EXTRACCIN DE SANGRE Y RGANOS LINFOIDES DE RATN. AISLAMIENTO DE LINFOCITOS.

1.- INTRODUCCIN En inmunologa humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio para la obtencin de antisueros o complemento, para la generacin de anticuerpos monoclonales o para la produccin de lquido asctico a partir de hibridomas. En esta prctica se aprendern las tcnicas bsicas de manipulacin de ratones que pueden tener utilidad en Inmunologa. Se llevarn a cabo tcnicas de inyeccin subcutnea e intraperitoneal, extraccin de sangre del plexo axilar y mediante puncin intracardiaca, extraccin de rganos linfoides y aislamiento de clulas a partir de estos tejidos slidos. Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisin para evitar estresar al animal, lo que puede resultar en mordeduras o araazos al experimentador y en daos innecesarios al animal. Debe tenerse en cuenta que los ratones son ms agresivos que las ratas y tendern a morder instintivamente. 2.- OBJETIVOS Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: - Sujetar manualmente los ratones para ser correctamente inyectados, sin riesgo personal y sin daar al animal. - Extraer sangre y preparar suero. - Anestesiar ratones por inhalacin - Abrir el abdomen y extraer el bazo. - Localizar y extraer ganglios linfticos. - Abrir el trax y extraer el timo. - Disgregar los tejidos para obtener clulas viables. 3.- EQUIPAMIENTO - Ratones Swiss o similares adultos, no importa el sexo. - Material de diseccin: Guantes, tijeras, bistur, pinzas, jeringuillas y agujas para insulina. - Vaso de precipitado de 1000 cc o recipiente de vidrio con tapa. - Tubo de 50 ml con tapa. - Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla. - Placas de cultivo de 24 pocillos. - Pipetas de 5-50 l y 200-1000 l y puntas. - Contenedor para material cortante. 4.- REACTIVOS

- Etanol 70% - Eter dietlico anestsico - Tampn PBS pH 7.2 - Suero fisiolgico 5.- MTODO A.- Inyeccin intraperitoneal. 1.- Cargar una jeringuilla con la suspensin a inyectar (en nuestro caso 2.5 ml de suero fisiolgico) expulsar las burbujas de aire y dejar preparada. 2.- Sacar al ratn de la jaula asindolo con una mano por la base del rabo y situarlo sobre la tapa para que se agarre a las barras. 3.- Con los dedos pulgar e ndice de la otra mano agarrar por la piel de la nuca. 4.- Situar el rabo por detrs del dedo meique para inmovilizar al ratn con una sola mano. 5.- Lavar el abdomen con etanol y dejar secar. 6.- Colocar al ratn ligeramente cabeza abajo. 7.- Introducir la aguja en el cuadrante inferior izquierdo (o derecho) del abdomen a un lado de la lnea media. 8.- Inyectar con presin moderada. B.- Inyeccin subcutnea. 1.- Cargar la jeringuilla con el lquido a inyectar (2.5 ml de suero fisiolgico) y expulsar el aire. 2.- Situar al ratn sobre sus patas encima de un secante. 3.- Sujetar por la piel del rea interescapular con los dedos ndice y pulgar. 4.- Introducir la aguja bajo la piel entre los dedos. 5.- Inyectar con presin moderada. C.- Anestesiado por inhalacin. 1.- Colocar un trozo grande de algodn en un vaso de precipitado y empapar ligeramente con ter dietlico (Evitar su inhalacin directa. Muy inflamable). Tapar y dejar evaporar dos minutos. 2.- Preparar un tubo de 50 ml con un algodn humedecido en ter y guardar tapado. Servir para suplementar anestesia si se requiere ms tarde. 3.- Introducir al animal en el recipiente y tapar. 4.- Cuando se observe que el animal se tiende y su respiracin es lenta y regular, puede extraerse. 5.- Si se requiriera aplicar un suplemento anestsico durante las manipulaciones siguientes, puede colocarse unos segundos en la cabeza del animal el tubo de 50 ml con el algodn humedecido en ter. D.- Extraccin de sangre del plexo axilar. 1.- Anestesiar al ratn. 2.- Colocar al animal tumbado de espaldas sobre un secante y sujetar una pata.

3.- Con un bistur cortar la piel de la zona del trax cercana a la regin axilar. 4.- Retirar ligeramente la piel con unas pinzas y con el bistur cortar los vasos. 5.- Recoger la sangre con una pipeta y dispensarla en un tubo. 6.- Dejar coagular, centrifugar a 600xg 10 minutos, recoger el suero con una pipeta y transferir a un tubo eppendorf. E.- Extraccin de sangre por puncin intracardiaca. 1.- Anestesiar al ratn y preparar una jeringa con aguja de insulina. 2.- Colocar al animal tumbado de espaldas. 3.- Introducir la aguja debajo y ligeramente a la derecha del cartlago xifoides (izquierda del animal) con una inclinacin de 15-20 grados. 4.- Introducir despacio la aguja al tiempo que se extrae ligeramente el mbolo. 5.- La sangre entrar en la jeringuilla cuando la aguja penetre en el corazn. Aspirar lentamente hasta que el flujo de sangre pare. Mover la aguja hacia delante o atrs para extraer la mxima cantidad posible de sangre. 6.- Depositar la sangre en un tubo, quitando previamente la aguja para evitar hemlisis. 7.- Dejar coagular, centrifugar a 600xg 10 minutos, recoger el suero con un pipeta y transferir a un tubo eppendorf. F.- Extraccin de rganos linfoides (bazo, timo y ganglios) 1.- Sacrificar al animal por dislocacin cervical: Colocar un mango de bistur detrs de las orejas, cruzando la nuca, tirar del rabo hacia atrs con la otra mano mientras se presiona hacia abajo en la nuca. 2.- Colocarlo de espaldas sobre un papel secante. 3.- Esterilizar con alcohol la zona de la lnea media. 4.- Cortar por la lnea media con tijeras. 5.- Retirara la piel con los dedos. Bazo: 6.- Girar al animal para exponer su flanco izquierdo. 7.- Abrir el peritoneo con una incisin de 2-3 cm mediante unas tijeras. 8.- Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas, cortando el tejido conectivo. 9.- Colocar el bazo en un pocillo con 1 ml de PBS. Ganglios: 10.- Diseccionar la regin axilar y localizar algn ganglio linftico. 11.- Extraer, depositar en un pocillo y limpiar de tejido graso y conectivo. Aadir 1ml de PBS. Timo: 12.- Tumbar al ratn de espaldas. 13.- Abrir el trax mediante una incisin, con tijeras, desde el xifoides hasta el cuello.

14.- Abrir las costillas con las pinzas. 15.- Extraer el timo con las pinzas y colocado en un pocillo con 1ml de PBS. G.- Disgregacin de tejidos linfoides (bazo, ganglios, timo). 1.- Depositar las piezas en pocillos o placas de petri pequeas en las que previamente se ha aadido PBS estril. 2.- Limpiar de tejido graso y conectivo. 3.- Pinchar repetidas veces con una aguja. 4.- Presionar suavemente con el mbolo de una jeringuilla. 5.- Aspirar el lquido que baa la pieza y depositarlo en un tubo. 6.- Reemplazar con PBS limpio y repetir los pasos 4 a 6 hasta que solo quede la cpsula. 7.- Cuando todo el lquido est en el tubo, dejar sedimentar los trozos de tejido no disgregado y transferir el lquido claro a un tubo limpio. 8.- Centrifugar a 400xg 5 minutos, decantar y aadir 1ml de medio de cultivo.