RESUMEN

El cultivo a gran escala de microalgas y el uso prctico de su biomasa como una fuente de ciertos constituyentes, ha sido muy importante. Un ejemplo de ello fue el uso del alga verde Chlorella vulgaris que puede ser utilizada como suplemento alimenticio, para la acuacultura; purificador de aguas residuales en biorremediacin, entre otras. Dadas las propiedades atribuidas a esta microalga, el presente trabajo tuvo como objetivo identificar el medio en el que Chlorella vulgaris crece con mayor rapidez, as como elaborar un producto comestible a partir de su biomasa y encapsularla. Se evaluaron tres diferentes medios de cultivo en laboratorio para el alga: Basal de Bold (BBM), Chu No. 10 y Solucin Nutritiva Knop, obteniendo como resultado un mayor crecimiento en el medio de cultivo Bolds Basal con una velocidad de crecimiento de 0.541 divisiones por da, esto debido a la cantidad de nutrientes que posee. Para verificar el contenido nutricional de Chlorella y realizar el producto comestible se realizaron pruebas para identificar vitamina C, monosacridos y protenas, las cuales resultaron positivas, por lo que es una buena opcin como suplemento alimenticio de consumo humano. Para encapsularla y elaborar un producto comestible a partir de su biomasa, se consider un anlisis bacteriolgico y la importancia de la esterilizacin del alga antes de encapsular o elaborar el producto, que en este caso fue una alegria de Chlorella.

CULTIVO Y ELABORACIN DE UN PRODUCTO COMESTIBLE DE Chlorella vulgaris.

MARCO TERICO

El reino protista tambin se conoce con el nombre de Protoctista. En l se encuentran los organismos unicelulares eucariontes y varios grupos de individuos en los que se observa una tendencia a la pluricelularidad, pero que no poseen verdaderos tejidos. Los protoctistas comprenden los organismos tradicionalmente llamados protozoos, as como todas las algas. El trmino alga es una denominacin vulgar que incluye los eucariotas fotoauttrofos que no son plantas ni cianobacterias. Las algas unicelulares representan un porcentaje muy notable del fitoplancton de los ocanos y aguas dulces, que es donde se lleva a cabo no menos del 50% del total de la fotosntesis que se realiza en nuestro planeta. Son muy importantes especialmente las diatomeas, dinoflagelados y clorofitas unicelulares porque son los principales productores de alimentos del ecosistema marino, que es donde se encuentra la principal reserva de alimentos y fuente renovadora del oxgeno de la atmsfera terrestre (Gama, 2004). El cultivo a gran escala de microalgas y el uso prctico de su biomasa como una fuente de ciertos constituyentes (por instancia lpidos) fue probablemente considerado en Alemania durante la Segunda Guerra Mundial. Las investigaciones inciales fueron realizadas por un grupo de cientficos de Carnegie Institute Washington, cuyo objetivo principal fue el uso del alga verde Chlorella como productor de alimento a gran escala (Becker, 1995). Antecedentes Chlorella apareci en la Tierra hace aproximadamente 1.5 o 2 mil millones de aos. Es un alga verde unicelular de agua dulce; de forma esfrica, cerca de 2-10 micras de dimetro que es extensamente encontrada en lagos y pantanos por todo el mundo. El nombre Chlorella proviene del griego Chloros, que significa verde, y del latn ella, que significa cosa pequea, y fue descubierta y nombrada por el holands M.W. Beyerinck en 1890.

Comparada con otras plantas, Chlorella tiene una alta concentracin de clorofila, as que su capacidad de fotosntesis es muchas veces mayor que la de otras plantas. Chlorella vulgaris puede dividirse en cuatro clulas cada 20 horas (Kanno y Kazie, 2005). En el curso del tiempo, el uso continuo del alga bajo condiciones controladas ha sido importante, con diversas posibilidades econmicas. La investigacin con la microalga ha demostrado que la biomasa puede ser usada para aplicaciones, como son: alimento para animales, biofertilizantes, condicionador del suelo, alimento de los acuarios o puede ayudar a resolver problemas de salud pblica, por medio de la purificacin biolgica de las aguas negras de las ciudades. Chlorella est siendo investigada como un nuevo recurso alimenticio (ya que una clula de Chlorella contiene cerca de 50% de protenas, 5% de clorofila y un gran nmero de vitaminas y carotenos) para utilizarse en las poblaciones humanas pobres de todo el mundo y para proveer comida y oxgeno en viajes al espacio y en submarinos (Lee, 1995). Segn se ha documentado, posee beneficios teraputicos, como la capacidad de desintoxicar al organismo de metales pesados como el Hg, el Cd y el Pb entre otros qumicos, que son contaminantes agregados a insecticidas o plsticos. Adems se piensa que posee la capacidad de prevenir el cncer (Konishi et al., 1996). En la tabla 1 se muestra la composicin qumica total de diferentes algas y de algunos alimentos humanos (Becker et al., 1995). Producto Leche Huevo de gallina Soya Arroz Pan Carne Chlorella vulgaris Chlorella pyrenoidosa Spirulina mxima Spirulina platensis Scenedesmus dimophus Protenas Carbohidratos 26 47 37 8 39 43 51-58 57 60-71 46-63 50-56 38 4 30 77 38 1 12-17 26 13-16 8-14 8-18 Lpidos 28 41 20 2 1 1 14-22 2 6-7 4-9 16-40 cidos nuclicos 4-5 3-4.5 2-5 -

Tabla 1. Composicin qumica total de algunos alimentos humanos

y diferentes algas (% de materia seca)

Como en las plantas superiores, la composicin qumica de las algas no es un factor constante. Muchos factores ambientales influencian la proporcin de los diferentes constituyentes de la biomasa de las algas. Taxonoma de Chlorella vulgaris
Reino: Protoctista Divisin: Chlorophyta Clase Chlorophyceae Orden: Chlorococcales Familia: Oocystaceae Gnero: Chlorella Especie: vulgaris

Las investigaciones sobre el cultivo de microalgas revisten gran importancia dada su amplia aplicacin biotecnolgica y comercial. En tal sentido, se han utilizado los cultivos discontinuos por su relativo fcil manejo, para determinar la cintica de crecimiento y los parmetros que influyen en el desarrollo poblacional de las microalgas (Abalde et al.1995). Sin embargo, el uso de los medios de cultivo sintticos ha incrementado sustancialmente el valor econmico para la produccin de la biomasa de estos microorganismos (Gonzlez et al. , 1999). Medios de Cultivo Un cultivo puede ser definido como un ambiente artificial en el que las algas crecen. En teora las condiciones del cultivo deben semejarse al ambiente natural del alga; en la realidad existen diferencias significativas. La imposicin de un ambiente artificial en una poblacin celular que sobrevivi anteriormente bajo condiciones complejas y fluctuantes, siguiendo un ciclo de vida estacional, causa inevitablemente un periodo de adaptacin fisiolgica o de seleccin, en el que el crecimiento de la poblacin puede no ocurrir o es muy lento.

Parmetros del cultivo Un cultivo tiene tres diferentes componentes: un medio de cultivo contenido en un recipiente adecuado; las algas creciendo en el medio y aire, para permitir el intercambio de dixido de carbono entre el medio y la atmsfera. Los parmetros ms importantes que regulan el crecimiento de las algas son, cantidad y calidad de nutrientes, luz, pH, turbulencia, salinidad y temperatura (Barsanti et al., 2006). Nutrientes
Requerimentos Compuestos qumicos Valores CO 2, CO 3 g/100 ml C g/100 ml O 2, H 2 O O, H N2, NH4, NO 3 g/100 ml N g/100 ml PO4 P SO4 g/100 ml S Sales g/100 ml Na, K, Ca, Mg Sales mg/100 ml Fe, Zn, Mn, B, Br, Si Sales g/100 ml Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Al, et B12, Tiamina y Biotina g/100 ml Vitaminas Tabla 2. Requerimientos principales de cultivos de microalgas

Temperatura La mayora de la especies de microalgas toleran temperaturas entre 16 y 27C, aunque esto puede variar de acuerdo a la composicin del medio de cultivo o la especie cultivada. Un valor intermedio de 18-20C es frecuentemente empleado. Temperaturas por debajo de los 16C pueden retardar el crecimiento, mientras que aquellas por arriba de los 35C son letales para cierto nmero de especies. Luz Como en las plantas, la luz es la fuente de energa que promueve las reacciones fotosintticas en las algas. Aqu, la intensidad, la calidad espectral y el fotoperiodo deben ser considerados. pH El rango del pH para la mayora de las especies de algas cultivadas es entre 7 y 9, siendo el rango ptimo 8.2-8.7. Para mantener un pH aceptable es necesario airear el medio de cultivo.

Aireacin La aireacin es necesaria para prevenir la sedimentacin de las algas, para asegurar que todas las clulas de la poblacin estn igualmente expuestas a la luz y los nutrientes, y para mejorar el intercambio de gases entre el medio de cultivo y el aire. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El crecimiento de los problemas al que se enfrenta la humanidad es proporcional al crecimiento poblacional. El dficit energtico, de alimentos, de agua, de terreno habitable y productivo y de medicamentos entre otros, aumenta de manera tal, que se hace imprescindible la bsqueda de nuevas fuentes de recursos, que permitan disponer de materia prima para el constante desarrollo y preservar la existencia de los seres vivos. Entre las posibilidades mundialmente reconocidas como fuente de diferentes productos de gran utilidad est la utilizacin de microorganismos, y en particular, las microalgas, como una opcin proteica con balance adecuado de aminocidos, vitaminas y minerales, y como fuente de colorantes, viscosantes, combustibles, medicamentos, edulcorantes, aditivos alimenticios y de materia prima para la fabricacin de cosmticos y frmacos. En el caso de Chlorella vulgaris, una especie con un alto rango fotosinttico, puede fijar grandes cantidades de CO2, gas que por sus altas concentraciones en la atmsfera est ocasionando lo que conocemos como efecto invernadero. Debido a su alto contenido de protenas, vitaminas, minerales, fibras dietticas, componentes antioxidantes y a sus componentes desintoxicadores, se ha empleado como suplemento alimenticio y tambin se emplea en el tratamiento de aguas residuales. Dadas las propiedades atribuidas a esta microalga, se pretende cultivar, bajo condiciones de laboratorio, en distintos medios para determinar su ptimo crecimiento, elaborar un producto comestible a partir de su biomasa y encapsularla. OBJETIVO GENERAL Identificar en qu medio de cultivo crece con mayor rapidez la microalga Chlorella vulgaris. Elaborar un producto comestible a partir de la biomasa de Chlorella vulgaris.

OBJETIVOS ESPECFICOS Cultivar Chlorella vulgaris bajo condiciones de laboratorio. Determinar la tasa de crecimiento de Chlorella vulgaris en diferentes medios de cultivo. Resaltar la importancia biolgica de Chlorella vulgaris como suplemento alimenticio. Identificar el contenido nutrimental de la microalga Chlorella vulgaris. Deshidratar y encapsular a Chlorella vulgaris para consumo humano. Elaborar un producto comestible con Chlorella vulgaris.

DESARROLLO 1. Preparacin de medios de cultivo. Medio Basal de Bold (BBM) Se pesaron las siguientes cantidades de reactivos para cada medio.
Componente Por litro 175 mg 25 mg 75 mg 250 mg 75 mg 25 mg 11.42 mg 1 ml 1 ml 1 ml

Solucin de microelementos Solucin 1 Solucin 2

KH2PO4 CaCl2 MgSO4 NaNO3 K2HPO4 NaCl H3BO3

Solucin de Microelementos
Componente

ZnSO4 MnCl2 MoO3 CuSO4 Co(NO3) 2

g/litro 8.82 1.44 0.71 1.57 0.49

Solucin 1
Componente Na2EDTA KOH g/litro 50 3.1

Solucin 2
Componente FeSO4 H2 SO4 (Conc.) Por litro 4.98 g 1 ml

Medio Chu No. 10

Componente Ca(NO3) 2 K2HPO4 Na2CO3 MgSO4 Na2SiO3 Citrato de Fierro Amoniacal Gramos/litro 0.04 0.01 0.02 0.025 0.025 0.005

Solucin Nutritiva Knop

Componente KNO3 Ca (NO 3) 2 KH2PO4 MgSO4 Citrato de Fierro Amoniacal Gramos/litro 0,2 0,8 0,2 0,2 0,1

2. Cultivos Se proporcionaron las condiciones adecuadas para el establecimiento del cultivo de una cepa de Chlorella vulgaris en los laboratorios LACE de la Escuela Nacional Preparatoria No. 2. Para ello se coloc cada medio de cultivo en un recipiente transparente con capacidad de 2 litros y se le aadieron 5 ml de la microalga respectivamente. Se les coloc una bomba de aire para evitar la sedimentacin de las algas y permitir la homogenizacin de los nutrientes. Despus se midi la temperatura y pH de cada medio con ayuda de un potencimetro y se colocaron de tal manera que pudieran recibir luz natural.
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3. Conteo de Clulas Se tom una gota de cada medio de cultivo y se evalu la densidad celular (clulas/ml), siguiendo el mtodo del hemocitmetro, utilizando una cmara de Neubauer.

Despus de 21 das se realiz un segundo conteo para determinar el crecimiento de Chlorella Vulgaris en cada medio y se determinaron los parmetros poblacionales segn las frmulas siguientes:

Cf ln Ci K= tf ti
Donde: K = velocidad de crecimiento (nmero de divisiones por da) TD = Tiempo de duplicacin Ci = concentracin inicial del cultivo Cf = concentracin final del cultivo ti = tiempo inicial tf = tiempo final Despus de 7 das se realiz un tercer conteo. 4. Deshidratacin

TD =

ln 2 K

Se dej sedimentar el cultivo de la microalga hasta observar la total separacin de las fases lquida y slida. La biomasa se separ del lquido sobrenadante por decantacin y se lavaron las clulas con agua destilada, utilizando un embudo de separacin. A continuacin se colocaron en un recipiente de vidrio con una lmpara de 100 W hasta que se deshidrat. Posteriormente se ray para obtener un polvo verde y se guard en un recipiente de vidrio con tapa. 5. Identificacin de Vitamina C Se agregaron 30 ml del medio a un tubo de ensayo, despus se aadi 1 gota de fenolftalena y se titul con NaOH [0.5 M] hasta que la solucin, conteniendo al cido ascrbico, se neutraliz.
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6. Identificacin de monosacridos Se colocaron 5 ml del medio en un tubo de ensayo y se le agregaron 5 gotas de la solucin de Fehling A (solucin de cobre) y a continuacin se le adicionaron 5 gotas de la solucin de Fehling B (solucin alcalina tartrato). Posteriormente se calent con una lmpara de alcohol hasta observar la presencia de un precipitado de color rojo (xido de cobre reducido).

7. Identificacin de protenas. Se prepar una solucin de 10 mg/mL de ovoalbmina. En 4 tubos de ensayo se prepararon las soluciones de la siguiente tabla.
Tubo Blanco 1 2 3 Cf 0 mg/ml 2 mg/ml 5 mg/ml 10 mg/ml Vi 0 ml 0.2 ml 0.2 ml 1 ml Agua 1 ml 0.8 ml 0.5 ml 0 ml Vf 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Donde: Cf = concentracin final Vi = volumen inicial Vf = volumen final Adems se prepar un tubo con 1 ml de la solucin problema (Chlorella vulgaris previamente deshidratada y molida). Se les coloc 2 ml de reactivo de Biuret a cada tubo, se agit y se dejaron reposar por 20 min. Transcurrido ese tiempo, se ley la absorbancia de cada solucin a 570 nm. Con los resultados obtenidos se elabor una grfica y se interpol la absorbancia de la protena problema para calcular su concentracin. 8. Anlisis Bacteriolgico a) Preparacin de medio de cultivo:
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Se disolvieron 7.5g del medio deshidratado (agar) en un matraz con agua destilada. Se esteriliz el medio de cultivo en la autoclave a 121 C durante 20 min. Con ayuda de la campana de flujo laminar, se vaci, dentro de cajas petri, los medios de cultivo y se rotul con la fecha y tipo de medio. b) Inoculacin del alga Con ayuda de la campana de flujo laminar se inocul cada placa de agar, con la biomasa de Chlorella vulgaris, utilizando la tcnica de siembra por estra. c) Tincin Gram Se colocaron dos gotas de agua destilada en el extremo de un portaobjetos, se disolvi en ella una muestra de una colonia representativa de una placa. Se tom una muestra con asa bacteriolgica, se prepar el frotis y se fij a la flama. Se cubri la preparacin con cristal violeta durante 10 min. Se escurri el colorante y se lav el frotis con agua corriente o destilada. Se cubri con lugol y se lav nuevamente. Se decolor con alcohol etlico, procurando no lavar todo el colorante. Se cubri el frotis con la solucin de fucsina por 30 segundos. Se escurri el colorante y se lav una vez ms. Se dej secar la preparacin y se examin al microscopio a 100X. Si las preparaciones se tornan violetas son Gram positivas y si se tien de rojo son Gram negativas. 9. Esterilizacin de la biomasa de Chlorella vulgaris Se coloc la biomasa de Chlorella vulagris en un matraz erlenmeyer tapado, se introdujo en la autoclave a 120C durante 20 minutos. Transcurrido este tiempo se sac y se realiz la prueba bacteriolgica una vez ms. 10. Encapsulado de la biomasa de Chlorella vulgaris El encapsulado se llev a cabo en la campana de flujo laminar, en donde se introdujeron 250 mg de Chlorella vulgaris deshidratada y esterilizada en cpsulas estriles de gelatina dura. 11. Elaboracin de producto comestible a base de Chlorella vulgaris Con amaranto y miel se elaboraron piezas de alegras. En un recipiente se pusieron capas alternadas de amaranto y miel, se dejaron secar por 24 horas hasta que tomaran una consistencia estable. Despus se espolvore un poco de alga esterilizada sobre las piezas de amaranto.

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RESULTADOS 1. Tras el segundo conteo se obtuvieron los siguientes resultados.

Velocidad de crecimiento
2.5 2 1.5 1 0.5 0 Semana 1 S emana 2 Semana 3 Solucin Nutritiva Knop Bold's Basal Chu No. 10

Velocidad de crecimiento (divisiones/da) Semana Solucin Bolds Basal Chu No. 10 Nutritiva Knop 1 0.44058784 0.541571023 1.983658166 2 0.88117568 1.083142046 0.000005589 3 1.32176352 1.624713069 0 Tabla 3. Velocidad de crecimiento

Grfica 1. Velocidad de crecimiento (divisiones/da)

300000 250000 200000 150000 100000 50000 0

Tiempo de Duplicacin
Solucin Nutritiva Knop Bold's Basal Chu No. 10 S emana 1 Semana 2 S emana 3

Tiempo de duplicacin (clulas/da) Solucin Semana Nutritiva Bolds Basal Chu No. 10 Knop 1 55087.84686 67714.03765 248021.9547 2 110302.1818 135428.0753 124010.978 3 165263.5406 203142.1129 0 12 Tabla 4. Tiempo de duplicacin

Grfica 2. Tiempo de duplicacin (clulas por da)

2. La identificacin de cido ascrbico (vitamina C) result positiva, ya que al agregar el indicador fenolftalena a la muestra, sta no cambi de color, sino hasta que se neutraliz con hidrxido de sodio y se calcul una concentracin de [0.001 M] de vitamina C. 3. La prueba de identificacin de monosacridos tambin result positiva. Al aadir las soluciones de Fehling (A y B) a la muestra, stas reaccionaron con los azcares reductores, y cambi de color azul (sulfato de cobre II) a color rojo (xido de cobre), con lo que comprobamos la existencia de carbohidratos en Chlorella vulgaris. 4. En la prueba de identificacin de protenas en Chlorella vulgaris se obtuvo una concentracin de 0.06% de protenas en un litro de solucin.

5. El anlisis bacteriolgico result gram positivo en la primera siembra y despus de la esterilizacin no se present crecimiento de ninguna bacteria. 6. Como resultado del encapsulado se obtuvieron cpsulas de gelatina dura, de 250 mg cada una, de Chlorella
vulgaris deshidratada, parte de este material se utiliz para la elaboracin de la alegra, la cual se mezcl con 250 mg de la biomasa.

ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS

1. Se obtuvo un mayor crecimiento en el medio de cultivo Bolds Basal debido a la cantidad de nutrientes que posee. A pesar de ello no se logr obtener una divisin completa al da y las clulas tardaron en duplicarse casi 9 das. Esto puede deberse a que siguen adaptndose a las condiciones de laboratorio.
Se observ un buen crecimiento en la solucin nutritiva Knop, cuya cantidad de nutrientes es mucho menor que la del medio Bolds Basal. Su tiempo de duplicacin fue de 11 das y tampoco se logr una divisin completa al da. 13

En el medio Chu No. 10 se observ una velocidad de crecimiento mayor pero al trmino de tres semanas no se encontr ninguna clula, probablemente porque el medio Chu No. 10 promueve un buen crecimiento en bajas concentraciones de clulas, pero puede exhibir deficiencias cuando hay una mayor densidad de clulas (Lewin, 1962).

2. La concentracin que se obtuvo en una muestra de 30 ml de vitamina C, fue de [0.001M], lo que quiere decir que la cantidad de vitamina detectada fue de 5.28 mg. Esta vitamina es muy importante por su funcin antioxidante y para la reparacin y crecimiento de tejidos en todas las partes del cuerpo humano. 3. La prueba de identificacin de monosacridos result positiva, con lo que se comprob la existencia de carbohidratos en Chlorella vulgaris, los cuales son primordiales por sus funciones estructurales y porque son la mayor fuente de energa almacenada de los seres vivos. 4. En la identificacin de protenas se obtuvo una concentracin de 0.06% de protenas en un litro de solucin. Se debe considerar que no se logr romper completamente la pared celular de Chlorella vulgaris. 5. La esterilizacin fue un xito ya que no se present el crecimiento de ninguna bacteria. Se debe considerar la desnaturalizacin de las protenas bajo el calor producido en la esterilizacin.

6. A partir del alga deshidratada se pudieron obtener productos comerciales con un gran contenido nutricional, como son las cpsulas y las alegras, siendo estas una buena propuesta para la elaboracin de un suplemento alimenticio comercial a partir de Chlorella vulgaris deshidratada y esterilizada. CONCLUSIONES El medio de cultivo en el que se present un crecimiento ms rpido fue el Basal de Bold. El cultivo de Chlorella vulgaris resulta econmico ya que no requiere de una gran cantidad de nutrimentos, su crecimiento es rpido y tiene mltiples aplicaciones.

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El estudio y la aplicacin de microalgas en suplementos alimenticios, as como su produccin en laboratorio puede llegar a ser una buena opcin para pases con escasos recursos, gracias a su contenido en protenas, vitamina C y monosacridos, que son compuestos bsicos para una buena alimentacin. Se logr el objetivo al elaborar un producto comercial apto para el consumo humano. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Gama Fuentes, Mara de los ngeles, (2004). Biologa. Biognesis y microorganismos. 2 edicin. Pearson educacin. Mxico. E. W. Becker, et al., (1995). Microalgae biotechnology and microbiology. Cambridge, Great Britain. Kanno, Toshihiro. Uyama, Kazie. (2005). Chlorella vulgaris: The Powerful Japanese Medicinal Green Algae as a Biological Response Modifier. Publicado por Woodland Publishing. 63 pginas. Lee R. E. (1995) Phycology. Cambridge, University Press, USA. Konishi, F. et al., (1996). Protective effect of an acidic glycoprotein obtained form culture of Chlorella vulgaris sp against myelo-suppression by 5-fluorouracil cancer inmunol inmunolother, 46:268-274. Abalde J., A. Cid, J. P. Fidalgo, E. Torres y C. Herrero. (1995). Microalgas: Cultivos y Aplicaciones. Universidad Da Corua. Gonzlez B., E. Buitargo y K. Frontado. (1999). Evaluacin de medios nutritivos para el crecimiento de tres microalgas marinas de uso comn en acuicultura. Barsanti, Laura y Gualtieri, Paolo. (2006). Algae. Anatomy, Biochemistry, and Biotechnology. Taylor & Francis group. 301 pginas. Lewin, Ralph A. (1962). Physiology and Biochemistry of algae. Academic Press. 929 pginas.

REFERENCIAS ELECTRNICAS

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 www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S02.htm

Consultada el 26 - Marzo -2009

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