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ESPECTROSCOPIA: Es el estudio de la absorcin o emisin de radiacin electromagntica efectuada por las distintas sustancias. En la espectrofotometra de absorcin no nos interesaba el destino de las especies excitadas., en este caso s, en este captulo nos interesa el comportamiento de los tomos y las molculas despus de excitadas. La especie excitada tiene 3 formas para liberar su energa (pasar a un nivel mas bajo) : 1. 2. 3. Energa dispersada en forma de calor (en etapas que ocurren colisiones con o tras molculas) Especies excitadas pueden sufrir rxnes qumicas. Mediante la emisin de la radiacin.

3 formas de excitacin 1. Quimioluminiscencia. Rxnes que generan productos en estados excitados a temperaturas ordinarias y en la regin visible. Ej La lu cirnaga Fluorescencia. (excitacin al absorber radiacin) Excitacin trmica. Ej. Lmpara de arco de Xenn.

2. 3.

CONCEPTOS
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Fotoluminiscencia. Es la radiacin que emiten los tomos o molculas excitados por medio de fotones; incluye la fluorescencia y la fosforescencia. Fluorescencia. Es la radiacin UV-Vis que emiten los tomos o, con mas frecuencia, las molculas que se han excitado al absorber radiacin; esta emisin cesa en 0.1 s despus de que la excitacin ha terminado. (contrario a la fosforescencia, en donde la emisin persiste durante un periodo mas largo) Fluorescencia atmica. Se basa en la irradiacin de una poblacin de tomos en estado basal y la radiacin fluorescente emitida se monitorea por medio de un detector. La fuente puede ser de lmpara de Xenn o lmparas de ctodo hueco. No es muy comn o utilizado en anlisis qu micos Compuestos que presentan fluorescencia: Acido saliclico, acido acetilsalicilico (aspirina), anfetamina, Barbituratos, aminocidos Fosforescencia. Es la fotoluminiscencia que continua durante un periodo mayor al de la fluorescencia despus de que se apaga la radiacin de excitacin. En la fosforescencia la emisin puede continuar durante varios segundos y hasta minutos. Sucede por un espn sin aparear que baja al estado basal (transicin prohibida). Quimioluminiscencia. Es la energa radiante que emiten, con frecuencia en la regin visible, las molculas que estn en estados electrnicos excitados que son ocasionados por reacciones qumicas a temperaturas ordinarias. Si la reaccin sucede en un sistema biolgico, a la emisin se le llama bioluminisc encia.

Espectrofotometra de Fluorescencia
Principio Ciertas molculas, particularmente aquellas con un cromforo y una estructura rgida, se pueden excitar por radiacin UV/VIS, y luego emitir la radiacin absorbida a una longitud de onda mayor. La ra diacin emitida se puede medir. Las molculas tienen diferentes estados llamados niveles de energa. La espectrometra de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrnicos. En general, las especies objeto de examen tendrn un estado electrnico basal (un estado de baja energa) de inters, y un estado electrnico excitado de mayor energa. Dentro de cada uno de estos estados electrnicos hay diferentes estados vibracionales.

En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorcin de un fotn de luz, desde su estado electrnico basal a uno de los distintos estados vibracionales del estado electrnico excitado. Las colisiones con otras molculas causan que la molcula excitada pierda energa vibracional hasta que alcanza el estado vibracional ms bajo de l estado electrnico excitado. La molcula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibracin del estado electrnico basal, emitiendo un fotn en el proceso. Como las molculas pueden caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibracin en el estado basal, los fotones emitidos tendrn diferentes energas y, por lo tanto, frecuencias. As pues, mediante el anlisis de las diferentes fr ecuencias de luz emitida por espectrometria de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles de vibracin. Aplicaciones 1. Determinacin de drogas fluorescentes de formulaciones de baja dosis en presencia de excipientes no fluorescentes. 2. Pruebas de lmite, donde la impureza es fluorescente o puede ser sometida a fluorescencia. 3. Para estudiar los enlaces de medicamentos con sus componentes en formulaciones complejas. 4. En bioanlisis para medir pequeas cantidades de droga y para su estudio del enlace protenadroga. En anlisis de: 1. Aminocidos 2. Protenas 3. Coenzimas 4. Vitaminas 5. cidos nucledos 6. Alcaloides 7. Porfirinas 8. Esteroides 9. flavonoides y muchos metablicos. Ejemplos de aplicaciones en anlisis farmacuticos Determinacin de ethinylestradiol en tabletas. Determinacin de la velocidad de disolucin de tabletas de digoxina Determinacin de aluminio en agua para inyeccin como un complejo fluorescente. Determinacin de la estabilidad de drogas ppticas en disolucin. Interferencias en fluorescencia Concentracin alta. Si la concentracin de una disolucin preparada para medir fluorescencia es muy alta, alguna de la luz emitida por la muestra como fluorescencia , podra ser reabsorbida por otras molculas no excitadas en disolucin. tomos pesados en disolucin disminuye el efecto de fluorescencia mediante las colisiones con molculas excitadas lo que provoca que la energa se disipe. Formacin de complejos qumicos con otras molculas in disolucin pueden cambiar el comportamiento fluorescente. Temperatura. La fluorescencia depende de la temperatura debido a que puede contribuir a la perdida de excitacin mediante colisin y vibracin Los solventes ms viscosos tienden a provocar la fluorescencia. Otras interferencias Los tipos ms importantes de dispersin en este contexto son la dispersin de Rayleigh y la de Raman. La luz dispersa por dispersin de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersin Raman la luz cambia a longitudes de onda ms largas. La dispersin de Raman es el resultado de un estado electrnico virtual inducido por la luz de excitacin. A partir de este estado virtual, las molculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal. En los espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de nmero de onda constante en relacin con la excitacin.

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Efecto del disolvente en fluo rescencia El disolvente tiene que estar libre de impurezas fluorescentes. La limpieza del material de vidrio, debe ser lo mas cuidadosa posible y debe evitarse los detergentes que suelen ser fluorescentes, se recomienda la mezcla sulfocrmica (solucin de cido sulfrico ( 25 al 30% v/v) y dicromato de sodio o potasio (5% -10%)). Cuando se trabaja en medio amortiguado, la influencia del disolvente es variable, se necesita saber que los fosfatos amortiguadores suelen tender a inhibir la fluorescencia. Cuando un disolvente cualquiera se irradia con una luz excitadora, emite perpendicularmente a la excitacin una radiacin policromtica compuesta de una lnea intensa y una serie de lneas de menor intensidad caractersticas del disolvente. Esas lneas menores constituyen la difusin RAMAN del disolvente y puede interferir con el mximo de emisin de una sustancia. Ejemplos de aplicaciones en anlisis farmacuticos Determinacin de ethinylestradiol en tabletas. Determinacin de la velocidad de disolucin d e tabletas de digoxina Determinacin de aluminio en agua para inyeccin como un complejo fluorescente. Determinacin de la estabilidad de drogas ppticas en disolucin. Instrumentos En la espectrometra de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos: 1. Fluormetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente. 2. Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculo de difraccin para aislar la luz incidente y la luz fluorescente. Componentes: y Fuentes: se necesitan fuentes ms intensas que las utilizadas en medidas de absorcin, por lo que se utiliza para los fluoromtros, una lmpara de arco de mercurio a baja presin. Y para los espectrofluormetros una lmpara de arco de xenn (emite de manera continua en 200 a 800 nm y sus radiaciones son muy intensas en el UV). Tambin se utilizan lseres. y Filtros y monocromadores. Se utilizan tanto los filtros de interferencia como los de absorcin. Deben seleccionar exactamente las long de onda para evitar un traslape de las long onda mximas de excita y emisin. y Detectores: los mas utilizados son los tubos multiplicadores. y Cubetas frecuentemente son de cuarzo y a diferencia de las de absorcin, las 4 caras son transparentes. Nota. La emisin se mide a los 90 grados del haz de excitacin para tener solo radiacin de emisin

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