DETERMINACION DE LA BIOMASA

I.

INTRODUCCION

En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el nmero de microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en estudio de curvas de crecimiento, anlisis de alimentos, preparaciones de inculos para fermentacin, etc. (Aquiahuati, 2004). Un parmetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de plantas de tratamiento de efluentes lquidos es la concentracin de biomasa. Biomasa es un trmino general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. Existen muchas maneras de medir la concentracin de biomasa, como por ejemplo masa, volumen, extensin linear de filamentos, dispersin de luz, conteo de clulas u organelas. Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos o peso (biomasa) de clulas microbianas en un cultivo; los mtodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos se puede mencionar a la determinacin de peso seco y el recuento de clulas en cmara de Neubauer (Aquiahuati, 2004). La determinacin de peso seco es un mtodo de cuantificacin muy utilizado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtracin, lavado, secado) se pueden causar prdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificacin. El mtodo de cuenta directa en cmara tiene la ventaja de ser muy rpido y econmico, aunque no se pueden distinguir las clulas viables y no viables. Se puede calcular el nmero de microorganismos en una muentra a partir del volumen de la cmara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la observacin y cuantificacin de dificultan en clulas muy pequeas (1 5 m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeo volumen de muestra que se utiliza (0.1 0.2 mm3) (Aquiahuati, 2004).

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II. OBJETIVOS  Dominar el uso y lectura en la Cmara de Neubauer por mtodo de conteo directo.  Conocer las tcnicas para aplicar las frmulas de conteo.  Determinar la concentracin de microorganismos (levaduras) a travs del microscopio, utilizando la cmara de Neubauer. III. FUNDAMENTO TEORICO Cmara de Neubauer La Cmara de Neubauer es un instrumento utilizado en cultivo celular para realizar conteo de clulas en un medio de cultivo lquido. Consta de dos placas de vidrio, entre las cuales se puede alojar un volumen conocido de lquido. Una de las placas posee una grilla de dimensiones conocidas y que es visible al microscopio ptico. Para contar las clulas de un cultivo lquido, se agrega una gota de este entre estas dos placas y observar al microscopio ptico la cantidad de clulas presentes en un campo determinado de la grilla. Con base en la cantidad de clulas contadas, conociendo el volumen de lquido que admite el campo de la grilla, se calcula la concentracin de clulas por unidad de volumen de la solucin de medio de cultivo inicial.

Figura 1. Cmara de Neubauer.

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La imagen simula el campo que est viendo al microscopio con un objetivo de 45x. Solo es visible el centro de la grilla. Intenta verificar esto al ir moviendo el campo de derechaizquierda y de arriba-abajo, como si de una pletina de microscopio se tratase. Muy importante: Cuando la muestra observada se sita en mitad de las lneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sita en mitad de las lneas inferior y/o de la derecha.

Figura 2. Forma de manipulacin de la cmara de Neubauer.

La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.
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Si contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x clulas entre las cuatro reas, la concentracin en la suspensin celular ser:concentracin en la suspensin (clulas / mL) = 10000 (x/4). Conteo en cmara de Neubauer Esta cmara se utiliza para conteo celular. Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, este debequedar centrada. Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en ladistribucin de las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeao con una jeringa ya que la cmara se llena con una gota. El llenado debe sercontinuo en un solo intento. La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas delrecuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, laapariencia en la cmara es de lquido abundante en las terminaciones delrecuadro. Conteo: Lleve la cmara al microscopio y enfoque el cuadro de conteo con elocular de 4X.

Figura 3. Representacin de la cuadrcula de la cmara de Neubauer con el ocular de 4X. Si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras, bacterias,etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X.

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Figura 4. Representacin de la cuadrcula de la cmara de Neubauer con el ocular de 10X. En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las clulas presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada unode los campos y con ayuda del carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de lacmara de conocer como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro seve de la siguiente manera:

Figura 5. Representacin de la cuadrcula de la cmara de Neubauer con el ocular de 40X. Las clulas se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomiendarealizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las clulasdos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observaque hay tres lneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en elmomento del conteo ya que definen cuales clulas son contables o cualesestn fuera del campo de conteo. Las clulas que no tocan la segunda lneason contables, si la tocan o estn encima de ella no se incluyen.

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Grficamentese puede apreciar la forma correcta de conteo. Las clulas que tiene una X sonlas que no se deben contar.

Figura 6. Orientacin que se debe seguir para el conteo de microorganismos usando la cmara de Neubauer.

Figura 7. Conteo de clulas en cuadrados terciarios. Despus de contar las clulas se procede a calcular la el nmero de clulaspor unidad de volumen. Para esto se utiliza el rea de cada cuadro, el espacioocupado por el lquido en el que estn las clulas que es el mismo espacio quehay entre la cuadricula de la cmara y la laminilla de cuarzo. Se promedia el nmero de esporas de la cmara de arriba con la de abajo, semultiplica por el factor de dilucin y por un factor F igual a106 si se cont elcuadro central o 104 si se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo elvalor X. 1ml del preinoculo ________________ X esporas ? ________________ Esporas a inocular

Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va adesarrollarse el microorganismo, esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.

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IV. MATERIALES Y METODOLOGIA A. MATERIALES  Pipetas Pasteur  Lmina cubre objeto  Levadura instantnea (Microorganismo: Saccharomycescerevisiae)  Agua destilada B. EQUIPOS  Microscopio  Cmara de Neubauer  Balanza analtica Sartorius CPA224S, Max 220g, d=0.1mg. C. METODOLOGIA  En 50 ml de agua destilada se agreg 0.5 gr de levadura, se homogeniz la muestra para que as no forme grumos.  Se limpi con papel toalla la cmara de Neubauer.  Se coloc el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales de la cmara, donde se aprecia una zona cuadriculada.  Con ayuda de una pipeta Pasteur, se obtuvo una pequea de muestra del tubo de ensayo, y se coloc en el borde del cubreobjetos.Se dej que la solucin ingrese a la cmara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales.  Luego que la muestra ingrespor la cmara de Neubauer, se dej reposar, y posteriormente, se coloc en el microscopio.  Se realiz la cuantificacin de clulas en las zonas de los cuadrados ms pequeos de 0.05 mm., tomando precauciones para evitar contar dos veces la misma clula u omitir alguna.

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 Luego de calcular las clulas en los cuadrados intermedios, extremos y los determinados al azar, se calcul la media de clulas por cuadrado, y por medio de la siguiente frmula, se determin el nmero de clulas por mililitro.

Figura 1. Frmula recuento (Levaduras/mL) en cmara de Neubauer

V. RESULTADOS Tabla 1. Nmero de levaduras contabilizadas

LISTAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 6 12 11 11 28 11 13 10 12 9 17 8 1 13 14 16 9 7 10 8 11 16 17 7 11 2 9 12 10 25 9 18 14 25 17 20 9 17 3 9 5 5 11 12 7 5 9 11 8 7 11 4 10 18 9 6 12 15 12 5 16 9 10 10 5 8 8 10 13 5 18 6 8 17 8 12 5 6 16 21 13 10 6 10 13 15 16 12 19 20 7 6 11 18 15 11 16 24 4 17 11 22 11 8 18 10 13 16 27 13 10 8 12 8 25 8 9 20 6 10 14 15 7 12 17 15 12 12 10 10 13 10 7 4 12 15 12 23 12 12 9 17 11 15 15 21 10 10 20 15 13 11 14 4 11 12 12 10 12 16 8 17 9 18 11 20 9 7 13 11 13 13 11 10 9 8 7 13 5 16 20 14 10 8 8 16 16 22 19 17 6 12 13 6 15 19 24 7 12 21 7 9 7 5 9 12 23 16 Sumas 195 197 183 199 209 215 189 197 207 186 203 195 Promedio 12.19 12.31 11.44 12.44 13.06 13.44 11.81 12.31 12.94 11.63 12.69 12.19

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13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 11 11 6 10 18 10 8 8 10 13 19 10 14 15 12 25 7 16 10 10 12 24 11 12 15 9 14 9 14 12 11 21 17 10 21 10 17 6 9 20 8 11 6 6 12 13 21 9 13 11 5 10 8 8 12 12 11 9 14 13 14 18 14 18 16 10 14 6 5 10 10 10 14 6 6 6 13 18 15 13 26 7 21 15 8 9 22 6 11 21 20 15 13 5 16 16 9 6 8 6 11 10 10 13 13 12 5 14 14 10 12 10 6 10 13 21 8 10 18 24 8 8 11 22 9 24 14 10 10 12 9 21 13 19 12 7 10 17 15 20 21 24 5 16 10 15 11 17 8 5 9 17 18 13 16 14 11 7 6 23 10 12 15 7 7 15 14 18 4 4 14 7 20 7 8 12 13 8 18 11 6 23 11 5 9 11 16 15 8 16 4 19 17 5 26 9 9 22 8 11 21 13 16 20 10 6 17 11 191 184 206 189 204 188 183 192 213 212 205 215 212 11.94 11.50 12.88 11.81 12.75 11.75 11.44 12.00 13.31 13.25 12.81 13.44 13.25

Tabla 2. Promedios finales despus del conteo de levaduras. Promedio Final Desviacin Promedio Coef. Variabilidad 12.42 0.6646976 0.8152899

A. Clculo de las levaduras / ml: 

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VI. DISCUSIONES YCONCLUSIONES Se pudo determinar el promedio de levaduras (s. cerevisiae) contadas en la muestra de 12, por el mtodo de conteo directo, usando la cmara de Neubauer, que constituye un mtodo eficaz para el conteo de dichas levaduras. Madiganet al (1998), utiliza el mtodo de conteo directo en cmara de Neubauer. Para dicho mtodo utiliza la frmula expresada en Figura 2, mostrando diferencia a la utilizada para el recuento de levaduras en laboratorio (Figura 1.).

Figura 2. Frmula recuento (Levaduras/mL) en cmara de Neubauer. Fuente (Madiganet al, 1998). Por otra parte, la concentracin de levaduras (levaduras/mL) encontradas, por el mtodo de conteo directo en la cmara de Neubauerfue de .

Los datos encontrados despus del conteo nos arrojan valores promedios de levaduras, con una desviacin estndar de 0.67, por consiguiente un coeficiente de variacin de 0.82. De los datos anteriores nos podemos dar cuenta que el coeficiente de variacin es mayor al 30%. Esta diferencia se pudo deber a la no homogeneidad de la muestra de levadura analizada.

VII. RECOMENDACIONES Se recomienda agitar la muestra antes de utilizarla, para obtener una muestra homogenea.

Realizar el llenado correcto de la muestra en la cmara, sin que esta caiga en la lmina cubreobjeto.Luego de su uso limpiar la cmara de Neubauercon agua tibia

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Utilizar el zoom adecuado, con la finalidad de observar de manera ms clara las levaduras con el fin de facilitar el conteo.

VIII. BIBLIOGRAFIA

UNAM, (1986); Biologa Celular, Manual de Prcticas. Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad autctona de Mxico. Pg. 20 28. AQUIAHUATI M. (2004), Manual de Prcticas: Laboratorio de Microbiologa Celular, Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Departamento de Biotecnologa, 1era Edicin, Pg. 63-68. MADIGAN M. et al (1998). Brock Biologa de los microorganismos Octava Edicin, Prentice Hall, Espaa, P. 155 156.

Manual de Prcticas de Microbiologa Bsica. Hernano Valencia. Universidad Nacional de Colombia. 2001.

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ANEXOS

Entre las ventajas y desventajas de este mtodo se tiene lo siguiente:

VENTAJAS -Es rpido -Los frotis se pueden guardar -Las exigencias de equipo son mnimas -Se pueden observar las diferentes morfologas de los microorganismos. -Se observan tanto los microorganismos viables como los no viables

DESVENTAJAS -La cantidad de muestra analizada es poca -Provoca cansancio del operador -Slo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por ml -Es difcil distinguir los microorganismos de las partculas de muestra -Una inadecuada distribucin de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores.

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