Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Qumica Qumica Biolgica Lic.

Ciencias mencin Qumica

Laboratorio N3

Mtodos de separacin de protenas

Integrantes: lvaro Etcheverry Matas Leal. Profesora: M Cecilia Rojas

INTRODUCCIN El objetivo de este laboratorio consiste en utilizar distintos mtodos de separacin de protenas. Bsicamente existen tres tipos: Filtracin por exclusin molecular, en la cual se aprovecha los distintos tamaos y formas de las protenas para separarlos mediante cromatografa. En la cromatografa de intercambio inico, se aprovecha el hecho de cada protena interacta de distinta forma con un intercambiador inico, para as separarlas mediante una cromatografa. Finalmente est la electroforesis en geles de poliacrilamida, el cual es uno de los mtodos ms poderosos, el cual consiste en colocar la solucin con protenas en un gel de poliacrilamida al que posteriormente se le aplica un campo elctrico, de esta forma las protenas pueden ser separadas de acuerdo a sus tamaos y cargas. En el caso de este laboratorio, slo se realiz la filtracin por exclusin molecular. MTODOS El mtodo utilizado en esta sesin es el de filtracin por exclusin molecular, el consiste en colocar a la solucin de protenas en una matriz que contiene numerosas cuentas porosas. De esta forma, aquellas molculas lo suficientemente pequeas como para entrar en ellas quedan atrapadas y eluyen ms lento atravs de la columna, siendo las molculas ms grandes las que eluyen en primer lugar. Los polmeros ms usados son el dextrano, la agarosa y la poliacrilamida RESULTADOS Y ANLISIS DE DATOS En primer lugar se realiz una curva de calibracin con una solucin patrn de protenas cuya concentracin es de 10 mg/mL. Para esto se tomaron distintos volmenes del suero, se completaron 2 mL con una solucin de NaCl 0,15 M y se analiz la muestra en un espectrofotmetro, de donde se obtuvieron los datos que se muestran en la Tabla N1: Tabla N1: Absorbancias obtenidas a distintas concentraciones de protena.
Volumen de suero (mL) Cantidad de protena (mg) 2 4 6 8 10 Volumen de NaCl 0.15 M (mL) 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 Absorban cia

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.190 0.369 0.499 0.662 0.790

Con estos datos se obtuvo el siguiente grfico.

Grfico N1: Cantidad de protenas versus absorbancia Mediante una regresin lineal obtuvimos una ecuacin que nos permite calcular la cantidad de protenas presentes en una muestra al medir su absorbancia: A 0, 0541 = C protena 0, 07235 Donde A corresponde a la absorbancia. Gracias a esta ecuacin es posible calcular la cantidad de protenas que se encontraban en una muestra de cero y adems se calcul la cantidad de protenas totales, la cantidad de seroglobulinas y por diferencia la cantidad de seroalbminas, como se muestra en la Tabla N2: Tabla N2: Concentraciones de protenas en el suero
Absorban cia Suero total Seroalbm inas Seroglobul inas Cantidad de protenas (mg) 3,74 0,66 Volumen de suero (mL) 2 2 Concentracin de protenas (mg/mL) 1,87 0,33 1,54

0,333 0,103

Finalmente, para se tom una muestra de suero al que se le agreg cido actico hasta alcanzar el punto isoelctrico donde la mayor parte de la protena estaba insolubilizada. Posteriormente, se agreg una solucin de NaCl 2 M, hasta solubilizar la protena nuevamente, gastndose un total de 0,18 mL.

CUESTIONARIO 1. Por qu se utiliza sulfato de amonio para separar protenas por salazn? Debido a que el sulfato de amonio es una sal divalente, son necesarias una mayor cantidad de molculas de agua para solvatar los iones de sal presentes. De esta manera existe una menor cantidad de molculas de agua disponibles para interactuar con la protena y las interacciones protena-protena aumentan y la hacen precipitar. 2. Qu entiende por suero sanguneo y plasma? Qu protenas se encuentran en el suero sanguneo? El plasma corresponde a la fraccin lquida y desprovista de clulas de la sangre, que contiene iones, gases y protenas en solucin; dentro de las protenas que posee se encuentran las albminas, las globulinas y el fibringeno, el cual es el encargado de llevar a cabo los procesos que promueven la formacin de los cogulos. Mientras que el suero corresponde a la fraccin del plasma que queda despus de que se han eliminado los componentes relacionados con la coagulacin, es decir que slo posee las protenas albminas y globulinas. 3. Por qu es necesario agregar cido y base a la solucin de suero antes de estudiar el efecto solubilizante del cloruro de sodio? Al agregar cido estamos buscando el punto en que la protena se hace ms insoluble, es decir, el punto isoelctrico. Una vez que nos pasamos del punto isoelctrico agregamos la base para volver al pH correspondiente al punto isoelctrico, para finalmente agregar la sal y observar el efecto que sta tuvo. 4. Indique cul es la ecuacin correspondiente a la ley de Debye-Huckel. log( ) = A | Z + Z | I Donde corresponde al coeficiente inico medio, A es una constante que depende del solvente, Z corresponde a la carga de los iones, e I que corresponde a la fuerza inica, la cual corresponde a: 1 n I = ci Zi 2 2 i =1 Donde ci corresponde a la molalidad y Zi corresponde a la carga del in. DISCUSIN Y CONCLUSIONES Experimentalmente se obtuvo que la concentracin de la protena seroalbmina en el suero sanguneo es de 1,54 mg/mL. Por otro lado la concentracin de la protena seroglobulina en el suero sanguneo es de 0,33 mg/mL, con una concentracin total de 1,87 mg/mL. Las sales divalentes como el sulfato de amonio, pueden hacer precipitar por salazn, con mayor eficiencia a las protenas ya que hacen ms importantes las interacciones protena-protena. En cambio las sales monovalentes como el NaCl, estabilizan las protenas, y no la hacen precipitar, si no que lo disuelven. Aqu lo observado fue una

disminucin en la turbidez de la solucin puesto que solubilizo en cierto grado la protena. Se gastaron 0,18 ml de NaCl 2 M en solubilizar la protena. Los mltiples grupos cido-base de una protena determinan que sus propiedades de solubilidad dependan de la concentracin de las sales disueltas, de la polaridad del disolvente, del pH y de la temperatura. Ciertas protenas precipitan de su disolucin en condiciones en que otras permanecen completamente solubles. Esto fue observado en la precipitacin de protenas de suero sanguneo con Sulfato de Sodio, donde slo precipito la Seroglobulina y la Seroalbmina quedo en el sobrenadante.

REFERENCIAS Gua de trabajos prcticos Bioqumica 2011