DETERMINACION DE ACETAMINOFEN EN UN JARABE POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)

Escobar C., 0747075; Giraldo C., 0740526 Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Departamento de Qumica, Tecnologa Qumica, Universidad del Valle, Cali, Colombia 2 de Mayo de 2010 RESUMEN La prctica realizada consisti en la determinacin por cromatografa (HPLC) del contenido de acetaminofen en un jarabe. Para ello se utilizo una solucin stock de 400 ppm de acetaminofen preparada por disolucin del reactivo grado analtico, de esta se tomaron alcuotas que posteriormente fueron disueltas quedando estas con concentraciones de 20, 40, 60 y 80 ppm. A estas soluciones se les determino el contenido de acetaminofen por cromatografa obteniendo picos de concentracin de acetaminofen (reas bajo la curva), con estas se realizo una curva de calibracin y por interpolacin de la seal obtenida para la muestra problema se determina la concentracin de esta, luego por clculos de dilucin obtenemos la concentracin de acetaminofen en el jarabe siendo esta de 23014.62530.0032 ppm para la primera muestra y 16894.21530.0032 ppm para la segunda. Como fase mvil para la cromatografa fue utilizada una solucin 50:50 de agua-metanol.

CLCULOS Y RESULTADOS A partir de acetaminofen grado analtico se preparo una solucin estndar para posteriormente diluirla y construir la curva de calibracin   

Con los datos anteriores se realizo una grafica para por extrapolacin determinar la concentracin de la muestra problema
12000 9000 rea [mAU *s] 6000 3000 0 0.0 20.0 40.0 60.0 Acetaminofen (ppm) 80.0 100.0

Luego se tomaron alcuotas que fueron diluidas para preparar estndares a los cuales se les determino el contenido de acetaminofen por HPLC, obteniendo los siguientes resultados [ ] ppm rea mAU *s (0.005) (0.0001) 20 2914.5347 40 5535.6421 60 8481.2998 80 1.00529 x 104
Tabla 1. Datos de [ ] y rea bajo la curva

Grafica 1. Curva de calibracin para el acetaminofen

Por mtodo de mnimos cuadrados se determino la siguiente ecuacin de la recta   

Concentracin de acetaminofen en el jarabe Muestra 1 2 rea mAU *s (0.0001) 6262.4419 4771.4639

los porcentajes de error, para as tener una medida de que tan errnea se realizo la prctica.  

Tabla 2. reas obtenidas para las muestras problema

  El error para el segundo seria  

 

Con los datos obtenidos de rea bajo la curva para las muestras problemas obtenemos la concentracin de acetaminofen en las disoluciones, luego multiplican las concentraciones obtenidas por el factor de dilucin y as hallamos la concentracin de acetaminofen en el jarabe original    

Como podemos inferir de los porcentajes de error la prctica no fue llevada a cabo de la mejor manera. DISCUSIN La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones, lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. En la prctica se llev a cabo la determinacin del contenido de

  Ahora utilizamos el factor de dilucin         Realizando el mismo calculo para la segunda absorbancia obtenida  Podemos observar que ninguna de estas concentraciones se asemeja a la real del producto, ahora calcularemos  

acetaminofen en una muestra de jarabe por medio de la cromatografa liquida de alta resolucin, para la preparacin de esa muestra se utilizo un jarabe con una concentracin 30000 ppm del cual debimos tomar una alcuota de 0.5 mL para diluirla 10 mL y as obtener una concentracin 1500 ppm; de esta se tomo una alcuota 1.0 mL y se diluyo 25 mL para as obtener una concentracin final de 60 ppm de acetaminofen. Los errores en los resultados se deben principalmente al mal uso que se le puede dar las pipetas, a la dificulta que se tenga en el manejo de la muestra, para que a la hora de diluirla muestra tomada sean las muestras exactas las que se necesita y no ms ni menos porque al final las diferencias se notaron en los resultados obtenidos por arrojaron resultados muy diferentes entre s; llevando as a distintos resultados en cuanto a la concentracin real del acetaminofen, de lo cual podramos inferir que el anlisis realizado fue muy mal manejado. La cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de separacin ms ampliamente utilizada, esto se debe a su alta sensibilidad, y sus determinaciones cuantitativas exactas, su capacidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, salud, medioambiente. Algunos ejemplos de estas sustancias incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibiticos esteroides, especies organometlicas y una cierta variedad

de sustancias inorgnicas(I), por lo cual es ampliamente usada en el control de calidad de medicamentos y en determinacin de ingredientes activos en productos farmacuticos. Para la determinacin de acetaminofen llevada a cabo se tiene en cuenta su polaridad por lo cual, es afn a sustancias polares, razn para realizar la cromatografa de fase inversa en donde se utiliza una fase estacionaria apolar y una fase mvil polar, en nuestro caso una mezcla 50:50 de etanol-agua la cual arrastra a su paso el acetaminofen presente en la muestra, el tiempo de retencin de este depende de su afinidad con la fase mvil o la fase estacionaria, observamos un tiempo de retencin bajo (1.723 minutos aproximadamente) con lo cual comprobamos la polaridad del acetaminofen. Una representacin del equipo puede verse en la figura 1; este equipo tiene cuatro recipientes donde se recopilan los disolventes, cada recipiente posee un dispositivo para la filtracin del polvo y de las partculas solidas en suspensin de los disolventes.

Figura 1. Representacin esquemtica de un equipo de HPLC

Para que la fase mvil se desplace a travs de la columna y los dems dispositivos, los equipos emplean un sistema de bombeo. Un limitante en la precisin de las medidas es la reproducibilidad que se puede introducir la muestra en la columna. La dificultad es por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de las columnas. Los volmenes son muy pequeos (de unas pocas decimas de microlitro a tal vez 500 L). El cromatgrafo emplea un bucle de muestra (ver figura 2), ste dispositivo nos permite la eleccin de tamaos de muestra que van desde 5 a 500 L. La muestra se introduce en el bucle mediante una microjeringa que toma un volumen (en este caso 20 L) y lo traslada al cromatgrafo.

Las columnas se construyen con un tubo de acero inoxidable de dimetro interno uniforme el cual oscila entre 4 y 10 mm, tienen una longitud promedio entre 10 y 30 cm y los tamaos de partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10 m. Habitualmente las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. La columna empleada fue la de C 18, se llama de esta manera porque se compone de octadecil polisiloxano el cual es absorbido sobre el interior de la columna, este tipo de columnas se caracterizan por ser de naturaleza apolar. Las columnas C18 son las ms ampliamente utilizadas en HPLC de fase reversa, es importante distinguir entre dos formatos de fase con enlace distinto. El formato C18 de tipo monomrico incorpora enlaces de cadenas alquil C18 a un nico tomo de slice sobre la estructura del gel de slice. Las columnas de tipo monomrico C18-MS-II y la serie MS tiene una excelente reproducibilidad de sntesis, muy buena reproducibilidad lote a lote y cortos periodos de tiempo para la estabilizacin de la fase mvil. Por otro lado el formato C18 polimrico incorpora un proceso de silanizacin trifuncional por el que el grupo octadecil se une a 2 3 tomos de slice sobre la estructura del gel de slice. Esto aumenta el efecto de la silanizacin lo que proporciona una estabilidad de columna mucho mayor, particularmente en condiciones cidas de la fase

Figura 2. Representacin esquemtica de un bucle de muestra.

mvil. La capacidad de reconocimiento estrico tambin es mucho mayor que las de las columnas C18 del tipo de silanizacin mono funcional. Los solventes fueron desgacificados por filtrado a gravedad a travs de un filtro de poros muy pequeos con el objetivo de eliminar los gases disueltos y las partculas de polvo o partculas solidas en solvente

los dos mtodos porque?

recomienda y

Figura 3. Representacin esquemtica de un detector UV El ms utilizado es el UV/Vis, sobre todo el espectrofotmetro, que registra sustancias que absorben la radiacin ultravioleta o visible. Los hay muy sensibles, son relativamente independientes de las oscilaciones de temperatura y se pueden utilizar en la elucin en gradiente SOLUCIN AL CUESTIONARIO 1) Cul es la composicin columna C18 usado prctica? Explique. de la en la

R/ La cromatografa liquida de alta resolucin y cromatografa gas, cuando se pueden aplicar ambas tcnicas, la cromatografa de gas presenta la ventaja de su rapidez y sencillez de equipo y se aplica a compuestos que son voltiles en forma apreciable y trmicamente estables a temperaturas superiores, a unos cientos de grados Celsius. Por otra parte la cromatografa liquida de alta resolucin puede aplicarse a sustancias no voltiles (incluso iones inorgnicos) y a productos trmicamente inestables, lo que no es posible con la cromatografa de gas liquido. Con frecuencia los dos mtodos son complementarios. 3) Explique porque en HPLC realizar la cuantificacin con curva de calibracin es precisa mientras que cromatografa de gases es aconsejable realizada con el uso de un patrn interno R/ en cromatografa cuantitativa la mayor precisin se consigue con el uso de patrones internos debido a que se evitan las incertidumbres asociadas a la inyeccin de la muestra. En este procedimiento se introduce en cada estndar y en la muestra una cantidad exactamente medida de patrn interno y la relacin de las reas (o alturas) del analito y del patrn interno sirven como parmetro analtico.

R/ Esta pregunta se contesto en el anlisis. 2) Si usted posee una opcin de realizar un anlisis por HPLC o cromatografa de gases, cul de

Para poder aplicar este mtodo satisfactoriamente es necesario que el pico del patrn interno este bien separado de los picos de los dems componentes de la muestra; por otra parte el pico del patrn debera aparecer cerca del pico del analito. Con un patrn interno adecuado se pueden conseguir precisiones relativas mejores que el 1%. CONCLUSIONES  Es una tcnica muy til y precisa para la separacin, identificacin y cuantificacin de los componentes presentes en una muestra determinada, de especial importancia en la industria farmacutica al ser de carcter decisorio para determinar la calidad, estabilidad y tiempo de expiracin de un producto.  Es muy importante filtrar los solventes a utilizar, ya que se pueden encontrar partculas disueltas en ellos que afecten el resultado o daen el instrumento.  Es necesario tener cuidado especial con la fase mvil utilizada, la cual no puedo contener gases, que afectaran seriamente el equipo pudiendo daarlo, para su eliminacin se usa principalmente el filtrado al vacio.  Es posible la utilizacin de distintos tipos de detectores, siendo los ms

comunes el UV-Vis y el infrarrojo, la utilizacin du un tipo de detector en especial depende del analito.  En una tcnica con tan buenos limites de deteccin es de especial importancia la destreza del analista, ya aunque obtuvimos resultados muy por debajo de lo esperado, es posible obtenerlos sobrepasando los valores reales, para lo cual unos cuantos microlitros de mas bastara para dar valores errneos. BIBLIOGRAFIA I. SKOOG, HOLLER. LEARY. Principios de Anlisis instrumental. 5ed. Madrid: McGraw Hill, 1994. 730-794 pp. SKOOG, WEST. DOUGLAS. Qumica Analtica 4ed. Madrid: McGraw Hill, 1990. 527-561 pp. AIRES, H. GILBERT. Anlisis Qumica Cuantitativo 2ed. Madrid Castillo pg. 180-187 MILLER, J. N. and MILLER J. Estadstica Qumica Analtica 2ed. Addison-Wesley Iberoamericana; pg. 87- 100. http://www.scribd.com/doc/17065477/ HPLC-Aplicaciones-en-compuestosorganicos (28/04/2010).

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