APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA 1. Determinaciones cualitativas: identificacin de sps presentes en la muestra y determinacin de la estructura del analito 1.1.

Criterio identificativo (tr de la muestra y patrn) Identificacin por comparacin del tr de la muestra y un patrn del analito. En un sistema cromatogrfico estable, el tiempo de retencin de un soluto particular es constante, y por lo tanto puede utilizarse para identificar ese soluto. As,aunque la cromatografa es primordialmente una tcnica de separacin, es posible identificar los compuestos separados de una mezcla compleja por medio de sus tiempos de retencin. Indices de retencin (Indices de Kovats). Los tiempos de retencin pueden predecirse a partir de los tiempos conocidos de otros miembros de la serie homloga. La probabilidad de una coincidencia exitosa en los valores de los tiempos de retencin depende del conocimiento previo de la muestra, y por tanto de la aptitud para prever la presencia de compuestos especficos. El xito tambin depende de la disponibilidad de compuestos de referencia a propsito.

1.2. Confirmacin Comparacin de muestra y muestra ms patrn aadido en distintas condiciones y columnas cromatogrficas. El mtodo de las adiciones estndar se puede utilizar para verificar el tiempo de retencin del compuesto en cuestin. El tiempo de retencin del pico en la muestra no debe cambiar despus de efectuada la adicin con respecto al valor original si ambos compuestos (el problema y el estndar aadido) son el mismo. Uso de detectores como IR, RMN, UV-V, Fluorescencia y MS. Cuando no se tienen disponibles los compuestos de referencia debe recurrirse a la informacin estructural independiente que proporcionan otras tcnicas espectroscpicas. En muchos casos la identificacin de compuesto puede hacerse aislando el pico durante la obtencin del cromatograma y analizndolo a continuacin por un mtodo suplementario. La espectrometra de masas se ha acoplado con xito a la cromatografa tanto de gases como lquida. La informacin que se puede obtener incluye el peso molecular y la frmula emprica, informacin estructural y confirmacin de la estructura.

2. Determinaciones cuantitativas En cromatografa en columna la seal analgica generada por el detector se registra en la forma familiar de los picos cromatogrficos. El rea bajo estos picos puede integrarse en una variedad de maneras y los datos resultantes relacionarse con la composicin de muestras desconocidas. 2.1. Integracin del rea del pico: Integrador computarizado Los sistemas de datos basados en computadoras en lnea permiten una automatizacin completa. Esto incluye la adquisicin y reduccin de datos en forma automtica y la impresin de los resultados analticos. La seal cromatogrfica,

inicialmente analgica, se digitaliza por medio de un convertidor digito-analgico. Con programas se puede entonces detectar la presencia de picos, hacer correcciones por la desviacin de la lnea de base, calcular reas y tiempos de retencin, determinar la concentracin de los componentes utilizando factores de calibracin almacenados y generar un informe completo del anlisis (Fig. 2.7).

Las cuentas del rea del pico se acumulan cuando la seal abandona la lnea base. Este alejamiento de la lnea base usualmente se determina por medio de la medicin de la pendiente de la seal. El tiempo de retencin y las alturas de la seal en el mximo de cada pico se detectan con un programa almacenado en la memoria. El final del pico de un componente se establece cuando la seal regresa a la lnea base. Durante cromatogramas isotrmicos los programas pueden aumentar automticamente con el tiempo la sensibilidad a la pendiente, asegurando su habilidad para detectar los picos agudos iniciales y los picos bajos y chatos ms retardados con la misma precisin.

En el caso de picos fusionados es posible asignar el rea a cada componente proyectando perpendicularmente el mnimo del valle a la lnea base corregida (Fig. 2.8). Algoritmos especiales distribuyen el rea de componente en el caso de picos sobrepuestos. Tambin en el caso de picos sobre colas de otros picos es posible distribuir las reas de cada pico de forma coherente (Fig. 2.9). Habitualmente se utilizan identificadores como los mostrados en la figura 2.10 para conocer el modo en que el ordenador ha integrado cada pico.

2.2. Mtodos de evaluacin En el anlisis cuantitativo la hiptesis fundamental es que la masa de un analito i es igual al producto de un factor de respuesta (sensibilidad del detector a ese analito) por el rea del pico cromatografico de i. Por tanto, es necesario medir las reas, es decir, integrar los picos, y determinar los factores de respuesta. Los mtodos principales de evaluacin son: 1) Normalizaciones interna 2) Normalizacin con factores de respuesta 3) Patrn externo (calibracin con patrones o estndar) 4) Patrn interno. Cada uno tiene su lugar dependiendo de la naturaleza del anlisis.

a) Normalizacin interna La hiptesis es que: - Cada componente de inters da lugar a un pico - Todos los componentes dan la misma respuesta en el detector - Todos los componentes estn en el margen lineal del detector. Procedimiento: - Inyeccin de la muestra - Clculo de reas (integracin) Ci(%)= Ai/ *100 ( ) Cuando se sabe que el cromatograma representa la muestra completa, que todos los componentes se han separado y que cada pico se ha resuelto completamente; se puede utilizar la normalizacin de las reas para la evaluacin. Para utilizar este mtodo, se mide el rea bajo cada pico individual. Sumando todas estas reas de los picos se obtiene el rea total calculada. El porcentaje en volumen de los componentes individuales se obtiene multiplicando el rea calculada individual por 100 y luego dividindola entre el rea total calculada. El mtodo slo es vlido si el factor de respuesta de todos los componentes es el mismo, es decir iguales cantidades de distintos componentes dan la misma rea. En otro caso las reas deberan ser corregidas por un factor de respuesta de cada componente. b) Normalizacin con Factores de respuesta La hiptesis es que: - Cada componente de inters da lugar a un pico - No todos los componentes dan la misma respuesta en el detector - Todos los componentes estn en el margen lineal del detector. Ci(%)= mi/mt *100= Fi Ai / Fi Ai *100 Ci(%)= 100 Procedimiento: - Inyeccin de mezcla de patrones - Clculo de factores de respuesta - Inyeccin de muestra - Clculo de concentraciones c) Calibracin con estndares (mtodo del patrn externo). Cuando el volumen de la muestra es conocido con frecuencia se utiliza la calibracin con estndares o patrones. Tiene la ventaja de que slo se necesita, medir las reas de los picos de inters. Es un requisito que cada vez se inyecte la misma cantidad de muestra. Los estndares necesarios deben analizarse bajo las mismas condiciones de operacin que la muestra En la prctica, se preparan las soluciones estndar de(los) componentes de inters y se inyectan en el cromatgrafo. Para cada componente se obtiene la grfica: rea del pico en funcin de cantidad de componente. Despus, para el clculo de una concentracin desconocida, se obtiene el cromatograma de la muestra problema y el rea de cada pico se utiliza con la grfica anterior para obtener la cantidad.

d) Mtodo del patrn interno. El mtodo del patrn interno permite que varen las condiciones de operacin entre muestra y muestra y no requiere de repetibilidad en las inyecciones. El patrn interno debe ser un compuesto que pueda resolverse completamente de los picos adyacentes, que no est presente en la muestra problema y que no produzca ningn efecto interferente. Como en el caso anterior se preparan estndares que contienen los componentes de la muestra a analizar. A cada uno de ellos se aade una cantidad conocida del llamado patrn interno que obviamente no es uno de los componentes que se quiere analizar. Se obtienen los cromatogramas de cada estndar y se obtiene la grfica: cociente entre el rea de componente y rea del patrn interno frente a cociente entre cantidad de componente y cantidad de patrn interno. Entonces se aade una cantidad conocida del patrn interno a la mezcla desconocida. Se obtiene el cromatograma, y con el cociente entre las reas del pico de componente a determinar y la de patrn interno en la muestra problema se obtiene (con la grfica anterior determinada con estndares) el cociente entre cantidad de componente y cantidad de patrn interno. Como la cantidad de patrn interno aadida a la muestra problema es conocida puede calcularse la cantidad desconocida de componente. Cualquier variacin en el tamao de la muestra se evidenciar inmediatamente al comparar el rea del pico del patrn interno en cromatogramas diferentes pero no afectar al resultado.