s a 10
-6
s.
A taxa de decaimento radiativo situa-se em torno de 10
7
s
-1
a 10
8
s
-1
para uma
transio ptica forte (alta taxa de decaimento radiativo). Como essas emisses
ocorrem muito mais provavelmente do nvel vibracional menos energtico (10
12
s
-1

para transies vibracionais contra 10
8
s
-1
para transies fluorescentes), portanto,
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Aspectos Tericos 31
aps haver ocorrido decaimentos no-radiativos, na maioria dos casos, a energia
do fton emitido menor que a do fton absorvido. A fluorescncia de uma
molcula o decaimento de um estado excitado
0
v
exc
el
para o estado
fundamental por meio de emisso espontnea de um fton.
A ocorrncia de fluorescncia em uma molcula (quando excitada por luz
com um determinado comprimento de onda) est vinculada comparao dos
coeficientes de decaimento pelo(s) caminho(s) no-radiativo(s). A fluorescncia
acontece quando a taxa de decaimento radiativo pelo menos comparvel taxa
de decaimento no-radiativo.
Uma das caractersticas mais atrativas da espectroscopia de fluorescncia
sua sensibilidade, se comparada com a espectroscopia de absoro.O limite de
deteco das tcnicas fluorimtricas , em geral, de uma a trs ordens de
magnitude menor do que as de espectrofotometria de absoro. Seu limite de
deteco est, tipicamente, na escala de partes por bilho Esta alta sensibilidade se
deve existncia de detectores capazes de detectar um fton (detectores photon
counting). J os detectores de espectroscopia por absoro se baseiam na deteco
de uma reduo da intensidade da radiao incidente, o que faz necessrio medir
radiaes de grande intensidade que esto fora da faixa de operao dos
dispositivos photon counting.
Outra vantagem acessria a grande faixa de concentrao do fluorforo
em que as medidas de intensidade guardam uma relao linear, simplificando
assim o procedimento laboratorial de rotina. Igualmente importante, o fato de os
mtodos de espectroscopia por fluorescncia serem muito mais seletivos. Em
contrapartida, esta tcnica se limita a um nmero relativamente pequeno de
estruturas moleculares que apresentam emisso fluorescente aps a absoro de
ftons.
A fluorescncia ocorre tanto em sistemas qumicos simples como
complexos, sejam gases, lquidos ou slidos. O tipo de fluorescncia em que a
radiao absorvida reemitida sem alterao de freqncia chamada de
fluorescncia ressonante. As bandas de fluorescncia molecular, contudo,
encontram-se, muito mais freqentemente, centradas em comprimentos de onda
maiores (energias menores) que o da linha de ressonncia.

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Aspectos Tericos 32
A Figura 2 mostra esquematicamente as diferentes formas de decaimento
para eltrons excitados. Duas dessas transies, a fluorescncia e a fosforescncia,
so radiativas, pois envolvem a liberao de ftons. Porm, outras formas de
transio no radiativas podem ocorrer.

Fosforescncia
Converso
Interna e
externa
Fluorescncia
Absoro
Singletos Tripleto
Relaxao vibracional
Cruzamento intersistema

Figura 2 - Esquema de excitao e decaimento dos eltrons. Os nveis excitados
esquerda exemplificam estados singletos. O nvel eletrnico excitado da direita
representa um tripleto.

A Figura 3 mostra a outra alternativa de decaimento que ocorre quando a
molcula em estado excitado troca seu spin total realizando um cruzamento
intersistema do estado onde S = 0 (singleto) para um estado com S = 1 (tripleto).
Neste estado, o decaimento ao estado fundamental por emisso radiativa de um
fton de maior comprimento de onda denominado fosforescncia. Como a taxa
de cruzamento intersistemas baixa (at 10
1
s
-1
), fosforescncia um processo
lento.
Estado fundamental Singleto Tripleto

Figura 3 - Possibilidades de composio de spins para um par de eltrons

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Aspectos Tericos 33
Os processos no radiativos para a desexcitao da molcula so a relaxao
vibracional, a converso interna, a converso externa e o cruzamento
intersistemas. Como descrito a seguir, esses processos podem competir com as
transies radiativas ou mesmo complement-las.
Relaxao vibracional: Uma molcula pode ser excitada a qualquer um dos
nveis vibracionais dos nveis eletrnicos mais energticos durante um processo
de excitao eletrnica. Em um solvente, entretanto, este "excesso" de energia
vibracional muito rapidamente perdido para o meio, resultando em um pequeno
acrscimo na temperatura deste e levando o eltron ao mais baixo nvel
vibracional do estado excitado. O processo de relaxao vibracional to eficiente
que o tempo de vida dos nveis vibracionais da ordem de 10
-12
s ou menos. Desta
forma, a banda de fluorescncia associada a esta transio eletrnica , quando
existente, ocorre a energias menores que da excitao inicial.
Converso interna: Este fenmeno ocorre quando os nveis vibracionais de
um estado eletrnico de mais baixa energia se superpem, em energia, aos nveis
vibracionais de outro estado eletrnico de maior energia para o qual o eltron foi
excitado. Assim, o eltron pode decair para o estado eletrnico de menor energia
de forma no radiativa. Esta converso interna, alm de impedir a emisso
fluorescente, pode ser responsvel pela pr-dissociao destas molculas, uma vez
que a transferncia do eltron para um estado vibracional alto de um estado
eletrnico menos energtico pode provocar a ruptura da ligao molecular.
Converso externa: A desativao de estados eletrnicos excitados podem
envolver interaes e transferncia de energia entre a molcula excitada e o
solvente ou outros solutos da soluo. Esta converso externa experimentada
quando se verifica o efeito na intensidade da fluorescncia devido mudana do
solvente. Baixa temperatura e alta viscosidade, que diminuem a coliso entre
partculas, geralmente levam a um aumento da fluorescncia.
Cruzamento intersistemas: Este o processo no qual o spin do eltron
excitado invertido e, por exemplo, permite a migrao deste para um estado
tripleto. Este processo mais comum em molculas contendo tomos pesados. As
interaes spin/rbita ficam mais fortes na presena de tais tomos e, desta forma,
a mudana do spin favorecida. A presena, na soluo, de espcies
paramagnticas, tais como o oxignio molecular, tambm promove o cruzamento
intersistemas, diminuindo a fluorescncia.
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Aspectos Tericos 34
Estes mecanismos limitam a fotoluminescncia a um nmero relativamente
pequeno de sistemas. A rota mais favorvel para o decaimento aquele que
minimiza o tempo de vida dos estados excitados. Desta forma, o decaimento por
fluorescncia ser observado se o sistema apresentar caractersticas estruturais e
ambientais que faam este decaimento rpido o suficiente em relao aos
processos no radiativos.
A fluorescncia raramente ocorre para excitaes com radiao ultravioleta
de comprimento de onda menor que 250nm (~5eV), pois tal radiao constituda
por ftons com energia suficiente para causar a desativao da molcula por
dissociao ou pr-dissociao
2
.
observado empiricamente que a fluorescncia mais encontrada em
compostos nos quais a transio de mais baixa energia do tipo * . Este fato
pode ser compreendido pelo maior coeficiente de absoro deste tipo de transio
que para transies do tipo * n (da ordem de 100 a 1000 vezes maior).
Sabe-se empiricamente que molculas que possuem estrutura rgida
fluorescem mais. A falta de rigidez provavelmente causa um aumento na taxa de
converso interna diminuindo a fluorescncia. Igualmente conhecido o fato de
que h um aumento da fluorescncia quando corantes fluorescentes so
adsorvidos em superfcies slidas. Aqui tambm a rigidez estrutural, adicionada
pela superfcie, pode ser responsvel pelo efeito observado. Outro fator de
alterao da intensidade da fluorescncia a presena de oxignio dissolvido.
Neste caso, h, freqentemente, a diminuio da fluorescncia. Duas razes
concorrem para este efeito: a ocorrncia de induo fotoqumica da oxidao das
espcies fluorescentes ou, o que mais comum, o cruzamento intersistema,

2
A pr-dissociao deve ser diferenciada da dissociao. Na dissociao, a
radiao absorvida leva o eltron diretamente para um nvel vibracional
suficientemente energtico para causar a ruptura da ligao. No caso da pr-
dissociao, a radiao leva inicialmente o eltron a um nvel eletrnico de mais alta
energia. Posteriormente, por cruzamento intersistema, o eltron passa a um nvel
eletrnico baixo mas em um nvel vibracional mais energtico. A pr-dissociao
ocorre quando este nvel vibracional tem energia suficiente para causar a ruptura da
ligao.
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Aspectos Tericos 35
levando a molcula a um estado excitado tripleto, em virtude das propriedades
paramagnticas do oxignio molecular.
Para o clculo da concentrao de um fluorforo a partir de sua
fluorescncia, levamos em conta que a potncia da radiao fluorescente
proporcional radiao do feixe incidente que absorvido pelo sistema. Isto ,
( ) F K P P
0
; Equao 2
onde P
0
a potncia do feixe incidente e P sua potncia aps atravessar um
comprimento b do meio.
Para relacionar a potncia da radiao fluorescente F com a concentrao c
do fluorforo, escreve-se a lei de Beer na forma
P
P
bc
0
10

; Equao 3
onde o coeficiente de absoro e o produto bc a absorbncia A.
Substituindo a Equao 3 na Equao 2 temos
( )
bc
P K F

10 1
0
; Equao 4
expandindo o termo entre parnteses em srie de Taylor obtemos
( ) ( )
F K P bc
bc bc
+

1
]
1
0
2 3
2 303
2 303
2
2 303
3
.
.
!
.
!
...

; Equao 5
Para valores de bc < 0.02, todos os termos subseqentes no colchete so
pequenos quando comparados com o primeiro. Desta forma, utilizando-se apenas
o primeiro termo, o erro da Equao 5 em relao Equao 4 ser de no mximo
2,5%. Quando a concentrao de fluorforos pequena o suficiente para satisfazer
esta condio, pode-se, ento, escrever
Kc bc P K F
0
'
303 , 2 ; Equao 6
Para a situao objeto desta tese, que envolve a determinao de clorofila a
no mar, pode-se calcular at que concentrao de clorofila a na gua do mar,
analisada em uma cubeta simples, com 1cm de largura, se enquadra a Equao 6
com um erro mximo de 2,5%. Utilizando um coeficiente de absoro tpico
[Campbell & Esaias, 1983] em torno de 0,05 l/(g.m), as concentraes at 45
g/l apresentam um erro mximo de 2,4%, o que satisfaz a condio para
utilizao da equao 2.5.
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Aspectos Tericos 36
Na anlise deste clculo, vale acrescentar que outros dois fenmenos so
capazes de produzir desvios nesta relao linear: a auto-absoro e a auto-
extino. A auto-absoro ocorre quando o comprimento de onda de emisso se
sobrepe ao pico de absoro do fluorforo. Desta forma, a radiao emitida sofre
um decrscimo na medida que atravessa a soluo, pois uma parte reabsorvida
pelo fluorforo. A auto-extino ocorre por coliso entre os fluorforos,
provavelmente de uma maneira anloga converso externa. Os efeitos de ambos
os fenmenos crescem com o aumento da concentrao.
Para medidas realizadas diretamente sobre o mar necessrio levar em
conta os mltiplos espalhamentos sofridos pela radiao, que iro afetar o total de
luz disponvel a cada profundidade. Modelos de transferncia radiativas foram
utilizados para desenvolver a relao da concentrao de um fluorforo em uma
coluna de gua do mar, quando medido por um LIDAR (neste caso, conforme
descrito na Equao 12, linear a relao entre a potncia detectada da
fluorescncia e a concentrao do fluorforo). Segundo simulaes modeladas por
computador [Poole & Esaias, 1982], concentraes maiores que 1g/l devem ser
integradas em, no mximo, 3m. Deve-se tambm levar em conta que, segundo
Falkowski [Falkowski & Kolber, 1995], o valor mdio da concentrao da
clorofila a nos oceanos do mundo de 0,2 g/l.

3.1.2. Espalhamento Raman
A Figura 4 apresenta um espectro tpico da radiao retroespalhada da gua
do mar. Em que pese a ocorrncia de importantes bandas de fluorescncia ao
longo do espectro, o pico mais intenso deste espectro (excitado em 532nm) tem
outra natureza.: decorrente da emisso Raman da gua.
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Aspectos Tericos 37
E
m
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s
s

o

(
u
.
a
.
)

Figura 4 - Espectro de fluorescncia de gua costeira medido pelo LIDAR-PUC. O pico
da emisso Raman est em 651nm (excitao em 532nm).
O espalhamento Raman um espalhamento inelstico da radiao por um
material, isto , um quantum de energia (um fnon) transferido entre o quantum
de radiao e o material, de tal forma que a luz espalhada contm ftons com
energia menor (linha Stokes) ou maior (linha anti-Stokes) que o da excitao.
Para descrever completamente o espalhamento Raman necessrio utilizar
tanto a teoria de grupos como a teoria de perturbaes de ordens superiores.
Entretanto, possvel obter uma compreenso clssica do fenmeno
considerando-o decorrente da ao do campo eltrico da onda eletromagntica
sobre as cargas do material [Andrew & Demidov, 1995]. Ao contrrio do processo
de simples absoro, que requer a existncia na molcula de um momento de
dipolo eltrico, o efeito Raman est associado polarizabilidade da molcula,
mesmo que esta no possua momento de dipolo.
Considerando, por simplicidade, a interao da luz com uma nica
molcula, expressa-se o momento de dipolo desta molcula como:
( )

+ + + +
,... , , , l k j i
l k j ijkl k j ijk j ij i i
E E E E E E p P L ; Equao 7
onde i,j,k,l representam as coordenadas espaciais x, y e z e E
i
o campo
eltrico da radiao incidente. O termo p
i
expressa a possibilidade de um
momento de dipolo permanente. Dos componentes restantes, induzidos pela
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Aspectos Tericos 38
presena do campo eltrico, vamos fixar nossa ateno sobre o termo linear em E.
Os termos de ordens mais altas em E
i
expressam processos (no-lineares), como o
espalhamento hiper-Raman, e que no sero de interesse aqui.
Tanto o momento de dipolo p
i
como a polarizabilidade
i,j
podem variar no
tempo, se a molcula vibra. Expandindo p
i
e
i,j
como sries de Taylor em termos
das coordenadas generalizadas q
n
, que descrevem os n modos vibracionais (q
n
so
os deslocamentos atmicos de cada modo) temos:

,
_

,
_

n
n
q
n
i
i i
q
q
p
p p
0
0 ;

,
_

,
_

n
n
q
n
ij
ij ij
q
q
0
0

Equaes 8

Considerando os deslocamentos q
n
pequenos, pode-se aproximar a
dependncia temporal de q
n
e escrever:
( ) ( ) t q t q
n n n
cos
0
;
( ) ( ) t E t E
L i i
cos
0


Equaes 9

Substituindo as Equaes 8 e Equaes 9 na Equao 7 (desprezando os
termos de mais alta ordem) tm-se
( ) ( )
( ) [ ] ( ) [ ] { }

,
_

,
_

+ +

,
_

+
+ +

,
_

,
_

,... , , ,
0
0
0 0 0
0
0
cos cos
cos cos
l k j i
n
L n L n
q
n
ij
n oj
L j ij
n
n n
q
n
i
i
i
t t
q
q E
t E t q
q
p
p
P
L

;
Equao 10
O termo ( )

,
_

,
_

n
n n
q
n
i
t q
q
p
cos
0
0
est associado absoro no infra-
vermelho. O termo ( ) t E
L j ij
cos
0 0
representa a absoro associada ao
espalhamento Rayleigh, na mesma freqncia da radiao incidente. Finalmente,
o termo ( ) [ ] ( ) [ ] { }

,
_

+ +

,
_

n
L n L n
q
n
ij
n oj
t t
q
q E

cos cos
0
0
representa a parte
P
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Aspectos Tericos 39
do momento de dipolo que induzido pela luz e tambm proporcional
freqncia de oscilao de
i,j
. Se 0
0

,
_

q
n
ij
q

para determinado valor do par

i,j, dois termos aparecem; correspondem reemisso de ftons. Estes so os
espalhamentos Raman Stokes e anti-stokes, respectivamente, com energia com
valor para maior ou menor de um quantum de energia associado diferena de
energia dos modos vibracionais da molcula.
Esta descrio, entretanto, no explica a diferena das intensidades das
linhas Stokes e anti-Stokes. Para isto necessrio analisar o fenmeno
quanticamente. Neste caso, considera-se uma interao de dois ftons com um
fnon da molcula. A variao de energia do fton espalhado (reemitido) vista
como associado a um processo de emisso ou absoro de fnons quando do
relaxamento da molcula.
Naturalmente, o decaimento para nveis vibracionais de maior energia que o
estado fundamental sempre possvel, gerando um fton de menor energia que o
inicial. J para aniquilar um fonon, gerando um fton com maior energia que o
inicial, um eltron deve estar em um nvel vibracional de maior energia, e esta
probabilidade depende da temperatura. Desta forma, a razo entre as linhas Stokes
e anti-stokes refletem o fator de Boltzmann (
( ) kT h
e
/
). Apesar de este no ser o
nico fator determinante das intensidades das linhas Stokes e anti-Stokes,
possvel compreender, ainda que qualitativamente, esta diferena entre suas
intensidades.
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Aspectos Tericos 40
Stokes,
E = h - E
E
E
Espalhamento Rayleigh Espalhamento Raman
Anti-Stokes,
E = h + E

Figura 5 - Esquema dos espalhamentos Rayleigh (elstico) e Raman(inelstico).

A intensidade de um pico Raman depende de maneira complexa da
possibilidade de polarizao da molcula, da intensidade da fonte e da
concentrao da molcula ativa, entre outros fatores. A potncia da emisso
Raman cresce com a quarta potncia da freqncia da fonte de excitao (similar
ao espalhamento Rayleigh:
2
0
2
4
4
3
16
E
c
I

, onde o comprimento de onda e

E
0
a amplitude do vetor de campo eltrico). A intensidade do Raman em geral
diretamente proporcional concentrao da molcula ativa. Se o estado virtual
corresponde a um estado real, esta transmisso denominada Raman-ressonante.

3.2.Fotossntese
A captura da energia solar por organismos fotossintetizadores e sua
converso em energia qumica por meio da reao de sntese de compostos
orgnicos , em ltima instncia, a fonte de praticamente toda a energia biolgica
[Lehninger et alli, 1993].
A equao geral da fotossntese descreve a reao de oxi-reduo (mediadas
por uma srie de substncias presentes o cloroplasto) na qual H
2
O doa eltrons (e
prtons) para a reduo de CO
2
e sua transformao em carboidrato (CH
2
O):
( ) O CH O O H CO
luz
2 2 2 2
+ + ; Equao 11
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Aspectos Tericos 41
A fotossntese engloba dois processos: as reaes claras, que ocorrem
apenas quando as plantas esto iluminadas, e as reaes de fixao de carbono, ou
reaes escuras, que ocorrem tanto sob luz quanto na escurido.
Nas clulas fotossintticas eucariotas, tanto as reaes claras quanto as de
fixao de carbono se do no cloroplasto (Figura 6). O cloroplasto envolvido por
uma membrana externa que permevel a ons e pequenas molculas. Uma
membrana interna envolve o compartimento interno. Neste compartimento interno
h vrias vesculas (ou sacos) achatadas, envolvidas por uma outra membrana,
chamadas tilacides, que so normalmente dispostas em pilhas chamadas granas.
As membranas tilacides so separadas da membrana interna do cloroplasto. Os
pigmentos fotossintticos e todas as enzimas necessrias para as reaes a luz
esto embutidas na membrana tilacide. O fluido ao redor dos tilacides, o
estroma, contm a maior parte das enzimas necessrias para as reaes de fixao
de carbono, quando molculas de ATP e NADPH, produtos da fase clara, so
utilizados para reduzir o CO
2
para formar glicose e outros produtos orgnicos.
Neste trabalho, sero relatadas apenas as reaes que envolvem luz.
Grana
Estroma

Figura 6 - Cloroplasto. Os tilacides so os filamentos observados, em geral agrupados
nos grana.
3


A absoro de luz se d atravs de certos tipos de molculas instaladas nas
membranas tilacides chamadas pigmentos-antena. Destes, os mais importantes
so as clorofilas, pigmentos verdes, com um anel de porfirina (com Mg no centro)

3
Figura obtida em [Raven et alli, 1978]
P
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C
-
R
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C
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1
8
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Aspectos Tericos 42
ligado a uma longa cadeia de carbono. A estrutura do anel de porfirina apresenta
uma forte absoro na regio visvel do espectro. Por esta razo as clorofilas
apresentam coeficientes de absoro de luz especialmente altos e so, portanto,
particularmente adequados para absorver a luz visvel durante a fotossntese.
Os cloroplastos das plantas superiores sempre contm dois tipos de
clorofila. Um deles , invariavelmente, a clorofila a e o segundo tipo, em muitas
espcies, a clorofila-b. Apesar de os dois pigmentos serem verdes, seus
espectros de absoro so ligeiramente diferentes (Figura 7), permitindo que se
complementem na absoro de luz na regio do visvel. A maioria das plantas
superiores contm duas vezes mais clorofila a que clorofila-b. As clorofilas das
bactrias diferem muito pouco dos pigmentos das plantas.
Alm das clorofilas, as membranas tilacides contm pigmentos secundrios
(conhecidos como pigmentos acessrios). Os carotenides e as ficobilinas
absorvem luz em comprimentos de onda diferentes dos absorvidos pelas
clorofilas, conforme pode ser verificado na Figura 7 e so, portanto, receptores
suplementares de luz.
As propores relativas das clorofilas e dos pigmentos acessrios so
caractersticas para cada espcie de planta. A variao dessas propores
responsvel pela diversidade de cor dos organismos fotossintetizantes (tanto na
vegetao superior como no fitoplncton).

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Aspectos Tericos 43

Figura 7 - Espectros de absoro de diferentes pigmentos presentes nas membranas
tilacides, comparados com o espectro da luz do sol que atinge a superfcie da Terra
4


Os pigmentos das membranas tilacides que absorvem luz esto reunidos
em grupos funcionais denominados fotossistemas. Cada fotossistema composto
por at algumas centenas de pigmentos. Todos os pigmentos de um fotossistema
podem absorver luz, mas apenas alguns poucos podem transformar a energia da
luz em energia qumica. Os pigmentos transdutores consistem em vrias
molculas de clorofila combinadas com um complexo de protenas. Este conjunto
conhecido como centro de reao. Os outros pigmentos do fotossistema so
chamados de pigmentos-antena. Esta estrutura para absoro dos ftons est
esquematizada na Figura 8.

4
Grfico desenvolvido a partir de ilustrao de [25]
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Aspectos Tericos 44

Figura 8 - Esquema da disposio das estruturas moleculares nas membranas
tilacides
5
.

As molculas de clorofila nas membranas tilacides ficam ligadas a
protenas das membranas que orientam as clorofilas em relao ao plano das
membranas e conferem aos pigmentos propriedades de interao com a radiao
ligeiramente diferentes daquelas da clorofila livre. Quando as molculas de
clorofila (livres) so excitadas por luz, a energia absorvida rapidamente liberada
por fluorescncia e calor. No entanto, quando folhas intactas so iluminadas no
espectro do visvel, pouca fluorescncia observada. H uma transferncia
ressonante de energia da molcula excitada para um pigmento-antena vizinho,
sendo este excitado, e permitindo o retorno da primeira molcula a seu estado
fundamental. Esta transferncia ressonante de energia repetida para os vizinhos
subseqentes at que a clorofila do centro de reao excitada [Whitmarsh &
Govindjee, 1999].
A tarefa bsica do centro de reao funcionar como um capacitor
minsculo, armazenando energia ao separar e estabilizar cargas positivas e

5
Figura desenvolvida a partir de ilustrao de [Lehninger et alli, 1993]
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Aspectos Tericos 45
negativas em cada lado da membrana tilacide [Govindjee & Coleman, 1990]. No
centro de reao (do fotossistema II), a clorofila a doa um eltron para uma
molcula de feofitina, que o doa a uma molcula plastoquinona A que, por sua
vez, o doa a uma molcula quinona B. Esta, aps receber 2 eltrons (e
posteriormente 2 prtons, liberados da molcula de gua) pode circular livremente
pelo cloroplasto. Uma molcula Z reduz a clorofila a. Esta molcula Z, em
conjunto com catalisadores, que oxida a gua e produz O
2
. A excitao e
passagem de eltrons da clorofila a para a feofitina um processo extremamente
rpido, da ordem de alguns picossegundos.
Parte da energia absorvida pelos pigmentos antena, e que no aproveitada
no processo de fotossntese, que pode se transformar em radiao fluorescente.
Assim, a eficincia quntica da fluorescncia da clorofila a depende de uma srie
de fatores ambientais, tais como a disponibilidade de luz e nutrientes, temperatura
etc.. . Uma alterao no aparato fotossinttico tanto pode aumentar como diminuir
a intensidade da fluorescncia. Por exemplo, se o conjunto de pigmentos antena
for afetado, impedindo a chegada da radiao ao centro de reao, conclumos que
a fluorescncia diminuir. Entretanto, Falkowski [Falkowski & Kolber, 1995]
relata que se uma parte dos centros de reao deixa de funcionar a fluorescncia
em 685nm aumenta, pois os pigmentos antena conseguem redirecionar a energia
absorvida para outros centros de reao que, desta maneira, iro se saturar e,
portanto, favorecer a fluorescncia.
Para monitorar a fluorescncia dos pigmentos-antena devemos levar em
conta que cada molcula apresenta um espectro de fluorescncia caracterstico. A
clorofila a fluoresce em uma banda centrada em torno de 685 nm de 10,6 nm
(FWHM
6
) de largura [Schmitz-peiffer et alli, 1990b]. J a clorofila b fluoresce
em banda em torno de 730nm. Os carotenides em geral no fluorescem. A
ficoeritrina, uma ficobilina presente nas cianobactrias e algumas algas, fluoresce
em banda com pico entre 560 e 580nm, quando excitada, in vivo, em 532nm
[Hoge et alli, 1998]. A fluorescncia em bandas bem definidas (como o caso da
clorofila a, por exemplo) uma caracterstica importante para a identificao, no

6
FWHM: Full Width at Half Maximum, isto , a largura do pico calculada
entre os pontos com valor de metade do mximo.
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Aspectos Tericos 46
espectro de fluorescncia do meio natural, da contribuio de um tipo especfico
de fluorforo.

3.3. Normalizao de sinal de fluorescncia pelo espalhamento
Raman da gua
A concentrao de um fluorforo medida por um LIDAR descrita pela
equao conhecida como equao do LIDAR [Bristow et alli, 1981]:
( ) [ ]
( )
n
P H
P T
e
R
f
F
L rec
w
H
w
L F
f
L F

_
,

_
,

'

_
,

+
2 2
2
4
1

; Equao 12
onde n
f
a concentrao do fluorforo na coluna dgua (em mg/m
3
) e
P
F
= potncia detectada da fluorescncia
em
emis.
= F (W)
P
L
= potncia detectada do laser em = L
(W)

w
= ndice de refrao da gua no visvel
H = distncia do sensor ao alvo (m)

x
= coeficiente atmosfrico de atenuao
do feixe em = x (1/ m)
T = rea de cobertura efetiva do telescpio
(m
2
)
R
w
= Refletncia especular da interface ar-
gua para incidncia normal no visvel

rec
= eficincia do telescpio receptor

x
= coeficiente efetivo de atenuao pela
gua do feixe em = x (1/ m)

F
= seo de choque efetiva da clorofila a
para a banda de fluorescncia centrada em F
quando excitada em = L (m
2
/ mg)

Neste caso estamos assumindo que:
P
F
a contribuio produzida pela incidncia do feixe do laser. Todas
os demais sinais de fundo, tais como a reflexo e espalhamento da
radiao passiva e a fluorescncia induzida por este foi subtrada (por
iluminao passiva entende-se aquela gerada pela luz natural do sol e
suas reflexes e reemisses);
a superfcie da gua sujeita excitao situa-se toda sobre o campo de
viso do telescpio;
o sinal de fluorescncia integrado at uma profundidade infinita.
Esta aproximao requer que a profundidade da gua seja pelo menos
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Aspectos Tericos 47
quatro vezes superior ao maior comprimento de atenuao
caracterstico (
F
-1
ou
L
-1
);
em cada amostra n
f
,
L,

F
e
F
so independentes da profundidade.
razovel assim considerar para a camada superior da gua onde as
ondas e as correntes mantm uma mistura homognea. Medidas do
coeficiente de atenuao de feixe () indicam que este se mantm
essencialmente constante em pelo menos 2 vezes o comprimento de
atenuao (2
1
);
o tempo de vida da fluorescncia significativamente menor que a
durao do pulso do laser. O tempo de fluorescncia in vivo da
clorofila a menor que 1ns, e
o termo de atenuao atmosfrica mantm-se constante e prximo
unidade (isto verdade para at algumas centenas de metros).
Mesmo que
L,

F
e
F
permaneam constantes vertical e horizontalmente, a
determinao de seus valores no uma tarefa fcil. Para se obter
F
necessrio
a realizao de demoradas medidas in situ. Os coeficientes de atenuao efetiva
podem ser inferidos pela reflexo e pela fluorescncia do pulso do laser na coluna
dgua desde que, experimentalmente, se possa resolver no tempo este sinal de
retorno. Se estes coeficientes puderem ser considerados constantes, a quantidade
de clorofila a poderia ser calculada por
n C P
f F

1
; Equao 13
onde C
1
seria uma constante que poderia ser obtida para cada vo, atravs
de medidas in situ.
Entretanto, uma relao linear entre n
f
e P
F
no se realiza nas medies,
quando comparamos com os resultados das amostras coletadas in situ. Alm da
variao horizontal, tanto em pequena escala quando em larga escala, dos
coeficientes de atenuao efetiva e da seo de choque efetiva da clorofila a, um
problema bsico para a comparao de diferentes medies de fluorescncia da
clorofila a feitas por um sistema LIF-LIDAR est no fato da estrutura da
superfcie da gua ser diferente em cada medida, variando, assim, o total de luz
refletida e refratada.
Para contornar estas dificuldades experimentais, props-se como soluo
(Fadeev et alli em 1978 e Bristow et alli em 1981) a normalizao do sinal da
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Aspectos Tericos 48
fluorescncia pela emisso do espalhamento Raman devido aos modos
vibracionais da ligao O-H das molculas de gua. Este espalhamento se d (para
gua pura) com um deslocamento de 3418cm
-1
do comprimento de onda de
excitao. Assim, para a excitao a 532nm, a emisso Stokes do espalhamento
Raman estar em 650nm.
A equao da concentrao de molculas de gua na coluna dgua
estimulada pelo laser pode ser escrita de forma anloga equao 2.11 para
quantidade de fluorforos:
( ) [ ]
( )

,
_

'

,
_

,
_

+
w
R L
w
H
w
rec L
R
w
R
e
T P
H P
n
R L

2
2 2
1
4
; Equao 14
onde
n
w
concentrao de molculas dgua afetadas pela radiao na coluna
dgua e
P
R
= potncia detectada da
emisso Raman em = R

w
= seo de choque da emisso Raman
para o modo vibracional O-H da gua (lquida)
dividindo a equao 2-11 pela equao 2-13 teremos:
( ) [ ]
( ) [ ]

,
_

,
_

+
+

'

,
_

+
+
F
w
R L
F L
H
H
R
F
w
f
R L
F L
e
e
P
P
n
n

; Equao 15
A atenuao das radiaes devido atmosfera pode ser considerada
desprezvel para atmosferas limpas para valores de H at 150m. A seo de
choque
R
varia fracamente com a temperatura e a salinidade, mas para
temperaturas entre 5 e 25C pode ser considerada constante. A concentrao de
molculas na coluna dgua constante, exceto para guas altamente poludas.
Desta forma, a equao 4-4 pode ser rescrita como

,
_

,
_

+
+

,
_

F R L
F L
R
F
f
P
P
C c

1
2
; Equao 16
Onde c
f
a concentrao relativa de fluorforos na coluna dgua
considerada. Para guas onde o material particulado mude apenas em sua
concentrao mas no em sua composio, a razo entre os coeficientes efetivos
de atenuao uma constante. Se a composio deste material no muda de forma
abrupta, esta razo ainda pode ser considerada uma constante se os comprimentos
de onda R e F forem prximos (no limite em que F = R a razo ser sempre igual
a 1). Desta forma, simplifica-se a equao 4-5 para
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Aspectos Tericos 49
R
F
F
f
P
P C
c

3
; Equao 17

Assim, para sistemas onde
F
pode ser considerado constante, a
concentrao de clorofila a diretamente proporcional razo da intensidade da
fluorescncia da clorofila a pela intensidade do espalhamento Raman. Isto ,
podemos expressar a concentrao relativa de clorofila a em unidades Raman.
A seo de choque
F
pode sofrer grande variao tanto no espao como no
tempo, pois depende da espcie do fitoplncton e de sua situao nutricional, bem
como da irradiao descendente do ambiente. importante observar, contudo, que
o sinal da fluorescncia da clorofila a, normalizada pelo da emisso Raman, tem a
capacidade de fornecer in situ informaes justamente sobre a concentrao e a
eficincia quntica natural da fluorescncia da clorofila a, que so, desta forma,
informaes sobre a capacidade fotossinttica do fitoplncton, em determinada
localizao e em determinado instante. Para tanto, necessrio o emprego de
tcnicas complementares de medida da clorofila a. Uma das tcnicas disponveis
a utilizao de algoritmos que empregam o espectro de radiao passiva natural.


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