CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los ms importantes son aquellos que se basan en: a) Su consistencia b) Su utilizacin c) Su composicin d) Su origen

a) SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA):

1) Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin. 2) Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar: Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molcula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solucin al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y no se funde por debajo de 85C. Funde a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los 45C. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunqu e el agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en 1937, los dividi en dos grupos: - agarosa, con poco sulfato, libre de cido pirvico, y - agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporcin de agarosa a agaropectina en el agar vara segn el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales txicos.

3) Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias

SEGN SU UTILIZACIN.
1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de b acterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc. 2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc ) El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate). 3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias. 4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos. 5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc. 6) Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de

los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios especficos de identificaci n para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin. Son ejemplos de esto ltimos los medios CPS ID3 o Uriline ID (Biomerieux), utilizados para identificar los grmenes urinarios ms importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos especficos. 7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios. 8) Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el Laboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: a) haciendo pases peridicos de placa a placa, b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%. 9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart -Amies, Cary-Blair, etc.

ATENDIENDO A SU COMPOSICIN.
Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios de cultivo pueden ser clasificados en: 1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados. 2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida.

3) Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

Segn su origen:
a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de o rigen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente.

b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica definida cualitativa y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.

c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factore s de crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

DESCRIPCIN Y UTILIZACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO MEDIOS DE CULTIVO COMUNES .

Son los ms corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos, s son los ms conocidos en un laboratorio de Microbiologa.

Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de grmenes que no
presentan exigencias particulares. No es diferencial.

Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza adems para la investigacin de

los diversos tipos de hemlisis ( , gamma). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparacin del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sdico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja. La adicin de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que estn en el interior de los hemates, pero s puede aadir factores inhibidores del crecimiento

bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolbiles. La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolticas o contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de determinados grmenes.

Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de

adicionarla al medio base. Por esta razn el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable. El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos y meningococos) y Haemophilus, pero en l pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. El agar chocolate puede convertirse quizs en uno de los medios ms enriquecidos si aadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente segn las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen ms de una docena de compuestos que confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adicin de uno o varios antibiticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados microorganismos. Un ejemplo clsico es el Thayer-Martin, utilizado para el aislamiento del gonococo y que no es otra cosa que un agar chocola te enriquecido al cual se ha aadido una mezcla de tres antibiticos especficos que impedirn el crecimiento del resto de la flora acompaante.

Agar MacConkey: Es un medio utilizado para el aislamiento e identificacin de

enterobacterias. Es un medio inhibidor de los grmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y selectivo para enterobacterias por su contenido en sales biliares. En su composicin lleva un azcar (lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un medio diferen cial. Los grmenes que fermenten la lactosa producen una acidificacin del medio que hacen aparecer de color rojo fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas sern incoloras, apareciendo del mismo color que el medio subyacente (naranja).

Agar C.L.E.D. : El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrlito Deficiente) est

recomendado para el recuento e identificacin presuntiva de los microorganismos de las vas urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasin de los cultivos po r Proteus.La presencia de lactosa en su composicin le confiere el carcter de medio diferencial, aunque la interpretacin sea diferente al anterior medio por la incorporacin de otro indicador: el azul de bromo timol. Las colonias lactosa positivas aparecern de color amarillo y las lactosa negativas lo harn con un color verdoso, blanco o azulado.

Agar S.S.: El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y grmenes Gram positivos.

La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque adems de indicarnos el comportamiento de los grmenes con relacin a la lactosa, nos muestra los grmenes que son capaces de producir cido sulfhdrico, que se mani fiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia. As, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y ser exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas bioqumicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razn debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como el Hektoen.

Agar Hektoen: Es un medio ms diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se

utiliza para facilitar el aislamiento de las enterobacterias. La presencia de tres azcares (lactosa, sacarosa y salicilina) permiten ampliar el poder diferencial de este medio. Este medio es capaz de detectar los grmenes formadores de SH2, igual que el SS. Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azcares, que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos grmenes de cultivo delicado (Shigella en particular). El crecimiento de Salmonella es excelente, igual que el de Shigella, obtenindose colonias ms numerosas y voluminosas que en los medios selectivos usuales. La inhibicin tiene lugar, esencialmente, sobre E. coli y en menor medida sobre Proteus y Citrobacter. Hay que sealar que el vibrin colrico crece bien en este medio.

C.P.S. ID3. : Medio cromognico desarrollado por Biomerieux, que permite la

identificacin de E. coli, P. mirabilisy E. faecalis, con la simple visualizacin d el cambio de color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azulo marrn). La identificacin solo requiere la adicin de un reactivo para confirmar o descartar la especie sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificacin habituales (API, p. ej) Granada, Islam o New GBS: Medios utilizados para deteccin de Estreptococos agalactiae, mediante la utilizacin de un sustrato cromognico especfico de este microorganismo.

Agar Mueller-Hinton: Es el medio universalmente aceptado para la realizacin de

los antibiogramas o pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. A l nos referiremos ms ampliamente en el captulo correspondiente

Agar Tripticase de soja: Es un medio utilizado para el crecimiento de grmenes

exigentes, como Brucella, Neisseria o Estreptococos. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial. Caldo tioglicolato con resazurina: Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de aerobios, anaerobiosy

microaerfilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se manifiesta por un color rosa del medio.

Agar Chapman: Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado contenido en cloruro sdico permite la inhibicin de la mayora de los otros grmenes. La presencia de manitol y rojo fenol convierten a este medio en diferencial: as se puede identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que estegrmen crece bien en medios salados y fermenta el manitol (colonias amarillas). Agar Baird-Parker: Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la
vez que los diferencia del resto.

Medio de Loeffler: Es un medio especfico para el cultivo de Corynebacterium

difteriae.

Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS): Similar al agar SS. Es un

medio diferencial e inhibidor a la vez.

Agar Kligler : Medio especfico para pruebas de identificacin de enterobacterias.

Aunque de l hablaremos con ms detenimiento en el captulo de pruebas de identificacin bacteriana, podemos ir adelantando que se trata de un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azcares (glucosa y lactosa), investigar la formacin de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfato ferroso a partir del tiosulfato sdico.

Agar Levine EMB (Eosina azul de metileno): Se utiliza para aislamiento de

enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metlico caracterstico.

Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas. Agar Cetrimida. Agar King: Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo
Gram positivos y la mayora de enterobacterias. El segundo pone adems de manifiesto la pigmentacin fluorescente de Pseudomonas bajo luz UV.

Agar Schaedler: Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo
de anaerobios.

Agar Gardnerella: Agar con sangre humana ms una mezcla de antibiticos que
permiten la observacin de colonias betahemolticas caractersticas de Gardnerella vaginalis

Campylosel: Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a

42 C en microaerofilia.

Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract) : Se utiliza para el aislamiento de

bacterias del gnero Legionella

Lwenstein-Jensen: Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium

tuberculosis. Contiene verde malaquita para inhibir parcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza como sustancia de enriquecimiento.

Nutritivo Agar
Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso est descripto en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Fundamento
Por las caractersticas de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrgeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes. Frmula (en gramos por litro) Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 3.0 Cloruro de sodio 8.0 Agar pH final: 7.3 0.2 15.0 Instrucciones Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Siembra
En superficie o por la tcnica de pour plate, segn el uso a que se destine.

Incubacin
En aerobiosis, a 35-37 C durante 24 horas.

Resultados a-Agar nutritivo:

Microorganismos P. mirabilis ATCC 43071 Crecimiento Bueno-excelente

E. coli ATCC 25922 S. aureus ATCC 25923 B. cereus ATCC 10876 E. faecalis ATCC 29212 P. aeruginosa ATCC 27853

Bueno-excelente Bueno-excelente Bueno-excelente Bueno-excelente Bueno-excelente

B-Agar nutritivo suplementado con 5% de sangre de carnero:

Microorganismos S. pyogenes ATCC 19615 S. pneumoniae ATCC 6305 S. pneumoniae ATCC 49619 Crecimiento Abundante Abundante Abundante Hemlisis Beta Alfa Alfa

Caractersticas del medio Medio preparado: mbar claro a medio ligeramente opalescente.

Almacenamiento Medio deshidratado: a 10 -35 C. Medio preparado: a 2-8 C.

Presentacin x 100g :Cdigo: B02-122-05

x 500g :Cdigo: B02-122-06

6 x 50 ml: B04-122-84

MEDIOS DE CULTIVO Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razn por la cual es difcil aislarlas. A menudo nuestro inters es caracterizar una especie bacteriana, para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este camino, comenzaremos examinando los medios de cultivo, ya que en estos ltimos se basan muchos de los principios del aislamiento. OBJETIVOS:  Conocer la clasificacin de los medios de cultivo.

 Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparacin del medio de cultivo en la prctica microbiolgica.  Adquirir prctica en el preparado de algunos medios de cultivo a partir de sus componentes individuales.

 Reconocer la necesidad de evitar la contaminacin tanto de los medios de cultivo como de los dems elementos utilizados en el laboratorio de microbiologa.
INTRODUCCIN: Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es cualquier medio que proporcione sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo tambin lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan. El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Las caractersticas de los microorganismos a tener en cuenta al momento de preparar un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son: Tipo trfico: se refiere a los requerimientos de carbono y energa, segn los cuales se los clasifica en auttrofos, hetertrofos, quimiotrofos (litotrofos u organotrofos) y fototrofos. Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerfilos.

Agar nutritivo

Temperatura ptima de crecimiento: segn el rango de temperatura al cual el Microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en psicrfilos, mesfilos y Termfilos. Rango de pH: en general el rango ptimo de pH para la mayora de las bacterias oscila entre 6,6 y 7,2. CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU ORIGEN Los medios de cultivos pueden clasificarse en:

Naturales: Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo, agua, suero, papa, huevos, leche, sangre, tierra, etc. Artificiales: Estn compuestos de substancias que son manipuladas por el hombre en el laboratorio. A los medios artificiales a su vez se los puede dividir en sintticos y complejos. Un medio del cual se conoce exactamente su composicin qumica se denomina sinttico o qumicamente definido; puede ser una simple solucin de sales con una fuente de carbono o puede contener muchos compuestos orgnicos. Un medio no sinttico o complejo e s aquel del que se desconoce su composicin qumica exacta; se trata bsicamente de extractos de tejidos vegetales, animales o microbianos, cuya concentracin no se conoce con exactitud y que proveen todos los nutrientes necesarios, como por ejemplo el caldo nutritivo. CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS ARTIFICIALES COMPLEJOS SEGN SU FINALIDAD I. Comunes Medios Artificiales Complejos II. Especiales II.a. Enriquecidos II.b. Selectivos II.c. Diferenciales I. Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos, como el Caldo carne y agar carne. II. Medios especiales: se los clasifica segn su finalidad. II.a Medios enriquecidos o mejorados: se obtienen a partir de un medio comn, con el agregado de elementos nutritivos elegidos segn las necesidades. Tales como sangre, albmina, yema de huevo etc. Se utilizan para el cultivo de microorganismos exigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales. Se citan como ejemplos el agar sangre y el agar chocolate. II.b Medios selectivos: Estos medios han sido modificados de alguna manera para que, en una flora mixta, permitan el desarrollo de determinadas especies y al mismo tiempo inhiban la proliferacin de la flora acompaante. Para esto lt imo se busca establecer condiciones desfavorables de pH, nutrientes y de temperatura, o por el agregado de inhibidores.

El agar Saburaud es un ejemplo de medio selectivo, en el que el pH de 5,6 favorece el desarrollo de hongos al mismo tiempo frena el d esarrollo de la mayora de las bacterias. Ejemplos de sustancias inhibidoras son algunos colorantes (cristal violeta, verde brillante), los antibiticos, el alcohol fenil etlico y la azida de sodio. II.b.1 Medios selectivos para enriquecimiento: Son m edios en los que los microorganismos crecen en libre competencia, vindose favorecidos aquellos para los cuales las condiciones de desarrollo son las ms apropiadas, no llegndose a inhibir totalmente el crecimiento del resto de microorganismos. Se logra as la multiplicacin de los microorganismos que se desea identificar, hasta un nmero suficiente tal que sea posible su aislamiento en medios selectivos apropiados. II.b.2 Medios selectivos para aislamiento: son medios selectivos slidos, se utilizan para sembrar directamente con la muestra incgnita o a partir del medio selectivo para enriquecimiento. II.c Medios diferenciales: permiten el desarrollo de muchas de las especies que coexisten en una mezcla que se desea aislar. Aunque dos o ms tipos de microorganismos pueden crecer en este medio, algn elemento presente en l permite diferenciarlos, por ejemplo un indicador. Estas diferencias se basan en alguna propiedad bioqumica que unos poseen y otros no. Un ejemplo de este t ipo es el agar con eosina azul de metileno que diferencia Escherichia coli de Enterobacter aerogenes, sobre la base de la diferencia de color de sus respectivas colonias. Cuando se cultivan ambas especies sobre agar nutritivo, forman colonias de color blanco grisceo. Sin embargo en agar con azul de metileno las colonias de E. coli son oscuras y con brillo metlico, en cambio las colonias de E. aerogenes son rosadas con un centro azul y rara vez presentan brillo. En su mayor parte los medios diferenciales son asimismo selectivos, por el agregado de agentes que inhiben el crecimiento. Estos medio selectivo- diferenciales resultan muy tiles para el aislamiento de un microorganismo separndolo de la flora acompaante. Se ponen en evidencia las colonias de los microorganismos que se desea aislar y a su vez se diferencian de aquellas que pudieran haber desarrollado provenientes de la flora acompaante. CARACTERSTICAS GENERALES DE UN BUEN MEDIO DE CULTIVO Como ya se ha sealado, la provisin de elementos nutritivos en concentracin adecuada,

depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hbitat natural. La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona directamente con el pH, la fluidez y la presin osmtica que se le quiera brindar a los microorganismos. En funcin de la consistencia se puede clasificar a los medio el lquidos y slidos. En el laboratorio, los medios de cultivo pueden present arse en forma lquida, en cuyo caso se los denominacal dos, o en forma slida si se le agrega agar al caldo. En cuanto a la esterilizacin, este procedimiento garantiza la destruccin de todos los microorganismos no deseados que se encuentran presentes durante la preparacin del medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al autoclave (121 C, 15 minutos). Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como antibiticos y compuestos fcilmente oxidables al calor, se los esteriliza por separado por otros procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado cuando se haya enfriado a 50 C. En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor para algunos microorganismos y no para otros. Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentracin adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estril y que no contenga sustancias inhibidoras.

CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en la preparacin de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e incluso alguno de ellos puede estar ausente de la preparacin. Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacrido, al que acompaan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullicin (funde hacia los 98C) y al enfriarse forma un gel inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los 42C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser slido a la temperatura de incubacin. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3 %.

Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.) son extrados con agua y calor, y posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitgeno y carbono. Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales minerales que carecen de identidad qumica definida; se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas, peptonas, polipptidos y aminocidos. Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo Para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH. Indicadores de pH. Indicadores cido- base se aaden a menudo a los medios de cultivo Con objeto de detectar variaciones del pH. Agentes reductores. Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores que se aaden a Los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Agentes selectivos. La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo puede Convertirlo en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sdica, telurito potsico, antibiticos, etc.,

a la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

PREPARACIN En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso re hidratar. En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del fabricante y luego esterilizarlo. En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparacin de un medio de cultivo comienza por hacer un estudio de la frmula que constituye una receta que deber respetarse estrictamente. Primero se agrega agua destilada o desionizada a un recipiente, luego se van incorporando todos los ingredientes de la lista en el orden en el que se encuentran. Generalmente figura en primer trmino el compuesto que acta como tampn, como puede ser el PO4H2K, que adems provee fsforo y potasio. Es conveniente aadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de a uno antes de agregar el siguiente. Al finalizar la preparacin y una vez que sta se enfre, se debe verificar que el pH sea el adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o ClH (1N).

ACTIVIDADES I. Preparacin de medios de cultivo

Materiales: - Erlenmeyer - pipetas de 10 ml - tubos de ensayo con sus tapones - gradillas - tiras de pH - drogas correspondientes a cada frmula - balanza - autoclave A. Caldo nutritivo (Caldo carne)

Es el medio complejo ms comn para el cultivo de microorganismos. Frmula: Peptona............................................. 5 g Extracto de carne.... ...... 3 g Agua c.s.p................. 1000 ml pH................................. . 7,2 Preparacin: 1) Colocar un volumen medido de agua destilada en un recipiente. 2) Disolver los ingredientes de a uno y por orden. 3) Llevar a ebullicin agitando peridicamente con una varilla de vidrio. 4) Completar el volumen hasta 1000 ml. 5) Dejar enfriar y medir pH. Si hace falta corregir con HONa 1M. 6) Colocar 10 ml del caldo en tubos de ensayo y volmenes apropiados en frascos.

7) Tapar, colocar capuchn de papel y esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm. B. Agar nutritivo Frmula: Agar........................... 20 g Caldo nutritivo..... ... 1000 ml

Preparacin: 1) Colocar 1000 ml de caldo en un recipiente. 2) Agregar el agar calentando a bao mara agitando hasta disolucin total. 3) Ajustar pH hasta 7,2. 4) Llevar 10 ml a tubos de ensayo. 5) Esterilizar. Cuando se prepara agar nutritivo no es necesario usar caldo estril, la esterilizacin se lleva a cabo una vez que se ha envasado el caldo agarizado. Se prepararn tubos con agar inclinado o en pico de flauta (slant), para ello se colocan 5 ml del agar en los tubos de ensayo, se tapan y esterilizan. Una vez afuera del autoclave, cuando estn an lquidos, se apoyan sobre la mesada con un cierto ngulo hasta que solidifiquen.

Se prepararn tambin tubos con agar para puncin. En este caso, una vez que los tubos fueron retirados del autoclave se dejan solidificar en posicin vertical. Por ltimo se prepararn cajas de Petri con agar nutritivo. Para ello se puede utilizar medio de cultivo recin esterilizado y todava lquido, o bien medio solidificado y fundido a ebullicin en Bao Mara. Se deja enfriar el agar hasta 45 C, luego se lo vuelca aspticamente en caja de Petri estril, teniendo la precaucin de flamear previamente la boca del tubo o recipiente a la llama del mechero. Se deja solidificar en posicin horizontal.

Medio de cultivo caldo brilla Introduccin Las disponibilidades en agua constituyen un factor fundamental para el desarrollo econmico y la salud pblica. Los abastecimientos de agua se consideran en todos los pases como inversiones bsicas de inters general, en el sentido de que posibilitan actividades humanas e industriales directamente productivas que influyen en la tasa de crecimiento econmico. La contaminacin es un proceso de alteracin o de modificacin ms o menos importante de los equilibrios fsicos, qumicos o biolgicos del agua que son responsables de su calidad y la hacen inadecuada para sus numerosos usos y aplicaciones. Dicha contaminacin puede tener dos orgenes: Qumico o microbiolgico. El agua natural constituye un reservorio de microorganismos autctonos (Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus) o exgenos (Escherichia coli, Enterococcus). No debe olvidarse que recibe y arrastra partculas cargadas de bacterias, de tal modo que en cercanas de las grandes poblaciones incluso el agua de lluvia es portadora de un elevado nmero de microorganismos (Guinea, 1979, 1-8). El anlisis microbiolgico por recuento de bacterias indicadoras de contaminacin fecal en aguas es de suma importancia al evaluar el estado sanitario del sistema en estudio. Las bacterias que se utilizan normalmente forman parte de un grupo llamado coliforme, dentro de la familia Enterobacteriaceae (Madigan, 2004, 927 -941). Dicho grupo se caracteriza por estar formado por microorganismos que habitan el tracto gastrointestinal de los vertebrados. Su presencia indica el potencial patognico en aguas, es decir la probable existencia de agentes causantes de enfermedades como clera, hepatitis, polio, fiebre tifoidea, giardiasis, amebiasis, etc. Debido a que la concentracin de dichos agentes habitualmente es baja, su deteccin directa en aguas

es complicada, por la cual se utiliza, entre otras, a las bacterias coliformes, que son de fcil deteccin y cultivo en laboratorio y presentan un tiempo de supervivencia que excede al de los patgenos en ese ambiente (Vullo, 2000, 137 -141). Dentro de los mtodos de recuento de bacterias se encuentran dos que son los ms ampliamente utilizados: la tcnica de Nmero Ms Probable (NMP) y la tcnica de recuento en placa. Con la primera slo se obtiene una estimacin de la poblacin de microorganismos contenidos en una muestra, no proporcionando una enumeracin precisa. Cuando la poblacin es muy elevada, el recuento en placa supera en precisin a este mtodo. Por el contrario en poblaciones bajas (menos de 10 clulas por mL) es ms eficaz la tcnica de NMP porque permite la utilizacin de muestras de mayor tamao. El objetivo del presente trabajo prctico es la comparacin de dos mtodos de enumeracin de bacterias de importancia sanitaria, mediante la realizacin de recuentos paralelos de aguas de diferentes grados de contaminacin, utilizando las tcnicas de NMP y recuento en placa, en medios selectivos para coliformes.

Metodologa Tiempo estimado de realizacin y distribucin de los grupos de trabajo La experiencia fue diseada para tres clases de trabajos prcticos de tres horas de duracin cada una pertenecientes a la materia de grado Microbiologa General e Industrial de la Licenciatura en Ciencias Qumicas de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales-UBA. Como dichas clases cuentan con alrededor de 20 estudiantes, se forman 10 grupos de trabajo de 2 personas cada uno. Muestras de agua Se analizan 250 mL de muestras de agua de diferentes grados de contaminacin: agua del Ro de la Plata y agua de pozo, perteneciente al conurbano bonaerense. Las muestras deben tomarse en forma estril, utilizando frascos adecuados. Medios de cultivo Caldo Brila Fluorocult (Merck, 1994, 275) : Peptona 10 g/l; Lactosa 10 g/l; Bilis de buey desecada 20 g/l; Verde brillante 0,0133 g/l; L -triptofano 1 g/l; 4-metilumbeliferil-D-glucurnido 0,1 g/l. Caldo Citrato de Koser: Cloruro de sodio 5 g/l; Sulfato de magnesio 0,2 g/l; Hidrgeno fosfato de diamonio 1 g/l; Hidrgeno fosfato di potsico 1 g/l; disolver los componentes hasta obtener una solucin lmpida; agregar 2 g/l de cido ctrico y se lleva a pH=6 con hidrxido de sodio 1N.

Agar Chromocult (Merck, 1994, 270): Peptona 3 g/l; Cloruro sdico 5 g/l; Dihidrgenofosfato potsico 1,7 g/l; Hidrgeno fosfato di potsico 3 g/l; Piruvato sdico 1 g/l; Triptfano 1 g/l; Laurilsulfato sdico 0,1 g/l; Agar -agar 12 g/l; Mezcla de cromgenos 0,2 g/l. Recuento de bacterias del grupo coliforme segn la tcnica de NMP 1- Disponer de series de tres tubos con 10 mL cada uno de Caldo Brila -Fluorocult doble concentracin y series de tres tubos con 5 mL cada uno del mismo caldo, pero simple concentracin. Todos deben poseer en su interior una campana de Durham para ver produccin de gas. 2- Sembrar 10 mL de la muestra en cada uno de los tubos de doble concentracin, 1 mL o 0,1 mL en los de simple concentracin. Ver esquema de la Figura 1. 3- Incubar los tubos 48 hs a 37C.

4- Seleccionar los tubos que posean gas en el interior de la campana de Durham. Dichos tubos sern considerados positivos. Buscar en la tabla (Figura 2) el NMP de bacterias coliformes totales / 100 mL de muestra. Calcular en forma paralela el NMP/100 mL (AWWA, WEF, APHA, 1998, 9-53, Hurst, 2002 178 -179) segn: NMP/100 mL= n tubos positivos x 100 / (mL muestra en tubos negativos x mL muestra totales). 5- Sembrar con ansa recta, a partir de cada tubo con gas, en Caldo Citrato de Koser. Incubar 48 hs. a 37C. 6- Exponer los tubos positivos de Caldo Brila -Fluorocult a la luz ultravioleta. Los medios con Fluorocult poseen MUG: 4-metilumbeliferil- -D-glucurnido, sustrato de la enzima -D- glucuronidasa, que al clivarse libera un producto (4 -umbeliferona) de fluorescencia azul. Existen muchos grupos bacterianos que poseen dicha enzima, pero dentro de las Enterobacterias slo Escherichia coli y algunas especies de Salmonella y Shigella cuentan con ella. Por lo tanto la aparicin de fluorescencia y gas lleva a poder inferir la presencia de bacterias coliformes fecales (E. Coli). Para poder considerar estos tubos positivos para coliformes de origen fecal debe agregarse 1 mL de reactivo de Kovacs (p-dimetilamino benzaldehdo 5%(p/v) en alcohol amlico o isoamlico con 2,5%(v/v) de HCl(c), Merck, 1994, 307) para la prueba de indol en cada tubo, y ver el desarrollo de color prpura en la fase orgnica. Con este patrn de tubos positivos, calcular por ambos mtodos el NMP de bacterias coliformes fecales / 100 mL de muestra. 7- Segn los resultados positivos por la aparicin de turbidez en los tubos con Caldo Citrato de Koser, calcular el NMP de bacterias coliformes de origen no fecal.

8- Efectuar las correcciones por normalizacin, detalladas en la Figura 1 e informar los resultados del recuento. Recuento en placa de bacterias del grupo coliforme 1- Inocular por duplicado 0,1 mL de muestra en placas de Petri preparadas con Agar Chromocult. Rastrillar el inculo con esptula de Drigalsky. 2- Incubar a 37C durante 48 hs. 3- Observar y contar las colonias obtenidas. El Agar Chromocult identifica coliformes totales (enterobacterias fermentadoras de lactosa) y Escherichia coli a travs de dos sustancias cromgenas: Salmon-gal que pone en evidencia la -D-galactosidasa dando colonias de color rojo y X-glucurnido que determina la presencia de la -D glucuronidasa dando colonias azules. Escherichia coli escinde ambos compuestos dando coloracin violeta. Las colonias rojas y violetas son caractersticas de bacterias coliformes. Las rojas pertenecen al grupo de las no fecales, mientras que las violetas a las fecales. Las especies que no poseen ninguna de las enzimas se evidencian a travs de colonias transparentes. El medio tiene tambin laurilsulfato de sodio para inhibir el desarrollo de Gram positivas y triptfano para realizar la prueba de indol (rec onocimiento de E. coli) 4- Calcular el nmero promedio de unidades formadoras de colonias por mL (UFC/mL) de bacterias coliformes totales, fecales y no fecales presentes en la muestra, segn la expresin: UFC/mL = Nmero de colonias promedio de ambas placas Dilucin x volumen del inculo Obtencin, manejo e interpretacin de resultados

Recuento en placa de bacterias del grupo coliforme

A. Muestra: Ro de la Plata Se realizan diluciones seriadas al dcimo de la muestra hasta 10-4. Se siembran en placas de Agar Chromocult y se calcula el nmero de UFC/mL de las colonias rojas (Coliformes no fecales), violetas indol positivas (Coliformes fecales) y la suma de ambas (Coliformes totales). Los resultados se resumen en la Tabla 4. B. Muestra de agua de pozo del con urbano bonaerense Se siembra la muestra sin diluir en placas de Agar Chromocult. y se calcula el nmero de UFC/mL de las colonias rojas (Coliformes no fecale s), violetas indol

positivas (Coliformes fecales) y la suma de ambas (Coliformes totales). Los resultados se resumen en la Tabla 5. Discusin de los resultados Una vez realizada la lectura de los resultados para las distintas muestras, se dispone de una ltima clase destinada a la discusin e interpretacin de los resultados obtenidos por los distintos grupos de trabajo. As por ejemplo para el caso de agua de ro, se determina que el recuento de bacterias coliformes totales por mL, obtenido mediante la tcnica de NMP corresponde a la mitad con respecto al valor en placa (Tablas 2 y 4). El intervalo de 95% de confianza para el mtodo de NMP es muy amplio (AWWA, WEF, APHA, 1998, 9-52). Para el recuento de coliformes totales, el NMP calculado es 7,6 x 105 / 100 mL (Tabla 2: dilucin 10 -4 de la muestra original) y su intervalo de 95% de confianza oscila entre 3 y 25 x 105 / 100 mL. Los valores de recuento en placa ( Tabla 4) estn dentro de este intervalo. En este caso, segn el error de la tcnica, el resultado oscila entre 2,4 y 1,2 x 104 UFC/mL. Los resultados muestran entonces una mayor precisin en el recuento en placa, ya que el mtodo de NMP es un concepto estadstico, derivado de la teora de probabilidades, aplicable a la enumeracin de microorganismos bajo ciertas condiciones, es decir cuando las muestras son lo suficientemente diluidas como para realizar un recuento en placa. Para el caso de un agua de poz o, no se puede realizar el recuento en placa debido a la baja proporcin de bacterias coliformes presentes en la muestra. Un recuento tan bajo como 3,6 bacterias coliformes totales/100 mL slo se puede estimar por la tcnica de NMP. En este caso el intervalo del 95% de confianza se encuentra entre 1 y 13 bacterias coliformes totales/100 mL (AWWA, WEF, APHA, 1998, 9-52). Como conclusin general del trabajo, es necesario conocer el origen y posible nivel de contaminacin microbiolgica de una muestra de agua a analizar, para utilizar el mtodo de enumeracin de mayor precisin en cada caso.

Levine EMB Agar.

Medio adecuado para la bsqueda y diferenciacin de bacilos entricos, a partir de muestras clnicas, aguas servidas, y otros materiales. Es recomendado por la American Public Health Association, para el anlisis microbiolgico de productos lcteos y alimentos, y por la USP para la realizacin de los ensayos lmite microbiolgico.

Fundamento

La frmula original de este medio de cultivo, fue modificada por Levine, eliminando la

sacarosa e incrementando la concentracin de lactosa, lo que permite una mejor diferenciacin de E. coli.

Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias. La combinacin utilizada de eosina y azul de metileno, inhibe el desarrollo de microorganismos Gram positivos y de bacterias Gram negativas fastidiosas, y tambin, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa. Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de color azulado negro, con brillo metlico. Las colonias producidas por microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras.

Algunas bacterias Gram positivas (cepas de estafilococos, enterococos) y levad uras, pueden crecer, originando colonias incoloras y puntiformes.

Este medio de cultivo, es til para la orientacin y no confirmacin de especies bacterianas (ya que numerosas cepas de Citrobacter spp. producen colonias con brillo metlico), por lo cual ser necesario realizar pruebas bioqumicas, para la identificacin de gnero y especie. Frmula (en gramos por litro) Peptona 10.0 Lactosa 10.0 Fosfato di potsico 2.0 Agar 15.0 Eosina 0.4 Azul de metileno 0.065 pH final:7.1 0.2 Siembra Directa, estriando la superficie. Instrucciones Suspender 37,4 g de polvo por litro de agua destilada, dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullicin hasta disolucin total. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121C.

Incubacin De 18-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

Resultados Microorganismos Crecimiento Caractersticas de las colonias Bueno a excelente Verdosas con brillo metlico y centro negro Escherichia coli ATCC 25922 azulado Klebsiella pneumoniae ATCC Bueno a excelente Mucosas, rosa prpura, confluentes 700603

P. aeruginosa ATCC 27853 Bueno a excelente Proteus mirabilis ATCC 43071 Bueno a excelente S. aureus ATCC 25923 Pobre Enterococcus faecalis ATCC 29212 Pobre Shigella flexneri ATCC 12022 Bueno a excelente Salmonella typhimurium ATCC Bueno a excelente 14028 Caractersticas del medio

Incoloras Incoloras Incoloras, pequeas, puntiformes Incoloras, pequeas, puntiformes Incoloras Incoloras

Medio preparado: color prpura con tonos verdosos, ligeramente opalescente con un precipitado floculento disperso.

Placas preparadas: color prpura. La esterilizacin del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color prpura se restaura por agitacin. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10 -35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Presentacin x 100g :Cdigo: B02-104-05 x 500g :Cdigo: B02-104-06 6 x 50 ml: B04-104-84

E.M.B. Agar.
Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento

Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas.

Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. Como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. Crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. Y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella. Frmula (en gramos por litro) Peptona 10.0 Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 Fosfato di potsico 2.0 Agar 13.5 Eosina 0.4 Azul de metileno pH final: 7.2 0.2 Siembra En superficie, por estriado a partir de un inculo poco denso, para obtener colonias aisladas. En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas. Incubacin De 24 a 48 horas a 35-37 C, en aerobiosis. Resultados Microorganismos Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Proteus mirabilis ATCC 43071 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Shigella flexneri ATCC 12022 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Caractersticas del medio: Tipo de Colonia Verdosas con brillo metlico y centro negro azulado Mucosas, rosa prpura, confluentes Incoloras Incoloras, pequeas, puntiformes Incoloras Incoloras 0.065 Instrucciones Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Esterilizar en autoclave a no ms de 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45C y distribuir agitando suavemente.

Placas preparadas: color prpura. La esterilizacin del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color prpura se restaura por agitacin. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10 -35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Presentacin x 100g :Cdigo: B02-101-05 x 500g :Cdigo: B02-101-06 6 x 50 ml: B04-101-84