NORMAS E ROTINAS OPERACIONAIS DO LABORATORIO DE NALISES CLNICAS

Setor de Coleta e Recepo

Procedimento Operacionais Padres (POP) 1. CADASTRO E INFORMAES 1.1 Identificar o paciente A chegar a recepcao do laboratorio, o paciente devera estar portanto requisicao medica com os exames solicitados pelo seu medico, a recepcionista entao ira cadastra-lo, dando enfase ao nome, idade, sexo, endereco e/ou telefone. O cadastro do paciente acompanha a identificacao numerico controle do laboratorio. 1.2 Identificao de amostra Cada cadastrado possui um numero de identificacao, utilizando para etiquetas os recipientes de coleta. E importante identificar sempre a parte lateral do frasco, e nunca a tampa, principalmente em frascos de urina e fezes para evitar trocas de material. 1.3 Identificaes dos exames a serem realizados No laboratorio as amostras sao registradas em fichas internas de seus respectivos setores, nestas fichas constam a identificao numrica, o nome e a idade do paciente; em seguida as amostras e as fichas serao encaminhadas para os devidos setores. 1.4 Informaes ao paciente Na recepcao do laboratorio o paciente ira receber as instrucoes de como deve proceder para coleta das amostras. Para dosagem bioquimica e o paciente e orientado sobre o periodo de jejum, sendo tambem necessario o conhecimento dos medicamentos que o paciente possivelmente esteja tomando. Quando a coleta de sangue, orienta-se o paciente quanto ao esforco fisico, o paciente deve vir ao laboratorio totalmente descansado para evitar qualquer alteracoes nos resultados de seus exames. 2 COLETA DE SANGUE O sangue colhido com o objetivo de estudar as frequencias alteracoes dos seus componentes quando o organismo e acometido por

doencas. No laboratorio sao executados exames de varios paciente ao mesmo tempo, torna-se imprescindivel que uma sistematizacao bem organizada de trabalho seja seguida, evitando-se os erros de um modo geral, a perda de tempo e, especialmente, a troca dos resultados. Cuidados tecnicos e de assepsia sao tambem necessarios a fim de evitar a contaminacao do paciente, do operador e do sangue colhido. A coleta e feita de preferencia pela manha, com o paciente em jejum. Muitos sao os meios para obtencao do sangue usado para o exame hematologico, como por exemplo, sangue o veneno, capilar, arterial, puncao da medula ossea de ossos como o externo, tibia, iliaco e usado na maioria das vezes o venoso e o capilar. 2.1 Sangue Venoso A sua obtencao e feita pela funcao das veias mais acessiveis. As que sao mais facilmente funcionadas localizam-se nas regioes do antebraco (veia mediana, cefalica e basilica), do pescoco (jugulares internas e externas) e inguinais (femural). Na crianca, tambem se realiza na regiao da fontanela frontal (seio longitudinal). A veia e a preferida nos exames rotineiros, pois apresenta frequentemente bom calibre e sua funcao e pouco dolorosa. Antes da puncao, avalia-se a orientacao do vaso pela visualizacao ou pela palpacao digital e fazer a agulha penetrar e aprofundar nessa direcao. 2.2 Sangue capilar E frequente usado em criancas quando se empregam micrometodos ou em adultos para alguns exames como estudos de plaquetas, citologia e citoquimica celular. A coleta se faz apos puncao da polpa digital dos dedos ou dos grandes artelho, na crianca. Pode-se ainda utilizar a regioes laterais do calcanhar, nos recem nascidos. 3. RECEPO AO PACIENTE O paciente e recebido com cortesia e cordialidade; explicando os procedimentos aos quais ele vai ser submetido, de modo a transmitir-lhe tranquilidade e seguranca. A coleta chama o paciente para a coleta de sangue, e de acordo com seu cadastro, confirma o nome, a idade e os exames a sem realizados pelo paciente. A mesma separa e identifica, na frente do paciente os tubos que serao utilizados para o material. 3.1 Condies para a coleta Sala bem iluminada e ventilada; Pia;

 Cadeira reta com bracadeira regulavel ou maca; Garrote; Algodao hidrofilo; Alcool etilico a 70% ou alcool iodado a 1%; Agulhas e lancetas descartaveis; Sistemas a vacuo: suporte, tubo e agulhas descartaveis; Tubo de ensaio com tampa; Etiquetas para identificacao de amostras; Caneta; Caixa descarpack; Jaleco e mascara; Luvas descartaveis; Estantes para tubos. 3.2 Identificao da amostra Identificam-se os tubos para colocacao da amostra. Escreva na etiqueta os dados do paciente: nome, numero do registro, data da coleta. 3.3 Tecnica para Coleta de Amostra do Sangue Venoso Coloca-se a agulha na seringa sem retirar a capa protetora. Nao tocando na parte inferior da agulha; Movimenta o embolo e pressione-o para retirar o ar; Ajusta o garrote e escolha a veia; Faz a anti-sepsia do local da coleta com algodao umedecido em alcool a 70% ou alcool iodatdo a 1%. Nao tocando mais o local desinfetado; Retira a capa da agulha e faz a puncao; Introduz a agulha na veia mediana, basilica ou cefalica, atingida a veia, aspira o sangue; Coleta-se aproximadamente 10 ml de sangue. Em criancas coleta 2 A 5 ML; Retira o garote e em seguida a agulha; Comprime o local puncionado com algodao embebido em alcool; Retira a agulha da seringa e transfere o sangue para os tubos, quando for transferido para um tubo contendo anticoagulante. Agita suavemente para facilitar a mistura do sangue como anticoagulante; Ao transferir o sangue para um tubo de ensaio sem anticoagulante. Escorrer delicadamente o sangue pela parede do tubo. Este procedimento evita a hemolise da amostra. Descarta as agulhas e seringas nas caixas de descarpack; Orienta o paciente a pressionar com algodao a parte puncionada, mantendo o

braco estendido, sem dobra-lo; 3.4Tecnica para coleta de amostra do sangue capilar Faz assepsia da poupa digital com alcool iodado. Deixar secar. Puncionar com lanceta ou agulha descartavel, desprezando-se a primeira gota de sangue e absorvendo-a com papel de filtro ou algodao seco; Sangue deve fluir espontaneamente, exercendo-se leve pressao somente quando necessario; Direciona o tubo de capilar na gota para que o sangue flua pos capilaridade; Limpar o dedo com algodao e aplicar anti-septico. Anticoagulantes. O sangue e coletado com a proporcao correta de Anticoagulantes utilizados. EDTA; 1 a 2 mg para cada ml de sangue. Heparina; 1 gota (5.000 U/ml) para cada ml de sangue. Oxalato de K; 1 a 2 mg para cada ml de sangue. Citrato de sodio; 0,5 ml para 4,5 ml de sangue. 3.6 Biossegurana na coleta Todo cuidado e pouco na manipulacao de materiais biologicos, tais como soro, sangue, secrecoes, fluidos organicos, tecidos, etc. Redobrase as precaucoes, pois esses materiais sao potencialmente infectantes e muitas vezes estao contaminados com agentes estiologicos diferentes do que se esta pesquisando, ou ainda desconhecidos. Usa-se sempre Equipamento de Protecao Individual (EPI): jaleco longo de mangas compridas e punho retratil, luvas descartaveis evita a formacao e dispersoes de aerossois sao micro particulas solidas e liquidas com dimensoes aproximadas entre 0,1 e 0,5 micra que podem, no caso de conter microorganismos, permanecer em suspensao e plenamente viaveis por varias horas. Jamais reencapa-se agulhas. Esse procedimento e uma das principais causas da contaminacao de profissionais de saude por microorganismos, existentes no sangue e em outros fluidos organicos, como por exemplo, o virus da Hepatite B e o HIV. Apos a coleta e descartado esse material diretamente em caixas descarpack. Reduz ao maximo o manuseio de residuos, em especial os pefurocortantes. Descarta o rejeito perfurocortante diretamente em caixas descarpack.

4. EMISSAO DOS LAUDOS DOS EXAMES LABORATORIAIS Os laudos estao disponiveis no prazo acertado com o paciente, se por algum motivo isto nao for possivel, ha uma justificativa e, sempre que possivel, o paciente e informado no mais curto prazo possivel. Em caso de laudo que possa oferecer perigo iminente a vida do paciente, o laboratorio informa ao medico assistente e/ou ao responsavel pelo paciente. O laudo e datado e assinado por profissional legalmente habilitado com o seu nome completo e legivel, e o numero do registro no conselho profissional. 4.1 Exames Nome do exame; Material utilizado; Metodo; Intervalo de referencia com as respectivas unidades e valores de alerta; Informacoes necessarias a interpretacao dos resultados, quando indicada; Conclusoes, quando indicadas. EXAMES DE SANGUE Acido urico Capac. Total de lig. do ferro Albumina Cetonemia Colesterol fracionado: HDL LDL VLDL Aldolase Cloretos Ferro colher pela amanha Amilase Creatinina Triglicerides Bilirrubinas Eletroforese de proteinas Ureia Calcio Fosfatase acida Colesterol ( sem fracionamento) Fosfatase alcalina

CPK total Fosforo CK MB Frutosamina Gama GT Glicose Hemoglobina glicosilada Lipase Potassio Magnesio Sodio Mucoproteinas Transaminases: TGO/AST; TGP/ALT Velocidade de hemossedimentacao (VHS) Hemograma Curva de fragilidade osmotica Plaquetas Tempo de protrombina Tempo de tromboplastina parcial ativada PTTa Reticulocitos Eletroforese de hemoglobina Pesquisa de drepanocitos Alfa 1 Glicoproteina acida Fator reumatoide Grupo sanguineo e fator Rh VDRL Proteinas C reativa Anti HBs Anticorpos antireoidianos: - antireoglobulina - antimicrossomal Antiestreptolisina O - Monoteste - Paul Bunnell Davidsohn - Epstein Baar (IFI ou ELISA) - Anti VCA IgG e/ou IgM Fan HbeAg Toxoplasmose IgG/IgM - ELISA - IFI HAI HbsAg (Antigeno australia) Chagas (T. Cruzii): - IFI HAI ELISA HAV IgG/ IgM Anti Hbe Citomegalovirus IgG/IgM HIV 1 e 2

Setor de Lavagem e Esterilizao PROCEDIMENTO OPERACIONAIS PADRES (POP) A importancia de uma boa descontaminacao de materiais (ESTERILIZAO) e pea imprescindivel para um melhor desempenho dos trabalhos a serem executados em um laboratorio de analises clinicas. O processo de esterilizacao o comeco de tudo, sem a mesma os resultados nao serao satisfatorios. Faremos uma descricao dos metodos que sao utilizados para a esetrilizacao dos materiais do laboratorio. 1 OBJETIVOS 1.1 Gerais Tomar conhecimento dos cuidados na manipulacao de materiais contaminados. Devemos tambem ter o conhecimeto de lavagem, secagem empacotamento e esterilizacao de materiais reaproveitaveis. 1.2 Especificos Uns dos objetivos mais importantes, e o conhecimento de como se deve usar as maquinas, como: AUTOCLAVE, ESTUFA DE SECAGEM E ESTERILIZAO E TAMBM O DEIONIZADOR. 2. EQUIPAMENTO BSICOS Autoclave Estufa de secagem Estufa de esterilizacao Deionizador OBS: Ha de se destacar tambem os materiais usados no processo de lavagem. So estes: Sabao Hipoclorito 1% 3. METODO PARA ESTERILIZAR MATERIAIS: 1. O 1o passo e colocar o material contaminado (coagulos e urina) sao colocados em frascos plasticos contendo hipoclorito a 1%, por duas horas vida media do hipoclorito. 2. 2o passo os materiais reutilizaveis ex: vidrarias sao colocados no hipoclorito a 1% por 30 minutos, 3. 3o passo sabao dextran por mais 30 minutos, 4. 4o passo lava-se em agua corrente por 30 minutos, 5. 5o passo mais 30 minutos de molho em agua deionizada, 6. 6o passo sao colocados na estufa de secagem.

 Matrias da microbiologia 1. Os materiais contaminados sao colocados na autoclave por 45 minutos a 121oC. 2. Depois que sair do autoclave, devemos seguir os mesmos passos a partir do 3o descrito acima; 3. Apos a secagem, leva o material para o balcao de empacotamento e la, definitivamente separado. Ex: plastico, vidro, etc. 4. Depois de separado, o material e colocado na estufa de auto precisao para esterilizacao com fita teste. Deve-se salientar que materiais plasticos nao devem ir para a estufa de esterilizacao, pois a mesma os danificara, devido sua alta temperatura que gira em torno de 180oC. O temo que o material deve ficar na estufa de esterilizacao e de 2 hs. E com relacao ao material plastico este e embalado e colocado na autoclave de 15 a 20 minutos. OBS: Para identificarmos um material autoclavado devemos verificar a fita teste, esta deve estar com listras queimadas. Com todos esses passos, nos faremos uma boa esterilizacao, pois a mesma os danificara, devido sua alta temperatura que girar em torno de 180oC. O tempo que o material deve ficar na estufa de esterilizacao e de 2 hs. E com relacao ao material plastico este e embalado e colocado na autoclave de 15 a 20 minutos. importante compreender a importancia da esterilizacao em todo o processo de trabalho em Laboratorio, bem como o uso de equipamentos essenciais(AUTOCLAVE, ESTUFA DE ESTERILIZAO E SECAGEM E DEIONIZADOR), e procedimentos de lavagem e descontaminacao de materiais. 4. DESCARTE DE MATERIAL CONTAMINADO Deve haver POP para o descarte de material contaminado gerado no laboratorio, que sao aqueles despejos em estado solido, semi-solido, liquido ou pastoso, apresentando caracteristicas de toxidade e/ou atividade biologica, que podem afetar direta ou indiretamente os seres vivos ou causar contaminacao das aguas, do ar e do solo. Procedimento para com os materiais. Agulhas (e capilares de hematcrito): Uma vez terminada a coleta do sangue-amostra sao desprezadas em caixas descarpack Seringas: Apos o termino da coleta do material, tambem sao descartaveis em caixas escarpack. Algodao, gaze, papeis e material afins: Apos o uso devem ser descartados em sacos de lixo branco e reforcados para posterior coleta por servico especializados.

 Swabs, especulos, espatulas, abaixadores de lingua, etc.: Proceder da forma descrita acima. Urina: Acrescentar uma parte de solucao de hipoclotito de sodio a 1%. Deixa em contatoo por 2 horas descarta no esgoto sanitario. Os frascos devem ser descaratados em sacos de lixo brancos reforcados para posterior coleta por servicos especializados. Fezes: descarta em saco de lixo reforcados. Sangue, coagulos e semelhantes: colocar todo o sangue e seus derivados em um recipiente de plastico resistente. Adicionar solucao de hipoclorito de sodio. Deixar em contato por 2 horas. Devido a decomposicao do hipoclorito em contato com o sangue, deve-se adicionar mais hipoclorito, ate nao haver qualquer formacao de espuma. Meios de cultura e despejos e bactriologicos: Dispensa o material o, a esterilizacao em autoclave e descartar em lixo especial. Lminas e lamnulas: Nao sao descartas. Ao recupera-las sao submetidas a um tratamento hipoclorito de sodio a 1% por 30 minutos. Apos o processo, proceder a lavagem e recuperacao.

PROCEDIMENTO DE ROTINA HEMATOLOGIA MANUAL

HEMATOLOGIA A hematologia compreende o estudo das celulas sanguineas e coagulacao. Normalmente, os constituintes do sangue (hemacias, leucocitos e plaquetas) permanecem em equilibrio sempre constante devido ao sistema hematopoietico, com funcao de formacao hemolitica ou de destruicao das celulas sanguineas. (O. LIMA, 1992) OBJETIVOS O estudo no Laboratorio de hematologia consiste em analisar celulas sanguineas e a coagulacao atraves de exames hematologicos, podendo assim qualificar e diferenciar as celulas sanguineas. Esses testes realizados possibiltam um diagnostico mais conclusivo, auxiliando clinico no tratamento de uma patologia pr deficiencia

hematologica. HEMATCRITO Consiste em determinar em porcentagem a concentracao de eritrocitos em dados volume de sangue nao coagula. E a razao entr o voluem deeritrocitos em relacaoao volume do sangue total. (O. LIMA, 1992) MATERIAIS E MTODOS Tubo capilar Bico de bunsen Centrifuga para microhematocrito Tabela para microhematocrito O tubo de microhematocrito e preenchido por capilaridade ate . da capacidade do capilar. A extremidade vaziae vedada pela chama do bico de bunsen. Colocar os capilares na centrifuga para microhematcrito, com o cuidado de coloca a parte aberta contra o apoio de borracha para evitar quebras e extravasamentos. A ponta selada fica voltada para fora. E recomendavel um centrifugacao a 3.000 RPM/5 minutos. Apos a centrifugacao, o tubo apresenta uma coluna de sangue, incluindo o plasma e uma coluna de eritrocitos. Devem ser medidos com o auxilio da tabela. HEMOGLOBINA (Hb) E o principal componente dos eritrocitos. E um conjugado de proteinas que serve como transporte de O2 e CO2. (O. LIMA, 1992) MATERIAIS E MTODOS Tubos para centrifuga Padrao (HiCN Cianetohemoglobina) Reagente de Drabkin Tomar 3 tubos e proceder da seguinte maneira: B P Padrao - 20uL Amostra Reag. de Drabkin 5.0uL 5.0uL

A 20 uL 5.0uL

Hogenizar. Descansar em temperatura ambiente por 5 minutos. Leitura a 540 nm no espectrfotometro. Zerar com o Branco.

ESFREGAO O exame de esfregaco sanguineo e uma parte importante da avaliacao hematologica. Para obter esfregacos satisfatorio, e indispensavel que se tome certas precaucoes: - laminas devem estar limpas e desengorduradas; - a gota de sangue nao deve ser muito grande. Quanto maior a gota, mais espesso o esfregaco. O ideal e uma gota de 20uL; - O esfregaco deve ser feito rapidamente, antes que ocorre a coagulacao. (O. LIMA, 1992) MATERIAIS E MTODOS Laminas limpas e desengorduradas Laminas de extensao (extensora) Colocar uma gota de sangue no final de uma lamina apoiada em uma superficie plana. Com o polegar e o indicador, segura-se o final da lamina de extensao contra a superficie da primeira laminas. Empurra-se a lamina de extensao a uma velocidade moderada para frente ate que o sangue tenha sido espelhado em um esfregaco moderadamente delgado. As laminas devem ser secas a temperatura ambiente e depois corada para analise ao microscopio. E conveniente confeccionar varios esfregacos ao mesmo tempo. Marcar sempre os esfregacos usando agulha ou lapis dermografico com o nome do paciente e a data sobre a superficie do mesmo. COLORAO Os corantes de anilina usados em esfregacos sanguineos sao de duas classes gerais: corantes basicos, como o azul de metileno; corantes acidos, como a eosina. O nucleo das celulas toma as cores basicas, como o azul de metileno, enquanto que os corantes basicos agem sobre os elementos citoplasmaticos. Pertencem a este grupo os corantes de Romanowsky. Os derivados mais usados do corante primitivo de Romanowsky sao: Giemsa. Leishman, Wrigth entre outros. Nesse setor foi usado o corante Leishman. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MTODOS Suporte para laminas - Corante de Leishman Colocar a lamina sobre o suporte. Verter 20 gotas do corante sobre a lamina ou o suficiente para cobri-la. O alcool metilico (metanol) da solucao corante fixa o

esfregaco. Deixar corar durante 15-20 minutos. Lavar em agua corrente e deixar secar. Observar ao microscopio com objetiva de imersao. CONTAGEM GLOBAL A contagem dos elementos morfologicos do sangue (eritrocitos, leucocitos e plaquetas deve ser efetuado pala manha. Consiste em trabalhar com material aferido com a finalidade de determinar o numero dos elementos morfologicos. Para isso, e necessario diluir volume conhecido de sangue com determinada quantidade de liquidodiluidor. Conta-se as celulas na area reticulada da camara destinada para cada tipo de celulas (ver Anexos) (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MTODOS Camara de Contagem (Camara de Neubauer) Liquidos diluidores (hayem, Turk, Oxalato de Amonia 1%) Pipetas graduadas e automaticas Laminulas

Contagem Global de Leuccitos Valores de Referencia: 5.000 10.000 mm3 0.38 mL do liquido de Turk 20uL sangue Diluicao = 1/20

Depois de homogeneizar o liquido de Turk com o sangue, umedecer a camara de liquido de Turk com o sangue, baixo da laminula, inserir com auxilio da pipeta automatica pequena quantidade da solucao diluida. Cuidado para evitar presenca de bolhas. Esperar 5 minutos a fim de que os globulos se depositem. Observar ao microscopio primeiramente com a objetiva de menor aumento e em seguida numa objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes destinados a leucocitos. Contagem Global de Plaquetas Valores de Referencisa: 150.000 400.000 mm3 0.38 mL oxalato de amoni 1%

20uL sangue Diluicao = 1:20

Depois de homogeneizar o oxalato de amonia 1% com o sangue, umedecer a camara de Neubauer e cobri-la com laminula. Por baixo da laminula, inserir com o auxilio da pipeta automatica pequena quantidade da solucao diluida. Cuidado para evitar presenca de bolhas. Esperar 10 minutos a fim de que as plaquetas se depositem. Esperar em camara umida. Observar ao microscopio primeiramente com a objetiva de menor aumento e em seguida numa objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes destinados a plaquetas, que sao os mesmo para contagem de eritrocitos. VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAO (VHS) E a velocidade com o qual os globulos vermelhos vao para o fundo do tubo. Os globulos vermelhos que sedimentam e porque a sua densidade e maior que a do plasma. A velocidade com que eles sedimentam e porque a sua densidade e maior que a do plasma. A velocidade com que eles sedimentam varia, direta ou indiretamente com varios fatores. (O. LIMA, 1992) MATERIAIS E MTODOS - Tubo de Westergren - Estante de westergren O metodo de Westergren modificado produz os mesmos resultados que o metodo de Westergren original, mas emprega sangues nao coagulado com EDTA ao inves de citrato. Isso permite que o VHS seja realizado com a mesma amostra de sangue que os outros estudos hematologicos. 2 mL de sangue com EDTA bem misturados sao diluidos em 0.5 mL de cloreto de sodio a 0.85% ou 0.5 mL de citrato de sodio a 3.8%. Uma pipeta de Westergren e completada ate a marca 0 (zero) e colocada exatamente na vertical na estante a temperatura ambientem, sem vibracoes ou exposicao direta a luz solar. Apos exatamente 60 minutos, a distancia do topoo da coluna e registrda em molimetros como o valor da VHS. Se a demarcacao entre o plasma e a coluna de celulas vermelhas e distinta, o nivel e lido onde a densidade total aparece primeiro.
Valores de Referncia: Homens: 3-15 mm Mulheres: 3-20 mm Criancas: 3-12 mm

CLULAS LE (Lupus Eritematoso) Um anticorpo presente na fracao globulina gama do soro dos pacientes de LES, o chamado fator LE, reage com a nucleoproteina dos nucleos dos leucocitos. O nucleo do fagocito acha-se comprimido na periferia da celula. A maior parte da regiao protoplasmatica e ocupada pela massa nuclear transformada. O citoplasma reduz-se a estreita faixa na periferia do leucocitos. Na celulas LE, a estrutura da cromatina e substituida por massa arredondada, homogenea, de coloracao purpura, de tamanho variavel, mas usualmente maior que a hemacia. O fagocito pode englobar mais de nucleo. (O. LIMA, 1992). MATERIAL E MTODOS - Banho Maria a 37oC - Toma-se o sangue sem anticoagulante e coloca-se em Banho Maria a 37oC/2hs. Depois realiza-se o esfregaco e observa-se ao microscopio. Deve-se sempre realizar o exame FAN junto com o exame de celulas LE. CONTAGEM DE RETICULCITOS Os reticulocitos sao celulas vermelhas imaturas nao nucleadas que contem RNA e continuam a sintetizar hemoglobina apos a perda do nucleo. O sangue incubado rapidamente em uma solucao de azul cresil brilhante ou azul metileno. No RNA e precipitado como um complexo corante ribonucleoproteinas. O complexo aparece microscopicamente como uma rede azul escura ou granulos azuis escuros que permitem a identificacao e contagem de reticulocitos. (O. LIMA, 1992) MATERAIS E MTODOS - Esfregaco sanguineo Conta-se o numero de reticulocitos em 10 campos diferentes. O esfregaco e feito a partir de 100uL de sangue + 1 gota de azul cresil brilhante. Valores de Referencias: 0.5 - 2.0% 10 campos = total / 10 = numero % COAGULOGRAMA Tempo de Sangria (TS)

 o tempo necessario para a cessacao da hemorragia, ocasionando por pequena incisao, de dimensao padronizada, praticada artificialmente. (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MTODOS - Equipamento para puncao digital - Papel de filtro - Cronometro Faz-se a assepsia da polpa digital ou do lobulo da orelha com a lanceta, fazer a incisao e deixar o sangue fluir espontaneamente. Marcar no cronometro o inicio no momento do aparecimento da primeira gota. Com o papel de filtro absorver de 30 em 30 segundos a gota de sangue formada sem tocar a incisao. Quando cessar o fluxo de sangue, parar o cronometro. Quando cessar o fluxo de sangue, parar cronometro. O intervalo decorrido entre o aparecimento da primeira e da ultima gota representa do tempo de sangria. Valores de referencia: 1 6 minutos Tempo de Protrombina Ativada (TAP) a prova de escolha para investigacao do sistema extrinseco da coagulacao sanguinea. E uma prova de grande valor na demonstracao de deficiencia dos fatores de coagulacao I, II, V, VII, X. (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MTODOS - Plasma citratado do paciente - Solucao de tromboplastina - Banho Maria a 37C - Tubos de ensaio - Solucao de cloreto de calcio a 0.025M Coloca-se 100uL do plasma citratado do paciente + 100uL da suspensao de tromboplastina no tubo de ensaio. Homogeneiza, adicionar rapidamente 100uL da solucao de cloreto de calcio. Neste instante, acionar o cronometro. Retirar o tubo do BM e agita-lo suavemente, de 2 em 2 segundos, ate o aparecimento do coagulo, parando simultaneamente o cronometro. O tempo consumido em segundos constitui o TAP. Valores de Referencia: 11 13 segundos Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)

E a melhor prova para investigar as alteracoes do mecanismo da coagulacao sanguinea. Fatores que participam do sistema intrinseco estao envolvidos, com excecao das plaquetas e do fator XIII, bem como do fator VII, do sistema extrinseco. (O. LIMA, 1992). MATERIAL E MTODOS - Plasma citratado do paciente - Solucao de tromboplastina parcial - Banho Maria a 37C - Cronometro - Tubos de ensaio - Solucao de cloreto de calcio a 0.025 M Coloca-se 100uL de cefalina + 100uL plasma citratado do paciente. Homogeneiza e encuba em Banho Maria a 37C/3 min. Apos esse tempo, adicionar rapidamente 100uL da solucao de cloreto de calcio. Neste instante, acionar o cronometro. Agitalo suavemente, de 5 em 5 segundos. Ao fim de 30 segundos, retirar o tubo do BM e agita-lo suavemente, observando o aparecimento do coagulo, parando simultaneamente o cronometro. O tempo consumido em segundos constitui o TTPA. Valores de Referencia: 35 45 segundos CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCCITOS Consiste em determinar a proporcao existente entre as distintas variedades de leucocitos. A contagem diferencial de leucocitos e dos mais valiosos metodos entre os exames citologicos do sangue. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MTODOS - Esfregacos corados Deve-se observar a lamina proximo a cauda o esfegaco onde quase nao se encontra roleaux e facilita a contagem. Total de 100 celulas. FIBRINOGNIO MATERIAIS E MTODOS - Tubo capilar - Plasma

- Microcentrifuga - Tabela de Hct - Banho Maria a 56 Aspira-se o plasma no tubo capilar e encuba-se em Banho Maria a 56oC/15 minutos. Leva-se a centrifuga para microhematocrito por 5 minutos / 3000 RPM. Faz-se a leiturana tabela para Hct e multiplica o resultado por 92. Valores de Referencia: 200 400 mg/dL INDCES HEMATIMTRICOS VCM = Hct / Hem x 100 u3 HCM = Hb/ Hem x 100 pg CHCM = Hb / 100%

PROCEDIMENTO DE ROTINA SOROLOGIA MANUAL

SOROLOGIA O melhor diagnostico de um processo infeccioso e a demonstracao do patogeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biologicos do hospedeiro. Nem sempre e possivel essa pratica pela ausencia do agente infeccioso ou pela pocua sensibilidade dos metodos ou por longos periodos exigidos para uma resposta laboratorial. Metodos parasitologicos ou microbiologicos sao deficientes para diagnostico de algumas patologias. Sao utilizados metodos imunologicos, sorologicos ou imunoensaios. Sao tecnicas para a deteccao e quantificacao de Ag ou Ac, podendo utiliza-se de reagentes marcados ou nao. Comumente sao utilizados marcadores radiotaivos, enzimpaticos, fluorescentes e quimioluminescentes. Os testes sorologicos sao feitos atraves de pesquisas de anticorpos pu antigenos, sendo a reacao Ag Ac, visualizada por alguns metodos como aglutinacao, precipitacao, floculacao e outros. Esses testes de pesquisa de Ag Ac desempenham uma importante funcao de

diagnostico laboratorial clinico como complemento de outros testes e provas, desde que sejam respeitadas suas indicacoes e limitacoes. OBJETIVO No setor de sorologia, o principal e demonstrar aos estagiarios os principios das tecnicas mais usadas nos testes sorologicos, assim sua importancia e identificacao. A alta sensibilidade dos testes utilizados garante um importancia no setor de triagem sorologica para selecao de pacientes que podem vir a ser doadores e recptores de orgaos, evitando transtornos postransfusionais. A Ciencia Sorologia tem como principal objetivo pesquisar anticorpos especificos auxiliando, assim, no diagnostico individual de determinadas patologias com tambem diferenciando as fases da doenca. v Imunodifuso Radial Simples - Prncipio Antigeno ou Anticorpo permanecem fixados ao suporte e o outro se difunde, ate haver um halo de precipitacao formado por reacao de Ag com o Ac ao redor da inoculacao. - Materiais e Mtodos Toma-se uma placa com gel (agar misturado com a diluicao apropriada de Ag especifico para Ac determinado) contendo orificios onde, com ajuda da micropipeta, sera adicionado 5uL do soro. Fecha a placa e guarda em forma invertida em camara umida, para que mantenha o meio umida, por 48h a 72h. Valores de Referencia: IgG: 710 1520 mg/dL IgM: 90 310 mg/dL AGLUTINAO A reacao de aglutinacao e caracterizada pela formacao de agregados visiveis como resultado da interacao de anticorpos especificos e particulas insoluveis que contem determinantes antigenicos em sua superficie. A aglutinacao pode ocorrer tanto com particulas que apresentam determinadas antigenicos naturais em sua superficie (hemacias, bacterias, protozoarios, etc.) como com particulas inertes (latex, poliestireno, etc.), ou mesmo com celulas antigenicamente nao relacionadas (hemacias, bacterias) as quais se absorvem ou se fixam

antigenos soluveis. As reacoes podem ser de aglutinacao direta ou indireta. A) TESTE DA AGLUTINAO DIRETA - Principio Aglutinacao de particulas antigenicas insoluveis, em sua forma integra ou fragmentada, na deteccao de anticorpos especificos. Teste bastante utilizado para classificacao sanguinea, mononucleose infecciosa e brucelose. - Materiais e Mtodos v Bruceloso (Antgeno Rosa Bengala): e uma suspensao de bacilozs em coloracao rosa, mistura o bacilo com amostras de pacientes e complexo Ag Ac se aglutina. v Mononucleose: Toma-se uma placa de vidro e mistura-se uma gota do soro do paciente com o reagente que contem hemacias de cavalo (ag para mononucleose mais Ac heterofilos). Observa-se a presenca de aglutinacao. Como os anticorpos heterofilos, que nao sao especificos para o virus Epstein-Barr, podem aglutinar as hemacias de cavalo, para o teste positivo realiza-se uma Segunda etapa. Nesta, mistura o soro com celulas renais de cobaia, as quais removam quase todos os anticorpos heterofilos da mononucleose infecciosa. B) TESTE DA AGLUTINAO INDIRETA - Princpio As hemacias e as particulas inertes podem ser sensibilizadas por adsorsao passiva, devida aos contatos direto com os Ag soluveis. Sao utilizados como suportes na adsorcao de proteina soluvel e Ag polissacarideos, funcionando como sistema indicador da reacao Ag-Ac. AGLUTINAO DO LTEX v PCR (Protena C Reativa): reacao de aglutinacao em laminas, a qual particulas de latex sensibilizadas com Ac anti-PCR estabilizadas sao aglutinadas em presenca da Proteina C Reativa. - Materiais e Mtodos a) Determinacao Qualitativa: Numa lamina de vidro, com areas para diferentes testes, depositar sucessivamente em 3 subdivisoes, 1 gota de soro positivo, 1 gota de soro negativo e 1 soro do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do reativo latex anti-PCR. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotacao procedendo a leitura apos cinco minutos. b) Determinacao Semi-Quantitativa: Em casode amostra positiva, realizar sucessivas diluicao do soro ate que se encontre a maior diluicao que ainda fornece aglutinacao. O procedimento da analise e o mesmo do teste qualitativo, porem, utilizase as amostras diluidas. Sendo a sensibilidade do teste de

7UI/mL, o calculo semi quantitativo e realizado da seguinte forma: [ ] = 7 x (maior diluicao positiva) v FR (Fator Reumatide) - Materiais e Mtodos a) Determinacao Qualitativa: Pipetar 1 gota do soro do paciente em uma area da lamina e , sobre ela, 1 gota da suspensao de latex sensibilizado com IgG humana altamente purificada e estabilizada e suspensa em tampao glicina. Proceder da mesma forma com os soros controle positivo e negativo. Fazer movimentos suaves de rotacao, sob uma boa fonte de luz, durante 2 minutos. Observar a formacao de aglutinacao. b) Determinacao Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, realizar sucessivas diluicoes do soro ate que se encontre a maior diluicao positiva. O calculo semi quantitativo e realizado da seguinte forma: [ ] = 25 x (maior diluicao positiva) v ASLO (Anti-Estreptolisina O): Reacao de aglutinacao em laminas, a qual particulas de latex sensibiladade com estreptolisina O estabilizada sao aglutinadas em presenca de anti-estreptolisina. O reativo e padronizado por comparacao com o padrao da OMS. - Materiais e Mtodos a) Determinacao Qualitativa: Numa lamina de vidro, com areas para diferentes testes, depositar sucessivamente em 3 subdivisoes, 1 gota de controle positivo, 1 gota de controle negativo e1 gota do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do latex sensibilidade com ASO. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotacao. Proceder a leitura em exatamente 2 minutos. b) Determinacao Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, a partir da diluicao 1/20, realizar sucessivas diluicoes de razao 2 a te 2560 em tampao glicocola. O procedimento da analise diluidas. O titulo de Ac ASO e calculado da seguinte forma: UI/mL = inverso da ultima diluicao positiva x 10. HEMAGLUTINAO INDIRETA Hemacias estao entre os melhores suportes de Ag para os testes de aglutinacao, pois uma serie de Ag que pode ser ligada a sua superficie para fornecer um sistema indicador sensivel na deteccao de Ac, porem, sua superficie e complexa, facilitando a ligacao de muitos Ag e, frequentemente, acarreta a presenca de Ac heterofilos que devem ser removidos antes da execucao do teste.

v CHAGAS - Princpio Eritrocitos de aves estabilizados, sensibilizados com compontes antigenicos Trypanossoma cruzi altamente purificados, mostram aglutinacao quando reagem com Ac contra esses antigenos presentes no soro do paciente. - Materiais e Mtodos a) Determinacao Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano umido para neutralizar as forcas eletrostaticas. Usar 1 cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo. Usar diluicao do soro 1/32 com a solucao diluente com os controles positivo e negativo. Transferir 25uL da suspensao homogenea de hemacias placa. Adicionar 25uL da suspensao homogenea de hemacias em cada cavidade. Agitar a placa por vibracao mecanica por 4 minutos. Deixar em repouso por 1 a 2 horas a temperatura ambiente, em locar livre de vibracoes. Fazer a leitura. Reacao positiva como um tapete e reacao negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um botao. b) Determinacao Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar sucessivas diluicoes (titulacao) a partir da diluicao do soro de 1/32. Pipetar 25uL da solucao diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, ate a diluicao que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluicao, desprezar os ultimos 25uL. Pipetar 25uL da suspensao homogenea de hemacias em todas as cavidades. Agitar a placa por vibracao mecanica por 4 minutos. Deixar em repouso por 1 a 2 horas a temperatura ambiente, em local livre de vibracoes. Fazer a leitura.

v TOXOPLAMOSE - Princpio Eritrocitos de aves estabilizados, sensibilizados com componentes antigenicos do Soxoplasma gonddi altamente purificados, mostram aglutinacao quando reagem com Ac contra esses antigenos presentes no soro do paciente. - Materiais e Mtodos a) Determinacao Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano umido para neutralizar as forcas eletrostaticas. Usar cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo. Usar diluicao do soro 1/16 com

a solucao diluente com 2-Mercaptonol. Fazer o mesmo com os controles positivo e negativo. Transferir 25uL da diluicao 1/16 de cada amostra e controles para as respectivas cavidades da placa. Adicionar 25uL da suspensao homogenea de hemacias em cada cavidade. Agitar a placa por vibracao mecanica por 4 minutos. Deixar em repouso por 1 a 2 horas a temperatura ambiente, em local livre de vibracoes. Fazer a leitura. Reacao positiva quando as hemacias de depositam no fundo da cavidade como um tapete e reacao negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um botao. b) Determinacao Quantitativa: Em caso de amostra positiva, devese realizar sucessivas diluicoes (titulacao) a partir da diluicao do soro de 1/32. Pipetar 25uL da solucao diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, ate a diluicao que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluicao, desprezar os ultimos 25uL. Pipetar 25uL da suspensao homogenea de hemacias em todas as cavidades. Agitar a placa por vibracoes mecanicas por 4 minutos. Deixar em repouso por 1 a 2 horas a temperatura ambiente, em local livre de vibracoes. Fazer a leitura.

v FLOCULAO (VDRL) O teste de VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) emprega cristais de colesterol que sao sensibilizados com cardiolipina para a pesquisa de Ac na sifilis. E classificado como um teste nao treponemico, usado como triagem ou controle da cura. - Princpio Reacao imunologica de floculacao utilizando antigeno de cardiopina, lecitina e colesterol em solucao alcoolica, onde as particulas de Ag floculam ao entrar em contato com o soro ou plasma (reagina). - Materiais e Mtodos a) Determinacao Qualitativa: Tem como objetivo a triagem e eliminacao dos soros nao reagentes. Para isso, toma-se uma placa de Kline com suas cavidades devidamente identificadas para cada reacao. Pipetar 50uL da amostra a ser analisada e dos soros controle positivo e negativo. Adicionar-se 25uL da suspensao antigenica a cada cavidade, que ira reagir com os Ac presentes. Colocar lamina em agitador mecanico por 4 minutos. Fazer leitura em microscopio com objetiva de 10x. b) Determinacao Semi - Quantitativa: Tem como objetivo reduzir a pequenos intervalos a quantidade de Ac presentes na amostra. Para tanto, devera ser feita diluicao da amostra em solucao salina. Proceder cada diluicao do mesmo modo como no teste qualitativo. O titulo da amostra sera o da

ultima diluicao onde ainda se visualiza a presenca de agregados.