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Dispositivos de interaccin de Lectura FRET

3 PROTEINAS FOSFORESCENTES

Combinadas 2 FRET (tiempo real) Donador Interaccin: PROTEINA:PROTEINA Donador

mCerulean mCitrina

Lectura FRET par mCherry 6 pares de protenas sintticas Aceptor

4 VALORES EFICIENTES FRET c/par de protena FKBP FRB Entrada

Salida

FRET
EFICIENTE

FRET
FKBP LEUCINA ZIPPER FRET FRB * Protenas de Fusin

Dos formas:  Muestras de Control separadas  Medidas en ausencias de Rapamacina

mCerulean FKBP: FRB mCitrina mCherry

inactivado

DISCUSIN
Marco Dispositivo de Interaccin Proteica Dominios intracelulares e interacciones :Composicin diseo de patrones DISPOSITIVO DE INTERACCION DE PROTEINAS Propone: Refracturar protenas:
P P P P

Desde partes de DNA: Diseo y Ensamble de partes proteicas


21 Prot. sint.

24 Bloques +
Hibrido

Clsica P P
CLONAR MET. STAND Modificado BBF RFC

R.S.B.P. BioBrick

Desde DNA a Protena: Produccin de protena sinttica


P 15 1 protocolo PROTEINAS SOLUBLES Identifico 2 factores de expresin 1 2 P P Codif. P P RNA RBS N t. RBS Gaussia princeps luciferase P P C RBS Secuencia Par N Luciferasa gLuc-fragil P 17 Optimizacin de Txicos proteicos

De Protena a Sistema: Caracterizacin del dispositivo


Interacciones proteicas:  Interaccin dentro del dispositivo  Combinados pares PRET : Interaccin dispositivo de lectura M M KD ON OF KD= 83 nM ZipE34:ZipR34 FKBP1:FRB Heterodimrico Inductor Rapamycin - Afinidad - Ligando natural Mutacin T2098L : acomoda AP21967 FRET Interaccin molecular Clulas +cofactores Interaccin SPR

LEUCINA ZIPPER FKB P12 Mod FRB

SPR anlisis

CONCLUSIONES
Se explor la factibilidad, para la obtencin de protenas sintticas biolgicamente. El diseo se inicio con partes reusables , para capturar protenas bsicas funcionales, seguido de un ensamble de protenas de fusin, expresin y purificacin de las mismas y la constitucin in vitro. Se provee de un protocolo para la construccin de interaccin entre protenas. Se demostr la factibilidad de un mtodo basado en diseo de protenas. La comparacin de construcciones sintticas en pruebas FRET, disean factores para el control de expresin proteica.