Rev. Fac. Ing. Univ. Antioquia N. 49. pp. 42-49.

Septiembre, 2009

Mtodo analtico para la determinacin de etilentiourea (etu) subproducto del Mancozeb en un Andisol del Oriente Antioqueo Analytical method for determining ethylenethiourea (etu) by-product of Mancozeb in Andisol of East Antioquia
Mara Carolina Domnguez1*, Gustavo Peuela1, Mara Teresa Flrez2 Grupo de Investigacin en Diagnstico y Control de la Contaminacin (GDCON), Facultad de Ingeniera, Universidad de Antioquia. Apartado Areo 1226, Medelln, Colombia
1

Grupo de Investigacin en Gestin y Modelacin Ambiental (GAIA). Facultad de Ingeniera, Universidad de Antioquia, Apartado Areo 1226, Medelln, Colombia
2

(Recibido el 6 de octubre de 2008. Aceptado el 26 de mayo de 2009) Resumen El Mancozeb (etilenbisditiocarbamato de cinc y manganeso) es uno de los fungicidas de mayor uso en Colombia, y esta clasificado en la categora toxicolgica IV. La etilentiourea (ETU) es el principal producto de degradacin del Mancozeb, estando clasificada en la categora toxicolgica I debido a que es carcinognico y mutagnico, lo que lo convierte en un compuesto de alto riesgo para la salud de las personas. En el presente trabajo se valid un mtodo de anlisis de la ETU utilizando la cromatografa de lquidos (CL) con detector de arreglo de diodos (DAD), el cual se us para la cuantificacin de la ETU en suelos del municipio de Marinilla (Oriente de Antioquia). El suelo usado en el anlisis de la ETU se determin como un Acrudoxic Fulvudand medial arcilloso mezclado, isomsico; estos suelos son los ms utilizados para la agricultura en el Departamento de Antioquia y en Colombia. El lmite de deteccin del anlisis fue 0,00046 mg/L, el lmite de cuantificacin fue 0,0015 mg/L y el porcentaje de recuperacin en el suelo fue 93%. ----- Palabras clave: Mancozeb, etilentiourea (ETU), cromatografa de lquidos (CL), andisoles.

* Autor de correspondencia: telfono: + 57 + 4 + 219 65 71, fax: + 57 + 4 + 219 65 71, correo electrnico: cagual@udea.edu.co (M. Domnguez).

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Abstract The Mancozeb (etilenbisditiocarbamato of zinc and manganese) is one of the fungicides of greater use in Colombia, and is classified in toxicological category IV. Ethylenethiourea (ETU) is the main product of degradation of the Mancozeb, classified in toxicological category I because of its carcinogenic and mutagenecity, which turns it a compound of high risk for people health. In the present work a method of analysis of the ETU was validated using the chromatography of liquids with diode array detector, which was used for the quantification of the ETU in soils of the municipality of Marinilla (East of Antioquia). The soil used in the analysis of the ETU was determined as an Acrudoxic mixed argillaceous medial Fulvudand, isomsico, these soils are used for agriculture in the Department of Antioquia and Colombia. The detection limit of analysis was 0,00046 mg/L, the limit of quantification was 0,0015 mg/L and the percent recovery in soil was 93%. ----- Keywords: Mancozeb, etilentiourea (ETU), chromatography of liquids (CL), andisols.

Introduccin
En Colombia se emplea un nmero apreciable de compuestos qumicos para la proteccin de los cultivos, sin embargo, el uso inadecuado e incontrolado, ha sido causa de mltiples afecciones de salud que van desde intoxicaciones leves o alergias, hasta casos de carcinognesis, mutagnesis, teratognesis y muerte, as como tambin de la destruccin de ecosistemas completos [1]. En Latinoamrica, Colombia ocupa el tercer lugar en la utilizacin de plaguicidas, despus de Brasil y Mxico, con un consumo anual de 21 millones de kilogramos, de los cuales 17,1 se aplican en el sector agrario. No obstante, Colombia supera a dichos pases en el grado de exposicin, indicador que establece la relacin entre el consumo de un producto y la poblacin econmicamente activa en el sector agrario, siendo superada slo por Panam y Costa Rica [2]. El departamento de Antioquia tiene una produccin agrcola de gran importancia para el abastecimiento de otras zonas del pas, con productos como: flores, caf, frjol, papa, maz, tomate y hortalizas en general; cultivos con los cuales se reconoce el uso y el abuso de los agroqumicos, representados por herbicidas, fungicidas, insecticidas y fertilizantes. Los plaguicidas ms usados

en el departamento son: mancozeb, endosulfan, malation, carbofuran, carbaril, metomil, dimetoato, metamidofos, metilparation, clorpirifos y paration. El uso exagerado, persistencia y lipofilicidad de los plaguicidas favorece su residualidad y acumulacin en alimentos, animales, aguas y suelos [3]. La contaminacin del suelo por plaguicidas se da por aplicaciones directas en los cultivos agrcolas, derrames accidentales, lavado inadecuado de tanques contenedores, filtraciones en los depsitos de almacenamiento y residuos descargados y dispuestos en el suelo. Esta contaminacin ocasiona la degradacin de los suelos que puede conducir a un impacto negativo en el ambiente y particularmente en la productividad [4]. Los productos de degradacin son compuestos derivados de la transformacin del plaguicida por procesos fsicos, qumicos y biolgicos [5, 6], y que varios de ellos pueden ser ms txicos, e incluso ms persistentes, que el plaguicida original. Uno de los fungicidas que por su alto espectro de accin y bajo costo, que se ha venido utilizando en grandes cantidades, son los de tipo etilenbisditiocarbamatos (EBDTC) tales como mancozeb, dithane, manzeb, mancofol y manzate, entre otros. Estos plaguicidas se utilizan en suelos destinados

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al cultivo de hortalizas y algunos tubrculos, tanto para el proceso de acondicionamiento del suelo (accin preventiva) como para su aplicacin sobre la planta (accin correctiva). Sin embargo, ellos se degradan rpidamente en metabolitos ms txicos, entre ellos la etilenotiourea (ETU), de caractersticas cancergenas, teratognicas y mutagnicas, con un amplio efecto antifngico, y que aportan metales como manganeso y cinc que pueden generar un desequilibrio nocivo entre micronutrientes o macronutrientes para los cultivos [7]. La ETU se produce por mltiples mecanismos de degradacin como la hidrlisis, oxidacin o degradacin microbiana [8]. En el Oriente antioqueo se encuentran suelos Andisoles, altamente conocidos por sus propiedades morfolgicas, fsicas y qumicas nicas, atribuidas a la fraccin arcilla de composicin amorfa y a la formacin de compuestos aluminio-humus. Estos suelos poseen altos contenidos de materia orgnica, alta capacidad de fijar fosfatos, baja densidad aparente as como aluminio e hierro extractables con oxalato cido de amonio, relacionados con contenidos proporcionales de vidrio volcnico y cantidades significativas de alfana, imogolita, ferrihidrita y/o complejos aluminio-humus que son nombradas como minerales de bajo grado de cristalizacin (mbgc) [9]. Las partculas pequeas de los minerales de bajo grado de cristalizacin (mbgc) que contienen los Andisoles absorben iones para equilibrar la carga de las partculas. Las cargas insaturadas son en su mayora negativas, por ello, son los cationes los que se adsorben. Tales iones se pueden intercambiar por otros debido a que permanecen en la superficie y no en el seno del cristal. Esto retrasa la prdida de iones del suelo y los retiene en estados disponibles para que puedan ser captados por las plantas [10].

de diodos DAD G1315B e inyector automtico G1329A modelo 1200, Columna Zorbax 5B-C18 (250 x 4.6 mm y 5 m de tamao de partcula), membrana de PVDF 0,45 m de poro, 13 mm de dimetro (Millex-HV). Vortex marca IKA Words, modelo MS1, bao mara marca Yamato, modelo BM200, bao de ultrasonido marca Branson, modelo 2510 y centrfuga marca Indulab Serie 4610 acoplada con un rotor para tubos falcn de 50 mL. Patrones, solventes y reactivos 2-imidazolidinethione (etilentiourea), pureza de 99% (Chem Service), agua milliQ (agua desionizada) obtenida al pasar agua destilada por un equipo de Millipore Simpak OR1, Acetonitrilo grado cromatogrfico, Hidrxido de Sodio, Grado reactivo (Merk) y Dithane- M45 wp NT, (Dow agrosciences). Procedimiento Suelos Las muestras analizadas se recolectaron en suelos cultivados con tomate chonto bajo invernadero. En el suelo se realiz una calicata de dimensiones 1.00 x 0.50 x 1.50 metros lo que facilit su muestreo. Definidos los diversos horizontes del suelo (Ap 0- 38cm, Ah de 38 46cm y A/Bw de 46 55cm en el espesor del suelo), se procedi a medir algunos parmetros como pH, textura, estructura, color, porosidad, consistencia, plasticidad, etc. Cada horizonte, una vez descrito, fue muestreado tomando aproximadamente 1 kg de muestra y se empac en bolsa plstica hermtica, y se llev al laboratorio del grupo GDCON (En la sede de investigaciones Universitarias, Medelln) con el fin de realizar los anlisis cromatogrficos para determinar la concentracin de la ETU en las muestras recogidas en campo. La procedencia y la descripcin del suelo se presentan en la tabla 1. Propiedades fisicoqumicas del suelo Las propiedades se determinaron siguiendo la metodologa utilizada en el Laboratorio de Suelos del Instituto Geogrfico Agustn Codazzi.

Materiales y mtodos
Equipos Cromatgrafo lquido de alta resolucin Agilent technologies modelo 1100, equipado con bomba cuaternaria G1311A, detector de arreglo

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Tabla 1 Descripcin y propiedades del suelo en estudio

Parmetros** Taxonoma Uso Actual Horizontes Ap Ah A/Bw Acrudoxic Fulvudand medial arcilloso mezclado, isomsico Cultivo de tomate chonto bajo invernadero Municipio de Marinilla, Departamento de Antioquia, Cuenca media de la quebrada La Marinilla, Vereda Juan Bosco. Altitud: 2430 msnm. Posicin fisiogrfica: Parte media de la ladera de colinas bajas, redondeadas, desarrolladas en saprolito de anfibolita y recubiertas con ceniza volcnica, rgimen climtico dico, bien drenado. 0 38 FA 5,87 8,10 15,10 8,11 3,50 0,69 1,30 5,51 1,50 38 46 LAr 5,28 24,14 1,60 74,90 1,70 0,40 0,88 3,09 0,80 46 55 ArL 5,63 16,72 2,40 55,40 0,93 0,25 0,74 2,09 0,12

Localizacin geogrfica

Horizonte Profundidad (cm) Textura* pH * (1:1) Materia Orgnica (M.O.) (%) ** Fsforo Disponible (mg/L) (Bray II modificado ) ** Capacidad intercambio catinico (CIC) (cmol/kg de suelo) ** Ca2+ - intercambiable (cmol/kg de suelo) ** Mg2+ - intercambiable (cmol/kg de suelo) ** K+ disponible (cmol /kg de suelo) ** Boro disponible (cmol /kg de suelo) ** Acidez intercambiable (AI) (cmol /kg de suelo) **

* Corresponden a las texturas al tacto y a los pH realizados en campo. **MTODOS: Textura: Bouyoucos; A.I.: con KCI; Fsforo disponible: Bray II; MO: Walkley - Black; CIC y bases intercambiables (Ca2+, Mg2+, K+): Acetato de amonio 1 normal y neutro; Boro disponible: agua caliente.

Extraccin de la ETU del suelo Los ensayos se realizaron con suelo ndico hmedo, ya que este tipo de suelos en condiciones de sequedad puede producir cambios importantes en las propiedades de los suelos, hasta el punto de dificultar la extraccin debido a la retraccin que sufren los suelos por la presencia de las estructuras alfanas e imogolita [11,12].

Para la determinacin del porcentaje de recuperacin se emplearon 1,5 g de suelo ndico, a los cuales previamente se le agreg ETU a tres niveles de concentraciones (79,7, 246,1 y 522,2 mg/L), realizndose la extraccin con el procedimiento descrito en la Figura 1. Anlisis Cromatogrfico Las condiciones cromatogrficas para el anlisis de la ETU en los suelos se encuentran resumidas

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en la tabla 2. La idoneidad del sistema se evalu mediante la determinacin de los parmetros: factor de capacidad, resolucin, factor de separacin y asimetra.

Resultados y Discusin
Suelo El suelo estudiado presenta propiedades qumicas tpicas de los Andisoles, correspondientes de la cuenca de la quebrada La Marinilla en general del Oriente Antioqueo [13,14]. Es un suelo fuertemente cido en la superficie hasta moderadamente cido en la profundidad con alto contenido de materia orgnica, pobre en bases intercambiables y presenta disminucin del fsforo disponible a medida que se incrementa la profundidad del perfil. La capacidad de intercambio catinica efectiva (CICE) es alta, lo que indica, junto con el pH, que su carga variable es de alta densidad. De acuerdo a lo anterior, se trata de un suelo con bajo nivel de fertilidad que proporciona bajo contenido de macro y micronutrientes en las plantas y que podra presentar toxicidades por aluminio, hierro y manganeso, de acuerdo a la caracterizacin qumica y fertilidad de Andisoles del Oriente Antioqueo [15]. El suelo estudiado cumple los conceptos centrales de la clasificacin taxonmica norteamericana [16] y ha sido clasificado como: Acrudoxic Fulvudand medial arcilloso mezclado, isomsico. Validacin Se realizaron curvas de calibracin a dos rangos de concentracin, una entre 0,015 y 1,0 mg/L (Figura 2) y otra entre 0,2 y 15,0 mg/L (Figura 3), cuyos datos se analizaron con el programa Statgraphics versin 5.6 plus, mostrando que existe una fuerte relacin entre la concentracin y su respuesta medida como rea (coeficientes de correlacin de 0,999). La ETU se cuantific a una longitud de onda de 232 nm y el tiempo de retencin de la ETU fue 4,7 minutos (Figura 4). Cada una de las muestras se inyect por duplicado y en algunas ocasiones hasta por triplicado, para lograr una mayor reproducibilidad y confiabilidad en el dato obtenido. En la tabla 3 se observan los parmetros de linealidad, precisin, repetibilidad, reproducibilidad y exactitud, los cuales cumplen con los criterios de

1,5g de suelo hmedo

Se agreg 20mL de agua milliQ a pH de 10,5 en un tubo Falcn

Se agit por 2 min a 1600 rpm en el vrtex

Bao Mara a 70C durante 8 min

Bao de ultrasonido por 13 min a 70C

Centrifugar la muestra durante 10 min a una velocidad de 2700rpm

Separar el sobrenadante y realizar una segunda extraccin

Figura 1 Extraccin de la ETU en suelo Tabla 2 Condiciones cromatogrficas para la determinacin de ETU en suelo
Parmetros instrumentales Longitud de onda (nm) Temperatura C Volumen de Inyeccin (ml) Columna Fase Mvil Flujo (ml/min) Tiempo de Corrido (min) Metodologa Analtica 232 25 20 Zorbax C18 250mm x 4,6 mm I.D, 5m Agua Acetonitrilo (98:2) 0,9 7

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aceptacin postulados para la validacin de mtodos analticos por CL de Quattochi [17]. Las curvas de calibracin exhiben un amplio rango de linealidad lo que permite analizar las muestras sin muchas restricciones en la concentracin de la muestra extrada. La repetibilidad y reproducibilidad es buena, menos del 5% de coeficiente de variacin, y el modelo exhibe un amplio rango de linealidad, Extraccin de la ETU enbuen nivel de lo que permite un Suelo. Figura 1 sensibilidad para la deteccin de concentraciones Figura 3 Curva de Calibracin de la ETU (0,2-15 bajas de la ETU. Figura 3 Curva de Calibracin de la ETU (0,2-15 mg/L). mg/L)
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 y = 205,132x - 16,684 R2 = 0,999 Area 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Concentraciones (ppm )

250

200

y = 200,919x - 3,374 R2 = 0,999

150 Area

100

50

0 0 0,2 0,4 0,6 Concentracin (ppm ) 0,8 1 1,2

Figura 2 Curva de calibracin de la ETU (0,015 1 mg/L).

Figura 2 Curva de calibracin de la ETU (0,015 1 mg/L) Tabla 3 Validacin del mtodo analtico
Parmetro Procesamiento estadstico

De acuerdo al lmite de cuantificacin del mtodo (1,5 g/L) se pueden analizar muestras con muy baja concentracin, y no se requerira para estas muestras realizar grandes preconcentraciones de la muestra. Las muestras de suelos que se usaron para la determinacin del porcentaje de recuperacin, no presentaron concentracin de ETU (por debajo del lmite de deteccin) durante los tres meses de muestreo, y por lo tanto, la recuperacin que se realizar en el procedimiento era debido al que se agregar a la muestra de suelo.

Figura 4 Cromatograma del anlisis de la ETU a diferentes concentraciones.

Resultados r2= 0,999 r = 0,999 CVf= 10,106% texp = 179,672 ttab = 2,313 texp = 1,939 ttab = 2,313

Criterios de aceptacin

Coeficiente de correlacin y determinacin Test de Linealidad Test de proporcionalidad Ecuacin de regresin PRECISIN Repetibilidad y Reproducibilidad EXACTITUD SENSIBILIDAD %CVrepet %CVreprod t de Student Limite de Deteccin ( LD) 0,00046mg/L

r2= 0,98 r = 0,99 CVf = 16% texp > ttab texp < ttab

LINEALIDAD

rea = 205,132 * Concentracin 16,684 Conc. baja 1,009 0,587 Conc. media 0,594 1,727 texp = 1,727 ttab = 1,739 Conc. alta 1,435 0,445

%CV < 5 texp< ttab

Limite de Cuantificacin (LC) 0,0015mg/L

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mAU 400 350 300 250 200 150

Estndar de 15ppm

Estndar de 10ppm

Estndar de 5ppm
100 50 0

el mayor porcentaje de recuperacin se obtuvo dejndolo 2 minutos. Tanto con el bao mara y como con el bao ultrasonido, el porcentaje de extraccin aument al elevar la temperatura hasta 70C debido a que la solubilidad del analito se incrementa proporcionalmente con el aumento de la temperatura.
min

Figura 4 Cromatograma del anlisis de la ETU a diferentes concentraciones. El volumen de solucin extractora (tabla 4) con el que se alcanz los mejores porcentajes de recuperacin fue con 40 mL (93, 92 y 92% para cada nivel de concentracin). El tiempo de la homogenizacin de la matriz en el solvente con el fin de extraer el analito,

El mayor porcentaje de recuperacin (90%) en la extraccin de la ETU ocurri a pH 10,5, lo cual se debe a que la ETU cuando no tiene protonados los nitrgenos es ms soluble a pH bsico. Sin embargo, a pHs muy altos, por arriba de 12,0, se dificulta la extraccin por la solubilizacin de los cidos hmicos y flvicos que contiene el suelo, los cuales le dan una coloracin vino tinto al solvente, que permaneca a pesar de filtrar la muestra, y que no es conveniente inyectarla al cromatgrafo para no deteriorar la columna o ensuciar el detector.

Tabla 4 Porcentajes de recuperacin con diferentes volmenes de extraccin

Volumen de extraccin Concentracin de la ETU 79,78 25 mL 280,43 552,66 79,78 30 mL 280,43 552,66 79,78 40 mL 280,43 552,66 79,78 50 mL 280,43 552,66 % de recuperacin 54,30 66,58 78,10 76,24 82,56 82,59 93,86 92,98 92,93 75,02 83,25 85,63 Coeficiente de variacin 2.76 1,18 2,28 0,48 1,77 4,27 1,22 2,46 0,63 1,93 3,74 1,17

Conclusiones
El suelo estudiado es un Acrudoxic Fulvudand medial arcilloso mezclado, isomsico, que se encuentra cultivado con tomate chonto bajo invernadero.

El mtodo validado tuvo un lmite de cuantificacin de 1,5 g/L, que es muy bajo, apropiado para determinar la residualidad de plaguicidas en suelos ndicos, no reportados previamente.

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El mtodo presenta un amplio rango de linealidad que permite la cuantificacin de la ETU en un amplio rango de concentraciones. La metodologa de extraccin permite altos porcentajes de recuperacin disminuyendo los efectos de matriz. La buena repetibilidad y reproducibilidad obtenida con el mtodo, garantiza la precisin, permitiendo la aplicabilidad de la tcnica para el anlisis de la ETU por mtodos cromatogrficos.

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