MDULO SUBMDULO RESULTADO DE APRENDIZAJE

II 1

Procesar las tcnicas para el diagnostico microbiolgico

DURACIN: 272HRS Procesar tcnicas bacteriolgicas bsicas DURACIN 96HRS Realizar las tcnicas bacteriolgicas para su diagnostico fundamentadas en la normatividad vigente, bioseguridad y biotica profesional.

TINCIONES Son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante PREPARACIN DE EXTENSIONES DE CULTIVOS BACTERIANOS PARA TINCIONES

A partir de cultivos en medio lquido o bien en medio slido, se procede como en el caso de la preparacin en fresco: - Extender la suspensin con el asa hasta conseguir una capa fina. - Secar la preparacin acercndola a la llama del mechero, evitando que se caliente demasiado, para no afectar a la estructura y forma normal de los microorganismos (se comprueba con el dorso de la mano que no est demasiado caliente). - Una vez seca la preparacin se procede a la fijacin de la muestra, haciendo pasar la preparacin 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte inferior del portaobjetos). - Una vez seca y fijada la preparacin, se procede a su tincin y posterior observacin

TINCIONES SIMPLES Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. Ejem: Azul de metileno, safranina etc.

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Una vez fijada la preparacin (tras esperar que se enfre), cubrir con el colorante durante 1 minuto, lavar a continuacin abundantemente con agua destilada, y secar con papel de filtro. Observar al microscopio. TINCIONES DIFERENCIALES Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante. Tincin de Gram: El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gramtienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las clulas permanecern azules.Las clulas Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

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Instrucciones para la tincin de GRAM - Cubrir la preparacin con cristal violeta y mantener durante 1 minuto. - Escurrir el colorante y cubrir con lugol. Dejar actuar durante 1 minuto. Lavar con agua - Cubrir con safranina. Dejar actuar durante30 segundos. - Lavar con agua y secar la preparacin.

Tincin de endosporas: Schaiffer-Fulton Las bacterias de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman endosporas. Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie ante situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulacin de metabolitos txicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la clula bacteriana, pudiendo alcanzar un dimetro considerablemente mayor que el de la clula. La clula acaba por lisarse y morir dejando libre a la espora. Las endosporas germinarn cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los gneros Clostridium: y Bacillus: C. tetani (ttanos), C. perfringens (gangrena gaseosa), C. botulinum (botulismo), B. anthracis (antrax). - Cubrir el portaobjetos con una solucin de verde de malaquita (en abundancia), y calentar hasta la emisin de vapores. Mantener durante 5 minutos. Lavar con agua.

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- Cubrir con safranina como colorante de contraste. Dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua y secar. - Observar al microscopio (objetivo de inmersin). Las esporas aparecen teidas de verde y las clulas vegetativas de rosa.

Tincin de cido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen): Se basa en que ciertos microorganismos no son desteidos por una mezcla de cido y alcohol si han sido previamente teidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos cido-alcohol resistentes. Una vez realizada la decoloracin con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (el Azul de metileno) para poder observar las clulas sensibles a la decoloracin por cido-alcohol. Son microorganismos cido-alcohol resistentes las micobacterias, por la especfica composicin de su pared celular, y algunos actinomicetos, como

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Nocardia. Algunos microorganismos patgenos son cido-alcohol resistentes: Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis), M. leprae (lepra). - Cubrir la preparacin con fucsina fenicada y calentar hasta la emisin de vapores. Dejar actuar durante 5 minutos cuidando que no se deseque la preparacin. Lavar abundantemente con agua. - Decolorar con la solucin de cido-alcohol durante 10-20 segundos. Lavar con agua. - Teir con azul de metileno como colorante de contraste durante 2 minutos. Lavar y secar la preparacin. - Observar al microscopio. Las clulas cido-alcohol resistentes permanecen teidas de fucsia, ya que retienen el primer colorante, mientras que las no resistentes se decoloran con el cido-alcohol y se teirn de azul con el colorante de contraste

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Tincin con tinta china. -Se coloca una gota de agua y tinta china en el portaobjetos, colocamos un poco de cultivo y mezclamos suavemente. -Colocamos el cubreobjetos y presionamos suavemente (evitando las burbujas) -Sellamos con barniz

Tincin de Hiss -Teir con cristal violeta durante 1 minuto -Enjuagamos con sulfato de cobre al 20%