Diario de Laboratorio Bioqumica 1. SISTEMAS BUFFER Y MECANISMOS REGULADORES DEL pH Alumno: Jaime Wilfredo Garca Viera. Carn: GV01009.

Objetivos. 1. Comprobar que el pH de una solucin cambia cuando varia la concentracin de iones de Hidrogeno 2. Comprobar la accin amortiguadora de los sistemas buffer 3. Valorar la importancia de los sistemas buffer en el mantenimiento del equilibrio acido-base del organismo. Resumen de sistemas buffer y el mecanismo de accin de regulacin de pH del cuerpo. Las soluciones buffers, son soluciones que resisten cambios de su pH. Estas soluciones mantienen constante el pH cuando se adicionan pequeas cantidades de cidos o bases. Una solucin buffer debe contener un cido dbil y una sal de ste cido Segn la teora de Bronsted y Lowry Definimos cido como una sustancia que, en solucin, desprende protones (H+), mientras que una base es una sustancia que, en solucin, desprende iones oxhidrilo (OH-) o capta protones. Cuando un cido libera un protn se convierte en una base conjugada, y a la inversa, cuando una base acepta un protn se convierte en un cido conjugado. Si las cantidades de H+ y OHson idnticas la solucin resulta neutra. Si la concentracin de H+ excede la concentracin de OH-, la solucin resultara cida. Por el contrario si la concentracin de OH- excede la concentracin de H+, la solucin resultara bsica o alcalina. pH El pH es una expresin matemtica de la concentracin de protones (H+). el pH es el logartmo negativo de la concentracin de los iones hidrgeno. pH = - log [H+] La escala de pH se extiende desde 0 a 14 en solucin acuosa. Las soluciones con pH menor a 7 son consideradas cidas; las que poseen un pH mayor a 7 son bsicas o alcalinas; finalmente un pH de valor 7 indica la neutralidad de la solucin. Tambin se define el pOH, que mide la concentracin de iones OH-. pOH = - log [OH-] Regulacin del pH Existen tres sistemas de regulacin de pH o del Equilibrio cido-Base

1) Sistemas Buffer de los Lquidos Corporales, de respuesta inmediata. 2) El sistema respiratorio, eliminando o reteniendo CO2 3) Rin, excretando excedentes por orina

La Hemoglobina constituye el principal buffer de la sangre, de accionar extremadamente eficiente gracias a su elevada concentracin y a la gran cantidad de residuos de histidina que posee en su estructura. Es menester mencionar que la carboxihemoglobina tiene su capacidad buffer algo aumentada con respecto a la oxihemoglobina, lo cual es una contribucin muy importante ya que, como antes mencionamos el CO2 es un cido potencial Bicarbonato El sistema cido Carbnico-Bicarbonato es el buffer ms importante de nuestro organismo. Existen mltiples caractersticas que hacen de este sistema un regulador de pH el ms eficaz en el hombre. En primer lugar se trata de un sistema que est presente en todos los medios tanto intracelulares como extracelulares. A primera vista su pKa parecera corresponder a un buffer poco til para nuestro organismo ya que su valor es de 6,10. Sin embargo este hecho se ve compensado por la posibilidad de regular independientemente las concentraciones tanto de la especie aceptora de protones como la dadora de protones. La reaccin qumica est dada por: H2CO3 H+ + HCO3Como mencionamos anteriormente el H2CO3 est en equilibrio con el CO2. Por consiguiente la ecuacin de Henderson-Hasselbach esta dada por:

pH = 6,1 + log [HCO3-] -----------[CO2] De este modo la concentracin de la especie aceptora de protones (H2CO3) va a estar regulada por un sistema de intercambio de solutos a nivel renal y la concentracin de la especie dadora de protones (CO2) ser regulada por un sistema de intercambio de gases a nivel pulmonar. Si tomamos los valores de concentracin para el CO2 y el H2CO3 y calculamos el valor del pH utilizando la ecuacin de Henderson-Hasselbach obtendremos 7,40 como resultado, lo que implica que este buffer es ideal para mantener la homeostasis de nuestro pH. REGULACIN RESPIRATORIA DEL PH Nuestro sistema respiratorio se encarga de regular la presin parcial de dixido de carbono (PCO2) arterial. El CO2 es barrido en los pulmones por la ventilacin. La presin parcial de dixido de carbono es proporcional a su concentracin. Nuestros pulmones regulan indirectamente la

concentracin de cido del organismo. Al ser la PCO2 de la sangre mayor que la alveolar, en condiciones normales se va a producir una difusin neta de CO2 hacia el interior del alveolo desde donde ser eliminado.

Fosfato Este buffer ejerce su accin fundamentalmente a nivel intracelular, ya que es aqu donde existe una mayor concentracin de fosfatos y el pH es ms prximo a su pKa (pKa = 6,8). Este sistema tambin posee una accin importante a nivel de los tbulos renales, que presentan un pH menor a 7:

H2PO4- H+ + HPO42REGULACIN RENAL DEL PH Regula el HCO3- recuperado o reabsorbido del filtrado glomerular. El bicarbonato es filtrado continuamente hacia la luz del tbulo renal de modo que en el filtrado glomerular intacto la concentracin de bicarbonato es prcticamente igual a la del plasma, de ah la importancia del proceso de reabsorcin del mismo. A la concentracin fisiolgica de bicarbonato plasmtico (24 mEq/l), prcticamente todo el bicarbonato filtrado va a ser reabsorbido. Este proceso tiene lugar fundamentalmente en el tbulo contorneado proximal (TCP) donde se reabsorbe un 85%. El resto es reabsorbido en el asa de Henle (10-15%) y en el tbulo contorneado distal (TCD) y colector. Genera HCO3- nuevo que reemplaza al que se pierde amortiguando cidos producidos por el organismo. Si a pesar del proceso de reabsorcin la concentracin de bicarbonato plasmtico permanece por debajo del valor normal, en las clulas tubulares se va a sintetizar bicarbonato. Esto sucede fundamentalmente en el tbulo contorneado distal a partir del CO2 procedente de la sangre o del propio metabolismo de la clula tubular por accin de la anhidrasa carbnica. El H2CO3 as generado se disocia en bicarbonato que se reabsorbe hacia la sangre y un protn que es eliminado. Secreta HCO3- en condiciones de alcalosis crnica. El sistema renal es lento en su ejecucin como sistema amortiguador, requiriendo entre 10 y 20 horas para iniciar una actuacin eficaz y 4-5 das para desarrollarse por completo. Es por eso que su accionar es muy eficaz en condiciones de desequilibrio crnico. pKa La relacin entre las concentraciones de AH, y estn dadas por la Constante de Disociacin del cido (Ka) que es caracterstica de cada sustancia: [H+] [A-] Ka = ----------------[AH]

La tendencia de cualquier cido dbil a disociarse, es decir la fuerza del cido, est dada por la constante de disociacin. Cuanto mayor es Ka, ms disociado estar el cido en solucin y mayor ser su fuerza. El valor de pH en el cual el cido se encuentra disociado en un 50% se conoce como pKa. Podemos calcularlo con la siguiente frmula: pKa = - log Ka En este caso a menor pKa, mayor ser el grado de disociacin del cido en solucin. Cuando trabajamos con cidos fuertes el clculo del pH se reduce a la expresin que enunciamos anteriormente. Sin embargo cuando trabajamos con soluciones buffer para calcular el pH utilizamos la ecuacin de Henderson-Hasselbach: pH = pKa + log [A-] ------[AH] Es importante destacar que ecuacin de Henderson-Hasselbach es vlida para valores de pH cercanos al pKa del cido considerado. Sin embargo es extremadamente til en medicina ya que los valores de pH de los buffers de nuestro organismo siempre van a ser cercanos a sus respectivos pKa. PARTE EXPERIMENTAL Reactivos:

Acido Actico 0.1 N Hidroxido de Sodio 0.1 N Buffer Fosfato 0.05 M pH 7.4 Azul de Bromotinol 0.02% Acido Clorhidrico 0.1 N Acetato de Sodio

CH3-COOH NaOH H2PO4 / HPO4 (indicador de pH) HCl CH3-COONa

Material:

Gradilla para tubos Tubos de ensayo Pipetas Graduadas de 1 mL, 5 mL y 10 mL Papel pH

1. Prepare dos tubos de ensayo y rotlelos 1 y 2 respectivamente. 2. Mida 9.0 mL de agua destilada con una pipeta de 10 mL y virtalos en el tubo N1 3. En el tubo N2 vierta 4.5 mL de solucin acido actico 0.1 N y 4.5 mL de solucin de acetato de sodio 0.1N; estos volmenes debern ser medidos con respectivas pipetas de 5mL, Mescle bien.

4. Mida el pH en ambos tubos con el papel indicador que le ser proporcionado por el docente. Tubo 1 pH :__________ Tubo 2 pH: ____________ 5. Con una pipeta de 1 ml graduada en decimas, agregue a cada tubo 1.0 ml de HCl 0.1N, mezcle bien. 6. Mida de nuevo el pH en ambos tubos. Tubo 1pH:___________________ Tubo 2 pH:___________________ Anote Resultados. _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________

CURVA DE TITULACION DEL ACIDO ACETICO En esta parte, la adicin de NaOH al cido actico, conduce a la formacin de acetato de sodio. La cantidad de sal formada en cada tubo depender de la cantidad de NaOH aadida. Cuadro 1. Cantidad de Reactivo por tubo de ensayo. Tubo A acet NaOH pH Utilizando la formula de Henderson- Haselbach, calcule el pH de los tubos de la curva de titulacin del N 2 al 10. Tubo 2 pH= pKa + log ________ Tubo 3 pH= pKa + log ________ Tubo 4 pH= pKa + log ________ Tubo 5 pH= pKa + log ________ Tubo 6 pH= pKa + log ________ Tubo 7 pH= pKa + log ________ Tubo 8 pH= pKa + log ________ Tubo 9 pH= pKa + log ________ Tubo 10 pH= pKa + log ________ 1 5 0 2 5 0.5 3 5 1.0 4 5 1.5 5 5 2.0 6 5 2.5 7 5 3.0 8 5 3.5 9 5 4.0 10 5 4.5 11 5 5.0

1. Coloque en una gradilla 11 tubos de ensayo ordenados y numerados correlativamente. 2. Transfiera a cada uno de los tubos 5.0 mL de de acido actico 0.1N usando una pipeta de 5mL 3. Con una pipeta graduad agregue a cada tubo las cantidades de hidrxido de sodio 0.1 N, indicados en el cuadro. 4. Agregue a cada uno de los tubos 5 gotas de indicador universal 5. Mezcle bien los tubos y observe el color obtenido. 6. Compare el color obtenido 7. Selecione el tubo que usted considere que tiene la mxima accin amortiguadora y determine el pH, usando la ecuacin de Henderson-Haselbach. 8. Grafique el valor de pH de cada tubo y la cantidad de hidrxido de sodio 0.1N agregada a cada uno de ellos. Colocando el pH en las Ordenadas y el volumen en mL en las abscisas.

Preguntas? En que tubos es igual la cantidades de cido actico no neutralizado y acetato de sodio? _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ En que regin de la curva es minimo el cambio de pH despus de la adicin de cantidades equivalentes de base? _________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

Cul es la explicacin al cambio de pH observado en la curva? _________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

En que tubo ocurri la total neutralizacin del cido actico por la base? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

ACCION AMORTIGUADORA EN LOS LIQUIDOS CORPORALES (IN VITRO)

En esta parte reproduciremos la forma en que el sistema renal participa en mantener el equilibrio acido-base del organismo, analizando el papel que juega la solucin Buffer Fosfato presente en el filtrado glomerular (pH 7.4), el cual acepta los iones de hidrogeno eliminados por el rion durante el proceso de formacin de orina (pH 6) En condiciones normales, la velocidad de secrecin de hidrogeniones es del orden de 3.5 mmol/min y la velocidad de filtracin de bicarbonato es de 3.46 mmol/min, es decir la cantidad de ambos iones es practicamente la misma, neutralizandose en la luz tubular. Por tanto la excrecin directa de H+ libres, es mnima de 0.1 mEq/da como mximo. 2. As pues, para eliminar el exceso de hidrogeniones por la orina, se debe combinar este in hidrgeno con tampones intratubulares: I. Como acidez titulable : a) en forma de fosfato: HPO4= + H+ = H2PO4-; este sistema tiene un pK de 6.8, y por tanto es activo entre 7.3 y 6.3 de pH. b) en forma de creatinina: es cuantitativamente poco importante, su inters es por tener un pK de 4.8, y poder actuar en los rangos bajos del pH urinario. PARTE EXPERIMENTAL. 1- Utilizando una pipeta serolgica de 5mL, mida 5 mL de una solucin buffer fostato pH 7.4 y transfiralos a un tubo de ensayo (Este buffer fosfato en esta practa representa el liquido del filtrado glomerular) 2- Agregue al tubo 5 gotas de indicador azul de bromotimol, agitar. 3- Titule la solucin del tubo agregando gota a gota y agitando acido clorhdrico (HCl) 0.1 N utilizando una pipeta serolgica de 5mL hasta obtener un color amarillo (esto ocurre aproximadamente a pH 6) Anote en su plan de trabajo el volumen gastado HClen la titulacin 4- Los H+ que usted agrega por medio del HCl 0.1 para cambiar el pH del buffer fosfato desde 7.4 hasta 6 representan a los H+ que el rion agrega al filtrado glomerural para eliminarlos con Na+ t recyoar eb esta firna base (HCO3-)

Preguntas:

Cul es el papel que desempea la solucin buffer fosfato y la solucin HCl 0.1N en este experimento? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

Cmo son eliminados los iones H+ por las clulas renales a la luz del tbulo? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________

Calcular cuantos mEq de ase (NaHCO3) son restaurados a la sangre (pH 7.4) por la excresion de un litro de orina pH 6.0 haciendo uso de datos obtenidos en la titulacion del buffer fosfato con la solucin HCl.