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ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE FUNGOS TOXGENOS ISOLADOS DE AMOSTRAS DE RAES DESTINADAS ALIMENTAO DE EQINOS NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
KELLY MOURA KELLER1 BEATRIZ DIAS QUEIROZ1 LUIZ ANTONIO MOURA KELLER2 JESSIKA MARA MARTINS RIBEIRO3 CARLOS ALBERTO DA ROCHA ROSA4
1. Aluna de Iniciao Cientfica PIC/UFRuralRJ, Discente do Curso de Medicina Veterinria; 2. Discente do Curso de Medicina Veterinria da UFRuralRJ; 3. Mestranda em Microbiologia Veterinria pela UFRuralRJ; 4. Professor Titular do Instituto de Veterinria da UFRuralRJ.

RESUMO: KELLER, K. M.; QUEIROZ, B. D.; KELLER, L. A. M.; RIBEIRO, J. M. M.; ROSA, C. A. da R. Isolamento e identificao de fungos toxgenos isolados de amostras de raes destinadas alimentao de eqinos no Estado do Rio de Janeiro. Revista Universidade Rural: Srie Cincias da Vida, Seropdica, RJ: EDUR, v. 25, n.1, p. 93-96, jan.-jun., 2005. Este estudo objetivou isolar e identificar a micoflora toxgena contaminante em amostras de raes para eqinos em cinco centros eqestres do Estado do Rio de Janeiro. Foram coletadas trinta amostras entre julho de 2003 e maro de 2004, e o valor mais elevado da mdia da contagem total para fungos filamentosos foi 1,2 X 105 UFC.g-1 para amostras de aveia laminada, muito utilizada como complemento energtico na alimentao de cavalos atletas. O gnero Aspergillus e seus teleomorfos foram os mais prevalentes (40,54%), seguidos pelo gnero Penicillium (18,38%) e Fusarium (16,22%), alm de outros. Palavras-chave: micobiota, micotoxinas, aveia, micotoxicoses. ABSTRACT: KELLER, K. M.; QUEIROZ, B. D.; KELLER, L. A. M.; RIBEIRO, J. M. M.; ROSA, C. A. da R. Isolation and identification of toxigenic fungi from equine feed samples in Rio de Janeiro State. Revista Universidade Rural: Srie Cincias da Vida, Seropdica, RJ: EDUR, v. 25, n.1, p.93-96, jan.-jun., 2005. This study was carried out to isolate and identify the toxigenic mycoflora contaminant in equine feed samples from five hippo centers of Rio de Janeiro state. Thirty samples were collected, between July 2003 and March 2004, and the highest average of total count for filamentous fungi was 1.2 X 105 CFU g-1 for oats, commonly used as an energetic complement for athletic horses. The genus Aspergillus and their teleomorphs were the most prevalent (40.54%), followed by genus Penicillium (18.38%) and Fusarium (16.22%), beside others. Key Words: mycobiota, mycotoxins, oats, mycotoxicoses.

INTRODUO Numerosas espcies fngicas so hoje reconhecidas como produtoras de uma ou mais toxinas e, um grande nmero destes metablitos txicos j foi identificado e caracterizado como substncias produzidas em contaminaes naturais de gros e outros alimentos (CRUZ, 1996). A ocorrncia de micotoxicoses entre os animais domsticos um reflexo do sistema produtivo adotado pelos criadores. Quanto mais evoludo for, maior ser a utilizao

de alimentos concentrados, a base de gros, tornando maior a probabilidade de intoxicao pelas micotoxinas. As Aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2) so produzidas principalmente por Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus. A Aflatoxina B1 (AFB1), mais freqente e mais txica, reconhecida como o mais potente hepatocarcingeno de origem biolgica para o homem e os animais (ROSA et al.,1996). Estas toxinas so encontradas como contaminantes naturais de produtos vegetais tais como: amendoim,

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milho, arroz, centeio, sorgo, cevada e raes. As Aflatoxinas so hepatotxicas e em baixas concentraes produzem alteraes sobre o metabolismo, levando lentamente, a srios danos sade e produtividade do animal. Os efeitos mais f reqentemente observ ados nas intoxicaes por aflatoxinas, so a diminuio da velocidade de crescimento e da eficincia alimentar, causados pela reduo do metabolismo protico e absoro de gorduras, pela supresso da resposta imune e a hepatocarcinognese. As micotoxicoses em eqinos esto relacionadas principalmente com a ingesto de milho contaminado pelas toxinas produzidas por fungos do gnero Fusarium, como as Fumonisinas. Este grupo de micotoxinas responsvel pela Leucoencefalomalcea eqina (LEME). Casos de LEME foram confirmados na Hungria, Brasil, frica do Sul e EUA, e f oram atribudos especificamente atividade das fumonisinas. A LEME consiste de uma desordem neurolgica aguda e fatal, que afeta cavalos. Apresenta sinais clnicos como: ataxia, paresia, hipersensibilidade e alteraes locomotoras. Nas leses cerebrais ocorre necrose de liquefao em um ou em ambos os hemisfrios. Entretanto, quando pensamos em af latoxinas, as mais freqentes micotoxinas detectadas em milho e raes para animais, observamos que h poucos dados referentes a micobiota toxgena e a incidncia de patologia nessa espcie animal. Casos suspeitos de aflatoxicose eqina tm sido descritos (CRUZ et al., 1985). Os sinais clnicos observados incluem depresso do sistema nervoso central (SNC), anorexia, perda de peso, ictercia e hemorragias subcutneas. A necropsia evidenciou fgado gordo, rins friveis, petquias epicardiais e enterites hemorrgicas. A concentrao de AFB1 em raes analisadas nestes episdios variou de 58,4 a 6.500 ng.g-1. Existem tambm certas espcies do gnero Penicillium, em especial Penicillium rubrum, que so

importantes por produzirem Rubratoxinas, as quais podem potencializar as aes das aflatoxinas. Uma exposio crnica as rubratoxinas produz extensos danos nos tecidos vivos que consiste basicamente de necrose hemorrgica. Conhecer os fungos toxgenos, as micotoxinas produzidas e seus ef eitos txicos tornaram-se indispensvel aos mdicos veterinrios e a todos os profissionais voltados para a preservao da sade humana e animal. Para o controle de qualidade de alimentos e raes, a identificao da micobiota contaminante essencial. A identificao a nvel especfico poderia prover dados importantes sobre a biologia e a bioqumica dos microrganismos, incluindo a produo de suas micotoxinas (DALCERO et al., 1997). Em f uno do potencial de contaminao de raes para eqinos por aflatoxinas e a pouqussima quantidade de dados sobre aflatoxicose eqina, este estudo foi idealizado objetivando-se avaliar a micobiota toxgena em amostras de raes fornecidas a eqinos nos diversos haras do Estado do Rio de Janeiro.

MATERIAL E MTODOS As anlises micolgicas e micotoxicolgicas foram realizadas nos laboratrios do Ncleo de Pesquisas Micolgicas e Micotoxicolgicas do Dept de Microbiologia e Imunologia Veterinria do Instituto de Veterinria da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Durante o perodo compreendido entre julho de 2003 e maro de 2004, foram coletadas 30 amostras de raes para eqinos em cinco postos de coleta do Estado do Rio de Janeiro, conforme lista a seguir: Posto 1 Colgio Militar do Rio de Janeiro (CMRJ); Posto 2 - Regimento Escola de Cavalaria (REsC); Posto 3 - Escola de Equitao do Exrcito (EsEqEx); Posto 4 - Centro Hpico do Rio de Janeiro (CHRJ); Posto 5 - Instituto de Zootecnia da UFRuralRJ. As amostras de raes coletadas no posto 5 foram as

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nicas que no sofreram processo de peletizao durante a sua produo, sendo fornecida aos animais sob a forma farelada. No posto 1, alm das amostras de raes, foram coletadas amostras de aveia laminada, muito utilizada como complemento energtico na alimentao de cav alos atletas. A contagem de unidades formadoras de colnias (UFC) de fungos filamentosos foi realizada segundo metodologia de diluio decimal seriada descrita por PITT & HOCKING (1997): Homogeneizou-se 10 gramas da amostra em 90 mL de gua destilada estril. A partir desta diluio inicial (10-1) preparou-se diluio decimal seriadas at 10-4. Inoculouse alquotas de 0,1mL de cada uma das diluies nos meio de cultivos, tais como: dichloran rose bengal chloranphenicol (DRBC), utilizado para contagem (KING et al., 1979, modificado por PITT & HOCKING, 1985); dichloran 18% glicerol agar (DG18), um meio seletivo para fungos xeroflicos (HOCKING & PITT, 1980); dichloran chloranphenicol peptone agar (DCPA) para isolamento de espcies do gnero Fusarium. As placas foram incubadas a 25C por cinco a sete dias. Todas as placas f oram observ adas diariamente, selecionando-se para a enumerao as placas que continham em torno de 10 a 100 unidades formadoras de colnias (DALCERO et al., 1997). As colnias fngicas pertencentes ao gnero Fusarium foram repicadas em V-8 juice agar (V-8J), e as dos gneros Aspergillus e Penicillium foram armazenadas em malt extract agar (MEA), e mantidas sob refrigerao at identificao das espcies. A identificao das cepas fngicas pertencentes ao gnero Aspergillus seguiram as chav es de identificao descritas por KLICH & PITT, e baseadas na semeadura em trs meios bsicos como: Czapek yeast extract agar (CYA); malt extract agar (MEA) e Czapek yeast extract agar 20% sucrose (CY20S). Preparou-se uma suspenso de condios a partir de cada cepa, em 0,5 mL de meio constitudo de 0,2% de agar-agar e 0,05%

de Tween 80TM , distribudo em tubos de hemlise e previamente esterilizados por autoclavao a 121C por 15 minutos (PITT & HOCKING, 1997). A seguir, introduziuse um estilete de platina em forma de agulha na suspenso de condios inoculando-a nos meios de cultivo. Cada cepa f oi inoculada em trs pontos eqidistantes nas placas contendo os meios de cultivo. Estas foram incubadas por sete dias a 25 C. Aps o perodo de sete dias de incubao, observaram-se as caractersticas macroscpicas das colnias (dimetro, textura, forma, aspecto da superfcie e do reverso, pigmentao dos condios e pigmento solvel, produo e cor de exsudato) e determinaram-se as caractersticas de suas estruturas micromorfolgicas, visando a identificao das espcies.

RESULTADOS E DISCUSSO A carga fngica contaminante, expressa atravs de unidades formadoras de colnia por grama (UFC/g) de amostra analisada est apresentada na tabela 1.
Tabela 1. Mdia dos valores da contagem total dos fungos filamentosos is olados de amostras de raes para eqinos.
Postos de Coleta Composies avaliadas Posto 1 - Aveia Posto 1 - Rao A Posto 2 - Rao B Posto 2 - Rao C Posto 2 - Rao D Posto 3 - Rao E Posto 4 - Rao F - Rao G - Rao H Posto 5 - Rao I DRBC UFG g
-1 5

DG18 UFG g
-1 5

DCPA UFG g
-1 4

1.2 x 10 3 3.4 x 10 3 0.5 x 10 3 0.6 x 10 4 1.0 x 10 4 0.8 x 10 3 1.1 x 10 4 0.9 x 10 2 1.0 x 10 5 1.0 x 10

1.1 x 10 4 3.3 x 10 3 1.6 x 10 3 1.4 x 10 4 2.0 x 10 4 1.0 x 10 3 1.0 x 10 4 1.2 x 10 NC 5 0.4 x 10

6.4 x 10 3 0.5 x 10 3 1.2 x 10 3 0.9 x 10 4 3.0 x 10 4 0.3 x 10 3 0.6 x 10 4 0.5 x 10 NC 5 0.4 x 10

NC: no houve crescimento.

De acordo com os resultados faixas de UFC.g-1 e suas respectivas mdias obtidas nos meios DRBC, DG18 e DCPA a partir das amostras coletadas nos postos

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estabelecidos. As maiores cargas fngicas foram obtidas a partir de amostras de aveia laminada quando semeadas em meio DRBC, mantendo elevados nveis tambm nos meios DG18 e DCPA, obtendo-se UFCs da ordem de 105 nesse substrato. Dentre as amostras de rao analisadas, os valores mais elevados foram obtidos em amostras de rao no peletizada (posto 5 rao I), isto , valores de at 2.0 x 105 UFC.g -1 . Esses v alores ultrapassam aqueles estabelecidos como limtrofes, isto , da ordem de 105 UFC.g-1. Nas demais marcas de raes analisadas, os valores obtidos para a carga fngica contaminante esto dentro dos limites tolerados. Observou-se uma maior ocorrncia de fungos filamentosos, sendo isolados 185 cepas pertencentes a seis gneros fngicos, alm da ordem Mucorales. (Tabela 2).
Tabela 2. Fungos filamentosos isolados de amostras de raes destinadas alimentao de eqinos no Estado do Rio de Janeiro.

ochraceus, e patognicas, como o Aspergillus fumigatus foram isoladas em menor nmero (Tabela 3).
Tabela 3. Espcies do gnero Aspergillus isoladas de amostras de raes destinadas alimentao de eqinos no Estado do Rio de Janeiro.

Seo Seo Fumigati A. fumigatus Seo Versicolores A. caespitosus Seo Usti A. puniceus Seo Flavipedes A. flavipes Seo Flavi A. flavus A. tamarii Seo Nigri A. niger Seo Circundati A. ochraceus Seo Candidi A. candidus Total

Nmero de Ocorrncia isolados (%) 01 01 02 01 09 01 04 02 04 25 4,0 4,0 8,0 4,0 36,0 4,0 16,0 8,0 16,0 100,0

Gnero fngico Aspergillus spp. e teleomorfos Penicillium spp. Fusarium spp. Cladosporium spp. Mucorales Alternaria spp. Nigrospora spp. Total

Nmero de Ocorrncia isolados (%) 75 34 30 18 14 13 01 185 40,54 18,38 16,22 9,73 7,57 7,03 0,54 100,0

As espcies prev alentes f oram pertencentes aos gneros Aspergillus e seus teleomorfos (40,54%), seguido por Penicillium (18,38%), e por Fusarium (16,22%), dentre outros. Vinte e cinco cepas do gnero Aspergillus f oram identificadas em nvel de espcie, e foram predominantes as pertencentes a seo Flavi (40,0%). O Aspergillus flavus foi a espcie de maior prevalncia (36,0%), entretanto outras espcies toxgenas importantes, como o Aspergillus

A presena de espcies aflatoxgenas e ochratoxgenas evidencia a necessidade de serem aprofundadas as pesquisas. A identificao e a determinao da micobiota contaminante e de suas caractersticas fisiolgicas, nutricionais e toxgenas revestem-se de grande importncia para o estabelecimento e a anlise do risco de exposio do homem e dos animais de criao estes fungos, e suas potenciais micotoxinas.

CONCLUSO A alta ocorrncia de fungos toxgenos dos gneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium justifica um monitoramento micotoxicolgico rotineiro das raes fornecidas eqinos, principalmente no que tange contaminao por Fumonisinas.

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AGRADECIMENTOS s doutoras Ana Maria Dalcero e Carina Magnoli, do Dept. de Microbiologia da Universidade Federal de Rio Cuarto - Rio Cuarto, Crdoba Argentina, que cooperaram na identificao de cepas isoladas do gnero Fusarium spp., bem como cepas de outros gneros e espcies que no puderam ser identificadas em nossa Instituio.

ROSA, M.F.A.P.; SANTANA, D.M.N.; DIREITO, G.M.; SABINO, M. & ROSA, C.A.R. An improved method to determinate aflatoxins B1 and M1 and Aflatoxicol in Brazilian Industrialized liver paste. In: IX INTERNATIONAL IUPAC SYMPOSIUM ON MYCOTOXINS AND PHYCOTOXINS ISTITUTO SUPERIORI DI SANIT, Rome Italy, 27-31 May 1996.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS CRUZ, L.C.H. Micotoxinas so to importantes. In: Micotoxinas: Perspectiva Latinoamericana. Rio de Janeiro: Editora Universidade Rural, 1996. DALCERO, A.; MAGNOLI, C.; CHIACCHIERA, S.; PALACIOS, G. & REYNOSO, M. Mycoflora and incidence of af latoxin B1, zearalenone and deoxynivalenol in poultry feeds in Argentina. Mycopathology, v. 137, p. 179-184, 1997. HOCKING, A.D & PITT, J.I. DichloranGlycerol media for enumeration xerophilic fungi from low moisture foods. Appl. Environm. Microbiology, v. 39, p. 488-492, 1980. KLICH, M.A.; PITT, J.I. A laboratory guide to the common Aspergillus species and their teleomorphs. CSIRO - Division of Food Processing, Australia, 116p. PITT, J.I & HOCKING, A.D. Fungi and Food Spoilage. First edition. Sidney: Academic Press, 1985. PITT, J.I & HOCKING, A.D. Fungi and Food Spoilage. Second edition. London: Black Academic & Professional - Chapman & Hall, 1997, 593p.

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