Fenomeno Postzona

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Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica Aurora Martnez Romero Jos Luis Ortega Snchez
Libro electrnico Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica. 2011 A esta obra le ha sido emitida los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14
Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 19962011.
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Autores Dra. en C. Aurora Martnez Romero. Divisin de Estudios

de Postgrado e Investigacin de la Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Jurez del Estado de Durango. Gmez Palacio, Durango. Mxico. quimicaaurora@hotmail.com
C. Dr. en C., M.S.P. Jos Luis Ortega Snchez. Unidad Regional

Universitaria de Zonas ridas. Universidad Autnoma Chapingo. Bermejillo, Durango. Mxico. jlortega@chapingo.uruza.edu.mx
Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.
INDICE Presentacin.................................................................................................................................................. 7 Introduccin ................................................................................................................................................. 8 Manejo, transporte y almacenamiento de materiales en el laboratorio de Inmunologa ........ 9 Prcticas generales de seguridad y bioseguridad en el laboratorio..................... 100 Reglamentos ........................................................................................................ 100 Normas de Seguridad especficas de las prcticas ................................................ 10 Manejo de residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI).................................. 13 Los residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI) ........................................................................13 Cuadro de Competencias........................................................................................... 14 Mapa del sistema de prcticas de Inmunologa. Estructura y programa del sistema de rcticas....................................................................................................................... 14 Contenido de cada prctica en particular ............................................................... 1616 PRACTICA NO. 1...................................................................................................................................... 17 ANIMALES DE EXPERIMENTACIN........................................................................ 17 Posicin de las inyecciones: a) intravenosa b) intraperitoneal ................................... 19 PRACTICA NO. 2...................................................................................................................................... 25 DILUCIONES ............................................................................................................. 25 PRCTICA NO. 3.................................................................................................................................... 300 MTODO DE OUCHTERLONY ................................................................................. 30 REACCIONES DE INMUNODIFUSIN ..................................................................... 30 PRCTICA NO. 4...................................................................................................................................... 34 DETERMINACIN DE INMUNOGLOBULINAS SRICAS ........................................ 34 1 PRUEBA DE PRECIPITACIN DEL SULFITO DE SODIO .............................. 34 2 PRUEBA DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC ........................................... 36 3 PRUEBA DEL GLUTARALDEHDO.................................................................. 39 PRACTICA NO. 5...................................................................................................................................... 40 BRUCELOSIS: Aspectos generales y Serodiagnstico ............................................. 40 PRUEBA RAPIDA DE AGLUTINACIN EN PLACA.................................................. 45 (ROSA DE BENGALA (Card Test))............................................................................ 45
PRACTICA NO. 6...................................................................................................................................... 48 FUNDAMENTO .......................................................................................................... 48 PRACTICA NO. 7...................................................................................................................................... 53 PRIMERA PARTE ...................................................................................................... 53 AGLUTINACION ESTNDAR EN TUBO ................................................................... 53 SEGUNDA PARTE..................................................................................................... 57 AGLUTINACIN EN TUBO EN PRESENCIA DE ...................................................... 57 2-MERCAPTOETANOL ............................................................................................. 57 PRACTICA NO. 8...................................................................................................................................... 61 PRIMERA PARTE ...................................................................................................... 61 AGLUTINACIN ESTANDAR EN MICROPLACA ..................................................... 61 AGLUTINACIN EN PRESENCIA DE 2- Me EN MICROPLACA .............................. 61 SEGUNDA PARTE..................................................................................................... 64 PRACTICA NO. 9...................................................................................................................................... 67 ANTGENOS DE SUPERFICIE DE GRUPOS SANGUNEOS .................................. 67 SISTEMA ABO ........................................................................................................... 67 METODOLOGA ........................................................................................................ 68 PRACTICA NO. 10.................................................................................................................................... 71 REACCIONES FEBRILES ......................................................................................... 71 PRCTICA NO. 11.................................................................................................................................... 75 ANTIESTREPTOLISINAS .......................................................................................... 75 PRACTICA NO. 12.................................................................................................................................... 81 DIAGNOSTICO PRECOZ DEL EMBARAZO ............................................................. 81 PRACTICA NO. 13.................................................................................................................................... 85 DIAGNOSTICO SEROLGICO DE SFILIS .............................................................. 85 PRACTICA NO. 14.................................................................................................................................... 89 DETERMINACION DEL FACTOR REUMATOIDE..................................................... 89
PRACTICA NO. 15.................................................................................................................................... 97 PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIN DE CLULAS MONONUCLEARES A PARTIR DE SANGRE TOTAL POR EL MTODO FICOLL-HYPAQUE................................... 97 Viabilidad Celular.................................................................................................... 97 CONGELACIN Y DESCONGELACIN DE CLULAS MONONUCLEARES...... 98 PRACTICA NO. 16.................................................................................................................................. 101 PRUEBAS CRUZADAS ........................................................................................... 101 PRACTICA NO. 17.................................................................................................................................. 104 PRUEBA DE COOMBS............................................................................................ 104 PRUEBA DE COOMBS DIRECTA ........................................................................... 104 PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA ....................................................................... 106 PRACTICA No. 18................................................................................................................................... 108 PODER BACTERICIDA DEL SUERO NORMAL ..................................................... 108 Glosario de trminos ................................................................................................ 111
Presentacin Este manual de prcticas de Inmunologa se propone iniciar al estudiante en el estudio de la inmunologa. Su contenido es terico y esquematizado, redactado de tal manera que facilite su comprensin. Su planeacin intenta seguir el trayecto que realiza una sustancia extraa a travs del organismo, con los diversos mecanismos de defensa que opone a su penetracin y en algunos casos limitar su replicacin a travs de la respuesta inmune. Se plantea la realizacin de 17 prcticas correspondientes a la aplicacin de la inmunologa clnica, implementadas de tal manera que el estudiante las pueda realizar sin la necesidad de material ni equipo sofisticado, nicamente con el material necesario para realizar las pruebas convencionales, de rutina en cualquier laboratorio de anlisis clnicos, con fines didcticos se proporcionan a los estudiantes muestras de fluidos corporales positivas, trabajando siempre con tica profesional, en el manejo de este tipo de muestras. La base para la realizacin del presente Manual fue la visualizacin de la importancia que tiene que el estudiante de inmunologa, tenga una formacin slida sobre su conocimiento prctico y que ingrese al mbito laboral con las habilidades para resolver problemas en el rea de la inmunologa, adems los estudiantes adquieren el conocimiento sobre la importancia de desarrollar su trabajo con tica y responsabilidad, con el compromiso de otorgar a los individuos que requieran de su servicio, la confianza de saber que cuentan con un laboratorio comprometido con la calidad y de esta manera puedan ser partcipes del mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes. Esta obra enfrenta la aplicacin de otorgar un servicio de calidad, proporcionando diagnsticos oportunos y confiables, es de fundamental importancia para quienes trabajamos sobre los problemas que aquejan la salud, tengamos conciencia de ser profesionales de calidad. Este Manual de prcticas de Laboratorio de la Ctedra de Inmunologa, representa una revisin exhaustiva destinada a la enseanza de la inmunologa. La elaboracin de este proyecto inicia con la construccin de las tcnicas de laboratorio implementadas en el trabajo diario de un laboratorio clnico. Como criterios de seleccin de las prcticas, se consider la necesidad sobre el conocimiento de las mismas frente al desempeo en el campo laboral. Adems, las prcticas desarrolladas en su metodologa se manejan el uso de material accesible en nuestro laboratorio, implementado de tal manera que se puedan aplicar en un laboratorio clnico, sin necesidad de equipo sofisticado, en donde el principio en su aplicacin es el conocimiento del fundamento de cada uno de los exmenes de diagnstico realizados.
La problemtica que se presenta es la necesidad de que los estudiantes procesen muestras positivas, para esto se les adiestra a trabajar con responsabilidad, puesto que al procesarlas estn bajo el factor de riesgo inminente de infectarse. Es necesario trabajar con este tipo de fluidos corporales para que conozcan la interpretacin real de los resultados que sern de suma importancia en la orientacin al mdico tratante sobre el estado de salud de los pacientes, el plasmar un diagnstico presuntivo certero en la hoja de reporte dar credibilidad a nuestro desempeo como profesionales de la salud. Todo el personal involucrado en el sector salud tiene que manejar todo el material biolgico teniendo en mente que es potencialmente infectante. Al egresar de la carrera tenga una slida formacin con base en sus estudios de inmunologa, para aplicar sus conocimientos en el mundo del desempeo laboral, resolviendo problemas en el rea de serologa o inmunologa, otorgando a los pacientes que requieran de su servicio, otorgar un elevado nivel de competitividad en cuanto al trabajo de calidad en su desempeo, colaborando con el equipo del personal de salud pblica en el uso racional y oportuno de las sustancias, solamente para otorgar el mejor servicio a los usuarios. Desarrollando con tica y responsabilidad profesional su trabajo con el propsito de mejorar la calidad de vida del paciente. Incluso, este manual genera el inters del alumno a incursionar en el rea de la investigacin bsica y aplicada relacionada a las reas de la salud. Para comprender la terminologa utilizada en inmunologa, se anexa un glosario de trminos. Adems se recomienda al estudiante que busque la relacin entre sus actividades diarias y conocimientos adquiridos anteriormente, para que lo logre en ellos un aprendizaje significativo y en vez de memorizar que analicen la terminologa utilizada en inmunologa buscando su significado etimolgico, de esta manera lo que se estudie durante el curso jams se olvide.
Introduccin
Por definicin, la Inmunologa tiene como objetivo el estudio de los fenmenos relacionados con la inmunidad, por inmunidad se entiende el conjunto de mecanismos de defensa que protegen contra los microagresores que se encuentran en el medio ambiente. Inmunologa, palabra de origen latino, etimolgicamente significa, privilegio, exencin. Actualmente, la Inmunologa ya no puede limitarse al estudio de los medios de lucha contra los agentes infecciosos: su dominio, mucho ms amplio, reagrupa las diversas reacciones que utiliza el organismo para mantener su integridad. La Inmunologa es el estudio del mecanismo y de las consecuencias de las modificaciones especficas producidas en un organismo por introduccin de una sustancia llamada antgeno; se llama reaccin inmunitaria a la reactividad nueva y especfica que el organismo adquiere despus de la introduccin de este antgeno, tanto si se trata de un agente infeccioso como de una molcula de peso molecular elevado o de una clula. Es importante generar la conciencia de trabajar con calidad, para que el mdico siempre tenga confianza en el qumico para apoyarse en l, con la certeza que se le apoyar para poder otorgar al paciente un diagnstico definitivo. En cada prctica se realiz un anlisis en la metodologa de trabajo e interpretacin de los resultados obtenidos. Se deben promover y coordinar esfuerzos de los diferentes constituyentes del sector salud para preservar la salud, combatir las enfermedades, prolongar la vida y estimular el desarrollo fsico, mental y social de sus habitantes. Otorgar un servicio de calidad a la comunidad, nuestro trabajo nos respaldar y ser nuestra carta de presentacin. Los objetivos del presente manual de prcticas son exponer de manara clara las prcticas elementales implementadas en la medicina cotidiana en un laboratorio de diagnstico del rea de serologa de un laboratorio de anlisis clnicos, desarrollar habilidades y aptitudes necesarias para el manejo adecuado de muestras biolgicas, realizar tcnicas y mtodos inmunolgicos que apoyarn en el diagnostico certero y oportuno de padecimientos inmunes.
Manejo, transporte y almacenamiento de materiales en el laboratorio de Inmunologa Se implementa un programa de eco-eficiencia, que se logra a travs de la generacin de productos y servicios que satisfacen las necesidades humanas y generan calidad de vida, al mismo tiempo que se reducen en forma progresiva los impactos ambientales y el uso de recursos no renovables, reduccin de la energa y de las emisiones txicas, aumento de la cultura del reciclaje y durabilidad del producto/servicio, entre otros. Se llevan a cabo estrategias de gestin ambiental, por lo que, se cuenta con servicio de recoleccin, transporte y disposicin final de residuos biolgicoinfecciosos procedentes de las actividades relacionadas con la prevencin y cuidado de la salud implementada en la Facultad de Ciencias Qumicas. En las reas de laboratorio hay rtulos de informacin y los contenedores necesarios para eliminar los residuos biolgico-infecciosos: 1. Patolgicos (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/03) 2. Punzocortantes (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/05) 3. Miscelneos (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/06) Las actividades implementadas para monitorear el desempeo en el cuidado y mantenimiento del medio ambiente son: infecciosos. Inspeccionar el sitio donde se generan los residuos y los programas de recoleccin, tipos de equipo, material y procedimientos adecuados. Mantener los suministros de material necesario para la seleccin, clasificacin y empaque de residuos (contenedores plsticos, bolsas, cajas de cartn, etc.). Monitorear que se respete la programacin de las fechas de recoleccin de residuos, en funcin de sus volmenes de generacin de los mismos y realizar los ajustes y seguimientos necesarios. Vigilar que el transporte de los residuos biolgico-infecciosos generados sea el adecuado y bajo las normas de confinamiento para ste objeto. Garantizar que el destino final de los residuos biolgicos generados sea el adecuado segn las disposiciones de la Secretara de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca (SEMARNAP).
Capacitar al personal en el manejo adecuado de residuos biolgico-
Prcticas generales de seguridad y bioseguridad en el laboratorio. Reglamentos

El presente manual est sustentado bajo normas oficiales mexicanas y reglamentos de los Laboratorios de la Facultad de Ciencias Qumicas de la UJED, as como,
Normas de Seguridad especficas de las prcticas

a) Cuadro de Deteccin de Riesgos Particulares. Tipo de peligro Cortaduras Como evitarlo Utiliza guantes de asbesto y/o acerados en caso de manejar equipo cortante, as como solicitar al laboratorista y/o a tu docente las recomendaciones en el manejo del mismo. Como proceder en caso de un accidente Si el sangrado es intenso, aplica presin o una compresa directamente sobre la herida y consiga atencin mdica. Si la cortadura es pequea deja que sangre un poco y lvala con agua y jabn. Procura que la persona respire aire fresco. acomdala de modo que su cabeza quede debajo del cuerpo Procura que la persona respire aire fresco. Acomdala de modo que su cabeza quede debajo del cuerpo. Cierra todas las tomas de gas, desconecta todos los circuitos elctricos. Usa una manta contra el fuego o un extinguidor para apagarlos. Lava de inmediato el ojo con agua corriente. No permitas que la vctima se frote el ojo.
Descarga elctrica
Desmayo
Utiliza como tapete de piso un material aislante (madera) al encender o conectar electricidad; no tomes cables expuestos o daados visiblemente. Cerciorarte de la ventilacin en el rea de trabajo (extractores) y evita llevar a cabo la prctica en caso de sentirte dbil y/o mareado.
Incendio
Lesin de los ojos
Quemaduras
Apaga el equipo en caso de sobrecalentamiento y as mismo, desconctalo en forma inmediata. No uses material no equipo visiblemente daado. Utiliza lentes protectores y toma una distancia de medio metro o ms de ser posible en la actividad a desarrollar. Utiliza guantes, camisa de manga Lava con agua fra hasta que larga y tu bata de trabajo, tomando el la sensacin de ardor se material y el equipo calientes con calme. pinzas, contenedores, etc.
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b) Cuadro de Disposicin de desechos. Tipo de desechos Orgnicos e inorgnicos Como clasificarlos Tipo de contenedor
Orgnica: cscaras de frutas, El indicado para cada caso sobras de comida, cabello y uas, pasto y hojas, y esto es lo que usas para hacer la composta. Inorgnica: latas de aluminio y acero, pero deben de estar limpias. Al acabarse su contenido, se lavan como trastes normales y se dejan secar. Papel, cartn, envases de vidrio, de plstico.
c) Normas oficiales mexicanas. NOM-025-STPS-1999:5.1, 5.2, 5.3: NOM-001-STPS-1999:5.5. Condiciones de iluminacin en los centros de trabajo http://info4.juridicas.unam.mx/ NOM-017.STPS-2001:NOM-114-STPS-1994:NOM-022-STPS-1999 Sistema para la identificacin y comunicacin de riesgos para proporcionar seguridad a los trabajadores de los centros de trabajo, como una solucin a los problemas de riesgos de trabajo por esas sustancias. Se considera que existe una responsabilidad general para proporcionar seguridad a los trabajadores en los centros de trabajo. La comunicacin sobre riesgos es una parte importante de esta responsabilidad, ya que las empresas pueden llegar a utilizar sustancias qumicas y los trabajadores deben estar capacitados para reconocer el riesgo potencial de los diversos productos qumicos, en los procedimientos de operacin y saber usar el equipo de proteccin personal. Este sistema ha sido diseado para llenar la necesidad de una comunicacin efectiva y proporcionar informacin del uso seguro de sustancias qumicas por los trabajadores, a travs de la capacitacin de los elementos que componen el sistema. La parte central de este sistema es la identificacin de los riesgos inherentes de una sustancia:
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NOM-002-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad para la prevencin y proteccin contra incendios en los centros de trabajo. http://www.dif.gob.mx/edif/sad/SGC_CHN/EXTERNOS/NOM-002-STPS1993.pdf NOM-005-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad en los centros de trabajo para el almacenamiento transporte y manejo de sustancias inflamables y combustibles. http://wwweconomia.gob.mx/work/normas/noms/kpronoman/p005stps.pdf NOM-008-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para la produccin, almacenamiento y manejo de explosivos en los centros de trabajo. http://wwweconomia.gob.mx/work/normas/noms/kpronoman/p005stps.pdf NOM-009-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para la produccin, almacenamiento y manejo de sustancias corrosivas, irritantes y txicas en los centros de trabajo. http://wwweconomia.gob.mx/work/normas/noms/kpronoman/p005stps.pdf NOM-010-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se produzcan, almacenen y manejen sustancias qumicas capaces de generar contaminacin en el ambiente laboral. http://www.fabregat.com/catalogo/NOMs/NOM-010-STPS-1993.doc NOM-028-STPS-1993 Seguridad-cdigo de colores para la identificacin de fluidos conducidos por tuberas. http://www.celorio.com/vapor/norma.htm NOM-026-STPS-1993 Seguridad colores y su aplicacin. http://www.dif.gob.mx/edif/sad/SGC_CHN/EXTERNOS/NOM-026-STPS1993.pdf CONVENIO 170 (OIT) Convenio sobre la seguridad en la utilizacin de los productos qumicos en el trabajo. NOM-008-SCFI-1993 Sistema General de Unidades de Medida. http://www.ine.gob.mx/ueajei/publicaciones/nom-008a.html NOM-022-STPS-1999 Relativa a las condiciones de seguridad en los centros de trabajo en donde la electricidad esttica representa un riesgo. Electricidad esttica en los centros de trabajo. Condiciones de seguridad e higiene. http://www.steps.gob.mx/DGSST/normatividad/noms/Nom-022.pdf NOM-114-STPS-1994 Sistema para la identificacin y comunicacin de riesgos por sustancias qumicas en los centros de trabajo. http://www.facmed.unam.mx/deptos/salud/strabajo/pdf/nom-114.pdf
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Manejo de residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI) Los residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI), son los que contienen bacterias, hongos, virus, parsitos, microorganismos capaces de causar infecciones, efectos nocivos para la salud y el medio ambiente. NOM-087-ECOL-1995 Establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los RPBI que se generan en establecimientos que prestan atencin mdica (Diario Oficial de la Federacin 07/11/1995). Dicha Norma es de observancia obligatoria para los establecimientos que presten atencin mdica, tales como: hospitales, clnicas, laboratorios clnicos, laboratorios de produccin de agentes biolgicos, de enseanza e investigacin, tanto humanos como veterinarios en pequeas especies y centros antirrbicos, cuando estos generen ms de 25 kg/ mes o 1 kg/da de RPBI. http://bvs.insp.mx/artculos/2/11/06032001.pdf Los RPBI se clasifican en: 1. Residuos de sangre y sus derivados: plasma, suero, etc. 2. Cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos: vacunas, placas de cultivo, etc. 3. Residuos patolgicos: residuos de tejidos, rganos, partes y fluidos corporales, etc. 4. Residuos no anatmicos derivados de la atencin a pacientes y de los laboratorios: torundas, guantes, cubrebocas, tubos, etc. 5. Residuos de objetos punzocortantes usados o sin usar: navajas, jeringas, pipetas Pasteur, porta y cubreobjetos, etc. El siguiente cuadro muestra el color y tipo de envase requerido para cada uno de los tipos de RPBI: Tipo de residuos Sangre Cultivos y cepas de agentes infecciosos Residuos no anatmicos Patolgicos Patolgicos Objetos punzocortantes usados y sin usar Estado fsico Slidos Lquidos Envasado Bolsas de plstico Recipientes hermticos Color Rojo Rojo
Slidos Lquidos Slidos
Bolsas de plstico Recipientes hermticos Recipientes rgidos
Amarillo Amarillo Rojo
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Cuadro de Competencias Ubicar dentro del siguiente cuadro las competencias profesionales donde se ubica la ctedra de inmunologa, identificando los diferentes mbitos del desempeo profesional y laboral, el contenido requerido, as como tambin, las habilidades y actitudes que sern adquiridas durante el desarrollo de las prcticas de inmunologa. Competencia a adquirir Objetivo Intencin o finalidad Contexto o restricciones Rangos (s) o situacione s En los procesos acadmic os, relativos a la inmunolog a bsica
Aplicar
Aplicar en el laboratorio clnico las prcticas realizadas en el laboratorio de Inmunologa
Para realizar exmenes de diagnstico certeros y confiables
Utilizacin de los laboratorios, material y equipo correspondiente, en cada prctica
Mapa del sistema de prcticas de Inmunologa. Estructura y programa del sistema de prcticas. El presente manual forma parte esencial de la ctedra de Inmunologa, la cual se imparte en la Facultad de Ciencias Qumicas dentro del plan de estudios del octavo semestre de la carrera de Qumico Farmacutico Bilogo. Se desarrolla de manera secuencial, acorde al programa temtico de la parte terica de inmunologa, y es parte del sistema formativo bsico de los estudiantes de la carrera de Q.F.B. LABORATORIO Duracin: 6 sesiones (2 horas en cada una) que corresponden al 33.34% del curso.
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Competencia o unidad de competencia Encuadre
Semana 1.
Prcticas Introduccin a la parte prctica de la ctedra de Inmunologa Prctica No. 1 Animales de experimentacin Prctica No. 2 Diluciones Prctica No. 3 Mtodo de Ouchterlony Prctica No. 4 Determinacin de Inmunoglobulinas sricas Prctica No. 5 Brucelosis: Aspectos generales y serodiagnstico Prctica No. 6 Prueba de Rivanol Prctica No. 7 Primera parte. Aglutinacin estndar en tubo Segunda parte. Aglutinacin en tubo en presencia de 2Mercaptoetanol (2-Me) Primera parte. Aglutinacin estndar en microplaca Segunda parte. Aglutinacin en microplaca en presencia de 2-Mercaptoetanol (2-Me) Prctica No. 8 Antgenos de superficie de grupos sanguneos Prctica No. 9 Reacciones febriles Prctica No. 10 Antiestreptolisinas Prctica No. 11 Diagnstico precoz del embarazo Prctica No. 12 Diagnstico serolgico de sfilis Prctica No. 13 Determinacin del factor reumatoide
Tipo Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)
Pre-requisitos Lectura de reglamento de Laboratorio Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo
1. Unidad Generalidades sobre inmunidad y medios de defensa 2. Unidad Clulas involucradas en el fenmeno de fagocitosis 3. Unidad Inmunidad celular y humoral 4. Unidad Complemento 5. Unidad Anormalidades del sistema inmune e inmunidad frente a diferentes microorganismos 6. Unidad Autoinmunidad 7. Unidad Reacciones de hipersensibilidad
2.
3.
Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)
4.
5.
6.
7.
Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)
8.
8. Unidad Complejo Principal de histocompatibilidad (MHC) 9. Unidad Reacciones inmunolgicas 10. Unidad Inmunidad y terapia gnica: beneficios y riesgos 11. Unidad Biotica en Inmunologa 12. Unidad
9.
Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)
10.
11.
12.
13.
13. Unidad
14.
Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo
15
14. Unidad
15.
15. Unidad
16.
Prctica No. 14 Procedimiento para la obtencin de clulas mononucleares a partir de sangre total por el mtodo de Ficoll-Hypaque Prctica No. 15 Pruebas cruzadas Prctica No. 16 Prueba de Coombs directa Poder bactericida del suero normal
Laboratorio (2 horas)
Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo
Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)
17.
Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo
Contenido de cada prctica en particular

Se recomienda que la cantidad de alumnos por equipo para poder trabajar ptimamente en el laboratorio en la ctedra de Inmunologa, sea de 4 a 5 alumnos por mesa de trabajo, para un mejor desempeo personal y participativo de cada integrante. En el desarrollo de las prcticas se pretende que se conceptualicen y apliquen los trminos de respuesta inmune celular y humoral, fagocitosis, aglutinacin, precipitacin, inmunoglobulinas, diluciones, reacciones febriles, etc., asocindolos con la solucin de problemas enfocados a resolver problemas relacionados con la salud. Se pretende que con el presente manual el estudiante adquiera las habilidades y conocimientos necesarios para el buen desempeo en un laboratorio clnico y que con el conocimiento del fundamento de cada procedimiento den un razonamiento lgico al diagnstico presuntivo otorgado al mdico solicitante del estudio con un espritu crtico y resolutivo frente a los problemas que se puedan enfrentar en el ejercicio de su profesin.
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PRACTICA NO. 1 ANIMALES DE EXPERIMENTACIN Introduccin La biotica tiene como objetivo conectar la reflexin tica con la investigacin cientfica con la finalidad de construir una ciencia con conciencia al servicio integral del hombre, la experimentacin clnica, constituye un valor en s misma que debe ser buscado lcitamente por los cientficos y que no se contrapone con la instancia tica en cuanto al objetivo comn de ambas que es la bsqueda de la verdad para el hombre y para su salud. La Ley Federal de sanidad animal, publicada el 18 de Junio de 1993 (vigente) trata la prevencin y control de las enfermedades de los animales, la cual fija las bases para el diagnstico, prevencin, control y erradicacin de enfermedades y plagas de los animales terrestres, establece atribuciones de la Secretara en cuestiones de medidas zoosanitarias. Normas oficiales para productos, subproductos animales, productos qumicos, farmacuticos, biolgicos y alimenticios para uso en animales o consumo por stos, as como envases y rtulos. Normas que deben reunir los siguientes establecimientos: ferias, frigorficos, fbricas de productos o subproductos animales para consumo humano, los que fabriquen o expendan alimentos procesados para consumo animal y productos qumicos y farmacolgicos para uso en animales, hospitales y clnicas vegetarianas. Desde el punto de vista biotico, la experimentacin clnica es objetada en base al uso de los pacientes y el investigador y puede aplicarse en varias etapas de la investigacin: la seleccin de pacientes y su reclutamiento. La Ley Federal de Sanidad Animal contempla los laboratorios de prueba o diagnstico en cuanto al trato humanitario, cuidado zoosanitario y tcnicas de sacrificio. La eleccin de especies animales se basa en diversas consideraciones. Se debe tomar en cuenta si la especie en cuestin es susceptible a la enfermedad contra la cual estamos elaborando el producto. Es importante, adems considerar el costo de los animales as como el de su mantenimiento, el tamao y docilidad de los mismos, etc. Un factor importante en bioterios (unidades en donde se cran estos animales) y en laboratorios, es el manejo adecuado, tanto para evitar heridas por mordeduras y araazos, etc., como para evitar el excesivo sufrimiento de los mismos. El manejo de estos animales vara de especie a especie. En las figuras 1-7 se muestra el manejo adecuado de las especies ms comunes en el laboratorio. Las especies que ms se utilizan en el laboratorio son el cobayo, ratn albino, rata albina y el Hamster, ofrecen mayor dificultad la rata y el ratn porque al sentirse
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capturados muerden. El cobayo y Hamster son sumamente dciles, la manera ms fcil de tomar una rata es con una mano y de la cola y con la otra sujetar la piel del cuello, as queda inmovilizada. El ratn se toma boca arriba, tomando la cola con los dedos medio e ndice (como se toma un cigarro), y rodearlo con el resto de la mano. Para inyecciones o inoculaciones deber tomarse de la piel del dorso con el pulgar y el ndice, sostenindolo de la cola con el meique y el anular apoyados en la palma de la mano. El Hamster nicamente se utiliza la sujecin por la piel del dorso, ya que. Tienen la cola muy pequea. Los cobayos no ofrecen dificultad, basta con rodearlos por el dorso con una mano y ejerciendo poca presin porque fcilmente se asfixian. El uso de los animales de granja en investigacin cientfica debe estar sujeto a las mismas consideraciones ticas que el uso de otros animales para el mismo propsito, sin importar los objetivos cientficos del investigador ni las fuentes de financiamiento. Los sistemas de alojamiento para los animales de granja empleados en investigacin biomdica pueden o no ser diferentes de los usados en investigacin agrcola. Los animales utilizados tanto en investigacin biomdica como agrcola pueden alojarse en jaulas, pesebres, o pastizales. Algunos estudios agrcolas necesitan condiciones uniformes para minimizar la variabilidad medio ambiental y algunos estudios biomdicos se llevan a cabo en circunstancias de granja. Las guas para la utilizacin de los animales en estudios de campo preparadas por las sociedades profesionales son tiles siempre que se adhieran a los principios humanitarios. OBJETIVO Aprender el manejo adecuado de los animales ms comunes de laboratorio. METODOLOGA 1) Despus de observar el manejo de cada animal de laboratorio, tomars cada uno de ellos y practicars su manejo, con mucho cuidado, evitando molestar a los animales y evitar salir lesionado (Figuras 1-7). 2) Se llevar a cabo toma de muestra (venopunciones) a cada animal.
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TECNICAS DE VENOPUNCIN (SANGRADO) E INOCULACIN 1. Venopuncin o Inoculacin intravenosa en conejos. El conejo se inmoviliza como se muestra en la figura 2, se limpia la oreja en el margen exterior con una torunda y agua caliente, para favorecer la dilatacin de la arteria central; posteriormente, con una torunda se desinfecta la zona, con la ayuda de una jeringa tipo tuberculina con aguja delgada, se procede a tomar una muestra sangunea o inoculacin, segn sea el caso. Inoculacin intravenosa en ratas macho y cobayos. Anestesie al animal en cmara de ter. Despus colquelo en posicin ventral, localice la vena dorsal del pene y administre con una aguja delgada la sustancia deseada. Inoculacin intravenosa en ratn. Introduzca al ratn en un tubo de paredes lisas y con un orificio de salida en la tapa donde se extrae la cola. Limpie la cola con una torunda y agua caliente, para que la vena caudal se dilate e inocule con una jeringa de tipo tuberculina usando una aguja del 25. No debe forzarse la jeringa en ningn momento. Para la venopuncin se procede de la misma manera e incluso se puede cortar un pedazo de la cola. Inoculacin o venopuncin intraperitoneal en ratn. Sujete al animal con la mano, como se muestra en la figura 6, con la parte ventral hacia arriba, incline la cabeza hacia abajo, con la idea de que las viseras se desplacen hacia abajo, limpie la regin peritoneal con una torunda y agua caliente; posteriormente, con una torunda desinfecte la zona, con la ayuda de una jeringa tipo tuberculina con aguja delgada, se procede a tomar una muestra sangunea o inoculacin, al introducir la aguja debe percibir que perfora los dos planos (piel y pared abdominal). Inoculacin subcutnea en rata o ratn. Con la ayuda de unas pinzas, se inmoviliza al animal por atrs de las orejas, fije las pinzas del lado opuesto y jale la cola. Con los dedos pulgar e ndice forme un pliegue de la piel e introduzca la guja por este pliegue. Inoculacin con sonda gstrica. Se usa para administrar lquidos en estmago y para eso se una aguja roma, del tipo de las que se utilizan para anestesia raqudea en humanos. Sujete al animal con la parte ceflica hacia arriba con el dedo ndice y medio realice extensin del cuello e introduzca lentamente la sonda sin lastimar al animal. No es necesario anestesiar. Sangrado en aves. Se inmoviliza el animal como muestra la figura 1. Se sube una de las alas y abajo se localiza la vena alar, es la vena ms irrigada y se utiliza para realizar un sangrado exitosamente. Se limpia la zona con una rotunda y agua caliente, 19
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as se estimula la dilatacin, posteriormente se desinfecta con alcohol y se procede a tomar la muestra. Para realizar puncin cardiaca. Anestesiar al animal, limpiar la zona izquierda del trax , localizar el corazn y extraer lentamente la sangre usando una jeringa con aguja del nmero 20 x 32 Sangrado de yugular. En chivos y en carneros es relativamente fcil de realizar. Derribe al animal e inmovilcelo, crtele el pelo en un lado del cuello y localice la yugular, limpie con benzal el rea y ligue en la base del cuello lo que hace que se vea mejor la vena. Corte de vena axilar. Este sangrado se puede realizar en ratn, rata, cobayo. Se anestesia el animal, colquelo en posicin ventral y con un bistur realice una incisin en el rea axilar, corte plexo axilar y colecte la sangre con una pipeta Pasteur. Plexo venoso oftlmico. Es una tcnica para obtener pequeas cantidades de sangre en ratones y ratas. Anestesie al animal, introduzca una pipeta Pasteur en la parte interna del ojo girndola, despus se retira un poco para que la sangre suba por capilaridad.
INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. Por que es importante en Inmunologa conocer el manejo de animales de experimentacin? 2. Qu es la biotica? 3. Investiga la Ley Federal de Sanidad Animal CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) Que animales encontraste ms fcil de manejar, y porqu? 2) Que animales encontraste ms difcil de manejar, y porqu? 3) Realiza una lista de los animales manejados de acuerdo a su docilidad. 4) Cul es tu opinin acerca de la biotica y de la Ley Federal de Sanidad animal? Explica 5) Para que se realiza la inmunizacin de los animales y cuales son las prcticas de inmunizacin usando modelos en animales? 6) Cules son las especies que se usan con ms frecuencia?
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Posicin de las intraperitoneal
inyecciones:
a)
intravenosa
b)
DIAGRAMA DE FLUJO
1.- Observar la manipulacin adecuada del animal en cuestin. Metodologa
2.- Evitar molestar

a los animales, practicar su manejo con mucho cuidado.
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PRACTICA NO. 2 DILUCIONES En el laboratorio de Inmunologa constantemente estars realizando diluciones. Esto obedece a que, para determinar la cantidad de anticuerpos que tiene un animal, o la cantidad de antgeno que contiene una vacuna, etc., es necesario diluir stos hasta el punto donde ya no es posible detectar actividad. A este proceso se le denomina titulacin, y la ltima dilucin que todava muestra actividad se le denomina ttulo. Aunque existen muchas maneras de efectuar diluciones, dos de ellas son las ms utilizadas. Diluciones dobles Para iniciar una serie de diluciones dobles se mezcla una parte del lquido que se va a diluir en una parte del diluyente (por ejemplo, una parte de suero en una parte de solucin salina fisiolgica). A esta primera dilucin se le denomina 1:2, porque hay en este caso, una parte de suero en dos partes de lquido. Una vez mezclado esto se pasa una parte de la mezcla a una nueva parte de diluyente, la dilucin ahora es de 1:4 (Figura 1). Este tipo de diluciones son las ms utilizadas en Inmunologa, puesto que nos dan divisiones pequeas entre un tubo y el siguiente, permitiendo as determinar con bastante exactitud el ttulo de la muestra.
Diluciones Logartmicas: Estas diluciones se hacen de la misma manera que las dobles, pero en este caso, la muestra se mezcla cada vez con nueve partes (Figura 2). De esta manera se obtienen diluciones de 1:10, 1:100, 1:1000, etc. Este tipo de diluciones no se usan mucho en Inmunologa pero en ocasiones se recurre a ellas cuando se sospecha que el ttulo ser muy elevado, como por ejemplo, se titulan sueros de individuos sospechosos de Leptospirosis. El objetivo de esta prctica es aprender las tcnicas de diluciones.
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METODOLOGA 1) En una serie de 10 tubos, pon 0.25 mide agua en cada uno. 2) Deposita 0.25 ml de colorante en el primer tubo y mezcla muy bien. 3) Con una pipeta limpia, toma 0.25 ml del primer tubo y colcalos en el segundo tubo, mezclando bien.
4) Con una pipeta limpia, pasa 0.25 ml del segundo al tercer tubo, mezclando bien. 5) Repite el proceso en todos los tubos. 6) Observa y anota tus resultados. 7) En una serie de 10 tubos, coloca 2.25 ml de agua en cada uno. 8) Mezcla 0.25 ml de colorante en el primer tubo. 9) Cambia de pipeta y transfiere 0.25 ml de la mezcla de colorante del primer tubo al segundo tubo. 10) Repite el proceso en todos los tubos. 11) Observa y anota tus resultados. Realizar una dilucin DOBLE (1:2) de cido clorhdrico (HCl) en agua, en un volumen de 25 ml
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Soluto Diluyente TOTAL
PROPORCION 1 parte de HCl 1 parte de agua 2 partes en total
VOLUMEN 12.5 ml 12.5 ml 25.0 ml
Realizar una dilucin QUINTUPLE (1:5) de cido clorhdrico (HCl) en agua, en un volumen de 25 ml PROPORCION VOLUMEN Soluto 1 parte de HCl 5 ml Diluyente 4 partes de agua 20 ml TOTAL 5 partes en total 25.0 ml Realizar una dilucin 1:250 de cido clorhdrico (HCl) en agua, en un volumen de 25 ml PROPORCION VOLUMEN Soluto 1 parte de HCl 0.1 ml Diluyente 249 partes de agua 24.9 ml TOTAL 5 partes en total 25.0 ml De lo anterior se deduce que para obtener el volumen correspondiente a una parte de la dilucin (parte correspondiente al soluto), bastar dividir el volumen deseado entre el total de partes de la dilucin: SOLUTO = VOLUMEN TOTAL / TOTAL DE Partes de la dilucin
Posteriormente se multiplicar el valor de una parte por el nmero de partes que ocupa el diluyente, para determinar el volumen del mismo: DILUYENTE = Valor de una parte No. De partes del diluyente INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) Investigue que es dilucin. 2) Que finalidad tiene el conocer el ttulo en una aglutinacin? 3) Que diferencia habr entre una dilucin doble y una logartmica? CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) Hasta que dilucin llegaste en la primera serie de tubos? 2) Hasta que dilucin llegaste en la segunda serie de tubos?
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3) Porque cambiaste la pipeta en cada uno?
DIAGRAMA DE FLUJO
Realizar una dilucion DOBLE (1:2) de HCl en agua.
En un volumen de 25 mL.
Realizar una dilucion QUINTUPLE (1:5) de HCl en agua, en un volumen de 25 mL.
H2O
HCl
1 H2O HCl 1
20 mL
5 mL
Realizar una dilucion (1:250) de HCl en agua, en un volumen de 25 mL.
H2O
HCl
24.9 mL
0.1 mL
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En una serie de 10 tubos, coloca 0.25 de agua.
En el tubo 1, deposita 0.25 mL de oolorante.
Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del primer tubo y colocalos en el segundo tubo.
Mezclar muy bien.
1 2 3 4 5 H2O 6 7 8 9 10 1 1 2 2
Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del tubo 2, pasa al tercer tubo.
Mezclar muy bien. Repite el poceso con todos los tubos. observa y anota tus resultados.
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Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del primer tubo y colocalos en el segundo tubo.
En una serieserie de 10 tubos, En una de 10 tubos, coloca 0.25 0.25 de agua. coloca de agua.
Mezclar muy bien.
En el tubo 1, deposita 0.25 mL de oolorante.
1 2 3 4 5 H2O 2 2 1 1 6 7 8 9 10
Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del tubo 2, pasa al tercer tubo.
Mezclar muy bien. Repite el poceso con todos los tubos. observa y anota tus resultados.
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PRCTICA NO. 3 MTODO DE OUCHTERLONY REACCIONES DE INMUNODIFUSIN Cuando una solucin de antgeno soluble, es mezclado con un antisuero correspondiente, el antgeno se combina muy rpido con el anticuerpo y si las condiciones son las adecuadas los reactantes forman un precipitado. La velocidad de la reaccin de precipitacin est influenciada por factores fsicos, qumicos e inmunolgicos. Ouchterlony en 1947, introdujo el mtodo de inmunodifusin doble, es una tcnica de doble difusin en agar, se fundamenta en que cuando el antgeno y el anticuerpo, se difunden en un medio semislido (agar) forman un inmunoprecipitado, estable que se visualiza fcilmente. Antgeno y anticuerpo difunden simultneamente a partir de pozos cercanos, de modo que a su alrededor se forme un gradiente de concentraciones que, al alcanzarse y llegar al punto de equivalencia, formen bandas visibles de precipitacin. METODOLOGA 1. Se disuelve la Solucin salina amortiguada y el agar con ayuda de calor, ya disuelto totalmente, el volumen perdido se debe restituir con agua destilada. Para evitar la contaminacin microbiana se agrega 1 ml de solucin de timerosal 1:1000 en agua destilada. Se disponen de portaobjetos o capas petri. Barnice los portaobjetos con agarosa al 1% y squelos al horno. Funda agarosa al 1% y en caliente se colocan 5 ml de la agarosa al portaobjeto, sin derramar. Deje que gelifique. Si usa caja petri se llenan hasta una altura de 1 a 2 mm con la solucin de agar an caliente. Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente y si no se van a utilizar el mismo da, las cajas petri pueden guardarse en cmara hmeda a 4C. Al agar de la caja petri se le hacen varias perforaciones: una central y dos o ms alrededor de sta. En el pozo central se coloca el antgeno que se desea investigar, y en los pozos perifricos se colocan los diversos antisueros. Tanto los antgenos como los antisueros se difunden por el agar, separndose por su peso molecular, de tal manera que los que tienen menor peso se difunden ms rpidamente. Cuando el antgeno y su anticuerpo especfico se encuentran, se unen y precipitan. Este precipitado se ve como una estrecha banda blanca en el agar. Perfore los portaobjetos con un sacabocados, distribuya los agujeros alrededor de un pozo central (3 mm de dimetro aproximadamente), en 30
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donde se colocar el anticuerpo, el antgeno se coloca en pequeos pozos laterales. Se debe mantener una distancia de aproximadamente 0.5 cm entre pozo y pozo. 5. Incube en una cmara hmeda, a temperatura ambiente por 24 h. Observe las bandas de precipitacin, los portaobjetos tambin se dejan reposar en una cmara hmeda y se deja proseguir la difusin a temperatura ambiente durante 24 h. INTERPRETACIN Se busca la presencia de bandas opalescentes entre ambos pozos. El nmero de bandas indica la cantidad de sistemas antgeno-anticuerpo presentes en las preparaciones. Si se trata de comparar dos antgenos, habr identidad total entre ambos si se establece la continuidad en el punto donde se alcanzan las bandas correspondientes a uno y otro; no hay identidad si ambas bandas slo se cruzan y cada una continua en lnea recta; identidad parcial si hay un fenmeno mixto. Si al cabo del perodo de incubacin no aparecen las bandas de precipitacin o stas an no son muy claras, puede proseguirse la incubacin durante el tiempo que sea necesario. Debe siempre vigilarse que el agar no se deshidrate. Las bandas pueden teirse con algn colorante de protenas (amido negro, eosina, fucsina, etc.) para ser mejor observadas. VENTAJAS DE LA PRUEBA DE OUCHTERLONY a. b. Se puede ver de cuantos antgenos est compuesto un producto (embutido, bacteria, etc.). Se pueden comparar antgenos y antisueros entre s. En efecto, cuando en dos pozos adyacentes existe un mismo anticuerpo contra el antgeno central, la lnea de precipitacin se une. A esta lnea se le denomina identidad total. Cuando los anticuerpos son diferentes y reaccionan contra antgenos del pozo central, las lneas de precipitacin se cruzan y se les denomina no identidad. Existe tambin la posibilidad de que se encuentren dos o ms antgenos diferentes que tengan el mismo peso molecular y que uno de ellos tenga anticuerpos especficos en dos pozos adyacentes y el otro solo en uno. En este caso, la lnea estar al mismo tiempo, unida y cruzada, denominndose a este fenmeno identidad parcial.
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INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. A que se le llama precipitacin? 2. Investigue el sistema de difusin de Oudin (1947) 3. Investigue las aportaciones de Grabar y Williams (1953) 4. Investigue el mtodo de Manzini 5. Investigue el mtodo de Ouchterlony CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE A. B. C. D. Realiza un esquema de las perforaciones que realizaste sealando los diferentes antisueros y el antgeno que utilizaste Efecta un esquema de las lneas obtenidas en la precipitacin en gel. Enumera las fuerzas fisicoqumicas que son responsables de la unin antgeno-anticuerpo Consideras que esta prueba puede utilizarse para la identificacin de los grupos sanguneos en manchas de sangre en Medicina Legal, y porque?
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DIAGRAMA DE FLUJO
Se disulve la solucin salina amortiguadora y el agar con ayuda del calor.
Ya que este disuleto totalmente, el volimen perdido se restituye con agua destilada.
Solucin salina
H2O Destilada
Agre time ga 1 mL r des ti os al 1:1 de s oluc 0 la i c onta da, p/e 0 0 en a n v it gua mina c i n ar mic r obia na.
H2O Destilada
Fundir agarosa al 1% y en caliente se colocan de 1 a 2 mm en la caja petri con una solucin de agar caliente.
Barnizar las cajas petri con agarosa al 1% y secarlos al horno.
Se seja solidificar el agar a temperatura ambiente, al agra de la caja de petri se le hacen varias perforaciones.
En el pozo central se coloca el antigeno que se desea investigar, y en los pozos perifericos se colocan se colocan los diversos antisueros.
Incube en una camara humeda, a temperatura ambiente por 24 horas, observe las bandas de precipitacin.
Antisuero
Antigeno
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PRCTICA NO. 4 DETERMINACIN DE INMUNOGLOBULINAS SRICAS 1 PRUEBA DE PRECIPITACIN DEL SULFITO DE SODIO OBJETIVO El alumno determinar la presencia de inmunoglobulinas (Igs) sricas llevando a cabo la prueba de precipitacin de sulfito de sodio. FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la precipitacin de Igs del suero por sales de sulfito de sodio. Esta prueba es til cuando se determina la presencia de Igs en recin nacidos hasta tres semanas de edad. Su interpretacin es de tipo objetivo y tiene un porcentaje de confiabilidad de aproximadamente 93%. Es indispensable que la muestra sea de suero y no plasma, ya que este contiene protenas que se precipitaran con las Igs, dando falsos resultados. La hemlisis parcial de la muestra parece no afectar los resultados de esta prueba. Esta prueba permite diagnosticar la Falla en la Transferencia de Igs (FTI). METODOLOGA Se preparan tres soluciones de sulfito de sodio al 14, 16 y 18% en agua destilada. Se colocan 1.9 ml de cada solucin en tres tubos de ensaye (con capacidad de 3 a 5 ml) y se aade 0.1 ml de suero a cada uno de los tubos, mezclando perfectamente bien el contenido. INTERPRETACIN En caso de haber titulacin de Igs, se observar turbidez en forma inmediata y la formacin de un precipitado al cabo de 30 - 60 min. Los resultados se interpretan de la siguiente manera: Precipitacin en los tubos con 14, 16 y 18%: 15 mg Ig/ml de suero. Precipitacin en los tubos con 16 y 18%: 5 - 15 mg Ig/ml de suero. Precipitacin en los tubos con 18% o ninguna precipitacin: 5 mg Ig/ml de suero.
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DIAGRAMA DE FLUJO
1
Se preparan tres disoluciones de sulfito de sodio al 14, 16 y 18 % en agua destilada.
Prueba de precipitacin del sulfito de sodio
ZnSO4 7H2O
Sulfito de sodio 14 %
2
Colocar 1.9 de cada solucion y colocar 0.1 ml de suero en cada tubo.
Mexclar perfectamente el contenido.
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2 PRUEBA DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC OBJETIVO El alumno determinar la presencia de Igs sricas llevando a cabo la prueba de turbidez de sulfato de zinc. FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la precipitacin de Igs del suero al entrar en contacto sales de sulfato de zinc. Esta prueba es til cuando se determina la presencia de Igs en recin nacidos hasta tres semanas de edad. Su interpretacin es de tipo objetivo, el grado de turbidez desarrollado por la reaccin tiene una correlacin de 0.96 con el contenido de IgG o IgM del suero. Sin embargo, esta prueba puede verse afectada por la temperatura ambiental, el periodo de incubacin, la presencia de bixido de carbono en el reactivo y el grado de hemlisis de la muestra. Es indispensable que la muestra sea de suero y no plasma, ya que esta ltima causa lecturas ms altas en los resultados. Esta prueba permite diagnosticar la FTI. METODOLOGA 1. Se colocan 20.8 mg de Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4 7 H2O) dentro de un frasco color mbar de 100 ml de capacidad, se aade agua destilada a temperatura ambiente (previamente hervida) hasta llegar a la marca de 100 ml. Inmediatamente se cierra el frasco con su tapn y se agita hasta lograr una disolucin total de la sal. Se fija el tapn a la botella con cinta adhesiva para lograr un buen sellado. La solucin del reactivo debe sustituirse aproximadamente cada dos meses, ya esta absorbe gradualmente bixido de carbono, lo que altera los resultados de la prueba. Tambin la exposicin excesiva a la luz afecta la solucin, la solucin debe guardarse en refrigeracin a una temperatura de 4 a 7C 2. Se toman 0.1 ml de suero y se colocan en un tubo de ensayo al que se agregan 6 ml de la solucin de ZnSO4 7H2O. 3. Se agita suavemente la muestra y se deja incubar por una hora a 20C.
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4. Se calibra el espectrofotmetro a 0, utilizando un tubo control con el reactivo de ZnSO4 7 H4O. A continuacin, se mezcla bien el contenido del tubo prueba y se lee en el espectrofotmetro. 5. Se lee el grado de absorbancia (turbidez) a una longitud de onda de 660 nm. 6. El resultado se multiplica por 10 y se expresa como el nmero de unidades de turbidez del ZnSO4 7 H4O. El nmero de U. TSZ corresponde a los miligramos de Igs totales por mililitro de suero. El nmero de U. TSZ se ha relacionado con las posibilidades de supervivencia del neonato. Menos de 10 U. TSZ (menos de 10 mg/ml): estos niveles son insuficientes para una proteccin adecuada (septicemia, diarrea por E. coli, etc. De 10 a 20 U. TSZ (de 10 a 20 mg/mI): accin de organismos patgenos sobre la mucosa intestinal ocasionando diarreas, principalmente. Ms de 20 U. TSZ (ms de 20 mg/ml): lactacin exitosa. A medida que aumentan los niveles de anticuerpos (Abs), la mortalidad por causas infecciosas, se reduce hasta eliminarse por completo cuando sobrepasan las 40 U. TSZ.
DIAGRAMA DE FLUJO
1
Colocar 20.8 mg de ( ZnSO4 7H2O), dentro de un frasco color ambar.
Aadir agua destilada (previamente hervida) 100 mL. Inmediatamente se cierra el frasco con su tapon, agitacndo hasta llegar a la dilusion total.
ZnSO4 7H2O
ZnSO4 7H2O
20.8
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2
Una vez separado el suero, tomar 0.1 mL y colocarlo en un tubo de ensayo.
Agregar 6 ml de la solucion de (
ZnSO4 7H2O), agiitar suavemente la muestra.. Incubar durante una
hora a 20 C
AGITAR SUAVEMENTE
Leer al espectofotometro a 660 nm. el resultado se multiplica por 10.
ZnSO4 7H2O
ZnSO4 7H2O
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3 PRUEBA DEL GLUTARALDEHDO Se colocan 50l de una solucin de glutaraldehdo al 10% en un tubo de ensaye, agregar 0.5 ml de suero y mezclar perfectamente. El tiempo requerido para que ocurra la coagulacin es inversamente proporcional a la concentracin de Igs en suero. Las muestras sricas con alta concentracin de Igs coagulan la muestra entre 5 y 15 min. INVESTIGACIN EXPERIMENTO PREVIA AL
1. Investigue la estructura de una Ig 2. Describa las caractersticas de cada una de las Igs 3. Porque es importante determinar la presencia de las Igs?
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PRACTICA NO. 5 BRUCELOSIS: Aspectos generales y Serodiagnstico Aspectos generales: Se entiende por Brucelosis al conjunto de enfermedades provocadas por los microorganismos del gnero Brucella tanto en el hombre como en los animales. Investigaciones en historia de la medicina consideran que la brucelosis es una enfermedad conocida desde Hipcrates (400 a. C.); sin embargo, las primeras descripciones en las que se presenta con claridad son las de Cleghorn en 1751. Marston en 1863, realiz estudios clnicos cuidadosos y autopsias de fiebres de Malta remitentes y en 1863 present una descripcin detallada de la enfermedad tal como ocurra en Malta, la que fue confirmada por otros investigadores, no solo en esas Islas sino en otras zonas, considerndose desde entonces como padecimiento endmico caracterstico de los pases del mediterrneo. Por otro lado, el agente causal de la Brucelosis fue descrito por Bruce en 1886, en el bazo de soldados muertos por esa enfermedad. El mayor impacto de esta enfermedad en el humano se debe al alto costo del tratamiento, la prdida de horas de trabajo, los costos de hospitalizacin y diagnstico. Es una enfermedad principalmente de animales y el hombre se infecta de manera accidental al estar en contacto con productos, subproductos o secreciones de animales infectados ya sea porque trabaja en ranchos ganaderos, empacadoras de carnes, queseras, rastros, frigorficos o por consumir leche o sus derivados sin pasteurizar. El gnero Brucella incluye tres especies importantes: B. melitensis, que infecta primordialmente cabras, pero puede infectar bovinos y cerdos; es el agente ms patgeno responsable de la mayora de los casos humanos; B. abortus, responsable de la brucelosis bovina y de patogenicidad moderada para el hombre; B. suis, cuyo reservorio primario son los cerdos; B. neotomae que se asla de la rata de bosque; B. canis de los perros. Actualmente, se ha aislado B. maris que se encuentra en los animales marinos. Dos nuevas especies han sido propuestas para ser adicionadas a este gnero, B. cetaceae y B. pinnipediae aisladas de mamferos marinos, cetceos y pinipedios, respectivamente. Tambin la B. cetaceae se ha aislado de focas.
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1. Resistencia y sobrevivencia Comparada con otras bacterias patgenas no esporuladas, Brucella tiene la capacidad de sobrevivir y persistir en el medio ambiente bajo ciertas condiciones de humedad y temperatura (Cuadro 1). A baja temperatura, Brucella puede sobrevivir en la tierra ms de 10 semanas y en el estircol lquido ms de 2 1/2 aos. En canales congeladas puede sobrevivir por muchos aos. La Brucella es bastante sensible al calor ya que muere a temperatura de pasteurizacin o a una exposicin de 60 C por 30 min o a 70 C durante 10 min. Es bastante sensible a las radiaciones ionizantes y muere rpidamente al ser expuesta a los rayos ultravioleta o rayos Gama de tal manera que bastan 4 5 h de exposicin a la luz solar para que muera la bacteria. En leche a 15 C puede sobrevivir durante 38 das y en queso a 4.4 C hasta 180 das. En placenta y tejidos fetales expulsados por los animales durante la primavera y el invierno puede sobrevivir hasta por 135 das. 2. Desinfectantes empleados en el control de Brucelosis Las explotaciones pecuarias afectadas de brucelosis se deben desinfectar peridicamente de acuerdo a los resultados obtenidos en los muestreos serolgicos, es muy importante la desinfeccin de los materiales posteriormente a los partos as como de otras reas donde ocurren los nacimientos. Todas las especies de Brucella mueren al exponerse a los desinfectantes comunes tales como componentes fenlicos al 3%, solucin de sosa custica al 2%, creolina al 5% as como formol al 2%. El material de laboratorio empleado debe enjuagarse y desinfectarse en una solucin de fenol al 5% durante la ejecucin de pruebas (Cuadro 2). Serodiagnstico Debido a que el aislamiento de Brucella a partir de personas o animales infectados es difcil y prolongado se utilizan y se confa en las pruebas serolgicas para el diagnstico rutinario de Brucelosis. Las pruebas de aglutinacin para el diagnstico son las ms utilizadas en Mxico. Prueba rpida en placa con antgeno Rosa de Bengala Es una prueba rpida de aglutinacin en la que se emplea una suspensin de clulas de B. abortus (99S) teidas con colorante Rosa de Bengala y disueltas en cido lctico a pH 3.6. Esta prueba ha sustituido a la prueba de Huddleson, por ser ms sensible y especfica.
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Se considera como prueba positiva cuando ocurre cualquier tipo de aglutinacin y negativa cuando no hay aglutinacin al cabo de 4 min. Prueba de fijacin de complemento La finalidad de la reaccin de fijacin de complementos (FC) es descubrir si en el suero existen anticuerpos especficos contra un antgeno al comprobar que el complemento desaparece (fijacin) cuando se mezcla con el suero (anticuerpo). Al formarse un complejo antgeno anticuerpo ste fija el complemento presente en el medio, una vez fijado, este complemento est incapacitado para la lisis de glbulos rojos sensibilizados aadidos en una segunda fase. Esta prueba ha demostrado ser exacta y sensible. Es una prueba excelente, slo que para su realizacin requiere de personal capacitado, as como material y equipo adecuados. Prueba de Coombs (prueba de la antiglobulina) Es una tcnica muy laboriosa y se basa en la demostracin de anticuerpos no aglutinantes que en general pertenece a las clases lgG e IgA. Cuando este mtodo se compara con la prueba de aglutinacin en tubo los ttulos obtenidos por Coombs son superiores, sobre todo en pacientes con brucelosis crnica en donde pueden llegar a ser 200 veces mayor al ttulo. La prueba tiene una limitante ya que como mnimo se requieren 48 h para obtener resultados, de tal manera que algunos investigadores lo han sustituido por el mtodo de inmunofluorescencia indirecta que determina este tipo de anticuerpos. Esta prueba detecta anticuerpos especficos que se han unido al antgeno pero que son incapaces de aglutinar. La prueba emplea una antigammaglobulina que se une a los anticuerpos que previamente se unieron a las clulas de Brucella, lo que da por resultado una aglutinacin visible. Para el caso de la prueba de Coombs aplicada a sueros se utiliza la antiglobulina bovina (Alton). Prueba de ELISA Los trabajos publicados indican que el mtodo de Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en ingls), es una prueba muy sensible y especfica y capaz de distinguir entre Brucelosis aguda y crnica. El antgeno ms utilizado consiste en una suspensin de bacterias lisas o de extractos enriquecidos en lipopolisacridos (LPS) as como algunos antgenos de protenas exteriores de la membrana (OMP). Con este mtodo se identifican
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inmunoglobulinas totales (lgG, lgM, e IgA principalmente) presentes en el suero o en liquido cefalorraqudeo. La prueba utiliza como reactivo anticuerpos antiinmunoglobulinas acoplados a una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina, betaglucoronidasa, etc.) estos anticuerpos reaccionan con las inmunoglobulinas y su antgeno. La muestra problema se hace reaccionar con su antgeno que se halla fijo en una superficie y si posee anticuerpos que se unen al antgeno hay reaccin la cual se pone en evidencia con el reactivo enzimtico y su substrato. La prueba se lleva a cabo en placas de microtitulacin de poliestireno. Despus de varios perodos de incubacin la lectura se realiza en un lector de ELISA en el cual se determina absorbancia a 492 nm. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Este mtodo conocido como PCR, por sus siglas en ingls, permite la rpida amplificacin del material gentico para su posterior anlisis. El DNA de la Brucella sp es extrado mediante la tcnica de fenolcloroformo modificada; posteriormente el DNA purificado se amplifica con la PCR. La PCR permite ampliar el material gentico de la Brucella sp para su posterior anlisis. La tcnica est basada en el hecho de que las enzimas que realizan la sntesis del DNA requieren de la presencia de un iniciador o primer para copiar la cadena que les sirve de molde y en que la capacidad del DNA de formar hbridos es dependiente. El DNA obtenido se conserva a temperatura menor de 20C hasta su procesamiento. La prueba ha sido de gran impacto, ya que goza de una gran sensibilidad y especificidad, puede determinar gnero, especie y hasta variedad en un corto tiempo. Cuadro 1: Tiempo de sobrevivencia de B. abortus bajo diversas condiciones ambientales (Gillespie y Timoney, 1981). Medio Exudado uterino Placenta, rganos fetales Leche Temperatura o Condiciones estacin ambientales Febrero Sobre la tierra Invierno y primavera Bajo las hojas en el bosque 15C Muestras de leche de vacas infectadas 4.4 C 12-21 C Feb. 15 -27 C Mayo Tiempo de sobrevivencia (d) 10 135 38
Mantequilla Queso Pasto
152 mm de lluvia Exposicin al sol
142 180 6 <1 43
Cultivos en placa abierta Agua Cadver de cobayo infectado
2.2-21 C Nov. Octubre y Nov. <40 C. 37 C, 25 C, 8C. Enero (Wisconsin) Junio y Agosto (Wisconsin) Enero (Wisconsin) 0 -20C 70C
Exposicin al sol
5 2 -3 800 57 44 1 29 65 < 4h 2 250
Sobre la tierra Sobre la tierra Bajo la tierra Muestra del fondo Muestra de la parte superior
Carne y carne salada Abono en seco
Abono colocado
12C
Cuadro 2: Productos recomendados para la desinfeccin en caso de brucelosis (Trejo, S. J., 1988). Desinfectante Concentracin de solucin en % 2-2.5 2 10-20 5 2 Temperatura de la solucin 20 70-80 Ambiente 70-80 70-80 Exposicin (h) 1 3 3 3 3
Cloruro de calcio Solucin de sosa caustica Cal recin apagada Emulsin de creolina Solucin de formol
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PRUEBA RAPIDA DE AGLUTINACIN EN PLACA (ROSA DE BENGALA (Card Test)) INTRODUCCION Se emplea para el diagnstico de brucelosis, es una prueba de aglutinacin en donde se emplea el antgeno rosa de Bengala, cuando esta reaccin es positiva el diagnstico se debe de complementar desarrollando las pruebas de aglutinacin en tubo y/o microplaca y la prueba de aglutinacin con 2-mercaptoetanol (2-Me) en tubo y/o microplaca. Anteriormente, se realizaba la prueba de Huddleson y fue muy utilizada en todo el mundo para diagnstico de brucelosis, pero segn observaciones de la Universidad de Minnesota, este mtodo si se utiliza solo debe usarse como prueba de seleccin porque se han encontrado a menudo reacciones falsamente positivas. OBJETIVO Desarrollar la prueba de tarjeta rosa de bengala como prueba tamiz para diagnstico de brucelosis. FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la bsqueda de Abs que se ponen de manifiesto para hacerse reaccionar con los antgenos complementarios que existen en la superficie bacteriana. METODOLOGA 1) Centrifugar la sangre y separar el suero del paquete celular (1500 rpm). 2) Antes de utilizar cualquier antgeno se debe llevar a cabo una prueba del antgeno a utilizar con un suero control positivo y un suero control negativo. Se depositan 0.08 ml de suero positivo en un valo de la placa serolgica y 0.08 ml de suero negativo en otro valo, se agrega una gota de antgeno en cada uno, se mezcla con aplicador y se somete a rotacin mecnica o elctrica durante cuatro min. 3) Con una pipeta serolgica (Bang) se extrae suero (a temperatura ambiente) problema. Manteniendo la pipeta en ngulo de 45 se deposita en una placa de vidrio serolgica, en el primer valo se depositan 0.08 ml, en el segundo 0.04 ml, en el tercero 0.02 ml, 0.01 y 0.005 ml.
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4) El frasco que contiene el antgeno se homogeniza por agitacin (a temperatura ambiente) y se deposita una gota (0.03 ml) del antgeno sobre cada una de las cantidades de suero problema. 5) Con un removedor o aplicador de madera se mezclan el antgeno y el suero (comenzando con la dilucin ms baja a la ms alta), extendindose cada una de las mezclas en crculos. 6) Agitar la placa manualmente o por rotacin mecnica, durante cuatro min. 7) Observar la placa sobre un fondo bien iluminado. 8) Anotar y registrar el grado de aglutinacin en los primeros cuatro min. 9) Reportar el ttulo del suero como recproco de la ltima dilucin donde se observe aglutinacin. INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) Que es aglutinacin? 2) Describa el concepto de antgeno y anticuerpo. 3) Investigue que es Brucilla 4) Cules son las diferentes especies de Brucella? 5) Describa su morfologa 6) Explique que es una reaccin cruzada. 7) Cual es el principal antgeno de superficie de Brucella? 8) Con que bacterias Brucella presenta reaccin cruzada? 9) Cual es la Brucella que presenta mayor patogenicidad y porque evade la fagocitosis? 10) Porque el antgeno de Huddleson ya no se utiliza para diagnstico de Brucelosis?
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CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) Qu es serologa? 2) Que resultado obtuviste en la prueba Rosa de BENGALA? 3) Por qu solo se reporta esta tcnica como positivo o negativo? 4) Qu es el antgeno Rosa de Bengala? 4) Anota 5 enfermedades que diagnosticaras por aglutinacin?
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PRACTICA NO. 6 INTRODUCCIN La brucelosis es una zoonosis que tiene una distribucin mundial. La Brucelosis es una enfermedad infectocontagiosa y zoontica de origen bacteriano que afecta al ser humano y a diferentes especies animales domsticas, sobre todo al ganado bovino, ovino y caprino. La enfermedad en los animales ocasiona grandes prdidas econmicas debido a disminucin en la produccin de leche, abortos e infertilidad en machos y hembras. Generalmente, la brucelosis bovina se caracteriza por provocar aborto en el ltimo tercio de la gestacin. El gnero Brucella est formado por bacterias parsitas intracelulares facultativas, que producen el aborto epizotico en muchas especies domsticas de animales y una enfermedad febril septicmica o infecciones focalizadas en el hombre. Tiene una importante repercusin econmica en la produccin pecuaria, debido a que provoca abortos, metritis, infertilidad y el nacimiento de animales dbiles, constituyendo un serio problema para la salud pblica. La especie de Brucella que afecta al ganado bovino son B. abortus, al ganado caprino, B. melitensis, en borregos es B. ovis la que causa la infeccin, para perros B. canis, en cerdos B. suis y para roedores B. neotomae. B. abortus primeramente infecta a ganado bovino y puede ser transmitida a perros, caballos, borregos y al hombre. La prueba solamente detecta Abs del grupo lgG que estn presentes en el suero de animales infectados, esta prueba nos diferencia los animales vacunados de los animales infectados con Brucella. Al respecto, es importante mencionar que esta diferenciacin solo ocurre cuando el animal fue vacunado con la cepa atenuada 19 de B. abortus, al contrario que si fue vacunado con la cepa RB51 de B. abortus, la prueba diagnstica de rivanol no diferenciar estos anticuerpos por no tener especificidad contra esta cepa y solo detectar animales infectados al igual que la prueba de tarjeta. Por lo tanto, es importante seguir investigando nuevas tcnicas diagnsticas que sean capaces de detectar con gran confiabilidad cualquier tipo de reaccin ya que existen una serie de factores que influyen en el control de la brucelosis. OBJETIVO Diagnosticar la brucelosis bovina y/o caprina en animales infectados con Brucella, con la tcnica diagnstica Rivanol.
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FUNDAMENTO El diagnstico de brucelosis en los laboratorios se fundamenta en pruebas convencionales que identifican anticuerpos circulantes en sangre. La prueba se basa en la precipitacin de la albmina y las macroglobulinas por la accin del lactato-2-etoxi-6-9-diamino acridina (Rivanol) poniendo de manifiesto la IgG. METODOLOGA a) El suero problema, el antgeno y la solucin de rivanol deben estar a temperatura ambiente por lo menos una hora antes de realizar la prueba. b) Antes de procesar la prueba diagnstica rivanol, se debe de realizar la prueba de tarjeta, como prueba tamiz capaz de identificar una mnima cantidad de sueros falsos negativos, ya que si esta prueba no manifiesta aglutinacin (negativa) no es necesario realizar las pruebas confirmatorias como rivanol o fijacin de complemento. c) En un tubo pequeo (13 x 100 mm), depositar 0.4 ml del suero problema. Agregar 0.4 ml de solucin rivanol y mezclar bien agitando el tubo y dejar a temperatura ambiente no menos de 10 min y no ms de una h. d) Centrifugar las mezclas a 1000 x g durante 5 a 10 min. e) Con pipeta serolgica, aspirar el lquido sobrenadante y hacer una prueba de aglutinacin similar al mtodo de tarjeta. En una placa de vidrio clara y limpia, depositar cantidades de 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 ml. f) Agregar una gota (0.03 ml) de antgeno rivanol a cada cantidad de lquido sobrenadante, mezclar con un aplicador de madera, removedor mltiple metlico agitador mecnico, comenzando con la cantidad ms pequea (0.01 ml). Cada dilucin debe ser extendida de forma que cubra la superficie indicada para la prueba estndar de aglutinacin en placa (18, 21, 24 y 27 mm, respectivamente). g) Si se usa removedor mltiple metlico, enjuagarlo y secano bien antes de pasar la siguiente muestra. h) Inclinar la placa imprimindole movimiento circular hacindola girar 4 veces.
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i) Transcurridos 6 min, girar 4 veces la placa. A los 12 min rotar nuevamente la placa y efectuar la lectura con luz indirecta sobre fondo negro. INTERPRETACION Para facilitar las lecturas y la comparacin con los resultados en otras pruebas se acepta denominar a las diluciones obtenidas como de 1:25, 1:50, 1:100 y 1:200, respectivamente. El resultado se expresa en funcin de la dilucin ms alta en la que observa aglutinacin. Cualquiera que sea el ttulo de reaccin, se interpreta como infectado (ttulo 1:25), ya que la prueba solamente detecta anticuerpos del grupo lgG en la misma forma que en la prueba de 2-Me en animales vacunados. El rivanol puede causar cierta precipitacin de lgG, por lo cual el ttulo final puede ser inferior al obtenido con la prueba de 2-Me. Nota: 1:25 sospechoso en animales vacunados (Alton). INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) En que casos es til la prueba de rivanol? 2) Que diagnosticamos en una prueba de rivanol? 3) Cuales son los anticuerpos aglutinantes? 4) Que anticuerpos se detectan en esta prueba? 5) Como se da la respuesta inmunolgica a la infeccin por Brucella? 6) Que Brucella es la ms resistente al mecanismo de muerte intracelular? 7) Porque se debe suspender la administracin de un antibitico 48 h antes de tomar una muestra de sangre? CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) Que inconvenientes encontr al realizar la prueba de rivanol? 2) Porque no se utiliza esta prueba para diagnstico de Brucelosis en el hombre? 3) Que diferencia hay entre el fenmeno de prozona y postzona? Explique.
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DIAGRAMA DE FLUJO
El suero problema, el antigeno y la solucion de rivanol, deben estar a temperatura ambiente.
Depositar 0.4 ml de suero problema.
Depositar 0.4 ml de solucion rivanol al 1%.
Mezclar bien agitando el tubo. dejar a temperatura ambiente 10 minutos.
Antigeno
Suero problema
Rivanol 1%
Rivanol 1%
Rivanol 1%
En placa de vidrio, depositar 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 ml.
Con pipeta serologica Bang, aspirar el liquido sobrenadante y hacer una prueba de aglutinacion.
Centrifugar a 2000 rpm de 5-10 minutos.
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Agregar 0.03 de antigeno rivanol a cada cantidad de liquido sobrenadante.
Rivanol 1%
Mezclar con aplicador de madera, trancurridos 6 minutos girar 4 veces la placa en forma indicada al punto anterior.
A los 12 minutos rotar nuevamente la placa y efectuar la lectura con luz indirecta sobre fondo negro.
0.01 ml 0.02 ml
0.04 ml
0.08 ml
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PRACTICA NO. 7 PRIMERA PARTE AGLUTINACION ESTNDAR EN TUBO INTRODUCCIN Las pruebas serolgicas se efectan para determinar la presencia de anticuerpos especficos anti-Brucella en el suero del paciente, para observar el incremento del ttulo en la brucelosis aguda y para evaluar la eficacia del tratamiento. Dichas pruebas serolgicas incluyen aglutinacin con rosa de bengala, aglutinacin estndar y aglutinacin en presencia de 2-Me. La interpretacin de los resultados es diferente en los casos de brucelosis aguda y crnica. En las etapas tempranas de la infeccin la aglutinacin estndar es positiva mientras que la de 2-Me permanece negativa. Con la evolucin de la enfermedad, se observa aumento en el ttulo de la prueba de 2-Me, llegando a alcanzar ttulos tan elevados como los de aglutinacin estndar. Un ttulo de 1:20 - 1:40 en la prueba de aglutinacin estndar por s solo puede ser sospechoso, pero no es definitivo, mientras que igual ttulo en la prueba 2-Me indica una infeccin activa y requiere tratamiento; los resultados de la prueba de 2- Me indican en forma til en lo que se refiere a la respuesta del paciente al tratamiento antimicrobiano. El antgeno usado en las pruebas de aglutinacin para detectar Abs en contra de B. melilensis, B. abortus y B. suis se prepara con suspensiones lisas de B. abortus cepa 99 S (o con B. abortus 1119-3). Si se desea investigar anticuerpos contra B. canis se emplea un antgeno preparado con esta bacteria, no puede usarse el mismo antgeno de cepas lisas puesto que B. canis es rugosa natural. Lo mismo sucede si se desea investigar Abs contra B. ovis. Los antgenos producidos se someten a procedimientos de control de calidad, se ajustan a lo establecido en los manuales de los centros internacionales de referencia para la Brucelosis y se comparan con los antgenos de referencia. OBJETIVO Efectuar la tcnica cuantitativa y confirmatoria, aglutinacin estndar en tubo para diagnostico de brucelosis aguda humana.
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FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la bsqueda de Abs que se ponen de manifiesto al hacerse reaccionar con los antgenos complementarios que existen en la superficie bacteriana. Esta prueba detecta las Igs especficas totales (IgM, IgG, IgA) presentes en el suero. METODOLOGA A) Antes de procesar esta prueba debe realizar al suero problema la prueba de rosa de Bengala [0.03 ml de suero problema y 0.03 ml de antgeno (una gota)], con esta dilucin eliminar el fenmeno de prozona y postzona, interpretar el resultado y si es positivo se procesa la prueba de aglutinacin en tubo con solucin salina fenolada (SSF). Se efecta haciendo primero una dilucin 1:10 del suero problema con SSF y a partir de esta, diluciones seriadas con factor de dilucin 1:2 en SSF. Se aade despus un volumen igual de antgeno diluido. B) El antgeno se diluye 1: 10 en SSF para la prueba estndar. C) PREPARACION DE LA SSF. El antgeno normalizado deber diluirse con una solucin salina (SS) con 0.5% de fenol, la cual se preparar de la siguiente manera: a) b) Cloruro de sodio (NaCl) 25.5 g Agua destilada. 3000 ml
Esta SS ya preparada queda a una concentracin del 0.85%, la cual deber esterilizarse en autoclave a 121C durante 10 min (de preferencia preparar volmenes adecuados para almacenarlos). c) Fenol 15g De esta manera queda lista la SSF que se emplear para diluir tanto el antgeno como el suero. 1) 2) 3) Etiquetar una serie de 10 tubos limpios (13 x 100 mm). Colocar 0.9 ml de SSF al 0.5% en el primer tubo. Aadir 0.1 ml del suero problema al primer tubo y mezclar perfectamente. 54
4) 5) 6) 7)
En el resto de los tubos colocar 0.5 ml de SSF. Tomar 0.5 ml del primer tubo y pasar al segundo. Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y as sucesivamente hasta el ltimo. Desechar los 0.5 ml del ltimo tubo.
8) Agregar a cada tubo 0.5 ml de antgeno previamente diluido en SSF. 9) Incubar a 37C durante 24 h (48 h).
10) Las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1: 160, 1:320, etc. 11) Examinar sin agitar los tubos empleando una fuente luminosa colocada detrs de los tubos. 12) Deber procesar al mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un suero negativo y otro suero positivo (testigo). INTERPRETACIN Medir el grado de aglutinacin por la mayor o menor clarificacin que se haya producido en los tubos en comparacin con su testigo y la formacin de una malla de aglutinacin en el fondo del tubo. ++++ Aglutinacin - sedimentacin completas con clarificacin total del lquido sobrenadante. +++ Aglutinacin casi completa, clarificacin del 75% ++ Aglutinacin pronunciada y transparencia del 50% + Sedimentacin parcial y clarificacin del 25% - Clarificacin nula. El ttulo corresponde al ltimo tubo donde hubo clarificacin del 75 al 100%, y se considera positivo cuando el ttulo es mayor o igual a 1:80, es importante sealar que cuando hay exceso de Abs se presenta fenmeno de zona, por lo que se recomienda emplear siempre una serie de cuando menos 10 tubos.
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Realizar al suero problema la prueba de rosa de bengala, 0.03ml suero problema, 0.03 ml de antigeno.
DIAGRAMA DE FLUJO
Interprete el resultado si es positivo, procese la prueba de aglutinacion en tubo con solucion salina fenodala.
Para preparar la solucion salina fenolada se agrega 25.5 g de NaCl y 3000 ml de agua destilada, se diluye el antigeno normalizado.
Rosa de Bengala
H2O destilada
NaCl
Realizar una dilucin 1:10 del suero problema con solucin salina fenolada y a partir de esta, diluciones seriadas con factor de dilucin 1:2 en solucin salina fenolada, se aade despus un volumen igual de antgeno diluido.
PRIMER
Colocar 0.9 ml de solucion salina fenolada en el primer tubo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
Solucin salina fenolada 0.5%
2
En el resto de los tubos colocar 0.5 ml de solucin salina fenolada.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
56
Pasar 0.5 ml del primer tubo al segundo.
Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y asi sucesivamente hasta elultimo.
Desechar los 0.5 ml del ultimo tubo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
Agregar a cada tubo 0.5 ml del antgeno previamente diluido en solucin salina fenolada. Incubar a 37C durante 24 horas. Examinar sin agitar los tubos empleando una fuente luminosa.
SEGUNDA PARTE AGLUTINACIN EN TUBO EN PRESENCIA DE 2-MERCAPTOETANOL INTRODUCCIN El 2-Me es un agente reductor (reduce los puentes de disulfuro de la IgM) que disocia la macroglobulina IgM, que es un pentmero, con lo que se inactiva su actividad de Ab, por lo que si observamos la presencia de Abs aglutinantes se deber a las Igs IgG e IgA. La IgG es resistente a este tratamiento cuando se usan las diluciones correctas del reductor. Esta prueba se considera de utilidad para controlar la eficacia de la quimioterapia, ya que al alcanzar valores negativos de IgG se considera que el tratamiento fue el adecuado, y se estar evitando originarle al paciente una brucelosis crnica por proporcionarle tratamientos inadecuados e inespecficos. En infecciones crnicas, los niveles de IgG son mucho ms altos que los de IgM. FUNDAMENTO Se emplea para poner de manifiesto Abs de la clase IgG principalmente, ya que los de la clase IgM se inactivan por el tratamiento con 2-Me.
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METODOLOGIA A) Esta prueba de debe de procesar al mismo tiempo que la aglutinacin en tubo con SSF o aglutinacin estndar. B) Preparacin de la SS con 2-Me a) Pesar 0.85 g de NaCl y disolver en 100 ml de agua destilada. b) Aadir 0.71 ml de 2 - Me. Agitar y colocar en un recipiente limpio. C) Hacer dilucin 1:10 del suero problema en SS con 2 - Me. D) Diluir el antgeno 1:10 con SS (no fenolada). Se efecta haciendo primero una dilucin 1:10 del suero problema con SS con 2Me y a partir de esta, diluciones seriadas con factor de dilucin 1:2 en SS con 2 Me. Se aade despus un volumen igual de antgeno diluido. 1) Etiquetar una serie de 10 tubos limpios (13 x 100 mm). 2) Colocar 0.9 ml de solucin salina 2-Me al 0.71 en el primer tubo. 3) Aadir 0.1 ml del suero problema al primer tubo y mezclar perfectamente. 4) En el resto de los tubos colocar 0.5 ml de SS con 2-Me. 5) Tomar 0.5 ml del primer tubo y pasar al segundo. 6) Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y as sucesivamente hasta el ltimo. 7) Desechar los 0.5 ml del ltimo tubo. 8) Agregar a cada tubo 0.5 ml de antgeno previamente diluido en SS. 9) Incubar a 37C durante 24 h (48 h) y realizar la lectura. 10) Las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, etc. 11) Examinar sin agitar los tubos empleando una fuente luminosa colocada detrs de los tubos.
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12) Deber procesar al mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un suero negativo y otro positivo (testigo). INTERPRETACION Cualquier ttulo de aglutinacin por este mtodo se considera positivo y se debe a la presencia de Igs de la clase IgG.
DIAGRAMA DE FLUJO
Para preparar la solucion salina-mercaptoetanol, pesar 0.85g de NaCl y disolver en 100 ml de agua destilada, aadir 0.71 ml de 2-Mercaptoetanol y colocar en un recipiente limpio.
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Hacer dilucin 1:10 del suero problema en solucin salina con 2-mercaptoetanol. Diluir el antgeno 1:10 con solucin salina (no fenolada)
H2O destilada
NaCl
Colocar 0.9 ml de solucion salina 2-ME en el primer tubo.
3 2
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
Solucin salina 2-ME
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Colocar 0.5 ml de solucion salina 2-ME en el resto de los tubos.
4
Solucin salina 2-ME
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
Solucin salina 2-ME
Pasar 0.5 ml del primer tubo al segundo.
Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y asi sucesivamente hasta el ultimo.
Desechar los 0.5 ml del ultimo tubo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
Agregar 0.5 ml de antigeno previamente diluido en solucion salina.
Antigeno
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
Incubar a 37C durante 24 horas (48 horas) y realizar la lectura, las diluciones finales son: 1:20,1:40, 1:80, 1:160, 1:320, examinar sin agitar los tubos empleando una fuente luminosa colocada detrs de ellos.
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PRACTICA NO. 8 PRIMERA PARTE AGLUTINACIN ESTANDAR EN MICROPLACA Esta tcnica es la adaptacin como micromtodo de la aglutinacin estndar en tubo, que detecta al igual que esta, inmunoglobulinas especficas totales (IgG, IgM, IgA) del suero. METODOLOGIA 1) Se utiliza una placa de 96 pozos con fondo en U. 2) Colocar 180 L de SSF al 0.5% en el primer pozo. 3) Aadir 20 L del suero problema al primer pozo y mezclar perfectamente. 4) En el resto de los pozos colocar 100 L de SSF. 5) Tomar 100 L del primer pozo y pasarlo al segundo. 6) Mezclar bien y pasar 100 L al tercero y as sucesivamente hasta el ltimo. 7) Desechar los 100 L del ltimo pozo. 8) Agregar a cada pozo 100 L de antgeno previamente diluido en SSF. 9) Incubar a 37C durante 24 h (48 h) y realizar la lectura. 10) Las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, etc. 11) Examinar sin agitar la placa empleando una fuente luminosa colocada detrs de la microplaca. 12) Deber procesar al mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un suero positivo y otro suero negativo (testigo). INTERPRETACION Medir el grado de aglutinacin por la mayor o menor clarificacin que se haya producido en los pozos en comparacin con su testigo y la formacin de una malla de aglutinacin en el fondo del pozo.
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++++ Aglutinacin - sedimentacin completas con clarificacin total del lquido sobrenadante. +++ Aglutinacin casi completa, clarificacin del 75% ++ Aglutinacin pronunciada y transparencia del 50% + Sedimentacin parcial y clarificacin del 25% - Clarificacin nula. La reaccin positiva se observa como un conglomerado de clulas en el fondo del pozo formando una malla de aglutinacin (la cual al inclinar ligeramente la placa permanece adherida al fondo del pozo). El ttulo corresponde al ltimo pozo donde hubo clarificacin del 75 al 100%, y se considera positivo cuando el ttulo es mayor o igual a 1:80, en el ltimo pozo se forma una malla bien definida, es importante sealar que cuando hay exceso de anticuerpos se presenta fenmeno de zona, por lo que se recomienda emplear siempre una serie de cuando menos 10 pozos.
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DIAGRAMA DE FLUJO
PRIMERA PARTE Aglutinacin Estndar en microplaca
Colocar 180 microlitros de solucion salina fenolada al 0.5% en el primer pozo. Depositar 20 microlitros de suero problema. Colocar 100 microlitros de solucion salina fenolada al 0.5% en el resto de los pozos.
Tomar 100 microlitros del primer pozo y pasarlo al segundo.
Mezcalr bien y pasar 100 microlitros al tercer pozo.
Desechar los 100 microlitros del ultimo pozo.
Agregar a cada pozo 100 microlitros de antigeno previamente diluido en solucion salina fenolada.
Antigeno
Incubar a 37C durante 24 horas (48 horas) y realizar la lectura, las 8 diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, examinar sin agitar la placa empleando una Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la 63 fuente luminosa colocada detrs de Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009ellos. Deber procesar de mismo 111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplementoel REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con siguiendo cada uno la editorial Veterinaria Organizacin S.L. tiempo y n ISSN 1695-7504 por de los http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector pasos un suero negativo (testigo). Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.
AGLUTINACIN EN PRESENCIA DE 2- Me EN MICROPLACA SEGUNDA PARTE Esta tcnica es la adaptacin como micromtodo de la aglutinacin en tubo en presencia de 2- Me, que detecta al igual que esta, inmunoglobulinas de la clase IgG principalmente ya que los de la clase IgM se inactivan con el 2-Me. METODOLOGIA 1) Se utiliza una placa de 96 pozos con fondo en U. 2) Colocar 180 L de SS con 2-Me al 0.71% en el primer pozo. 3) Aadir 20 L del suero problema al primer pozo y mezclar perfectamente. 4) En el resto de los pozos colocar 100 L de SS con 2-Me. 5) Tomar 100 L del primer pozo y pasarlo al segundo. 6) Mezclar bien y pasar 100 L al tercero y as sucesivamente hasta el ltimo. 7) Desechar los 100 L del ltimo pozo. 8) Agregar a cada pozo 100 L de antgeno previamente diluido en solucin salina. 9) Incubar a 37C durante 24 h (48 h) y realizar la lectura. 10) Las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, etc. 11) Examinar sin agitar la placa empleando una fuente luminosa colocada detrs de la microplaca. 12) Deber procesar al mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un suero positivo y otro suero negativo (control). INTERPRETACION Cualquier ttulo de aglutinacin por este mtodo se considera positivo y se debe a la presencia de inmunoglobulinas de la clase IgG, es importante recordar que
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cuando hay exceso de anticuerpos se presenta fenmeno de zona, por lo que se recomienda emplear siempre una serie de cuando menos 10 pozos. INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) Qu es Brucelosis? 2) Porqu se debe utilizar por lo menos una serie de 10 tubos o pozos? 3) Que anticuerpos detectamos en la prueba de aglutinacin estndar? 4) Porqu B. melitensis evade la fagocitosis? 5) Cmo se da la respuesta inmunolgica a la infeccin por Brucella? 6) Cules son los componentes antignicos de Brucella? 7) Cul es el tratamiento especfico para una brucelosis? 8) Qu anticuerpos detectamos en la prueba de aglutinacin con 2-Me? 9) Para qu fines diagnsticos se utiliza la prueba de aglutinacin con 2-Me? 10) Qu actividad presenta el 2-Me frente a IgM? CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) Cmo realizara en su laboratorio de anlisis bioqumico clnicos un diagnstico de Brucelosis? 2) Recomendara al paciente volver a su laboratorio a otra valoracin al terminar el tratamiento indicado por el mdico?
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DIAGRAMA DE FLUJO
SEGUNDA PARTE Aglutinacin en presencia de 2-Me en microplaca.
Colocar 180 microlitros de solucion salina 2-ME al 0.71% en el primer pozo. Depositar 20 microlitros de suero problema al primer pozo, mezclar perfectamente. Colocar 100 microlitros de solucion salina 2-ME al 0.71% en el resto de los pozos.
3 2
Solucin salina 2-ME al 0.71 %
Solucin salina 2-ME al 0.71 %
Tomar 100 microlitros del primer pozo y pasarlo al segundo.
Mezcalr bien y pasar 100 microlitros al tercer pozo.
Desechar los 100 microlitros del ultimo pozo.
Agregar a cada pozo 100 microlitros de antigeno previamente diluido en solucion salina.
Antigeno
Incubar a 37C durante 24 horas (48 horas) y realizar la lectura, las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, examinar sin Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la 66 agitar la placa empleando una Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con 8 N de Registro 03-2009el fuente luminosa colocada detrs de 111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria ellos. n ISSN procesar el editorial (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) conDeber 1695-7504 por la mismo Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa concada uno de los tiempo y siguiendo el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011. pasos un suero negativo (testigo).
PRACTICA NO. 9 ANTGENOS DE SUPERFICIE DE GRUPOS SANGUNEOS SISTEMA ABO INTRODUCCIN Los antgenos son protenas, polisacridos voluminosos o grandes complejos de lipoprotena, que se encuentran principalmente pero no exclusivamente en la superficie de las membranas celulares y estn colocadas de tal manera que las cadenas glucosdicas polares se encuentran en el ambiente externo de las clulas. Las estructuras exactas de estos glcidos unidos a lpidos y protenas de membrana estn determinadas genticamente. Los componentes antignicos de la membrana del eritrocito se han estudiado en detalle debido a su importancia en el tratamiento con transfusiones. Se han distinguido mas de 100 antgenos del eritrocito constituyendo por lo menos 15 sistemas de grupos sanguneos genticamente distintos; sin embargo, no todos desencadenan reacciones de transfusin tan severas como los antgenos que conforman el denominado sistema ABO y el sistema Rh. Los antgenos A, B y O son oligosacridos estructuralmente relacionados que pueden estar unidos a lpidos o a protenas. El antgeno O (tambin llamado antgeno H) es una cadena de fucosa, galactosa, N-acetilglucosamina y glucosa unido a un lpido ceramida (o un hidroxilo de la cadena lateral de una protena) a la glucosa. El antgeno A difiere del O solamente en que contiene un resto de Nacetilgalctosamina unido al resto ms externo de la galactosa, en cuanto al B que tambin es parecido al O se diferencia por poseer un resto ms de galactosa unido a la galactosa exterior. Todas las personas tienen la enzima que produce el antgeno O, las personas con el grupo sanguneo A tienen, adems, la enzima que adiciona Nacetilgalactosamina de ms, mientras que los de tipo B tienen la enzima que adiciona la galactosa extra; los que tienen el tipo AB sintetizan ambos antgenos, el A y el B, mientras que los que son del tipo O solo producen el antgeno O. Los Abs contra los antgenos ABO son isohemaglutininas, pues los antgenos son de origen humano (iso, de la misma especie) y se descubren ordinariamente por una reaccin de aglutinacin con clulas de un tipo ABO conocido; en otras palabras, el suero que contiene anticuerpos contra los antgenos A y B hace que se aglutinen los eritrocitos en cuya superficie existen dichos antgenos. Hay
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cuatro fenotipos ABO bsicos, tipo O (eritrocitos sin antgenos A ni B), tipo A (eritrocitos con antgeno A), tipo B (eritrocitos con antgenos B) y tipo AB (eritrocitos con antgeno A y B). Los antgenos Rh de los grupos sanguneos recibieron su nombre por haberse identificado inicialmente en los eritrocitos del mono Rhesus (Macaca mulata). Los hemates Rh+ poseen un antgeno denominado Rho en una nomenclatura y D en otra. El antgeno D es el que determina que un individuo sea Rh+ Rh-, las personas con genotipo DD o Dd son de tipo Rh+, los individuos con genotipo dd pertenecen al tipo Rh-. El antisuero antiD es sinnimo de antisuero antiRh. Para determinar los grupos sanguneos en la prctica se hacen pruebas con los antgenos ABO y Rh, provocando reacciones de antgeno-anticuerpo, mediante pruebas de aglutinacin. El mecanismo de una reaccin de aglutinacin se produce por medio de anticuerpos multivalentes que se combinan con partculas de antgeno, formando complejos antgeno-anticuerpo. La reaccin de aglutinacin se da cuando en una mezcla de las partculas de antgeno con los antisueros especficos provoca una agrupacin de dichas partculas de antgeno con los antisueros especficos provoca una agrupacin de dichas partculas antignicas. Por lo general la aglutinacin es perceptible a simple vista, pero en ocasiones se requiere de observaciones al microscopio de la preparacin estudiada. METODOLOGA 1. Acomodar al paciente de manera que este cmodo, e inspirarle confianza. 2. Explicarle al paciente lo que se le va a practicar. 3. Colocar el torniquete aproximadamente a la mitad entre el codo y el hombro. 4. Inspeccionar el rea que planeamos usar (vena ceflica, vena baslica, vena cubital mediana, vena mediana). 5. Retirar el torniquete, ya que no puede durar mucho tiempo. 6. Ya localizada la vena, nuevamente colocamos el torniquete. 7. Se hace la asepsia con una torunda alcoholada al 7O%, procurando limpiar de arriba hacia abajo y dejar que se seque.
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8. Fijar la vena en posicin sujetando el antebrazo del enfermo con la mano y comprimiendo y empujando los tejidos blandos con el pulgar justo por debajo del punto donde se va a intentar la puncin. 9. Se empuja la aguja al interior de la vena con una puncin directa nica de piel y vena. 10. Hay que desatar el torniquete para que la sangre fluya libremente. 11. Se retira la jeringa y la aguja. 12. Se le aplica una presin suave (tres min) en el punto de la puncin con una torunda sin friccionar, ya que la friccin provoca hematomas, tambin, se le pide al paciente mantener extendido el brazo, para prevenir la formacin de un hematoma. 13. La sangre se coloca en sus respectivos tubos y en ese momento se etiqueta con el nmero de registro o las iniciales del nombre del paciente, los exmenes solicitados por el mdico y la firma de quien hizo la extraccin. 14. Si utiliza una lanceta estril, se desinfecta el dedo medio y se pincha la yema del dedo, se colocan tres gotas en sobre una placa de vidrio, se aade una gota de antisuero A, Rh y B, con diferente aplicador se mezcla cada antisuero con la gota de sangre. Se observa la reaccin de aglutinacin por debajo de la placa a contra luz y de ser necesario en el microscopio. 15. Al terminar, se sumerge la placa de vidrio en una solucin de cloro comercial al 50%. INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. Describe la importancia que tiene conocer la tcnica de extraccin de sangre venosa y porque es necesario que un Qumico conozca esta tcnica. 2. Describe los grupos sanguneos.
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DIAGRAMA DE FLUJO
SISTEMA ABO
Se colocan 3 gotas de sangre sobre una placa de vidrio. Aadir 1 gota de antisuero A, Rh, B. Observar la reaccion de aglutinacin.
Laura Perales Mota
Laura Perales Mota
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PRACTICA NO. 10 REACCIONES FEBRILES METODO: Inmunolgico; Prueba rpida de aglutinacin o placa INTRODUCCIN Esta prueba consiste en detectar en la sangre la presencia de anticuerpos o clulas de memoria, las que indican que el organismo ha estado en contacto previamente con diferentes tipos de bacterias, o bien que el organismo ha padecido ciertas enfermedades. Las reacciones febriles son particularmente tiles para apoyar el diagnstico de padecimientos como la fiebre tifoidea, brucelosis, paratifoideas y de Rickettsiosis. FUNDAMENTO La fiebre tifoidea, la fiebre malta y la tifoidea (salmonelosis, brucelosis y Rickettsiosis respectivamente) se confirman demostrando la presencia de los anticuerpos homlogos en el suero del paciente. Las diferentes salmonelosis se detectan usando antgenos especficos de la bacteria correspondiente seleccionados segn la clase de salmonelosis que son ms comunes en la regin y esta prueba se conoce como reaccin de Widal. La Brucelosis se comprueba con la reaccin de Rosa de Bengala usando antgenos de B. abortus. Las Rickettsiosis se detectan usando antgeno procedentes de algunas cepas de Proteus OX que comparten un antgeno comn con las Rickettsias (como el Proteus OX-1 9), en la Reaccin de Weil Flix. MUESTRA: Suero, Separarlo de 5 ml sangre sin anticoagulante previo reposo de 30 min. Para separarlo, centrifugar a 3,000 x g X 5 min. Antgenos: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Tfico O Tfico H Paratfico A Paratfico B Brucella Proteus OX 19
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METODOLOGA: PRUEBA CUALITATIVA 1. Revisar la caducidad de los antgenos, los cuales deben estar a temperatura ambiente. Marcar con el nmero del paciente una serie de 6 anillos de la placa de aglutinacin y sobre estos anotar los nmeros de los antgenos (1 al 6). 2. Trasladar a la placa de vidrio 0.08 ml. de suero x c/u de los 6 anillos. 3. Agregar una gota de cada antgeno previamente mezclado al anillo correspondiente. 4. Mezclar con un palillo (1/valo). 5. Balancear la placa durante dos min. 6. Interpretar la prueba antes de tres min, con la ayuda del aglutinoscopio. Anotar el nmero de los antgenos que den la reaccin positiva (aglutinacin franca). 7. Practicar la prueba con los antgenos que dieron la reaccin negativa (falta de aglutinacin) usando 0.01 ml de suero. Anotar los nmeros de los antgenos que den reaccin positiva (aglutinacin franca). 8. Practicar la prueba cuantitativa usando los antgenos que aglutinaron con el suero. PRUEBA CUANTITATIVA I.-Cuando los antgenos aglutinan con 0.08 ml de suero. a) Trasladar con pipeta de vidrio 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml de suero por valo. b) Mezclar el antgeno y agregar una gota a cada cantidad de suero. c) Mezclar con un palillo comenzando con el valo que tenga 0.005 ml de suero y terminando con el que tenga 0.04 ml de suero. d) Balancear la placa x dos min.
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e) Interpretar la prueba antes de 3 min con ayuda del aglutinoscopio para determinar la cantidad ms pequea de suero que da la aglutinacin franca. II.-Cuando los antgenos aglutinan con 0.01 0.005 mI: a) Preparar una dilucin progresiva doble de suero (1:2,1:4., 1:8, 1:16) en albmina bovina al 33% de la siguiente manera: - Trasladar 0.1 ml de albmina a c/u de los 3 tubos de ensayo y etiquetados. - Agregar 0.1 ml de suero del paciente al primer tubo y mezclar para obtener la dilucin 1:2 - Trasladar 0.1 ml de la dilucin 1:2 al segundo tubo y mezclar para obtener la dilucin 1:4 - Trasladar 0.1 ml de la dilucin 1:4 al tercer tubo y mezclar para obtener la dilucin 1:8, etc. b) Trasladar 0.01 de cada dilucin a la plaza de vidrio. c) Agregar una gota del antgeno correspondiente (mezclado).
Mezclar con palillo. Balancear x dos min. INTERPRETACIN Detectar la dilucin mayor que de la reaccin positiva (aglutinacin franca). Reportar el nmero del antgeno y el ttulo determinado: VOLUMEN DE SUERO (ml) TITULO 0.08------------------------------------------------------------------------1:20 0.04------------------------------------------------------------------------1:40 0.02------------------------------------------------------------------------1:80 0.01------------------------------------------------------------------------1:160 0.005 (0.01 de dilucin 1:2) ----------------------------------------1:320 0.01 de dilucin 1:4---------------------------------------------------1:640 0.01 de dilucin 1:8---------------------------------------------------1:1280 0.01 de dilucin 1:16-------------------------------------------------1:2560 NOTAS.- 1.-En das calurosos, las reacciones pueden ser falsamente positivas 2.-Ttulos menores de 1:80 se pueden considerar normales. Tomar en cuenta diagnstico clnico.
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INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) Qu significa reacciones febriles? 2) Para qu resulta til la demostracin de anticuerpos en el suero contra las especies de Salmonella? 3) Porqu en la actual serologa de suero de Salmonella deben utilizarse antgenos representativos de diversos grupos de Salmonella? 4) Cul es el (cuales son los) antgeno (s) de superficie de Salmonella? 5) Cmo resultan los ttulos de aglutininas O en el transcurso de la enfermedad? 6) Cmo resultan los ttulos de aglutininas H en el transcurso de la enfermedad? 7) Porqu el ttulo de aglutinina O constituye el indicador mas fiable en una infeccin reciente de Salmonella? 8) Qu puede enmascarar la respuesta de la aglutinina en el suero? 9) Cules son las especies que reconoce el esquema taxonmico de Salmonella y cual es la que contiene ms de 1500 serotipos? CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) Qu parmetros debemos considerar al considerar un resultado serolgico? 2) En qu consiste la preparacin de antgeno H y la del antgeno O? 3) Qu enfermedades se diagnostican en la prueba serolgica con cepas de Proteus y en que consiste su preparacin? 4) Cmo diagnosticara en su laboratorio una infeccin por Salmonella? 5) Cul es el tratamiento de eleccin contra Salmonelosis? 6) Cules son los factores importantes en la profilaxis de la transmisin de la fiebre tifoidea de hombre a hombre? 7) Considera usted poder erradicar la enfermedad humana causada por Salmonella que infectan los animales y al hombre?
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8) Investigue que es el fenmeno de prozona, postzona y zona de equivalencia. 9) Por qu es ms conveniente empezar a trabajar con la dilucin 1:40? 10) Qu es ttulo? 11) Qu ttulos considera indicativos de presencia de enfermedad en las reacciones febriles (positivos) y porque?
PRCTICA NO. 11 ANTIESTREPTOLISINAS INTRODUCCIN El anticuerpo estreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas en ttulos bajos, debido a que las infecciones estreptoccicas son comunes. Sin embargo, un ttulo alto o creciente de antiestreptolisina O, indica una infeccin reciente producida por estreptococo -hemoltico de grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal, erisipela, etc. Tiene adems especial inters en los procesos que aparecen como segunda enfermedad: fiebre reumtica y glomerulonefritis aguda. Por lo tanto a pesar de no ser una prueba especfica para fiebre reumtica, apoya su diagnstico cuando lo sugieren la historia y los signos clnicos. FUNDAMENTO La estreptolisina O, producida por el estreptococo -hemoltico de grupo A, tiene la propiedad de producir hemlisis cuando se pone en contacto con glbulos rojos. Al colocar distintas diluciones de un suero que contenga antiestreptolisina O en presencia de dosis constantes de estreptolisina O, se produce una reaccin antgeno - anticuerpo que neutraliza la capacidad hemoltica de la misma. Este fenmeno se evidencia por una inhibicin de la hemlisis al agregar suspensin de glbulos rojos del 3 al 5%. El ttulo de antiestreptolisina ser la recproca de la mxima dilucin del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente la estreptolisina.
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REACTIVOS Estreptolisina O: estreptolisina liofilizada titulada. Buffer concentrado: solucin de buffer fosfatos conteniendo fosfatos 0.36 mol/l y cloruro de sodio 1.2 moI/l, para pH final 6.5 Agua destilada Eritrocitos frescos humanos de grupo O Solucin fisiolgica PREPARACIN Buffer: diluir el contenido del frasco con el volumen de agua destilada indicado en el rtulo. A baja temperatura el buffer concentrado puede cristalizar. En tal caso colocar en bao de agua a 37C unos minutos mezclando por inversin hasta dilucin completa. Estreptolisina O: disolver cada vial con el volumen de buffer indicado en el rtulo, mezclando por inversin hasta disolucin completa. Suspensin de eritrocitos: lavar los mismos tres veces con solucin fisiolgica. Luego del ltimo lavado centrifugar a 2000 x g durante 15 min. En el sobrenadante no debe aparecer hemlisis; caso contrario desechar. Con los eritrocitos lavados, una vez descartado el sobrenadante, preparar una suspensin del 3 al 5% con buffer pH 6.5 ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos provistos: son estables en refrigerador (2 - 10C) hasta la fecha de vencimiento indicado en la caja. Estreptolisina O: Una vez preparada es estable 2 horas a temperatura ambiente, 5 das en refrigerador (2 - 10C) o 2 meses congelada (-20C) y fraccionada. Buffer: estable 1 ao en refrigerador (2 - 10C). Suspensin de eritrocitos: los eritrocitos pueden usarse hasta 48 horas despus de preparada la suspensin si previamente se lavan una vez con buffer y no se observa hemlisis.
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MUESTRA Suero a) Recoleccin: debe obtenerse suero libre de hemlisis. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: muestras con hemlisis visible pueden conducir a una interpretacin errnea de los resultados, por lo que deben descartarse. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la antiestreptolisina en suero es estable congelada por lo que puede mantenerse en estas condiciones hasta efectuar el ensayo. PROCEDIMIENTO Preparar diluciones de la siguiente forma: 1:10 (0.2 ml de suero + 1.8 ml de Buffer) 1:100 (0.5 ml de dilucin 1:10 + 4.5 mI de Buffer) 1:500 (1 ml de dilucin 1:100 + 4 mI de Buffer) Luego proceder de la siguiente forma: Dilucin de suero 1 en 10 1 en 100 Tubo No. 1 2 3 4 5 Suero diluido (ml) 0.2 1 0.8 0.6 0.4 Buffer (ml) 0.8 0.2 0.4 0.6 Estreptolisina O (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1 en 500 controles 8 9 10 11 12 13 0.8 0.6 0.4 0.2 0.2 0.4 0.6 0.8 1.5 1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
6 0.3 0.7 0.5
7 1
0.5
Mezclar y mantener a bao Mara a 37C 15 min (o incubadora) Eritrocitos 3 - 5% (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezclar agitando ligeramente y mantener en bao Mara a 37C durante 15 min, agitar nuevamente y continuar en bao Mara durante 30 min ms. Centrifugar 3 min a1500 x g y leer. Unidades Tood/ml 50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500 (-) (+) 77
MATERIAL - Tubos de ensayo. - Material volumtrico apropiado. - Centrfuga. - Bao de agua a 37C CONDICIONES DE REACCIN - Temperatura de reaccin: 37C - Tiempo de incubacin: 60 min. - Volumen final de reaccin: 2 ml INTERPRETACIN DE RESULTADOS El ttulo de la muestra se expresa mediante la inversa de la mayor dilucin en la cual se observa ausencia total de hemlisis. El tubo 12 (control eritrocitario) no deber presentar hemlisis mientras que el tubo 13 (control estreptolisina O) deber mostrar hemlisis completa. MTODO DE CONTROL DE CALIDAD Para controlar el procedimiento y los reactivos es conveniente procesar simultneamente un suero con cantidad conocida de antiestreptolisina O. VALORES DE REFERENCIA Normalmente, pueden existir en suero hasta 200 unidades de antiestreptolisina O. Ttulos superiores son indicativos de un proceso infeccioso por estreptococo hemoltico de grupo A. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO En caso de conservar la estreptolisina O reconstituida congelada, se recomienda fraccionaria de modo de evitar los congelamientos y descongelamientos sucesivos que ocasionan su deterioro.
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INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. Qu es la Estreptolisina O? 2. Cul es el ttulo de antiestreptolisina O (ASO) en adultos, que se considera como lmite superior normal? 3. Cmo es el ttulo de ASO en un recin nacido, y porque? 4. Cmo se obtiene el antgeno necesario para el mtodo de medicin del ttulo ASO? 5. Qu enfermedad presentan los pacientes con incidencia mayor de ttulos elevados ASO? 6. Cules son los anticuerpos utilizados ms a menudo en situaciones clnicas?
DIAGRAMA DE FLUJO
1:10
0.2 ml suero
1.8 ml Buffer
1:100
0.5 ml dilucin 1:10
4.5 ml Buffer
1:500
1 ml dilucin 1:100
4 ml Buffer
79
Dilucin en suero Tubo no.
1:10 1 2 3
1:100 4 5 6 7 8
1:500 9 10 11
Controles 12 13
Suero diluido (ml) Buffer (ml) Estreptolisisna O (ml)
0.2 0.8 0.5
0.8 0.2 0.5
0.6 0.4 0.5
0.4 0.6 0.5
0.3 0.7 0.5
0.8 0.2 0.5
0.6 0.4 0.5
0.4 0.6 0.5
0.2 0.8 0.5 1.5 1 0.5
0.5
0.5
Mezclar y mantener en bao mara a 37 C 15 min (o incubar)

Tubo no.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
=
Eritro 3-5% (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezclar agitando en el bao mara a 37 C durante 15 min., agitar nuevamente y permanecer 30 min Incubadora
Centrifugar 3 min a 1500 rpm y leer
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PRACTICA NO. 12 DIAGNOSTICO PRECOZ DEL EMBARAZO INTRODUCCIN La gonadotropina o gonadotrofina es una hormona secretada por la glndula pituitaria. En la mujer, estimula el crecimiento del folculo ovrico que contiene el vulo. La concentracin de la hormona estimulante del folculo (HFE o FSH) es mxima en la primera parte del ciclo, durante las primeras etapas de desarrollo del folculo. En el varn, la FSH es esencial para la espermatognesis (formacin de espermatozoides). Una de las funciones principales de la gonadotropina corinica humana (HCG, por sus siglas en ingls, Human Chorionic Gonadotropin), qumicamente una glucoprotena, es administrar los factores nutricionales y estimular cantidades necesarias de otras hormonas. Es una hormona que se sintetiza en el cerebro, manifestando diferentes funciones en la mujer y en el hombre. Es producida por clulas trofoblsticas (del sinciciotrofoblasto) de la placenta de la mujer durante el embarazo; aumenta su concentracin en la sangre y en la orina de la mujer poco tiempo despus de la implantacin, y su presencia sirve para realizar pruebas de diagnstico de embarazo. La HCG es la base histrica y actual del diagnstico de embarazos, su diferenciacin de los falsos embarazos que pueden constituirse en tumores, as como del diagnstico del cncer de prstata. La HCG estimula la maduracin del vulo y en los varones la produccin de testosterona dentro de los testculos. Una de las funciones ms importantes es la de prevenir la involucin normal del cuerpo lteo al final del ciclo sexual femenino. El cuerpo lteo, adems de secretar esta hormona, secreta progesterona y estrgenos. Todos los tratamientos con HCG en hombres y en mujeres deben ser supervisados por el mdico especialista, para evitar posibles interacciones. Existen dos formas de valorar la presencia de HCG en el laboratorio: en sangre y en orina. Los aos de funcin reproductiva de la mujer se caracterizan por cambios rtmicos en las tasas de secrecin de las hormonas femeninas y por cambios correspondientes en los rganos sexuales. Las funciones sexuales y reproductivas en la mujer pueden dividirse en dos fases principales: la primera es la preparacin del cuerpo para la concepcin, la segunda es el periodo de gestacin o embarazo.
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Durante el periodo de gestacin en la mujer se producen grandes cantidades de estas hormonas: HCG, estrgenos, progesterona y somatotropina corinica, ya que sus niveles son esenciales para la supervisin del embarazo. Una funcin principal de la HCG consiste en administrar los factores nutricionales y estimular cantidades necesarias de otras hormonas para mantener en ptimas condiciones el endometrio y la cavidad uterina, lo que, en caso de no haber concepcin o cantidad insuficiente de esta hormona, se perdera en forma de lquido menstrual. La HCG tiene otras aplicaciones diagnsticas, aparte del monitoreo del periodo de gestacin y sus consecuencias despus de ste. Tambin se utiliza como un marcador tumoral en diferentes padecimientos neoplsicos en la mujer y en el hombre. Existen diferentes mtodos cuantitativos de laboratorio para determinar la presencia y niveles de sta hormona, ya que con los aos se han actualizado y purificado para el estudio, valoracin y diferenciacin de diversos diagnsticos. Definitivamente el patrn de estudio de esta hormona es de gran importancia, ya que nos proporciona aspectos clnicos importantes durante las diferentes etapas de la naturaleza del hombre y de la mujer. FUNDAMENTO La gonadotropina corinica humana (HCG), es una hormona que aparece en la orina de mujeres embarazadas o en ciertos procesos neoplsicos. La determinacin de HCG se puede realizar inmunolgicamente mediante una prueba de inhibicin de la aglutinacin pasiva. La HCG es una glucoproteina producida por las clulas trofoblsticas despus de la concepcin. Despus de cinco semanas de gestacin aumenta la HCG en la orina y alcanza su mximo a las 10 semanas. En la medida de que la produccin de estrgenos y progesterona por la placenta aumenta, durante el segundo trimestre del embarazo, los niveles de HCG descienden. OBJETIVO Identificar la gonadotropina corinica humana en orina.
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MATERIAL - Orina problema - Suero anti HCG - Suspensin de partculas de ltex o eritrocitos recubiertos con GCFI - Aplicadores de madera - Pipetas graduadas de 1ml - Centrfuga METODO 1. Realice todo el proceso a temperatura ambiente 2. Filtre la orina o centrifugar y usar el sobrenadante 3. Coloque una gota de orina sobre la placa de vidrio 4. Adicione una gota del suero anti-HCG y mezcle 5. Adicione 2 gotas de suspensin de partculas recubiertas con HGC y mezcle 6. Mezcle suavemente la placa por 2 min y lea 7. Una inhibicin de aglutinacin indica una prueba positiva.
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DIAGRAMA DE FLUJO
1.- Realice todo el proceso a temperatura ambiente
2.- Filtre o centrifugue la orina y utilice el sobrenadante
3.- Coloque una gota de orina sobre la placa de vidrio
4.- Adicione una gota de suero anti-HGC y mezcle
. 5.- Adicione 2 gotas de suspensin de partculas con HGC
6.- Mezcle la placa por dos min (suavemente) e interprete
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INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. Que es la gonadotropina corinica humana? 2. Cmo es la estructura de la HCG? 3. Cmo es la relacin existente entre la HCG, pregnanediol y estriol en la orina? 4. Cual es e! perodo en el cual el nivel de HCG es ptimo para obtener resultados con esta prueba? 5. La persistencia de HCG en niveles altos es sugerente de PRACTICA NO. 13 DIAGNOSTICO SEROLGICO DE SFILIS INTRODUCCIN La sfilis es una enfermedad infecciosa aguda o crnica cuyo agente causal es Treponema pallidum (T. pallidum ) perteneciente, junto con otros treponemas, Borrelias y Leptospiras, a la familia Treponemataceae. La enfermedad est clasificada como venrea y de declaracin obligatoria, siendo su mecanismo de transmisin el contacto directo con una lesin productiva. Tras un perodo de incubacin de 12 a 90 das (media de 21 das), aparece en el lugar de la inoculacin una lesin primaria, rica en treponemas (el chancro), que desaparece espontneamente a las pocas semanas. Durante este primer estado, conocido como sfilis primaria, T. pallidum se multiplica en los linfticos regionales distribuyndose por la sangre a todos los rganos del individuo (infeccin sistmica). Generalmente las pruebas serolgicas se hacen positivas en este perodo pasadas 3-4 semanas de la infeccin. En el paciente no tratado, el segundo estado comienza con la aparicin de una de las manifestaciones sistmicas de la enfermedad: una erupcin en piel, palmas y plantas, la roseola sifiltica, acompaada de sntomas generales y frecuentemente, de otros signos localizados (condilomas genitales). Las lesiones abiertas de este perodo son muy contagiosas. Tras la primera desaparicin espontnea de la misma y durante el primer y segundo ao, pueden aparecen brotes similares cada vez de menor
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intensidad (fases de latencia precoz) hasta que desaparecen totalmente todos los signos y sntomas (fase de latencia tarda). El tercer estado de la enfermedad, que solo se presenta en unos pocos pacientes, se caracteriza por la formacin de lesiones granulomatosas destructivas (gummas) que, curiosamente, tienen escasa carga treponmica. En este perodo pueden aparecer sntomas y signos de focalizacin de la enfermedad: neurosfilis, sfilis cardiovascular, etc. La identificacin del T. pallidum mediante el examen directo del exudado de la lesin (campo oscuro y/o fluorescencia directa) es una prueba definitiva para asegurar el diagnstico, aunque un resultado negativo del mismo no descarta la posibilidad de la enfermedad, ya que la presencia de treponemas puede ser escasa dependiendo de los das de evolucin y de tratamientos previos. Debido a las dificultades que puede presentar la realizacin del diagnstico directo, la experiencia indica que el diagnstico indirecto (serolgico) se ha convertido en el procedimiento de uso ms frecuente. Actualmente existen diferentes tcnicas para el diagnstico serolgico de sfilis: las no treponmicas (reagnicas) no determinan anticuerpos especficos frente a T. pallidum y se basan en antgenos compuestos de soluciones alcohlicas con cantidades determinadas de cardiolipina, colesterol y lecitina. Miden anticuerpos frente a estas sustancias que son producidas por los tejidos daados por el T. pallidum. Estas pruebas son: VDRL (Venereal Research Disease Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin), TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test), USR (Unheated Serum Reagin) y ELISA (Enzimoinmunoensayo). Son de bajo costo, fciles de efectuar, se utilizan como pruebas de inicio en la deteccin de sfilis y para evaluar la respuesta al tratamiento. La desventaja que presentan es que, debido a su inespecificidad, pueden arrojar falsos resultados positivos. Las pruebas treponmicas, en cambio, detectan especficamente los anticuerpos de T. pallidum y su utilidad en el laboratorio est orientada a confirmar los resultados arrojados por las pruebas no treponmicas. Las pruebas treponmicas ms conocidas son: FTA-Abs (Inmunofluorescencia indirecta con absorcin del suero), FTA-Abs 200DS (Inmunofluorescencia indirecta con absorcin y doble tincin), TPHA (Microhemaglutinacin), Captia syphilis M (ELISA de captura anti cadena pesada), ELISA IgG, y WESTERN BLOT, las cuales tienen muy bajo ndice de falsos resultados, tanto positivos como negativos. Deben realizarse con una absorcin previa del suero para eliminar la reaccin cruzada con otras treponemas. Sin embargo, carecen de utilidad para monitorear los tratamientos, ya que suelen permanecer positivas en el 85/90% de los pacientes tratados y curados.
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FUNDAMENTO La prueba del VDRL es un procedimiento de floculacin no treponmico usado para detectar anticuerpos en sueros de pacientes con sfilis designados como reaginas. Si el resultado no esta de acuerdo con la observacin clnica, se debe hacer una prueba de inmunofluorescencia. MATERIAL Equipo de diagnostico para pruebas no treponmicas Suero problema, Suero testigo Placas de aglutinacin Bao mara Microscopio y aplicadores de madera METODO 1. Inactive el suero a 56C durante 30 min (para VDRL) 2. Adicione en las placas una gota de los siguientes sueros: suero problema, suero testigo positivo, suero testigo negativo. 3. Coloque una gota de emulsin del antgeno, en cada uno de los pozos de la placa. 4. Mezcle por tres min y lea de inmediato en un microscopio con objetivo 10X. La presencia de floculacin se interpreta como una prueba positiva.
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DIAGRAMA DE FLUJO
2.- Adicione a las placas una gota de los siguientes sueros: suero problema, suero testigo positivo y suero testigo negativo
1.- Inactive el suero para la VDRL
3.- Coloque una gota de emulsin del antgeno en cada uno de los pozos de las placas
4.- Mezcle por tres min y lea de inmediato a en un microscopio a un objetivo de 100x. La presencia de floculacin se interpretar como positiva
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INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. Qu es la Sfilis y cmo se puede prevenir? 2. Cmo se diagnostica en un laboratorio clnico? 3. Qu significa la prueba del antgeno no treponmico? 4. Qu significa VDRL? 5. Qu significa la prueba del antgeno treponmico? 6. Explique como se presenta una sfilis congnita. PRACTICA NO. 14 DETERMINACION DEL FACTOR REUMATOIDE INTRODUCCIN La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune sistmica que afecta el 1% de la poblacin adulta a nivel mundial , se caracteriza por inflamacin crnica de la membrana sinovial que finalmente conduce a prdida de la funcin, dolor crnico y fatiga, hasta incapacidad en las personas que la padecen. Su causa es desconocida, aunque mltiples factores estn involucrados en la patogenia de la enfermedad. Caractersticas inmunitarias principales Los factores reumatoides IgM, IgA e IgG monomrica y pentamrica, existen en suero y lquido sinovial Clnicamente, hay vasculitis y sinovitis. Consideraciones generales La AR es una enfermedad inflamatoria crnica, recidivante y sistmica, que afecta principalmente las articulaciones. Afecta de 1 a 3% de la poblacin de EUA, con una relacin de mujeres a varones 3:1. Los sntomas constitucionales incluyen malestar general, fiebre y prdida de peso. La enfermedad tiene un inicio caracterstico en las articulaciones pequeas de manos y pies, y progresa de manera centrpeta y simtrica. Los ancianos pueden presentarse con afeccin
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de las articulaciones grandes proximales. Son frecuentes las deformidades. Las manifestaciones extraarticulares son vasculitis, atrofia de piel y msculo, ndulos subcutneos, linfadenopata, esplenomegalia y leucopenia. Patogenia inmunitaria Se desconoce la causa de la AR. Cerca de 70% de los individuos con AR tienen un haplotipo HLA -DR4. Este haplotipo posee algunas variantes diferentes. Ciertos alelos HLA DR determinan la susceptibilidad a la enfermedad, as como su intensidad. Es posible que stos y quizs otros determinantes genticos proporcionen susceptibilidad a un factor ambiental no identificado, como un virus, que inicia el proceso de la enfermedad. Aunque nunca se han identificado partculas virales, en teora un estmulo antignico origina la aparicin de una IgG anormal, lo cual ocasiona la produccin de factor reumatoide y el desarrollo eventual de la enfermedad. Cualquiera que sea el estmulo primario, los linfocitos sinoviales producen IgG, IgM monomrica e IgM pentamrica antiinmunoglobulina (es decir, factores reumatoides). La presencia de agregados de IgG o complejos de IgG factorreumatoide, pueden activar el sistema del complemento e inducir diversos fenmenos inflamatorios, como liberacin de histamina, produccin de factores quimiotcticos para neutrfilos PMN y clulas MN y dao a la membrana con citlisis. Existe un marcado flujo de leucocitos hacia el espacio sinovial. Las prostaglandinas y los leucotrienos, producidos por clulas inflamatorias, se consideran que desempean una funcin principal en la mediacin de los procesos inflamatorios. Adems, los lisosomas activados y las enzimas liberadas al espacio sinovial por leucocitos, amplifican ms an la respuesta inflamatoria de la membrana sinovial. El infiltrado mononuclear que se observa de manera caracterstica dentro del sino vio, incluye colecciones perivasculares de clulas CD4 y conjuntos intersticiales de clulas CD8, linfocitos B, linfoblastos, clulas plasmticas y macrfagos. La interaccin inmunitaria de estas clulas origina liberacin de linfocinas, las cuales ocasionan acumulacin de macrfagos dentro del sinovio. Las diversas clulas inflamatorias de la articulacin producen protenas y colagenasas que lesionan el cartlago y las estructuras de soporte celular. Los factores reumatoides pueden tener una funcin importante en la causa de la enfermedad extraarticular. Los sujetos con vasculitis reumatoide tienen ttulos aumentados de factores reumatoides de IgG, IgM e IgA. Los complejos antgenoanticuerpo aplicados a animales de experimentacin en presencia de factor reumatoide IgM, originan vasculitis necrosante. En teora, los complejos
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inmunitarios inician la inflamacin vascular por la activacin del complemento. La afeccin pulmonar se relaciona con el depsito de complejos 11S y 15S, que contienen agregados de IgG en las paredes de vasos pulmonares y alvolos. El factor reumatoide IgM 19S tambin se ha detectado en arteriolas y paredes alveolares adyacentes a los ndulos cavitarios. Los factores reumatoides no inician el proceso inflamatorio que ocasiona la enfermedad reumatoide, pero quiz perpeten y amplifiquen este proceso. Diagnstico inmunitario El dato serolgico ms importante es el ttulo aumentado de factor reumatoide, presente en ms de 75% de los individuos. Los factores reumatoides son inmunoglobulinas con especificidad para el fragmento Fc de la IgG. La mayor parte de las tcnicas de laboratorio detecta factor reumatoide de IgM pentamrica, pero las propiedades del factor reumatoide tambin se aprecian en IgG e IgA. El factor reumatoide de IgM pentamrica puede combinarse con molculas IgG para formar un complejo soluble circulante de alto peso molecular de inmunoglobulinas en el suero. En la AR, la electroforesis de protenas sricas puede mostrar incremento de alfa2 -globulina, hipergammaglobulinemia policlonal e hipoalbuminemia. A menudo, se aprecian en la vasculitis reumatoide los crioprecipitados compuestos de inmunoglobulinas. Los valores sricos del complemento en general son normales, pero pueden estar reducidos cuando hay vasculitis activa. Muchos sujetos tienen anticuerpos antinucleares. Se dispone de varias pruebas para detectar factor reumatoide en el laboratorio. En la actualidad, el mtodo ms utilizado para deteccin de factor reumatoide es la prueba de fijacin en ltex. La gamma-globulina agregada (fraccin II de Cohn) se absorbe en las Partculas de ltex, que entonces se aglutinan en presencia del factor reumatoide; sin embargo, no es especfica, aunque si muy sensible, lo que origina gran incidencia de resultados falsos positivos. La prueba de eritrocitos sensibilizados de abeja (prueba de Rose- Waaler) depende de la fijacin de anticuerpo especfico, y es ms especfica que el anlisis de fijacin de ltex. Los eritrocitos de carnero se recubren con anticuerpo de conejo contra eritrocitos de carnero. Los eritrocitos de carnero sensibilizados se aglutinan en presencia de factor reumatoide. Otras tcnicas capaces de detectar el factor reumatoide de
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todas las clases, incluyen nefelometra con lser.
RIA,
inmunofluorescencia
indirecta,
ELISA
Sin embargo, resultados negativos de una prueba de factor reumatoide realizada con los procedimientos usuales de laboratorio no excluyen el diagnstico de AR. Cerca de 20% de los individuos con AR por otra parte clsica son seronegativos. Algunos de estos pueden tener IgG, IgA o factores reumatoides monomricos. Por el contrario, los factores reumatoides no son nicos para la AR. El factor reumatoide tambin se encuentra en sujetos con lupus eritematoso sistmico (30%), en un gran porcentaje de sujetos con sndrome de Sjogren (90%), y con menor frecuencia, en individuos con esclerodermia o polimiositis. Las pruebas positivas de aglutinacin con la prueba de ltex, tambin se presentan en personas con cierto nmero de afecciones inflamatorias crnicas como hepatitis crnica activa, kala-azar, sarcoidosis, neoplasia y sfilis. La prueba de los eritrocitos de carnero sensibilizados, en general es negativa en esos trastornos. En algunas enfermedades infecciosas crnicas, como lepra y tuberculosis, pueden ser positivas la prueba de ltex y la prueba del eritrocito de carnero sensibilizado. En la endocarditis bacteriana subaguda, ambas pruebas pueden ser positivas durante la enfermedad activa y es posible que se vuelvan negativas al mejorar el paciente. En los reclutas militares se ha notado la aparicin transitoria de factor reumatoide despus de vacunaciones. Los estudios epidemiolgicos han mostrado que un nmero pequeo de gente normal tiene factores reumatoides. Gran proporcin de los ancianos tiene prueba positiva de ltex, aunque en general es negativa la prueba de eritrocitos de carnero sensibilizados. ARTRITIS JUVENIL Sus caractersticas inmunitarias principales son la existencia de factores reumatoides evidentes o escondidos y la presencia de anticuerpos antinucleares. La artritis juvenil consiste en un grupo de trastornos que se presentan en individuos menores de 16 aos de edad. La incidencia de esta enfermedad tiene un punto mximo en los varones a la edad de dos aos y de nuevo a los nueve aos, mientras que en las nias alcanza su punto mayor entre 1 y 3 aos de edad. Esta enfermedad se puede presentar como una enfermedad sistmica (enfermedad de StiII), poliartritis o pauciartritis seronegativa, o bien poliartritis seropositiva idntica a la artritis reumatoide del adulto. El pronstico de las nias con enfermedad pauciarticular es excelente, mientras que los varones con esta enfermedad pueden desarrollar finalmente espondilitis anquilosante.
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En cuanto a su patogenia inmunitaria. Se desconocen los mecanismos bsicos inmunopatgenos de la artritis juvenil; sin embargo, se presentan defectos humorales y celulares. Est presente hipergammaglobulinemia difusa que incluye IgG, IgA e IgM. Se han detectado factores reumatoides de todas las clases de inmunoglobulinas. Cerca de 10% de los nios con artritis juvenil tiene una prueba positiva de fijacin de ltex para factor reumatoide IgM. El suero de algunas personas con pruebas negativas de fijacin de ltex puede contener factores reumatoides IgM. Se han ofrecido dos teoras principales es un intento de explicar la presencia de estos factores reumatoides escondidos en la artritis juvenil. Primero, el factor reumatoide IgM puede fijarse con avidez a la IgG nativa en el suero del enfermo y, por tanto, no tiene la propiedad de fijar la IgG que recubre las partculas de ltex. Segundo, puede haber una IgG anormal que de preferencia se fija a la IgM y, por tanto, bloqueo la prueba de fijacin de ltex. Los factores reumatoides de IgM pentamrica que reaccionan en fro (4C), llamados crioglobulinas se vinculan con la enfermedad grave. Estn aumentados los componentes sricos de la va clsica y alterna del complemento, aunque este aumento es menor en nios con factores reumatoides o enfermedad grave. El aumento del complemento srico puede reflejar una sobre compensacin secundaria en respuesta al incremento en el consumo o quiz un aumento general en la sntesis de protenas. Los estudios de metabolismo del complemento, en realidad muestran hipercatabolismo. La depresin del complemento en el lquido sinovial tal vez sea secundaria a la activacin del complemento, debida a complejos inmunitarios, similar a la que se aprecia en la artritis reumatoide. Los estudios sugieren que los pacientes con artritis juvenil poseen ciertos tipos tisulares de HLA con frecuencias mayores a las esperadas. De esta manera, las personas con la enfermedad pauciarticular de inicio temprano, tienden a ser positivos para los antgenos HLA -DR5 o HLA-DR8, mientras que aquellos con la enfermedad pauciarticular de inicio tardo, tienden a ser HLA -B27 positivas. Los individuos con enfermedad poliarticular positiva a factor reumatoide, tienden a ser HDL-D4 positivos, y aquellos con enfermedad sistmica tienden a resultar HLA-DR5 positivos. Finalmente, el diagnstico inmunitario de la artritis juvenil, al momento, se basa en estudios clnicos. Aunque ciertas anormalidades de las inmunoglobulinas, complemento e inmunidad celular son compatibles con el diagnstico de artritis juvenil, ninguna prueba inmunitaria especfica es diagnstica.
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FUNDAMENTO Las partculas de poliestireno cargadas con gamma-globulina humana son aglutinadas por las muestras que contienen factores reumticos. OBJETIVO Procesar el estudio de laboratorio para identificar la presencia o ausencia de factores reumatoides en pacientes, as como establecer sus caractersticas y significado inmunitario. MATERIALES Y REACTIVOS 3 Pipetas serolgicas de 1/100 ml 1 Placa plstica de prueba de factor reumatoide 3 Muestras sricas presuntamente positivas a factores reumatoides Aplicadores de madera o de plstico PROCEDIMIENTO 1. Llevar las muestras de los pacientes y/os reactivos a temperatura ambiente. 2. Colocar en uno de los campos de la placa de prueba, 40 l de muestra srica del paciente sin diluir; en otro campo, una gota (aproximadamente 40 I) de suero control positivo y, finalmente, en un tercer campo, colocar una gota de igual magnitud que las anteriores de suero control negativo. 3. Colocar una gota (aproximadamente 40 l) del reactivo comercial Rapi Tek-RF previa agitacin, en cada una de las muestras; despus, utilizando los aplicadores de madera o de plstico, mezclar estas soluciones. Al terminar, imprmale a la placa un movimiento de rotacin con el fin de homogeneizar los componentes. 4. Al cabo de 2 min observe si se presenta una aglutinacin (prueba positiva). INTERPRETACIN Una clara aglutinacin indica la presencia de factores reumatoides. Las muestras que no reaccionan a la prueba no contienen factores reumatoides o estos se encuentran en una concentracin menor a las 20 UI/ml.
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INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. Describe que es la protena C reactiva 2. En que individuos encontramos esta protena? 3. Cmo se determina la presencia de esta protena? 4. En que casos aumentan los niveles de protena C reactiva? 5. Cul es su utilidad ms comn?
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DIAGRAMA DE FLUJO
Llevar las muestras de los pacientes y/o los reactivos a temperatura ambiente
Colocar en uno de los campos de la placa de prueba, 40 l de muestra srica del paciente sin diluir, en otro campo, una gota del suero control positivo, y en otro campo, colocar una gota de control negativo
Colocar una gota del reactivo Rapi TekRF en cada muestra
Al cabo de dos minutos observe si se presenta aglutinacin (prueba positiva)
Mezclar las soluciones con un agitador. Enseguida imprimir movimiento para homogenizar componentes
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PRACTICA NO. 15 PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIN DE CLULAS MONONUCLEARES A PARTIR DE SANGRE TOTAL POR EL MTODO FICOLL-HYPAQUE OBJETIVO Aprender la metodologa para obtener clulas mononucleares (MN) a partir de sangre venosa. METODOLOGA La sangre perifrica se colecta en tubos Vacutainer con EDTA y se procesa en un lapso no mayor de cuatro horas a temperatura ambiente. Posteriormente, la sangre total se centrifug a 1500 x g durante 15 min, se recolect el plasma y se colect en un tubo cnico de 15 ml la capa de clulas MN o suspensin celular (SC) presente entre el plasma y el paquete globular, posteriormente la SC se resuspende en RPMI suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10% y 27 mM de bicarbonato de sodio llevndolo a 6 ml, despus se pasa a otro tubo cnico con 3 ml de Ficoll-histopaque de una manera lenta por las paredes del tubo, se centrifuga a 1,500 x g durante 15 min (eliminar freno de la centrfuga), se obtienen 4 capas, Ficoll, MN, Ficoll y PMN con eritrocitos, respectivamente. Posteriormente, se recupera el anillo rico en clulas MN mediante aspiracin con una pipeta Pasteur y se lava dos veces PBS estril llevndolo hasta 10 ml para lavar del Ficoll que haya quedado, manteniendo en hielo y centrifugar a 1500 x g durante 5 min. Se elimina el PBS por decantacin y el botn celular se resuspende con 1 ml (2 ml si es una SC grande) de medio de cultivo RPMI-1640 completo (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) suplementado con SFB al 10%, inactivado por calor, se mezcl dentro del medio para no formar burbujas con la misma micropipeta.
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Viabilidad Celular Los botones celulares se resuspenden en RPMI completo con SFB, 100 U/ml de penicilina/100 g/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 15 mM de hepes (2.38 g/l), aminocidos esenciales y 50 M de 2-Me. La viabilidad de las clulas se determina utilizando la prueba de exclusin del colorante azul de tripano. Se realiza en un hematocitmetro (cmara de Neubauer) de la siguiente manera: se preparan 100 l de suspensin (1:10): en un tubo eppendorf se agregan 90 l de PBS + 10 l de SC, se mezcla y en otro tubo eppendorf se toman de esta suspensin 10 l + 80 l de PBS + 10 l de azul de tripano, se mezcla e inmediatamente se toman 10 l y se agregan a un hematocitmetro para determinar la viabilidad celular. Se realiza una dilucin con 100 l de SC: en un tubo eppendorf de adicionan 90 l de PBS ms 10 l de SC (1:10), de esta suspensin se toman 10 l y se pasan a otro tubo eppendorf con 80 l de PBS ms 10 l de azul de tripano (1:100) e inmediatamente despus se mezcla y se toman 10 l para adicionarlos a un hematocitmetro para contar las clulas MN en un microscopio con el objetivo seco dbil (10X), una vez contadas, la densidad celular se ajust a una concentracin de 1 x 106 clulas/ ml: Nmero de clulas / 4 x 104 x factor de dilucin = cantidad de clulas/ ml Se incuban a 37C en una atmsfera hmeda con 5% de CO2, por ser una transformacin blastoide con antgenos especficos (5 a 6 das). Despus de haber incubado la SC, a cada pozo de la placa se le aaden 20 l de bromuro de difeniltetrazolio (MTT) (5 mg/ml de RPMI 1640)/pozo y se incuban durante 60 min ms; posteriormente, a las placas se les descarta el sobrenadante. Luego se adicionan 300 l de Dimetil sulfxido (DMSO)/pozo, para hacer liposolubles las clulas y se efecta la lectura de la placa en un lector de ELISA a una densidad ptica (DO) de 570 nm.
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DIAGRAMA DE FLUJO
OBTENCION DE CELULAS MONONUCLEARES POR EL METODO FICOLLLHYPAQUE Sangre en tubo procesada 15 min. Centrifugar
Recolectar plasma Resuspender en RPMI
Pasar a un tubo Ficoll-histopaque y centrifugar
Recuperar el anillo de clulas mononucleares con una pipeta Pasteur
Centrifugar 5 min, suspender en medio de cultivo con cultivo RPMI-1640
Numero de clulas /factor de dilucin = cantidad de clulas/ml
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CONGELACIN Y DESCONGELACIN DE CLULAS MONONUCLEARES Cuando sea necesario se lleva a cabo la congelacin de linfocitos la cual consiste en que una vez obtenidos los linfocitos de sangre perifrica se suspenden en 0.1 ml de RPMI 1640 a una concentracin de 6 X 107 clulas/ml y se colocan en un criotubo, inmediatamente se adiciona 90% (90l) de SFB y 10% (10l) de DMSO y luego se congelan a -70C. Para descongelar las clulas, se mantienen a temperatura ambiente durante 10 min y luego se centrifugan a 800 x g durante 10 min a 10C; despus se descarta el sobrenadante y el paquete celular se suspende en RPMI 1640, ajustando las clulas a la concentracin deseada. Se efecta la lectura de la placa en un lector de ELISA a una DO de 570 nm. Obtenidos los linfocitos se suspenden en RPMI
Se adiciona suero fetal bovino
Descongelar a temperatura ambiente 10 min
Centrifugar 10 min
Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la100 Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.
PRACTICA NO. 16 PRUEBAS CRUZADAS INTRODUCCIN La transfusin es uno de los modelos trascendentales que obligan a la aplicacin rigurosa del control de calidad. Actualmente, hay una gran variedad de pruebas pretransfusionales que se han desarrollado para mejorar la seguridad y eficacia de una transfusin; si se efectan de manera adecuada, establecen la compatibilidad ABO entre el donador y el receptor y detectan la mayora de los anticuerpos clnicamente significativos. FUNDAMENTO: Este se logra a travs de la deteccin de anticuerpos salinos y de anticuerpos incompletos. OBJETIVO: Establecer la aceptacin o rechazo de una transfusin. METODO 1. Preparar una suspensin al 5% de hemates en solucin isotnica, tanto del donador como del receptor. 2. Usando tubos de ensayo pequeos: PRUEBA MAYOR Una gota de suero del receptor Una gota de suspensin de eritrocitos eritrocitos del del donador AUTOTESTIGO Una gota de eritrocitos del receptor ms dos gotas de suero del receptor - Agitar cada tubo y centrifugar inmediatamente a 1000 x g durante 1 min. PRUEBA MENOR Una gota de suero del donador Una gota de suspensin de receptor
- Remover suavemente aglutinacin.
los
eritrocitos
sedimentados
observar
si
hay
- Si el resultado es dudoso, incubar a 37C durante 20 min. - Centrifugar a 1000 x g durante 1 min y remover los eritrocitos sedimentados. Observar si existe hemaglutinacin macroscpica. - Si la reaccin continua siendo negativa, dbil positiva o dudosa se lavan los eritrocitos 4 veces con solucin isotnica a 0.9%. - Despus del ltimo lavado se elimina el sobrenadante (solucin isotnica) y se resuspenden los eritrocitos en las ultimas 1 2 gotas de solucin isotnica. - Agregar una gota de suero de Coombs a cada tubo. - Mezclar. Centrifugar a 1000 x g durante un min. - Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe la aglutinacin macroscpica. Tambin se puede observar al microscopio sin cubreobjetos. - Interpretacin: en caso de compatibilidad, las reacciones o pruebas cruzadas no presentan ni hemlisis ni aglutinacin. NO aglutinacin en la prueba mayor y en la prueba menor, esto significa 100% de COMPATIBILIDAD SANGUNEA. Aglutinacin en la prueba mayor: 75% de incompatibilidad Aglutinacin en la prueba menor: 25% de incompatibilidad PRUEBAS CRUZADAS EN MEDIO PROTEINICO PRUEBA MAYOR Dos gotas de suero del receptor Una gota de suspensin de eritrocitos del del donador al 2% PRUEBA MENOR Dos gotas de suero del donador Una gota de suspensin de eritrocitos receptor al 2%
- Agregar dos gotas de albmina bovina al 22%

- Incubar 15 min a 37C - Mezclar y centrifugar durante un min a 3000 x g. - Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe aglutinacin macroscpica. INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. Para que se realizan en un Banco de Sangre las pruebas cruzadas?
DIAGRAMA DE FLUJO
Suspensin de eritrocitos en solucin isotnica
Prueba mayor
Prueba menor
Agitar y centrifugar cada tubo
Remover eritrocitos y ver aglutinacin
Si es dudoso el resultado, incubar. Centrifugar nuevamente resultado dudoso, lavar eritrocitos. Resuspender en solucin isotnica y agregar suero de Coombs 1 gota Mezclar y centrifugar 1 min Remover eritrocitos sedimentados, observar. EN CASO DE COMPATIBILIDAD, NO PRESENTA HEMOLISIS NI AGLUTINACION
PRACTICA NO. 17 PRUEBA DE COOMBS El Fundamento de la Prueba de Coombs es que permite demostrar la presencia de anticuerpos incompletos mediante el uso de un segundo anticuerpo, que es una antiglobulina. La Prueba de Coombs directa se utiliza como mtodo diagnstico de enfermedades como las anemias hemolticas, la enfermedad hemoltica del recin nacido y en las reacciones transfusionales. La Prueba de Coombs indirecta se usa para realizar tipificacin de grupos sanguneos, pruebas sanguneas cruzadas y como mtodo de rastreo para evitar reacciones transfusionales. PRUEBA DE COOMBS DIRECTA FUNDAMENTO Se emplea la antiglobulina para detectar los anticuerpos incompletos antieritrocitarios, que ya se encuentran unidos in vivo a los eritrocitos. Es un procedimiento valioso en el diagnstico de la anemia hemoltica del recin nacido y en la anemia hemoltica auto inmune. METODO EN TUBO - Colocar una pequea cantidad de sangre completa en un tubo de ensayo. - Lavar con solucin isotnica 4 veces, centrifugando en cada ocasin y eliminar el sobrenadante salino. - Preparar una suspensin de eritrocitos al 2% - Depositar una gota de la suspensin de eritrocitos en un tubo pequeo y aadir una gota de suero de Coombs. - Mezclar y centrifugar a 1000 x g durante 1 min. - Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe aglutinacin macroscpica. INTERPRETACIN Aglutinacin: significa prueba directa positiva.
MTODO EN PORTAOBJETOS: - Preparar una suspensin de hemates al 50%, lavando previamente los eritrocitos en 4 ocasiones. - Colocar una gota de la suspensin de hemates en un portaobjetos. - Agregar a un lado 1 gota de suero de Coombs. - Mezclar con un agitador. - Rotar el portaobjetos - Observar si hay aglutinacin dentro de los siguientes dos min.
DIAGRAMA DE FLUJO
PREPARAR SUSPENSION DE ERITROCITOS AL 2 %.
Lavar con solucion salina 4 veces, centrifugar en cada ocasion y eliminar el sobrenadado.
Depositar una cantidad apropiada de sangre y solucion salina, centrifugar durannte 5 minutos.
Colocar una pequea cantidad de sangre completa en un tubo de ensayo.
Decantar el sobrenadante e incorporar nuevamente solucion salina, centrifugar durante 5 minutos, realizar 1 vez mas.
Solucion salina
Solucion salina
Depositar una gota de suspension de eritrocitos en un tubo pequeo y aadir una gota de suero de Coombs.
Mezcalr y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe aglutinacion macroscopica.
PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA FUNDAMENTO Se emplea la antiglobulina para detectar la presencia de anticuerpos incompletos antieritrocitarios no unidos in vivo a los eritrocitos. Para detectar ciertos grupos sanguneos como el Duffy, kell y kidd. Se realiza en dos fases, en la primera se enfrentan los anticuerpos frente a hemates de antigeinicidad conocida para provocar su unin y posteriormente se aade al antiglobulina hemaglutinante. METODO EN TUBO - Preparar una suspensin de eritrocitos al 5% - Depositar una gota de la suspensin de eritrocitos a cada tubo pequeo - Mezclar y centrifugar a 1000 rpm durante un min. - Remover suavemente los eritrocitos sedimentados - Lavar con solucin isotnica 4 veces, centrifugando en cada ocasin y eliminar el sobrenadante salino dejando 1 o 2 gotas para resuspender. - Aadir una gota de suero de Coombs. Mezclar y centrifugar. - Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe aglutinacin macroscpica. INTERPRETACIN Aglutinacin: significa la presencia de anticuerpos incompletos. MTODO EN PLACA: - Preparar una suspensin de hemates grupo sanguneo O factor Rh positivo - Agregar dos gotas de suspensin de eritrocitos al 50%, en un tubo. - Agregar cinco gotas de suero problema. Mezclar e incubar a 37C durante 60 min.
- Lavar los eritrocitos en cuatro ocasiones con solucin isotnica y resuspender hasta obtener una suspensin de aproximadamente el 50%. - Depositar una gota de la suspensin de eritrocitos lavados y sensibilizados en un portaobjetos. - Depositar separadamente una gota de suero de Coombs. - Mezclar con un aplicador de madera y rotar el portaobjetos. - Observar si hay aglutinacin dentro de los dos min siguientes. - Agregar a un lado 1 gota de suero de Coombs. - Mezclar con un agitador. - Rotar el portaobjetos - Observar si hay aglutinacin dentro de los siguientes dos min.
DIAGRAMA DE FLUJO
PREPARAR SUSPENSION DE ERITROCITOS AL 5 %.
Depositar una cantidad apropiada de sangre y solucion salina, centrifugar durannte 5 minutos.
Decantar el sobrenadante e incorporar nuevamente solucion salina, centrifugar durante 5 minutos, realizar 1 vez mas.
Depositar una gota de la suspension de eritrocitos a cada tubo pequeo. mezclar y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto.
Lavar con solucion salina 4 veces, centrifugar en cada ocasion y eliminar el sobrenadado. dejando 1 gota para resuspender.
Solucion salina
Solucion salina
PRACTICA No. 18 PODER BACTERICIDA DEL SUERO NORMAL El suero normal contiene una serie de sustancias, que son capaces de destruir a las bacterias. Estas sustancias estn presentes en mayor o menor grado en todos los sueros, y por lo tanto no son el resultado de una inmunizacin previa. Por esta razn estn clasificadas dentro de las defensas inespecficas del organismo La cantidad de las diversas sustancias presentes en el suero vara de especie a especie, y entre individuos. Su eficacia depende tambin del agente infeccioso que se trate.
Sustancia
Lisozima Fagocitina Lisina Complemento Leuquina Espermita Hematina Polipptidos bsicos
Accin
Destruye pared celular de Gram + Acta sobre Gram - y algunos Gram + Acta sobre Gram + Tiene varias acciones. Presente en los leucocitos Presentes en los espermatozoides Presentes en glbulos rojos, puede actuar como sustancia nutritiva de algunas bacterias Mesohematina Plaquina Funcin similar a la hematina Presente en las plaquetas
Factor de Tillet Interfern Mucoproteinas
Inhibe a Streptococcus pyogenes. Protege a las clulas contra la infeccin viral. Inhibe las bacterias y virus en combinacin con iones Mg 2-4-
Properdina Peroxidasa
Inhibe la neuraminidasa producida por los virus. Destruye el perxido de hidrgeno que es el producto final de la respiracin de algunas bacterias.
Perxido de Hidrgeno
Mata a bacterias catalasa negativas.
Entre las sustancias ms importantes se encuentran: Lisozima. Esta es una poderosa sustancia bactericida que acta destruyendo la pared celular de un gran nmero de bacterias, sobre todo las Gram (+), se encuentra presente en forma abundante en las lgrimas (formando el mecanismo ms importante de defensa del ojo), y en el suero. Se encuentra tambin en saliva y secreciones mucosas, aunque en menor concentracin. Interfern. Esta es una sustancia viricida de gran poder, que se forma dentro de las clulas despus de que stas han sido infectadas. Acta inespecficamente contra todos los virus, y se puede utilizar como proteccin pasiva en individuos de la misma especie. Su papel como posible agente inmunizante a nivel de poblacin est bajo estudio. Fagocitina, Leuquina: Estas sustancias juegan un papel importante en la actividad bactericida de las clulas fagocitarias, aunque su mecanismo de accin no se conoce con exactitud. OBJETIVO Evaluar la sobrevivencia de una bacteria patgena en suero hiperinmune, suero normal y solucin salina fisiolgica. METODOLOGA 1) Coloca 0.25 ml de solucin salina (SS) estril en el tubo A 2) Coloca 0.25 ml de suero 1 en el tubo B 3) Coloca 0.25 ml de suero 2 en el tubo C 4) Coloca 0.25 ml (o una asada) de cultivo de Salmonella en todos los tubos. 5) Incuba los tres tubos a 37C durante 30 min. 6) Diluye el contenido de los tubos 1:20 con SS 7) Inocula 0.1 m de esta dilucin en una caja de agar nutritivo. 8) Incuba tus cajas a 37C durante 24 h. 9) Lee tus resultados y compara con tus compaeros.
Nota: El procedimiento debe realizarse usando tcnica estril. INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) Qu es un suero hipermmune? 2) Qu es el complemento? 3) Investiga que es la catalasa y el perxido de hidrgeno 4) Qu es lisozima? 5) Qu es Salmonella? CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) Cuntas colonias crecieron en cada caja? 2) En base a esa informacin, cual suero era hiperinmune y cual el normal? 3) Porque? 4) Cul es la accin del complemento en el suero normal y en el hipermmune? 5) Cul es la relacin entre catalasa y perxido de hidrgeno desde el punto de vista patgeno? 6) Realiza una lista de cinco bacterias en orden decreciente de su sensibilidad a la lisozima.
Glosario de trminos Es importante, que para la mejor comprensin y conocimiento de la ctedra de inmunologa, conocer el significado de la terminologa utilizada durante el estudio de la inmunologa. Adyuvante Cualquier sustancia que intensifica de manera inespecfica la respuesta inmunitaria frente a un antgeno o aumenta los efectos farmacolgicos de un medicamento. Anergia Tolerancia inmunolgica especfica potencialmente reversible en la cual el linfocito pierde la capacidad de respuesta funcional. Anticuerpo (Ab) Protena que posee las propiedades moleculares de una inmunoglobulina, sintetizada principalmente por las clulas plasmticas como resultado del estmulo de un antgeno (agente infeccioso o una sustancia extraa). Un anticuerpo es producido por clulas plasmticas derivadas de linfocitos B. Esta protena tiene afinidad especfica para el antgeno que estimul la formacin fijndose a l por su fragmento Fab en forma no covalente. Todos los anticuerpos IgG, IgM, IgA secretoria, IgA srica, IgE e IgD pertenecen a las inmunoglobulinas, sin embargo no todas las inmunoglobulinas funcionan como anticuerpos. Molculas proteicas producidas por el organismo como respuesta a un estmulo por un inmungeno. Ante los inmungenos que los originan, los anticuerpos tienen la propiedad esencial de reaccionar especficamente. Anticuerpo fluorescente Un anticuerpo conjugado con un colorante fluorescente como el FITC. Anticuerpo monoclonal Anticuerpo homogneo derivado de una nica clona celular B. Todos estos anticuerpos tienen idnticos sitios de fijacin antignica e isotipo.
Antgeno (Ag) Trmino que se acu en el s. XIX para designar cualquier sustancia que introducida en el organismo era capaz de inducir una respuesta inmunolgica. 1) en la actualidad el trmino se utiliza ms ampliamente para referirse a cualquier sustancia o clula (e.g. bacterias, virus, glbulos rojos, clulas de trasplantes o algunos componentes de estos como: protenas, lipopolisacridos) que es reconocida como extraa por el sistema inmune. 2) tambin se utiliza para designar a uno de los reactivos de las pruebas serolgicas, e.g. antgeno Rosa de Bengala, antgeno Tfico. Segn la definicin clsica, es una sustancia capaz de provocar en el organismo la formacin de anticuerpos que puedan unirse especficamente con ella, o de clulas que tengan una afinidad especfica ante ella. De hecho, esta definicin corresponde ms bien al trmino de inmungeno. Antgeno CD - Conjunto de diferenciacin celular Designacin de la aglomeracin de diferenciacin para molculas de la superficie celular leucoctica que son identificadas por un grupo dado de anticuerpos monoclonales. Los linfocitos T se localizan predominantemente en los folculos y entre ellos, en la paracorteza. La mayora (70% aproximadamente) de estas clulas T son linfocitos T colaboradores CD4+, entremezclados con escasas clulas CD8+. Las clulas CD4+ y CD8+ son protenas de superficie molculas de adhesin; integrinas. CD44 Isoforma CD45 principal (solo en seres humanos). La Isoforma de la molcula CD45 es identificada por anticuerpos especficos del segmento codificado por el exn A, por lo que recibe el nombre de CD45RA (restringida por A). Antgeno de Histocompatibilidad. Isoantgenos codificados por los genes del sistema mayor de Histocompatibilidad (HLA y H-2) que se localizan en la membrana celular de la mayora de las clulas nucleadas. Son las responsables de la interaccin y cooperacin celular (Ag de la clase II), as como del rechazo de injertos (Ag de la clase I). Apoptosis Muerte celular programada que se caracteriza por la digestin endonuclesica del ADN. Proceso de muerte celular caracterizado por la escisin del ADN, condensacin y fragmentacin del ncleo y la vesiculacin de la membrana plasmtica que provoca la fagocitosis de la clula sin inducir una respuesta inflamatoria. Este tipo de muerte celular es
importante en el desarrollo de los linfocitos, en la regulacin de las respuestas linfocticas a los antgenos extraos y en el mantenimiento de la tolerancia a los autoantgenos. Bacilo Calmette-Gurin (BCG) Mycobacterium tuberculosis o bovis atenuado que se emplea como vacuna especfica contra la TB y tambin como un adyuvante. CD 4+ Glucoprotena de la superficie celular, usualmente en las clulas T cooperadoras, que reconoce las molculas de la clase II del MHC en las APC. CD 8+ Glucoprotena de la superficie celular, usualmente en las clulas T citotxicas, que reconoce las molculas de la clase I del MHC en las dianas celulares. Clulas citocidas naturales (NK) Subpoblacin de linfocitos derivados de la mdula sea, diferentes de las clulas T o B, que actan en las respuestas inmunitarias innatas para destruir a las clulas infectadas por microorganismos mediante mecanismos lticos directos y secretando IFN-. Las clulas NK no expresan receptores para el antgeno de distribucin clonal como los receptores Ig o los TCR, y su activacin esta regulada por una combinacin de receptores estimuladores e inhibidores; estos ltimos reconocen molculas del MHC propio. Secretan citoquinas e IFN- Clulas Dendrticas Clulas accesorias inmunitarias derivadas de la mdula sea presentes en los tejidos epiteliales y linfoides que se caracterizan desde el punto de vista morfolgico por delgadas proyecciones membranosas. Actan como APC para los linfocitos T no estimulados, y son importantes para el inicio de las respuestas inmunitarias adaptativas a los antgenos proteicos.
Clula Dendrtica Folicular Clulas dendrticas negativas para la clase II del MHC y positivas para receptores de Fc que poseen inmunocomplejos en su superficie y probablemente participen en la generacin de clulas secretoras de anticuerpos y en el mantenimiento de la memoria celular B en los centros germinativos. Clula Dendrtica Interdigitante Clulas dendrticas APC positivas para la clase II del MHC y negativas para receptores de Fc que se encuentran en las reas celulares T de los ganglios linfticos y el bazo. Clulas de Langerhans Son de las principales poblaciones celulares presentes en la epidermis, stas son las clulas dendrticas inmaduras. Su funcin principal es atrapar y transportar antgenos proteicos a los ganglios linfticos de drenaje. Durante su migracin a los ganglios linfticos, las clulas de Langerhans maduran a clulas dendrticas a los ganglios linfticos, capaces de presentar eficazmente los antgenos a las clulas no estimuladas (vrgenes), positivas para la clase II del MHC y para receptores de Fc que se encuentran en la piel. Clulas M Son clulas de membrana especializadas. Clulas epiteliales especializadas utilizadas sobre las placas de Peyer del intestino que desempean un papel en la llegada de los antgenos a las placas de Peyer. Clula NK (destructora o citocida natural) Linfocito granular grande que no reordena ni expresa genes de inmunoglobulinas ni de receptores celulares T pero que es capaz de reconocer o destruir ciertas clulas tumorales o infectadas por virus de una manera independiente de los anticuerpos y el MHC. Clula presentadora de antgenos (APC) Clula que expone en su superficie fragmentos peptdicos de antgenos proteicos, asociados a molculas del MHC, y activa las clulas T especficas de los antgenos. Adems de presentar complejos pptido-molcula del
MHC, las APC tambin deben expresar molculas coestimuladoras para activar ptimamente a los linfocitos T. Clula presentadora de antgeno profesional (APC profesional) APC para los linfocitos T colaboradores, como las clulas dendrticas, los fagotitos mononucleares y los linfocitos B, que es capaz de expresar molculas de clase II del MHC y coestimuladores. Las APC profesionales ms importantes para el inicio de las respuestas de clulas T primarias son las clulas dendrticas. Clulas plasmticas Linfocitos B; clulas que sintetizan y secretan anticuerpos especficos de una especificidad e isotipo. Los anticuerpos son sintetizados y secretados por las clulas plasmticas. Las clulas plasmticas maduras son de corta vida y liberan muchos miles de anticuerpos idnticos por segundo. Cada anticuerpo es capaz de reaccionar especficamente con el antgeno que inici la respuesta inmune. El origen de los anticuerpos son las clulas plasmticas diferenciadas. Estas clulas se encuentran ms frecuentemente en la pulpa blanca del bazo, mdula de ganglios perifricos y otros tejidos linfticos secundarios. Las clulas plasmticas estn caracterizadas por su retculo endoplsmico rugoso iniciador de la sntesis proteica activa, su cromatina nuclear marginada y por la presencia de un citoplasma fuertemente basfilo. Los grnulos plasmticos son ricos en anticuerpos proteicos. Durante el curso de la respuesta inmune, las clulas plasmticas producen anticuerpos. Clulas presentadoras de antgenos (APC) Denominacin habitual para clulas que presentan pptido antignico procesado y molcula de la clase II del MHC al receptor T en los linfocitos T CD4+. Son ejemplos macrfagos, clulas dendrticas y clulas B. La mayor parte de los tipos celulares es capz de presentar pptidos antignicos con la clase I del MHC a las clulas T CD8+, como ocurre con las clulas infectadas por virus. Clulas presentadoras profesionales) de antgenos profesionales (APC
Son APC profesionales los linfocitos T colaboradores, como las clulas dendrticas, los fagotitos mononucleares y los linfocitos B, que es capaz de expresar molculas de clase II del MHC y coestimuladores. Las APC
profesionales ms importantes para el inicio de las respuestas de clulas T primarias son las clulas dendrticas. Clulas T colaboradoras Subpoblacin funcional de los linfocitos T cuyas funciones efectoras principales consisten en activar a los macrfagos en las respuestas inmunitarias celulares y promover la produccin de anticuerpos por las clulas B en las respuestas inmunitarias humorales. Estas funciones efectoras estn mediadas por citoquinas secretadas y por la unin del ligando de CD40 expresado en las clulas T al CD40 de los macrfagos o las clulas B. La mayora de las clulas T colaboradoras expresa CD4. Clulas Th1 (Clulas T colaboradoras) Subpoblacin funcional de clulas T colaboradoras que secreta un conjunto especfico de citoquinas, como IFN- , y cuya funcin principal consiste en estimular la defensa mediada por los fagotitos contra las infecciones, especialmente las debidas a los microorganismos intracelulares. Clulas Th2 (Clulas T colaboradoras) Subpoblacin funcional de clulas T colaboradoras que secreta un conjunto especfico de citoquinas, como IL-4 e IL-5, y cuyas funciones principales consisten en estimular las reacciones inmunitarias medidas por IgE y por eosinfilos/mastocitos y regular negativamente las respuestas de Th1. Cininas Una familia de polipptidos liberados durante las respuestas inflamatorias y que aumentan la permeabilidad vascular y la contraccin del msculo liso. Citometra de Flujo Mtodo para el anlisis del fenotipo de las poblaciones celulares que requiere un instrumento especializado (citmetro de flujo) que detecta la fluorescencia en clulas individuales en una suspensin y, por lo tanto, determina el nmero de clulas que expresan la molcula a la que se une la sonda fluorescente. Las suspensiones de clulas se incuban con anticuerpos marcados fluorescentemente o con otras sondas, y la cantidad de sonda unida por cada clula de la poblacin se mide haciendo pasar las clulas a travs de un fluormetro con un haz incidente generado por lser.
Citoquinas (citocinas) Protenas de bajo peso molecular que estimulan o inhiben la diferenciacin, proliferacin o funcin de las clulas inmunitarias. Protenas producidas por muchos tipos de clulas distintos que median las reacciones inflamatorias e inmunitarias. La citoquinas son uno de los principales mediadores de la comunicacin entre las clulas del sistema inmunitario. Citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpos Proceso por el cual las clulas citocidas naturales (NK) son dirigidas a las clulas recubiertas de anticuerpos. En la membrana de las clulas NK se expresa un receptor especfico de la regin constante de las IgG, denominado FcRIII (CD16), que media la unin a la Ig. Coestimulador Molcula de la superficie de una clula presentadora de antgenos (APC) o secretada por esta que proporciona un estmulo (una segunda seal) necesaria para la activacin de las clulas T no estimuladas (vrgenes), adems del antgeno. Los coestimuladores mejor definidos son las molculas B7 presentes en las APC profesionales que se unen a la molcula CD28 presente en las clulas T. Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) Es un locus gentico de gran tamao localizado en el cromosoma 6 del ser humano y en el 17 del ratn, consta de genes muy polimrficos que codifican las molculas de unin al pptido que son reconocidas por los linfocitos T. El locus CMH tambin contiene genes que codifican citoquinas, molculas que participan en el procesamiento antignico y protenas del complemento. Complemento (C) Complejo proteico, presente en todo suero normal. Es inespecfico, es decir, existe en ausencia de toda inmunizacin. Se fija a la mayora de complejos antgeno-anticuerpo. Completa, en cierta manera, la accin de los anticuerpos y es necesario en la hemlisis inmunolgica y en la bacterilisis. C es una serie de protenas plasmticas que, al activarse, operan como una cascada para efectuar la lisis de membranas celulares; pueden activarse por reaccin entre antgeno en una membrana celular
(va clsica) o por polisacridos bacterianos, como endotoxinas (va alternativa). Determinante antignico Una aglomeracin de eptopos. ELISA Anlisis de inmunoabsorcin ligado a enzimas Mtodo para cuantificar un antgeno inmovilizado en una superficie slida utilizando un anticuerpo especfico con una enzima unida covalentemente. La cantidad de anticuerpo que se une al antgeno es proporcional a la cantidad de antgeno presente, y se establece mediante la determinacin espectrofotomtrica de la conversin de un sustrato transparente en un producto coloreado por la enzima unida. Eptopo La parte de un antgeno que es reconocida (determinante antignico) Factor de Necrosis Tumoral (TNF) Citocina producida fundamentalmente por fagotitos mononucleares activados que acta estimulando el reclutamiento de los neutrfilos y los monocitos a los sitios de infeccin y activando estas clulas para erradicar a los microorganismos. El TNF estimula a las clulas del endotelio vascular para que expresen nuevas molculas de adhesin, induce la secrecin de quimioquinas por los macrfagos y las clulas endoteliales y promueve la apoptosis de las clulas Diana. Factor de Necrosis Tumoral-alfa y beta (TNF- y TNF-) Dos citocinas emparentadas que originalmente fueron designadas as por sus efectos citotxicos sobre ciertas clulas tumorales pero que tambin poseen funciones inmunorreguladoras. Fagocitosis Fenmeno que consiste en el englobamiento y destruccin por los fagocitos de partculas slidas organizadas o inertes. Proceso por el que ciertas clulas del sistema inmunitario, incluidos los macrfagos y los neutrfilos, engloban partculas de gran tamao (> 0.5 m de dimetro), como
por un receptor antignico
microorganismos intactos. La clula rodea la partcula con extensiones de una membrana plasmtica mediante un proceso dependiente de energa y del citoesqueleto; este proceso tiene como resultado loa formacin de una vescula intracelular denominada fagosoma, que contiene la partcula ingerida. Fagocitosis inducida Fagocitosis auxiliada por la accin de las opsoninas del suero sanguneo. Fitohemaglutinina (PHA) Lectina vegetal que acta como mitgeno para las clulas T. Fragmento Fab Obtenido por accin de la papana. Esta formado por las dos mitades C terminales de las dos cadenas ligeras. Fragmento Fc Fragmento, llamado cristalizable, de la molcula de Ig. Fragmento que no fija antgenos, obtenido de una molcula de Ig tras la digestin con papana. Consiste en la fraccin C-terminal de ambas cadenas pesadas que se une a los receptores de Fc y al C1q. Hipersensibilidad Respuesta inmunolgica inadecuada o exagerada que causa dao en un individuo inmunizado. Hipersensibilidad inmediata Sensibilidad anormal a un antgeno que se traduce por una reaccin patolgica (liberacin de aminas vasoactivas) en los minutos que siguen a la unin de este antgeno con el anticuerpo especfico correspondiente. Hipersensibilidad retardada Reaccin inmunitaria, mediante clulas nucleadas de un mismo individuo, responsables de la reaccin inmunitaria de rechazo de injertos. Corresponden a una especificidad del individuo.
IgG (immunoglobulin G) inmunoglobulina G (-gamma). PM de 150,000, 80% del total de inmunoglobulina en plasma; protege los lquidos corporales internos contra bacterias y sus toxinas; puede cruzar la placenta y conferir defensas en las primeras semanas de vida. Inflamacin La respuesta de los tejidos ante los traumatismos que se caracteriza por un aumento del flujo sanguneo y el influjo de leucocitos en el sitio afectado y cuyas consecuencias son la tumefaccin (tumor), el enrojecimiento (rubor), el aumento de la temperatura (calor) y el dolor. Inmune Protegido natural o artificialmente contra una enfermedad determinada. Inmunidad Conjunto de manifestaciones que un organismo vivo es capaz de desarrollar en su esfuerzo para adquirir un estado refractario frente a las infecciones. Inmunidad Activa (Inmunidad Actual) La debida a una reaccin del organismo contra el agente nocivo, despus de curado de una enfermedad infecciosa o de inoculado con la bacteria causante o sus productos. Inmunidad Adquirida (Inmunidad Artificial) Inmunidad mediada por linfocitos y caracterizada por especificidad antignica y memoria. Es la que se obtiene naturalmente despus de una enfermedad infecciosa o artificialmente por inoculacin o vacunacin. Inmunidad Antibacteriana o antitxica Inmunidad contra la accin de las bacterias o las toxinas respectivamente.
Inmunidad Celular Es la inmunidad mediada por clulas, alude a las respuestas inmunitarias mediadas por clulas T. Inmunidad en la que los factores activos son las clulas fagocitarias. Inmunidad de Comunidad La que por medidas higinicas u otras se confiere a un grupo de individuos contra una enfermedad a la que particularmente cada individuo sigue siendo susceptible. Inmunidad Congnita (Inmunidad Natural, inherente o innata) Inmunidad que poseen ciertos individuos o especies de animales contra una enfermedad determinada, como la que tienen muchas especies respecto a la sfilis. Inmunidad Especfica Inmunidad contra una enfermedad o antgeno particular. Inmunidad Familiar Inmunidad que existe como caracterstica de algunas familias. Inmunidad Humoral Aquella cuyos factores activos son los anticuerpos en los humores orgnicos. Derivada de linfocitos B y sntesis de anticuerpos especficos solubles por las clulas plasmticas; esto estimula la fagocitosis de clulas extraas o la combinacin con molculas extraas y su precipitacin. Inmunidad innata Inmunidad que no es intrnsecamente afectada por el contacto previo con el antgeno, o sea todos los aspectos de la inmunidad no mediada de manera directa por los linfocitos. Inmunidad Opsnica La debida a la presencia de opsoninas que estimulan la fagocitosis.
Inmunizacin Proteccin contra una enfermedad por medio de una vacuna, generalmente con una forma dbil del agente que causa la enfermedad. Inmunoglobulina (Ig) Fraccin de las protenas plasmticas ligada a la funcin anticuerpo; sinnimo de globulinas . Son globulinas sricas con propiedades de anticuerpo. Sin embargo, no todas las molculas de inmunoglobulinas tienen una actividad de anticuerpo. Actualmente se conocen cinco variedades denominadas IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Inmunomoduladores Medicamentos que se espera fortalezcan el sistema inmunolgico y ayuden al cuerpo a combatir las infecciones oportunistas u otras enfermedades. No son necesariamente usados para estimular el sistema inmunolgico ya que puede ser perjudicial. Incluyen dos sub-grupos: las citocinas y los inmunomoduladores de amplia actividad. Los inmunomoduladores de amplia actividad son hormonas mensajeras qumicas del cuerpo que regulan el sistema inmunolgico, como las endorfinas que controlan el calor. Interferones (IFN) El IFN- deriva de diversos leucocitos, el IFN- lo hace de fibroblastos y el IFN- proviene de los linfocitos T. Los tres tipos inducen un estado antivirsico en las clulas y el IFN- acta como una citocina en la regulacin de las respuestas inmunitarias. Interfern-gamma (IFN-) Citosina producida por los linfocitos T y las clulas citocidas naturales (NK) cuya principal funcin consiste en activar a los macrfagos en las respuestas inmunitarias, tanto innatas como adaptativas. El IFN- tambin se denomina interfern inmunitario o de tipo II. Interleucina (IL) Designacin de algunas citocinas secretadas por los leucocitos.
Interleucina 1 Linfocina secretada por los macrfagos o clulas accesorias que tiene como accin biolgica el activar los linfocitos T y linfocitos B contra los antgenos. Interleucina 2 Linfocina sintetizada por los linfocitos T cooperadores activados cuya funcin es la de causar la proliferacin y activacin de otros linfocitos T en forma no especfica. Este factor es esencial para mantener en cultivo por tiempo prolongado a los linfocitos T. ITAM (Motivos de activacin de inmunorreceptores basados en tirosina) Son secuencias concenso para la familia src de las tirosina cinasas. Estos motivos se encuentran en los dominios citoplasmticos de varias molculas de sealizacin, incluidas las unidades de transduccin de seales de los receptores antignicos linfocticos y de los receptores de Fc. Knockout El uso de recombinacin gentica homloga en clulas precursoras embrionarias para reemplazar un gen funcional por una copia defectuosa de ese gen. Los animales generados mediante esta tcnica pueden criarse hacia la homocigosis, lo que permite la aparicin de un fenotipo nulo para ese producto gnico. Lectina Una familia de protenas, en su mayora de origen vegetal, que se unen a los carbohidratos especficosen glucoprotenas y glucolpidos. Algunas lecitinas tambin son mitgenos (PHA, conA). Linfocitos B Linfocitos timoindependientes o burso -o bone marrow- dependientes, precursores de los plasmocitos que producen los anticuerpos. Linfocitos T Linfocitos timoderivados o timodependientes, implicados en las reacciones inmunitarias de tipo celular.
Linfocito T citotxico Clulas T (por lo general CD8+) que destruyen dianas celulares tras el reconocimiento de molculas del MHC-pptidos extraos en la membrana celular de la diana. Linfocitos T cooperador (auxiliar) TH Linfocitos T que colaboran en la sntesis de anticuerpos frente a antgenos timodependientes. Linfocitos T supresores Linfocitos T que ejercen una accin supresiva ante respuestas inmunitarias humorales. Linfokinas Mediadores solubles producidos tanto por linfocitos T sensibilizados a un antgeno, durante la reaccin inmunitaria celular, como por los linfocitos T no sensibilizados, bajo influencia de mitgenos no especficos. Lipopolisacrido (LPS) Endotoxina derivada de las paredes celulares de las Gramnegativas que tienen acciones inflamatorias y mitgenas. Macrfago (M) Clula fagoctica grande, derivada del monocito de la sangre, que tambin funciona como clula presentadora de antgenos y puede mediar la citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpos (ADCC). Mycobacterium Gnero de bacterias aerobias, muchas especies de las cuales pueden sobrevivir en el interior de los fagocitos y provocar enfermedad. La principal defensa del husped frente a las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis es la inmunidad celular. NADPH Forma reducida del fosfato de dinucleotido de nicotinamida adenina.
bacterias
Opsoninas Sustancia termolbil del suero sanguneo normal, que hace a los microbios o clulas sanguneas ms aptos para ser fagocitados por los leucocitos. Sustancias capaces de aumentar la fagocitosis. Son bsicamente anticuerpos y fracciones del complemento. Opsonina especfica o inmune Opsonina que se desarrolla en el suero sanguneo como resultado de una infeccin, activa nicamente contra el organismo infectante. Opsonizacin Proceso en que un antgeno se combina con el anticuerpo opsonina para hacerlo ms susceptible a la accin de englobamiento de los fagocitos. Organo linfoide central Organo bajo cuya influencia las clulas se hacen inmunolgicamente competentes, es decir, capaces de reaccionar con el antgeno. Lo son la mdula sea, el timo y la bolsa de Fabricio (est nicamente en las aves). rgano linfoide perifrico rgano en el que se realiza el contacto entre el antgeno y las clulas inmunolgicamente competentes. Comprende los ganglios linfticos, el bazo y las formaciones linfoides de las mucosas digestivas y respiratorias. Oxido Ntrico (NO) Molcula efectora biolgica con una amplia gama de actividades que en los macrfagos acta como un potente agente microbicida para destruir a los microorganismos ingeridos. Protena fijadora de manosa Un miembro de la familia de las colectinas (lectinas calciodependientes) que es una protena de fase aguda. Funciona como un estimulante de la activacin de la va clsica del C y como una opsonina para la fagocitosis a travs de su unin a la manosa, un residuo de carbohidrato que suele hallarse en una forma expuesta solo en la superficie de los microorganismos.
Quimioquinas Una familia de citocinas de estructuralmente que inducen con las clulas fagocticas y linfocitos. rpidamente la adhesin leucictica Reaccin inmunitaria Reactividad nueva y especfica del organismo adquirida como consecuencia de la introduccin de un inmungeno. Se distingue la reaccin inmunitaria humoral caracterizada por la produccin de anticuerpos y la reaccin inmunitaria celular, con produccin de clulas mononucleadas que reaccionan especficamente con el antgeno. Receptor de clula T (TCR) El receptor antignico heterodimrico del linfocito T existe en dos formas alternativas consistentes en cadenas y y en cadenas y . El TCR reconoce fragmentos peptdicos presentados por molculas del MHC en la superficie de las clulas. La funcin de los TCR no est tan bien definida pero se sabe que puede reconocer protenas nativas en la superficie celular. Receptores de Fc (FcRs) Receptores de la superficie celular que fijan la porcin Fc de clases particulares de Igs. Reclutamiento Movimiento regulado por los linfocitos. Respuesta inmune primaria Es la respuesta inmunitaria relativamente dbil que se produce en el primer encuentro de los linfocitos vrgenes con un antgeno dado. Respuesta inmune secundaria Es la respuesta inmunitaria con mejoras cualitativas y cuantitativas que ocurre en el segundo encuentro de los linfocitos programados con un antgeno dado.
bajo peso molecular, relacionadas selectividad quimiotaxis y activacin de Tambin son capaces de desencadenar mediada por integrinas.
Separador celular activado por fluorescencia (FACS) Adaptacin del citmetro de flujo que se utiliza para purificar las clulas de una poblacin mixta en funcin de que sonda y que cantidad de la misma se une a las clulas. Las clulas se tien con una sonda marcada fluorescentemente, como un anticuerpo especfico del antgeno de superficie de una poblacin celular. Las clulas se hacen pasar entonces de una en una a travs de un fluormetro con un haz incidente generado por lser y son deflectadas diferencialmente por campos electromagnticos cuya potencia y direccin varan de acuerdo con la intensidad medida de la seal de fluorescencia. Sintetasa de xido ntrico inducible (iNOS) Es una enzima citoslica que no existe en los macrfagos en reposo, pero puede inducirse en respuesta al LPS en combinacin con IFN-. La iNOS cataliza la conversin de arginina en citrulina, y se libera xido ntrico que se difunde libremente. Telergeno Antgeno utilizado para inducir tolerancia, a menudo depende de las circunstancias de la administracin que de cualquier propiedad inherente a la molcula. Timo Sitio de maduracin de los linfocitos T. rgano linfoide llamado central en el que tiene lugar la diferenciacin en los linfocitos T, responsables de la respuesta inmunitaria de tipo celular. Es un rgano glandular endcrino transitorio, propio de la infancia, del que solo quedan vestigios adiposos a los 10 o 12 aos de edad, situado en la parte inferior del cuello y superior del mediastino anterior, formado por dos lbulos alargados, compuestos cada uno de ellos por una serie de lobulillos dispuestos alrededor de un eje o cordn central conjuntivo. Cada lobulillo se halla dividido por un tabique de tejido conjuntivo en folculos formados de una sustancia cortical y otra medular con linfocitos, leucocitos y corpsculos de Hassall (cuerpos pequeos en el Timo, estriados concntricamente; restos del tejido epitelial que se encuentran en los primeros perodos de desarrollo de la glndula). Timocito Clula T en desarrollo en el timo.
Vacuna Preparacin microbiana que, introducida en el organismo, provoca en ste la inmunizacin activa contra una enfermedad determinada. Provoca una reaccin en el organismo y es principalmente preventiva. Vas de Activacin del Complemento La activacin de los factores proteicos del complemento se hace secuencialmente segn dos vas: en la va clsica, el activador est constituido por complejos antgeno-anticuerpo; en la va alterna, los activadores corresponden a las endotoxinas bacterianas, el zymosan, el veneno de cobra y agregados de determinadas inmunoglobulinas (IgA, IgE).
REDVET: 2010, Vol. 12 N 4

Este libro electrnico Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica est disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111110B.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n040411/041108.pdf REDVET Revista Electrnica de Veterinaria est editada por Veterinaria Organizacin. Se autoriza la difusin y reenvo siempre que enlace con Veterinaria.org http://www.veterinaria.org y con REDVEThttp://www.veterinaria.org/revistas/redvet

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http://www.veterinaria.org- info@veterinaria.

Autores Dra. en C. Aurora Martnez Romero. Divisin de Estudios

C. Dr. en C., M.S.P. Jos Luis Ortega Snchez. Unidad Regional

Capacitar al personal en el manejo adecuado de residuos biolgico-

Prcticas generales de seguridad y bioseguridad en el laboratorio. Reglamentos

Normas de Seguridad especficas de las prcticas

Lesin de los ojos

Slidos Lquidos Slidos

Bolsas de plstico Recipientes hermticos Recipientes rgidos

Amarillo Amarillo Rojo

Aplicar en el laboratorio clnico las prcticas realizadas en el laboratorio de Inmunologa

Para realizar exmenes de diagnstico certeros y confiables

Utilizacin de los laboratorios, material y equipo correspondiente, en cada prctica

Competencia o unidad de competencia Encuadre

Tipo Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)

Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)

Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)

Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo

Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)

Contenido de cada prctica en particular

Posicin de las intraperitoneal

2.- Evitar molestar

Soluto Diluyente TOTAL

PROPORCION 1 parte de HCl 1 parte de agua 2 partes en total

VOLUMEN 12.5 ml 12.5 ml 25.0 ml

3) Porque cambiaste la pipeta en cada uno?

Realizar una dilucion QUINTUPLE (1:5) de HCl en agua, en un volumen de 25 mL.

Realizar una dilucion (1:250) de HCl en agua, en un volumen de 25 mL.

En una serie de 10 tubos, coloca 0.25 de agua.

En el tubo 1, deposita 0.25 mL de oolorante.

Mezclar muy bien.

Mezclar muy bien.

En el tubo 1, deposita 0.25 mL de oolorante.

Se disulve la solucin salina amortiguadora y el agar con ayuda del calor.

Barnizar las cajas petri con agarosa al 1% y secarlos al horno.

Prueba de precipitacin del sulfito de sodio

Mexclar perfectamente el contenido.

Leer al espectofotometro a 660 nm. el resultado se multiplica por 10.

Mantequilla Queso Pasto

152 mm de lluvia Exposicin al sol

142 180 6 <1 43

Cultivos en placa abierta Agua Cadver de cobayo infectado

5 2 -3 800 57 44 1 29 65 < 4h 2 250

Carne y carne salada Abono en seco

Depositar 0.4 ml de suero problema.

Depositar 0.4 ml de solucion rivanol al 1%.

Mezclar bien agitando el tubo. dejar a temperatura ambiente 10 minutos.

En placa de vidrio, depositar 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 ml.

Centrifugar a 2000 rpm de 5-10 minutos.

Agregar 0.03 de antigeno rivanol a cada cantidad de liquido sobrenadante.

Colocar 0.9 ml de solucion salina fenolada en el primer tubo.

Solucin salina fenolada 0.5%

En el resto de los tubos colocar 0.5 ml de solucin salina fenolada.

Solucin salina fenolada 0.5%

Pasar 0.5 ml del primer tubo al segundo.

Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y asi sucesivamente hasta elultimo.

Desechar los 0.5 ml del ultimo tubo.

Colocar 0.9 ml de solucion salina 2-ME en el primer tubo.

Depositar 0.1 ml de suero problema.

Solucin salina 2-ME

Colocar 0.5 ml de solucion salina 2-ME en el resto de los tubos.

Solucin salina 2-ME

Pasar 0.5 ml del primer tubo al segundo.