Metablito Primrio

B Riboflavina 2
Nome: Henrique Marques de Oliveira Luciano Nobuhiro Aoyagi

(Hans-Peter Hohmann; 2010)

- INTRODUO Riboflavina foi isolada em (1879)

Lactocromo Principais fontes na dieta humana :
Leite e derivados Carne Ovos Folha verdes
Soja Ce Cereais

A. Wynter Blyth

(Souza et al; 2005)

Dose recomendada

0,4 mg (Criana)

1,3 mg (Adulto)

Estrutura Qumica Riboflavina 7,8-dimetil-10-ribitil-isoaloxazina

(Souza et al; 2005)

Anfiptica Apresenta cor amarela Fluorescente Pertencente ao complexo B2 Sensivel a luz Resistente temperaturas

Transferencia de eletrons*

- Justicativa A riboflavina fundamental no processo metablico de protenas, carboidratos e gorduras Necessria para a formao de hemcias, produo de anticorpos, respirao celular e crescimento. Alivia a fadiga ocular e importante na preveno e tratamento da catarata No produzida pelos animais

(Hans-Peter Hohmann; 2010)

Precursora de FAD e FMN

Riboflavina

FAD

FMN

Flavinas ligadas a enzimas do reparo do DNA

(Bacher et al; 2000)

- VIA BIOSINTTICA Bacteria

2 1 3 GTP ciclohidrolase II Fungo (R) (D) (D) (R) Desaminao Reduo 4

Desfosforilao 6,7-dimetil-8-ribitillumazina sintase

1- GTP
Aberto hidroliticamente liberando o ion formato e pirofosfato

2 - 5-amino-6-ribosilamino-2,4 (1H,3H)pirimidinediona 5
Clivagem hidrolitica do grupo amino reduo da cadeia lateral ribosil

5 - 5-amino-6-ribosilamino-2,4 (1H,3H) pirimidinediona 5 fosfato

Processo desconhecido

Dismutao

8 Riboflavina sintase 9 7

10 - Ribulose 5-fosfato

10

8 - 6,7 dimetil-8-ribiillumazina

9 - Riboflavina

(Hans-Peter Hohmann; 2010)

- Gentica e Regulao da via biosinttica Bacillus subtilis

Organizao em Operon

V Bacillus lichenform, Lactoccocus lactis e Corynebacterium glutamicum X Escherichia coli e outras gram -

FMN pode reprimir a produo de riboflavina

Atravs de ligao com o elemento RFN

(Vitreschak; 2002)

(D'Souza & Heitman; 2001) Elemento RFN

Ashbya gossypii
RIB1 ( GTP ciclohidrolase 1) RIB2 ( Desaminase) RIB3(3,4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintase) RIB4 ( Lumasina sinthase) RIB5 (riboflavina sintase) RIB7( Redutase).

(Hans-Peter Hohmann; 2010)

A superproduo esta ligada a produo dos ascsporos*

Estresse esporulao Riboflavina

Proteo contra raios U.V Atrao do vetor

Dysdercus nigrofasciatus

A suplentao de cAmp = Miclio em forma vegetativa

Cascata de sinalizao por cAMP

ATP cAMP

Promotor

(D'Souza & Heitman; 2001)

Via das purinas

O acumulo de ATP e GTP inibem a fosforibolamina sintase ( PRPP sintase)

PRPP sintase tambm regulada negativamente pela adenina em nivel transcricional

Bacher et al; 2000)

Suplementao com glicina

Aumenta a produo de riboflavina

- Micro-organismos produtores Riboflavina

Gnero Clostridium spp. Saccharomyces fragilis Candida spp. Algas Relatos de Guilliermondia -Clostridiumcapacidade de sntese C. acetobutylicum: CapazAspergillus niger de produzir riboflavina produo comercial varrhaggi e C. tropicalis (passado) fermentando soro de leite Protozorios C. Flareri produtos lcteos (meios Chilomonas paramecium Fontes deC. Arbrea cereais carbono complexos) (meio contendo apenas acetato+sais inorg.) C. Lactis triturados, arroz, milho, soro Aspergillus flavus C. Krusei

Bactrias Levedurasmelao e batata. de leite, C. Ghoshi Fungos C. chalmersi GneroC. Lypolytica Algas Lactobacillus spp. C. chrysogenum Penicillium Olea C. Pulcherrima Protozoriose C. melibiose. C. solan

Kutsal; Fusarium spp. zbas (1989)

- Micro-organismos produtores Cepas: Produo Industrial

S. cerevisiae

(Hans-Peter Hohmann, 2010; Stahmann 2000)

Produo Qumica
Perodo de muitos Cultivo: gros triturados ou soro de leite estudos Problemas: Menos sensveis : 40-60ppm laboratoriais sobre ProduoProblemas: Produo baixa: 0,6 g/LFerro: 1ppm = 75% produo baixa: 0,05-0,1g/L Sensibilidade a condies e
Eremothecium ashbyi Candida spp.
Clostridium acetobutilicum

Produo em Caractersticas similares: (ideais para cresc. e prod.) escala Industrial Roche Vitaminas DSM (lder) Comercial Sem sensibiidade: ferro do meio solvenntes + Ashbya gossypii No se mostram competitivas Produo: acima 5,0g/L (grandes produtoras
naturais)
Grain

produo 1965

Alto custo

Ashbya gossypii (1946)

Problema:

Produo ainda noFecham em 1968 atendia demanda (1990) BASF MECK (1974) Premier Malt SUCESSO Da industria!!! comercial e menos vantajoso que processo qumico
Prod
Candida famata = B2 15g/L

Candida famata: grande produtor natural crescendo na forma

leveduriforme. Meio: Amido de milho hidrolisado

Coors Brewing Com.

ADM
DSM

Bacillus subtilis

1930

1940

1950

1960

1970

1990

2000

Atualmente

- Micro-organismos produtores (Hans-Peter Hohmann, 2010)

Cepas -Produo Industrial

100% da Riboflavina produzida por micro-organismos

No presente 3 organismos so usados para a produo em escala industrial de riboflavina por fermentao:

DSM (Sua)
Ashbya gossypii

BASF (Alemanha Coria do Sul)

2000 ton/ano 2400 ton/ano

Produo:
3000 ton/ano

Ashbya gossypii

6500-7000 Ton/ano

ADM (EUA)
Candida famata

DSM e Hubei Guangji (China)

Bacillus subtilis

1930

1940

1950

1960

1970

1990

2000

Atualmente

- Produo Laboratorial, Industrial e Condies de CultivoProduo Laboratorial

Laboratrio

(250-500mL-1L1,5L)

Fatores importantes para a produo

Modificao de vias Modificaes genticas Bacillus subtilis

inicio Foco Meio de cultivo Temperatura pH Substratos Reduo de custos Substituio e substratos alternativos

Novas metodologias Engenharia gentica

- Produo Laboratorial Produo Laboratorial : Inico

Estudos do Meio de cultivo e Condies:
WICKERHAM; FLICKINGER; JOHNSON, (1946) (apud SILVA, 1973) - Difuso Meio de Cultura para fungos Riboflavinognicos: TANNER et al. (1949): Testa a retirada de componentes e demonstra que extrato de malte apenas necessrio em meio solidificado com gar todos os demais so necessrios glicose, peptona, extrato de levedura e extrato de malte (agarizado ou no)

zbas (1986): Idealiza um meio baseado ao de WICKERHAN utilizado em escala industrial e at o momento
Composio do Meio (g/L): glicose 20, peptona 5, Extrato de levedura 5, extrato de malte 5, MgSO4.7H2O 0,2; K2HPO4 0,2. O pH soluo de H2SO4 0,5M

Meio possui todas as exigncias para fungos produtores de riboflavina

Meios quimicamente definidos -Produo inferior - Menos utilizados

- Produo LaboratorialProduoEremothecium ashbyi e AshbyaInico sbaz, 1989) Estudos com Laboratorial : gossypii (Kutsal;
Temperatura: Crescimento e produo mxima obtido entre 25 a 30 C. Condies gerais de fermentao que afetam o crescimento e a V A melhor faixa foi a de 30 C Temp. altas e baixas possuem produo pelo microrganismo produtor de riboflavina so: mesmo efeito (inibio) temperatura pH nvel de aerao Comportamento similar ao de concentrao inicial de substrato, fatores de crescimento e estimulantes pH: metabolito sec. 6,0 a 8,0 para Eremothecium ashbyii 5,5 a 7,0 para Ashbya gossypii Produo de riboflavina Crescimento Melhor pH 6,5

- Produo LaboratorialEstudos com Eremothecium ashbyi e Ashbya gossypii (Kutsal; sbaz, 1989) Biotina e tiamina se mostraram ineficazes em estimular tanto o crescimento como a flavinognese, para Eremothecium ashby Apenas DL metionina (0,4g/L) e inositol (0,2g/L) se mostraram efetivos Os 4 foram efetivos para A. gossypii A melhor produo por A. gossypii ocorre no meio com todas vitaminas (G+I+B+T)

Aerao e agitao: 300-1200rpm = 750-1000rpm 70-330cc/min = 220cc/min Substrato Inicial: + Gli (5,0)+Sun(15,0) = 19% (0,2438 0,281)

Fatores de crescimento: -Condies prvias + - [ ] (+)biotina, inositol, metionina e tiamina

z
0,281

- Produo LaboratorialEstudos com Ashbya gossypii (Tanner, Vojinovich; Lanen1949)c

Idade do miclio: (24-120hs) -Tempo inicial igual (idade influencia)

- Influencia sobre a produo - clulas jovens sintetizam por mais tempo e em taxas mais rpidas (aps inicio).

Tempo de esterilizao: (15-90min) -Acima de 30 reduo drastica da produo

- Produo LaboratorialFontes alternativas de substratos

Evita a lise e estimula

Possuem glicina, treonia e estimulantes fortes

Preferncia por lipdeos (ativao da isocitrato liasemalatogtp sntese de riboflavina)

Precursor de intermedirio

(LIM; CHOI; PARK, 2001)

- Produo LaboratorialEstudos com Eremothecium ashbyii (KALIGAN; KRISHNAN, 1997-1998)

Fontes alternativas de substratos e estimulantes M.O: Eremothecium ashbyii NRRL1363

Meio de Cultura (g/L): KH2PO4 2,0; MgSO4 0,1; NaCl 1,0; Tween 80 1,8mL; pH 6,5 Fontes (30-60g/L) : C - Melao N - Amendoim Estimulantes: (0-30g/L): Sementes Archras sapota, Carica papaya, Arona squamosas, Cucumis melo (resduos ricos em cidos graxos, aminocidos e vitaminas) Condies: 30C, 500mL (100mL), 7dias, 160rpm Meio de Cultura (g/L): KH2PO4 2,0; MgSO4 0,1; NaCl 1,0; Tween 80 1,8mL; pH 6,5 Fontes (50g/L) : C - Melao N - Amendoim Estimulantes: (0-30g/L): Farinha de peixe (ac. Glutamico); Tripa de porco (cido palmtico e esterico); Extrato de carne; Farinha de sangue (leucina, valina e lisina). Condies: 30C, 500mL (100mL), 7dias, 160rpm

- Produo LaboratorialFontes alternativas de substratos e estimulantes (KALIGAN; KRISHNAN, 1997)

Estimulo flavinognico em relao ao controle (0g/L): Achras sapota: melhor estimulo - 47% produo Carica papaya: 2 melhor - 35% Anona saquamosa: 4 - 12%. Acima de 15g/L inibio Cucumis melo: 3 - 25% A boa quantidade de vitaminas, aminocidos, cidos graxos e substncias que atuam na germinao, tornam as sementes boas fontes,baratas e acessveis, dessas substancias

Mxima produo de riboflavina para ambas fontes = 50g/L prod. 3,3 g/L (alta)
Valores maiores = inibio

- Produo LaboratorialFontes alternativas de substratos e estimulantes (KALIGAN; KRISHNAN, 1998)

Inibio

Farinha de sangue Concluso:

Extrato de carne

- Extrato de carne melhor estimulante 71,86% da sntese de Riboflavina

55,9 % - Tripas de porco: promissor estimulante. Indica que baixas concentraes de cido palmtico e esterico so suficientes para promover grande sntese de Riboflavina. Tambm reduz a quantidade de substrato. 58,17% 55,51% 71,86%

Farinha de peixe

Tripa de porco

- Produo IndustrialEstudo de caso:

(Heinzle et al. 2006)
Produo Industrial de Riboflavina por Eremothecium ashbyi Pr-cultivo (50hs)

Meio dividido em grupos (evita reaes) 24-28hs Preparo do meio Processo contnuo Processamento upstream: (otimizado) 140-150C/10s 1% Esterilizao (reduz consumo e tempo) Fermentao em lotes: Fermentao Cepa geneticamente instvel (perda da produtividade ao longo dos principal (500hs) processos) Produo mxima Colheita (27g/L) de Riboflavina Tanque ocorre na fase estacionria Produo de 1000 ton/ano Cristalizador Precipitao Evaporao Cristalizao Dados: Processamento Downstream da gua so originais dos experimentos laboratoriais e os dados da fbrica , onde o Centrifugao processo Decantao completo foi desenvolvido e testado
gua+caldo+leo Biomassa+sais Agente redutor Riboflavina precipitada+HCl+60C (Cristalizao)

Secagem
(p ou granulado)

Produto final
70% (30% biom/sais)

Uso Humano (98% pureza) pH 4,5+121C+centrifugao

Produto final
(98%)

(Heinzle & Biwer ; 2006)

- Custos de produo 12 biorreatores 500 m3

Requerimento por lote (2004)

Unidade Eletricidade Quantidade anual 64 803 000 kWh Custo anual Dolares 6 440 000 Custo anual Real 11 666 704 Parte dos custos (%) 84

Vapor
gua de refrigerao gua gelada SOMA

26 398 000
3 010 857 000 3 441 616 000

528 000
75 000 7685 000

956 524,8
135 870 13 922 146

6,9
1,0 7,8 100

602 000 1 090 583,2

(Heinzle & Biwer ; 2006)

Material
Componente Glicose (g/L) 5,0 Eur/Kg 1,00 Real/Kg 2,43

Peptona
Extrato de levedura Extrato de malte

5,0
5,0 5,0

9,00
4,00 4,00

21,87
9,42 9,42

40 % 18 % 18 %

MgSO4 . 7H2O
K2HPO4 leo de girassol H2SO4 Metionina

0,2
0,2 15,0 2,0 0,4

1,50
1,50 0,55 0,10 35,00

3,64
3,65 1,34 0,24 85,30

7%

Total de gasto anual = 13 milhes de dolares = 23 550 800 de reais

(Heinzle & Biwer ; 2006) Resumo do investimento . Preos de 2004 Dolares Real

Total de capital investido ($) Custo de operao ($/ano)

Taxa de produo (Kg/ano) Custo de produo por unidade ($/ kg P) Total de receita ($/ano) Margem bruta(%) Retorno do investimento (%) Tempo de Payback Valor presente liquido (VPL)

118 800 000 45 460

215 218 080 82 355.34

82.61 90 342 680.4

997 000 45,6 49 869 000 8,84 11,6 8,6 - 9 980 000

Gastos diretos e indiretos de implantao Custo da instalao (49%) + Material (30%) + Custo de utilizao (17%) + funcionrios (<3%) + Tratamento dos residuos (1,5%)

25,37 U.S. dollars / kg - 45.96 R$ / kg (2007)

- Aplicaes Suplemento de alimentos animais Aditivo alimentar de yogurtes, bebidas e pes

80%

- Inseticida
- Uso no cncer - Tratamento de Ceratocone - Tratamento de enxaqueca - Previne Parkinson e radicais livres

- Bibliografia KUTSAL, T.; ZBAS,M.T. Microbial production of Vitamin B2. In: Microbial synthesis of riboflavin Biotechnology of vitamins, pigments, and growth factors ,Elseevier applied science,1989. HOHMANN, H.P.Biotechnology of riboflavin production. In: Comprehensive natural products II. Elsevier LTD. 2010 SILVA, R.S.S.F.Produo de riboflavina por fermentao com Eremothecium ashbyii. 1973 (Tese Mestrado em Cincias). Universidade Estadual de Campinas Campinas.

TANNER,F.W.; VOJNOVICH,C.; LANEN, J.M.V. Factor affecting riboflavin production by Ashbya gossypii. J Bacteriol. 1949 December; 58(6): 737745. Peoria, Illinois.
LIM, S.H.; CHOI, J.S.; PARK, E.Y. Microbial Production of Riboflavin Using riboflavin overproducers, Ashbya gossypii, Bacillus subtilis, and Candida famata: An overview.Biotechnology Process Eng. 75-88, 2001. .

KALIGAN, A.E. The kinect of riboflavin secretion br Eremothecium asbyii nrrl 1363. BioprocessEngineering, 445-449, 1993. HEINZLE,E.; BIWER,A.Development of Sustainable Bioprocess.John Wiley e Sons LTD. England, 2006.