FAGOCITOSIS 1. Recoger clulas en crecimiento exponencial en HL5 y resuspender en una concentracin de 2millones por ml en un volumen total de 10ml. 2.

Del volumen total recoger 100ul centrifugar 10segundos a 14.000 rpm, retirar el sobrenadante y congelar el pellet. 3. Dejar que los 10ml de clulas a una concentracin de 2millones/ml se recuperen durante 15 minutos en agitacin. 4. Aadir 100ul de FITC-labeled latex beads suspensin e incubar en agitacin, el ratio es 200:1 en relacin a clulas de dicty y beads. 5. Recoger rpidamente el tiempo 0, 1ml que se aade a un falcon de 15ml que contiene 2ml de buffer Sorensen fro que rpidamente para la reaccin. Seguir recogiendo a tiempos 15,30,45,60. 6. Las muestras pueden permanecer en hielo y procesarlas al final todas juntas. 7. Aadir a cada tubo PEG 10ml y centrifugar 800g-10min,4. 8. Lavar dos veces con buffer Sorensen 9. Resuspender 1ml de pellet en buffer de lisis y medir en el fluormetro(470 excitation, 515 emission). 10. Corregir con el tiempo 0 y la cantidad de protena. 11. Nota: si empezamos con 10ml nos sobran 5ml, as que dado que el producto es caro ajustar para que no sobre, se puede hacer con una concetracin mayor de clulas, menor de volumen y por lo tanto ahorro del producto Cuidado con el PEG, coger uno que sea bastante denso para as poder separar las beads que no captan las clulas sin problemas y que no queden en el pellet y nos fastidien el experimento. Los componentes de los buffer de lisis, Sorensen etc vienen detallados en el libro: Dictyostelium discoideum protocols.