Los cultivos celulares y sus aplicaciones I (cultivos de clulas animales)

Lic. Mara Eugenia Segretn INGEBI-CONICET - Dpto. FBMyC, FCEyN-UBA Los cientficos han desarrollado metodologas para aislar clulas y obtener poblaciones celulares homogneas, que luego pueden ser incluso mantenidas y multiplicadas in vitro (en vidrio = en recipientes especiales, en el laboratorio). Los cultivos celulares son esenciales en la investigacin cientfica, ya que permiten estudiar los procesos que ocurren en las clulas, y en diversas aplicaciones de la biotecnologa, como la produccin de molculas de inters industrial, ingeniera de tejidos, etc. Cmo se obtienen las clulas? El primer paso para aislar clulas de un mismo tipo a partir de un tejido (generalmente formado por clulas de diversos tipos) consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas 1. Para lograrlo, la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolticas (como tripsina y colagenasas) que degradan las protenas de la matriz; y tambin se utilizan agentes (como el EDTA cido etilendiaminotetraactico) que secuestran al in calcio, del cual depende la adherencia celular. De esta forma, y mediante una suave agitacin, se obtiene una suspensin celular que contiene a todas las clulas presentes en ese tejido. Para separar los diferentes tipos celulares se pueden utilizar varios mtodos: 1. La centrifugacin, que permite separar a las clulas por tamao. 2. La capacidad de adherencia al vidrio o al plstico que tienen algunos tipos celulares. 3. La unin a ciertos anticuerpos especficos para determinados componentes celulares. Estos anticuerpos se usan unidos a diferentes matrices (colgeno, bolitas de polisacridos, de ltex o de plstico). Las clulas unidas a la matriz (a travs de los anticuerpos) se recuperan por agitacin, tratamiento con tripsina (digiere a las protenas que median la adhesin) o, en el caso de una matriz digerible (como el colgeno), degradando la propia matriz con enzimas (como la colagenasa). 4. La unin a ciertos anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes. Las clulas que contienen un determinado componente son reconocidas y marcadas por los anticuerpos. Las clulas marcadas son separadas de las no marcadas en un separador de clulas activado por fluorescencia o cell sorter (Figura 1). 5. La diseccin de un grupo de clulas a partir de una seccin de tejido preparada para microscopa. La Figura 1. Equipo para la separacin de regin que contiene las clulas de inters es clulas marcadas por fluorescencia. Las irradiada con un lser, que funde un pequeo clulas individuales viajan a travs de un conducto muy delgado y son iluminadas por un crculo con las clulas que estn por debajo. Estas lser. El equipo puede detectar qu clulas clulas capturadas son luego removidas para un emiten fluorescencia (por el anticuerpo posterior anlisis. La tcnica, denominada adherido). Cada clula es incorporada en una microdiseccin de captura por lser, puede gota que es cargada elctricamente como utilizarse para aislar y estudiar diferentes partes de negativa o positiva en funcin de la presencia o un tumor, por ejemplo. Otra tcnica relacionada ausencia del colorante fluorescente. Luego, las emplea un lser para disectar un grupo de clulas y gotas son separadas por un campo elctrico catapultarlas a un contenedor apropiado para un hacia los recipientes colectores segn su carga (adaptado de Alberts y col., MBC 2002). posterior anlisis (Figura 2).
La matriz extracelular est compuesta por diferentes tipos de molculas, entre las que se encuentran los proteoglicanos, polisacridos como el cido hialurnico, y protenas como el colgeno, laminina, fibronectina, fibrina y elastina.
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Figura 2. Tcnica de microdiseccin para aislar clulas a partir de secciones de tejidos. Este mtodo emplea un lser para escindir una regin de inters y eyectarla a un contenedor, permitiendo el aislamiento de determinadas clulas (hasta clulas individuales) a partir de un tejido (adaptado de Alberts y col., MBC 2002).

Cmo se cultivan las clulas? La mayora de las clulas animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e incluso presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de plstico y con medios de cultivo adecuados. As, las clulas pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas bioqumicamente, para estudiar los efectos del agregado o remocin de molculas especficas, como hormonas o factores de crecimiento. Adems, se pueden estudiar las interacciones entre clulas, cultivando en la misma placa ms de un tipo celular. Cuando los experimentos se realizan con cultivos celulares, se los denomina ensayos in vitro (en vidrio), para diferenciarlos de aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o experimentos in vivo (en organismo viviente)2. El cultivo de tejidos y clulas comenz en 1907 con un experimento diseado para esclarecer una controversia en el rea de la neurobiologa. El investigador Dr. Ross Harrison, quien trabajaba en la Universidad Johns Hopkins, public un breve pero crtico artculo (Observaciones de la fibra nerviosa viva en desarrollo) que introdujo exitosamente una nueva tcnica, el cultivo de tejidos, para demostrar experimentalmente cmo se originan las fibras nerviosas. Los experimentos originales con fibras nerviosas se basaron en el cultivo de pequeos fragmentos de tejidos, llamados explantos. Utilizando tcnicas aspticas, Harrison tom fragmentos del tubo neural (tejido embrionario precursor del sistema nervioso) de un embrin de rana, y lo deposit en una gota de lquido linftico fresco (medio de cultivo) de rana colocada sobre un cubreobjetos estril. Una vez que la linfa coagul, invirti el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que posea una depresin, creando as un cultivo en gota suspendida, tcnica utilizada por los microbilogos para estudiar las bacterias. Luego de peridicas observaciones al microscopio, pudo describir el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de las neuronas presentes en el tejido extirpado. As, adems de argumentar slidamente la doctrina neural, resolvi los problemas bsicos del cultivo celular, como el medio, la observacin y la contaminacin.
Experimento de Ross Harrison (1907), donde el explanto es la porcin de tejido neural, incluido en una gota de linfa. Adaptado de www.corning.com.

Como se mencion anteriormente, los cultivos se establecen principalmente a partir de suspensiones celulares generadas por disgregacin de tejidos. A diferencia de las bacterias, la mayora de las clulas que forman parte de tejidos no pueden vivir en suspensin, y requieren una superficie slida sobre la cual crecer y multiplicarse. Este soporte generalmente es la base de una placa o frasco de plstico, aunque a veces los requerimientos son ms complejos y el plstico debe antes recubrirse con componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea y contiene a las clulas en los tejidos, y con la cual interactan), como por ejemplo el colgeno y la laminina.

En los laboratorios de bioqumica, por in vitro se entienden aquellas reacciones qumicas que se llevan a cabo en un tubo de ensayo en ausencia de clulas, mientras que in vivo se refiere a las reacciones qumicas que ocurren dentro de la clula, an en cultivo.

Cultivos primarios Se denominan as a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido u rgano. Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares. En estos cultivos las clulas estn vivas, conservan sus caractersticas originales y su proliferacin es limitada. Pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios (figura 3). Cultivos secundarios En estas condiciones las clulas suelen multiplicarse hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo, formando una monocapa (capa de una clula de espesor). Como consecuencia del contacto entre las clulas se detiene temporalmente su proliferacin, hasta que se las subcultiva a un recipiente con medio fresco. As, podrn subcultivarse durante semanas o meses. En este estado, las clulas frecuentemente mostrarn distintas propiedades segn su origen. Por ejemplo, los fibroblastos (clulas que sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido de muchos animales) secretarn colgeno, las clulas derivadas de tejido muscular esqueltico se fusionarn para generar fibras musculares con capacidad contrctil espontnea, las clulas nerviosas extendern prolongaciones (axones) elctricamente excitables que podrn conectarse (establecer sinapsis) con otras clulas nerviosas, las clulas epiteliales formarn largas capas con varias propiedades de un epitelio intacto (figura 4). Gracias a que estos fenmenos ocurren en cultivo, es posible estudiarlos con diferentes metodologas, a veces no aplicables a tejidos intactos. Figura 3

Cultivos continuos o lneas celulares La mayora de las clulas de los vertebrados dejan de dividirse luego de un determinado nmero de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular. Por ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y 40 veces en cultivo, antes de detenerse. En estas clulas, as como en muchas otras, la capacidad Figura 4. Clulas en cultivo. A) limitada de proliferacin es el resultado de un Micrografas de contraste de fase de acortamiento progresivo de los telmeros fibroblastos en cultivo. B) Micrografas de (porcin de ADN que se encuentra en los mioblastos en cultivo mostrando las extremos de los cromosomas). En las clulas clulas fusionadas para formar clulas somticas (todas las clulas que no son musculares multinucleadas. C) Clulas clulas sexuales) se encuentra apagado el precursoras de oligodendrocitos en gen que codifica para la enzima telomerasa, cultivo. D) Clulas de tabaco en cultivo que se encarga de mantener la integridad de los telmeros; como consecuencia, los telmeros se acortan en cada divisin celular. A los fibroblastos humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el gen que codifica para la telomerasa; as, pueden propagarse como una lnea celular inmortalizada. Pero como se mencion, no todas las clulas humanas se inmortalizan de la misma manera. Algunas clulas, a pesar de que sus telmeros permanezcan largos, pueden frenar sus divisiones celulares como consecuencia de la activacin de mecanismos denominados puntos de control (check points) del ciclo celular. Para inmortalizar estas clulas, hay que lograr la inactivacin de los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos oncogenes (genes promotores del cncer) que pueden obtenerse de virus que causan cncer, como algunas cepas del virus del papiloma humano, adenovirus, etc.

A diferencia de las clulas humanas, las de los roedores no tienen apagado el gen de la telomerasa, por lo que sus telmeros mantienen el largo a travs de las divisiones celulares. Pero cuando son cultivadas, esas clulas experimentan cambios genticos que inactivan los mecanismos de checkpoint, produciendo lneas celulares inmortalizadas espontneamente. Ambos tipos de lneas celulares son muy tiles en la investigacin celular, como fuente de un gran nmero de clulas uniformes, que pueden ser conservadas y almacenadas en nitrgeno lquido (a -196 C) por un perodo muy largo de tiempo, reteniendo su viabilidad y siendo un buen modelo experimental para las primeras etapas de una investigacin. A pesar de la gran similitud que las clulas de una lnea tienen entre s, no son idnticas. La uniformidad gentica en una lnea celular puede mejorarse por clonado celular, a travs del cual se asla una sola clula, la que prolifera para formar una colonia de clulas clonales (idnticas). Una de las aplicaciones ms importantes de esta estrategia es el aislamiento de lneas celulares mutantes que poseen defectos en ciertos genes. Su estudio puede servir para inferir el papel que tiene la protena ausente o alterada en las clulas normales. Entre los cultivos celulares ms promisorios, desde el punto de vista mdico, se encuentran las lneas de clulas madre embrionarias humanas. Estas clulas, obtenidas del macizo celular interno de un embrin en los primeros estadios del desarrollo, pueden proliferar indefinidamente reteniendo la habilidad de originar cualquier tipo celular del cuerpo. Estos cultivos celulares podran revolucionar la medicina al proveer de clulas capaces de reemplazar o reparar tejidos daados. Hay otras fuentes de clulas madre que se estn investigando en tejidos adultos, como la mdula sea y el cordn umbilical. Los hibridomas Se sabe que es posible fusionar dos clulas formando un heterocarionte (o heterocarion), es decir, una clula con dos ncleos separados pero con los contenidos citoplasmticos compartidos. Para lograrlo, se trata una suspensin de clulas con compuestos que inducen la fusin de membranas (fusgenos), tales como el polietilenglicol (PEG) o ciertos virus. Eventualmente, un heterocarionte puede entrar en mitosis, produciendo una clula hbrida en la cual las envolturas de ambos ncleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un nico gran ncleo. Tales clulas hbridas pueden clonarse estableciendo una lnea celular, pero se sabe que en muchos casos la lnea resultante es inestable genticamente, y tiende a perder parte del material gentico. En 1975, un equipo integrado por el cientfico argentino Csar Milstein, desarroll, mediante la tcnica de fusin, una lnea celular hbrida clave para la produccin de anticuerpos monoclonales (todos iguales) para fines teraputicos y de diagnstico: los hibridomas (este desarrollo llev al Dr. Milstein a ser galardonado con el Premio Nbel). Los hibridomas son lneas resultantes de la fusin de dos tipos celulares: linfocitos B secretores de inmunoglobulinas (anticuerpos) y clulas derivadas de una lnea tumoral de linfocitos B (figura 5). De la fusin se obtiene una mezcla heterognea de clulas, y con un medio de cultivo especial se seleccionan las clulas fusionadas que producen anticuerpos y proliferan indefinidamente. Estos hibridomas son propagados como clones individuales, y cada uno de ellos sirve como una fuente estable y permanente de un anticuerpo monoclonal. Dicho anticuerpo reconoce un nico eptope antignico (es decir, una pequea porcin de una protena). Una de las ventajas de los hibridomas, en comparacin con los cultivos clonales de linfocitos B, es que estos ltimos tienen una vida limitada en cultivo.
Figura 5. Preparacin de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales contra un antgeno en particular. El medio de cultivo selectivo utilizado luego de la fusin celular contiene un inhibidor que bloquea las rutas de sntesis de los nucletidos. Como consecuencia, las clulas deben utilizar una va alternativa para fabricar sus cidos nucleicos. Esta va es defectiva en la lnea celular mutante derivada del tumor de linfocitos B, pero est intacta en las clulas de bazo (linfocitos B) obtenidas del ratn inmunizado. Debido a que ninguna de las clulas utilizadas para la fusin inicial puede crecer por s sola, slo las clulas hbridas o hibridomas sobreviven.

Qu contienen los medios para el cultivo de clulas? Hasta los aos 70, el cultivo de tejidos pareca ser producto de una mezcla de ciencia y alquimia. De a poco, los fluidos coagulados (como en el experimento de Harrison) fueron reemplazados por placas con medios lquidos que contenan pequeas cantidades de una serie de molculas necesarias para la supervivencia y multiplicacin celular: sales, glucosa, aminocidos y vitaminas. Adems, la mayora de los medios incluan una mezcla poco definida de macromolculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo. Dichos medios se siguen utilizando en la actualidad para los cultivos de rutina, y por lo tanto es difcil saber qu macromolculas requiere un determinado tipo celular para funcionar y multiplicarse. Como consecuencia, se desarrollaron numerosos medios qumicamente definidos, denominados libres de suero, que poseen, adems de las pequeas molculas mencionadas, varias protenas especficas necesarias para la supervivencia y proliferacin, como los factores de crecimiento. As, gracias a estudios que buscaban establecer las condiciones mnimas de cultivo para un comportamiento celular adecuado, se descubrieron muchas molculas de sealizacin extracelulares esenciales para la supervivencia, desarrollo y proliferacin de determinados tipos celulares. Los medios de cultivo son generalmente tamponados para mantener un pH alrededor de 7,4 y tienen, adems, indicadores de pH, como el rojo fenol, que cambian de color a medida que aparecen catabolitos cidos como resultado del metabolismo celular. Suelen agregarse tambin antibiticos y antimicticos para impedir la contaminacin con microorganismos. Composicin de medios de cultivo para clulas de mamfero

Aminocidos

Vitaminas

Sales

Otros compuestos* Protenas requeridas en los medios definidos libres de suero Glucosa Penicilina Estreptomicina Anfotericina Rojo fenol Suero fetal bovino Insulina Transferrina Factores de crecimiento especficos

Arginina Cistena Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Tirosina Valina

Biotina NaCl Colina KCl Folato NaH2PO4 Nicotinamida NaHCO3 CaCl2 Pantotenato MgCl2 Piridoxal Tiamina Riboflavina

* La penicilina y la estreptomicina son antibiticos y la anfotericina es un antimictico, que se adicionan para impedir el crecimiento de bacterias y hongos contaminantes, respectivamente. El rojo fenol es un indicador de pH. Los cultivos crecen usualmente en contenedores de plstico o vidrio con una superficie apropiada para la adhesin celular, y se mantienen en una estufa a 37C en una atmsfera de 5% de CO2, 95% aire.

En qu recipientes se cultivan las clulas? Existen numerosos contenedores y recipientes para cultivar clulas y tejidos, dependiendo de las caractersticas de las clulas a cultivar y de la escala deseada. Cuando se cultivan clulas para hacer experimentos, se hacen cultivos a pequea escala. En esta escala, las clulas de multiplican en frascos que tienen una base de 25 a 175 cm2 (figura 5, frascos T). En un recipiente tpico de 175cm2 pueden obtenerse aproximadamente 1x107 clulas adheridas, y unas 1x108 clulas cuando se trata de lneas que crecen en suspensin. En los frascos T estndares no es posible producir cantidades mayores de clulas, dada la cantidad de tiempo insumida para los

repetidos pasajes necesarios a medio fresco, la demanda de espacio en un incubador (que controla la composicin de gases, la temperatura y la humedad del entorno) y el costo de los insumos. Cuando se necesita aumentar la escala del cultivo (escalado o scaling-up), se deben tener en cuenta numerosos parmetros, incluyendo problemas asociados con la falta de nutrientes, el intercambio gaseoso (especialmente la escasez de oxgeno), y la aparicin de metabolitos txicos como el amonio y el cido lctico. Existen muchos sistemas para escalar los cultivos celulares, que se muestran en la figura 6. Entre ellos, es posible encontrar desde arreglos de frascos triples y botellas cilndricas, hasta biorreactores ms complejos en su estructura. En todos los casos, es necesario asegurar el correcto intercambio gaseoso y la disponibilidad de nutrientes. Por ejemplo, el arreglo de botellas de cultivo sobre rodillos que se muestra en la figura 6c, est diseado de forma tal que las clulas cubran toda la superficie interna de la botella, con rodillos que al girar aseguran que el medio de cultivo bae a todas las clulas, aportndole nutrientes y retirando desechos. Otro ejemplo es el biorreactor (6d) que permite obtener un rendimiento importante de anticuerpos a partir de un cultivo celular. La adicin de bolitas de distintos materiales inertes puede ayudar tambin a aumentar la densidad celular en cultivos al aumentar la superficie de cultivo entre 10 y 100 veces.

Figura 6. Contenedores para cultivo de clulas. a) Frasco T; b) Frasco triple; c) botellas rodantes; d) biorreactor; e) frasco con paletas; f) frascos con agitacin (Erlenmeyer). Fotos: www.sigma-aldrich.com

Tipo de contenedores para cultivo de clulas y sus capacidades Contenedor Frasco T Frasco triple Biorreactor Botellas rodantes Frascos para agitacin (Erlenmeyer) Frascos con paletas Mx Vol (ml) 150 150 8000 1000 1000 1000 Mx clulas (suspensin) 1.5x108 1.5x108 -----1x109 1 x 109 1 x 10
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Mx clulas (adhesin) ~107 3x107 1.5x1010 1x108 -------------

Fuentes consultadas

Introduccin al cultivo celular. Universidad de Barcelona, Espaa, http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cap1.htm Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, y Peter Walter. Molecular Biology of the Cell, Editorial Garland, 4ta. Edicin (2002). Celebrando un siglo del cultivo de tejidos, en http://www.corning.com/Lifesciences/cells100/ Tcnicas fundamentales en el cultivo celular. Un manual de laboratorio. Sigma, http://www.sigmaaldrich.com