Crescimento microbiano

Introduo Medidas de crescimento Curva de crescimento (cultura descontnua) Efeito dos fatores ambientais no crescimento

Introduo ao Crescimento Microbiano

Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do nmero de clulas e no ao aumento das dimenses celulares. Crescimento Populacional: definido como o aumento do nmero, ou da massa microbiana. A taxa de crescimento a variao no nmero ou massa por unidade de tempo. O tempo de gerao o intervalo de tempo necessrio para que uma clula se duplique. O tempo de gerao varivel para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos at dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de gerao no corresponde a um parmetro absoluto, uma vez que dependente de fatores genticos e nutricionais, indicando o estado fisiolgico da cultura. O tempo de gerao pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela frmula abaixo: N=No.2n, onde N= nmero final de clulas, No= nmero inicial de clulas, n= nmero de geraes. n= log(N) - log(No)/0.301 g = t/n , onde g= tmpo de gerao, t= tempo de crescimento e n= determinado acima.

Medidas do crescimento microbiano

O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes tcnicas, tais como pelo acompanhamento da variao no nmero ou peso de clulas, por exemplo. Dentre as diferentes tcnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos. Contagem total de clulas: esta metodologia envolve a contagem direta das clulas em um microscpio, seja de amostras fixadas (e coradas) ou analisadas a fresco, (sendo aplicados cerca de 10 l da suspenso, na maioria dos casos), utilizando-se cmaras de contagem. A contagem direta uma tcnica rpida, mas tem como principais limitaes a impossibilidade de distino entre clulas vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso de corantes vitais, para leveduras) e contagens errneas, devido s pequenas dimenses de algumas clulas, ou pela formao de agregados celulares. Em preparaes no coradas, deve-se utilizar microscpio de contraste de fase, o qual deve ser empregado apenas quando as clulas no esto muito diludas (<106 clulas/ml).

Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

H tambm os contadores eletrnicos (do tipo Coulter) usados em hematologia, que podem ser empregados na contagem de clulas microbianas. Em determinadas situaes, por exemplo quando se requer apenas uma estimativa da quantidade de microrganismos, pode-se empregar a contagem proporcional, que corresponde a uma anlise comparativa das culturas com suspenses padro. Como exemplo de uma suspenso padro podemos citar a escala de MacFarland, que corresponde a uma srie de tubos contendo uma soluo de BaSO4 em diferentes concentraes, apresentando assim, graus de turvao distintos. Desta forma, comparando-se a turvao da cultura em estudo com os tubos de MacFarland, pode-se obter uma estimativa do nmero de clulas presentes na amostra. Contagem de viveis: Procedimento tambm conhecido como contagem em placa, que estima o nmero de clulas viveis (isto , capazes de se reproduzir) em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de alquotas de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais so ento inoculadas em meio slido. Aps a incubao dos meios, geralmente por uma noite, o nmero de colnias contado. Como uma colnia normalmente originada a partir de um organismo, o total de colnias que se desenvolvem no meio corresponde ao nmero de clulas viveis presentes na alquota analisada. Esta tcnica deve sempre realizada empregando-se vrias dilues (100 a 104 clulas) das amostras. A contagem de viveis pode ser feita pela semeadura em superfcie ou em profundidade ("pour plate"). Geralmente o volume a ser inoculado no deve ultrapassar 0,1 ml, para evitar a confluncia das colnias. Se a tcnica de semeadura em profundidade for utilizada, pode-se inocular de 0,1 a 1,0 ml de clulas. Esta tcnica precisa quando o nmero de colnias (ou placas de lise, no caso de partculas virais ) contadas situa-se entre 30 e 300 e quando as condies culturais e ambientais esto adequadas para os microrganismos analisados. Este tipo de contagem est sujeito a grandes erros (agregados, duas clulas prximas, originando uma colnia), que podem ser minimizados pela realizao de triplicatas para cada diluio. Esta metodologia amplamente utilizada, exibindo elevada sensibilidade, detectando baixos nmeros de clulas e permitindo tambm a contagem de diferentes tipos de microrganismos, pelo emprego de meios seletivos (meios que favorecem o crescimento de um determinado tipo ou grupo de organismo) e/ou seletivos e diferenciais (meios que alm de favorecerem o desenvolvimento de um tipo ou grupo de organismo, tambm permite sua distino,

a partir de alguma caracterstica fenotpica). Tambm podem ser usadas membranas filtrantes, onde os lquidos so filtrados e as membranas colocadas diretamente sobre os meios de cultura.

Tcnica de contagem de viveis

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Massa de clulas: pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso mido de uma cultura. Este tipo de procedimento realizado quando no necessrio determinar o nmero preciso de microrganismos presentes. Peso seco: Muito utilizado na quantificao de fungos, onde o miclio retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido secagem. Realizam-se ento sucessivas pesagens, at o momento onde no observa-se mais variaes. Este procedimento pode tambm ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou ento secando-o (100 - 150C/16 horas) e depois pesando-o. Turbidimetria: quantificao em espectrofotmetro ou colormetro a 660 nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura no interfere com os resultados. Nestes comprimentos, a absoro de luz por componentes celulares corados desprezvel mas, se necessrio, outros comprimentos de onda podem ser usados. Tal metodologia requer a confeco de uma curva padro. Embora a anlise turbidimtrica seja menos sensvel, de rpida e fcil execuo, no destruindo a amostra. Entretanto, no permite a determinao de clulas viveis.

Anlises qumicas: A partir da quantificao de protenas ou de nitrognio, ou por meio da anlise de diferentes atividades metablicas. Nmero Mais Provvel (NMP): Amplamente utilizado em laboratrios de microbiologia de alimentos ou ambiental, na quantificao de microrganismos em gua, leite e outros produtos. Esta metodologia basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes totais e coliformes fecais, que so microrganismos indicadores de poluio fecal, o que pode ter como consequncia a presena de outros organismos, tais como protozorios e vrus. Esta tcnica foi desenvolvida aps anlises estatsticas complexas. A determinao do NMP realizada inoculando-se 3 sries de 5 tubos, com 10, 1 e 0,1 ml da gua ou do produto homogeneizado em soluo salina, em meios seletivos para coliformes totais contendo tubos de Durham invertidos em seu interior. Estes so incubados por 48 hs/37C sendo ento analisados quanto ao crescimento e presena de gs no interior dos tubos de Durham. Tal resultado considerado como positivo para a presena de coliformes totais. Amostras dos tubos positivos so ento repicados para caldos seletivos para coliforme fecais, tambm contendo tubos de Durham, os quais so incubados por mais 24 ou 48 hs a 42C. De todos os tubos positivos fazse uma semeadura em placa com meio seletivo e posterior identificao bioqumica. De acordo com o nmero de tubos que apresentam gs determina-se o NMP, pela consulta de uma tabela desenvolvida por Hoskins (1934). Este um teste apenas presuntivo para a presena de coliformes. Curva de crescimento (cultura descontnua) Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado, pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionria e de declnio.

Curva de Crescimento Padro, em um sistema fechado

Lag: perodo varivel, onde ainda no h um aumento significativo da populao. Ao contrrio, um perodo onde o nmero de organismos permanece praticamente inalterado. Esta fase apenas observada quando o inculo inicial proveniente de

culturas mais antigas. A fase lag ocorre porque as clulas de fase estacionria encontram-se depletadas de vrias coenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares necessrios absoro dos nutrientes presentes no meio. A fase lag tambm observada quando as clulas sofrem traumas fsicos (choque trmico, radiaes) ou qumicos (produtos txicos), ou quando so transferidas de um meio rico para outro de composio mais pobre, devido a necessidade de sntese de vrias enzimas. Assim, durante este perodo observa-se um aumento na quantidade de protenas, no peso seco e no tamanho celular. Log ou exponencial: nesta etapa, as clulas esto plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Deve ser levado em conta tambm que neste momento, a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda pequena. A taxa de crescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do organismo em questo. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Nesta fase so realizadas as medidas de tempo de gerao. Geralmente, ao final da fase log, as bactrias passam a apresentar fentipos novos, decorrentes do processo de comunicao denominado "quorum sensing". Estacionria: Nesta fase, os nutrientes esto escasseando e os produtos txicos esto tornando-se mais abundantes. Nesta etapa no h um crescimento lquido da populao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que morrem. Na fase estacionria que so sintetizados vrios metablitos secundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre tambm a esporulao das bactrias. Foram detectados alguns genes (sur) que so necessrios sobrevivncia das clulas na fase estacionria. Alm destes, existem outros genes (fatores alternativos da RNA polimerase, protenas protetoras contra dano oxidativo). Declnio: A maioria das clulas est em processo de morte, embora outras ainda estejam se dividindo. A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de viveis cai lentamente. Em alguns casos h a lise celular. Culturas descontnuas tendem a sofrer mutaes que podem repercutir na populao como um todo. As prprias condies ambientais tendem a promover variaes de carter fenotpico (reversvel) nas culturas. Crescimento em culturas contnuas: tcnica muito usada nos processos industriais de obteno de produtos microbiolgicos. Nestes casos, tem-se o interesse em manter as clulas em fase log ou estacionria. Utilizam-se fermentadores ou quimiostatos, que permitem um crescimento em equilbrio dinminco, havendo assim um controle da densidade populacional e da taxa de crescimento. Estes so respectivamente controlados pela concetrao do nutriente limitante (fonte de C ou N) e pela taxa de fluxo (taxa de diluio). Em baixas concentraes do nutriente limitante, a taxa de crescimento proporcional concentrao do nutriente (que virtualmente zero).

Crescimento sincronizado: inicialmente obtido por processos que retardavam a sntese de DNA. Atualmente, utiliza-se mtodos de separao mecnica das clulas menores, recm-divididas. Pode ser feita pela filtrao em vrios papis de filtro, que retm clulas maiores, em fase de diviso. Efeito dos fatores ambientais no crescimento O crescimento dos microrganismos grandemente afetado pelas condies fsicas e qumicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem influir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo em questo. Temperatura: Corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam o desenvolvimento bacteriano. A medida que h um aumento da temperatura, as reaes qumicas e enzimticas na clula tendem a tornar-se mais rpidas, acelerando a taxa de crescimento. Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturao de protenas e cidos nuclicos, inviabilizando a sobrevivncia celular. Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura onde desenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as temperaturas mnima, tima e mxima (temperaturas cardeais), para cada microrganismo. A temperatura mxima provavelmente reflete os processos de desnaturao mencionados acima, enquanto os fatores que determinam a temperatura mnima ainda no so bem conhecidos, embora certamente a fluidez da membrana seja um dos fatores determinantes destes nveis trmicos baixos.

Temperaturas cardeais dos microrganismos

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de faixas de temperatura, onde para alguns o timo encontra-se entre 5 e 10C, enquanto para

outros de 90 a 100C. Assim, os microrganismos podem ser classificados em quatro grupos, de acordo com os timos de temperatura: psicrfilos (0 a 20C, timo de 15C - Flavobacterium), mesfilos (12 a 45C, 37C - E. coli), termfilos (42 a 68C, 62C - Thermococcus), e hipertermfilos (80 a 113C, 105C Pyrodictium brockii).

Tipos de bactrias em relao temperatura

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Psicrfilos: os ambientes frios so predominantes na Terra (oceanos, polos, solos) entretanto este grupo (bactrias, fungos e algas) muito pouco estudado. Destes, os mais conhecidos so as algas que crescem sob o gelo ou em geleiras (Chlamydomonas nivalis), dando colorao vermelha. H os microrganismos psicrotolerantes que so aqueles cujo timo encontra-se entre 20 e 40C e que sobrevivem a 0C. So um grupo amplo (bactrias, fungos, algas e protozorios) que podem contaminar alimentos e outros substratos refrigerados. Mesfilos: crescem numa faixa de 20 a 40C, com um timo em torno de 37C, sendo os principais microrganismos encontrados em animais de sangue quente. Termfilos e Hipertermfilos: timos de 45 e 80C, respectivamente. So encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo ocenico, em fontes. Geralmente so procariotos, sendo as Archaea as mais resistentes, apresentando enzimas e protenas termoestveis, provavelmente devido substituio de aminocidos, conferindo um novo folding. Tm tambm uma maior concentrao de cidos graxos saturados na MC. As Archaea no tem cidos graxos na MC, mas sim hidrocarbonetos de cadeias com diferentes comprimentos, compostas por unidades repetitivas de 5 C (fitano), ligadas a glicerol fosfato, por ligao ter. Os termfilos e hipertermfilos tem grande interesse biotecnolgico porque tendem a fazer os processo mais rapidamente, com menor contaminao por outros microrganismos e possuem enzimas mais termoestveis. pH: Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o crescimento de diferentes tipos de microrganismos. Bactrias - faixa entre 7, com algumas acidfilas (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com

timo entre 2 e 3,5) e outras alcaliflicas (Bacillus e Archaea). Fungos - tendem a ser mais acidfilos que as bactrias (pH <5).

Distribuio de alguns microrgansmos, de acordo com o pH

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Tenso de O2: Extremamente importante no desenvolvimento, uma vez que os microrganismos comportam-se de forma bastante distinta, sendo classificados como aerbios, anaerbios facultativos, anaerbios estritos, anaerbios aerotolerantes e microaerfilos (requerem concentraes baixas de O2). As condies de anaerobiose podem ser conseguidas pelo uso de agentes redutores nos meios de cultura, tais como o tioglicolato de sdio, que reage com o oxignio, formando gua; pela remoo mecnica do oxignio, sendo substitudo por nitrognio e CO2; pelo uso de sistemas comerciais do tipo "GasPak", que gera hidrognio e CO2 com um catalisador de paldio. Adiciona-se gua ao sistema, a qual gera hidrognio, que reage com o oxignio na superfcie do catalisador, formando gua; ou ainda pelo uso de "glove box" anaerbias ou a mesa inoculadora desenvolvida pelo VPI.

Classes de organismos, em relao tenso de oxignio

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

gua: Essencial a qualquer microrganismo, embora as necessidades sejam variadas. o solvente universal, mas sua disponibilidade varivel (solues com acares ou sais tm menos gua disponvel). Aw: presso do vapor em equilbrio com a soluo/ pv da gua, variando de 0 a 1. Os organismos que vivem em ambientes onde a disponibilidade de gua baixa desenvolvem mecanismos para extrair gua do ambiente, pelo aumento da concentrao de solutos internos, seja bombeando ons para o interior ou sintetizando ou concentrando solutos orgnicos (solutos compatveis), que podem ser aucares, lcoois ou aminocidos (prolina, betaine, glicerol). Presso osmtica: Fator extremamente importante, principalmente a partir do maior conhecimento sobre as Archaea, visto que vrios membros deste domnio requerem altas concentraes de sais para seu desenvolvimento.

Classes de organismos, em relao salinidade

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Fatores adicionais:

Fonte luminosa para fototrficos autotrficos. Presso atmosfrica, para aqueles que vivem em profundidades.