PRACTICA N2 DE MALALTIES INFECCIOSES I

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A AGENTES ANTIMICROBIANOS

Introduccin La determinacin de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos es una de las principales funciones de un laboratorio de enfermedades infecciosas. Esta funcin se vuelve de especial relevancia en una poca como la actual, en la que las resistencias a los agentes antimicrobianos son elevadas y existe una gran discusin sobre la utilizacin de antibiticos en los animales. Por ello es fundamental que el laboratorio pueda aportar la informacin necesaria para llevar a trmino un tratamiento adecuado. El principal objetivo de cualquier prueba de sensibilidad antimicrobiana es predecir cul ser el resultado de un tratamiento. En muchas ocasiones los resultados se expresan, para un patgeno aislado y analizado, de forma cualitativa: como sensible (en cuyo caso se supone que un tratamiento estndar con aquel compuesto producir la curacin), resistente (el antimicrobiano examinado no ser eficaz en aquella patologa) o intermedio (la efectividad de aquel compuesto depender de su localizacin o de la dosificacin utilizada). Un segundo objetivo de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana es la de obtener series histricas que permiten predecir el comportamiento de un tratamiento cuando ste se hace de forma emprica.

Objetivos de la prctica Los objetivos de esta prctica son: a) Aprender las tcnicas ms usuales de determinacin de la sensibilidad antimicrobiana: mtodo por difusin de microdiscos (Kirby-Bauer) y mtodo de dilucin en caldo (CMI). b) Aprender los criterios de seleccin de antimicrobianos a testar en una prueba de sensibilidad antimicrobiana. c) Conocer los criterios de interpretacin. Normas generales La determinacin de la sensibilidad antimicrobiana slo es factible para aquellos patgenos para los que existen mtodos adecuados y estandarizados de anlisis y para aquellos en los que es esperable la existencia de resistencias. En algunas ocasiones puede ser interesante llevar a cabo estos anlisis por laboratorios especializados si los microorganismos tienen una especial relevancia (Mycobacterium tuberculosis, etc.). Un estudio de antibiosensibilidad no tiene sentido a partir de microbiota normal o saprofita dado que los resultados no tendrn relevancia y pueden inducir a tratamientos errneos.

Mtodos de anlisis de la sensibilidad antimicrobiana Podemos distinguir diferentes tipos de mtodos en funcin de la tcnica utilizada y de la informacin que dan (Tabla 1).

MTODO CUALITATIVO

TCNICA

INFORMACIN

ANTIBIOGRAMA DIFUSION de MICRODISCOS RESISTENCIA VALOR INTERMEDIO (KIRBY-BAUER) SENSIBILIDAD APROXIMACION A LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA (CMI) DETERMINACION DE LA CMI

SEMICUANTITATIVO GRADIENTE ANTIBIOTICO (E-TEST)

CUANTITATIVO

1. DILUCION DE CALDO: -MACRODILUCION EN TUBO -MICRODILUCION EN PLACA 2. DILUCION EN AGAR 3. SISTEMAS AUTOMATIZADOS (Vitek...)

Tabla 1 Mtodos de deteccin de antibiosensibilidad Cada sistema tiene sus ventajas y sus inconvenientes: El mtodo de Kirby-Bauer es probablemente el ms utilizado por su sencillez y, si se realiza correctamente, presenta una correlacin muy buena con los mtodos cuantitativos. Algunos laboratorios trabajan con mtodos semicuantitativos como el E-test. Estos sistemas son una modificacin del mtodo de Kirby-Bauer, en los que en lugar de discos se utilizan tiras de papel impregnadas con un gradiente del antibitico, lo que permite una semi-cuantificacin. Los sistemas cuantitativos son los ms exactos pero tambin los ms laboriosos.

Establecimiento de los puntos de corte (breakpoints) en una prueba de sensibilidad antibitica En definitiva, sea cual sea el mtodo utilizado, el veterinario exige al laboratorio que clasifique los resultados en funcin del potencial xito que tendr la administracin de un antibitico en una enfermedad concreta. Por este motivo, es necesario establecer a partir de qu punto (dimetro de inhibicin en el antibiograma, CMI, etc) clasificamos un microorganismo como sensible, intermedio o resistente. En el argot de la microbiologa clnica es lo que se llama un punto de corte. El establecimiento de este punto de corte puede depender de cuatro factores: a) b) c) d) Distribucin de la CMI Caractersticas farmacodinmicas y farmacocinticas Respuesta clnica Dimetros de inhibicin (Kirby-Bauer)
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Comparacin de tcnicas Normalmente, las pruebas cuantitativas clsicas (dilucin en caldo o en agar) se suelen tomar como patrones de referencia para evaluar otros sistemas de determinacin de sensibilidad antimicrobiana. Cualquier laboratorio que realice antibiogramas con regularidad debera comparar peridicamente sus resultados con la determinacin de CMI como mtodo de control de calidad. A partir de esta comparacin podemos elaborar un cuadro similar al siguiente, en el que se puede ver la clasificacin de resultados en las dos tcnicas:

Resistente CMI 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 Error menor

Intermedio

Sensible

C
Error menor Error muy grave Error menor

A
Resistente

C
Error grave Error menor

Intermedio

Sensible

B
<14 16 18 20 22

C
24 26 28 30 32 34 36 38 40 42

Dimetros (Kirby-Bauer)

Se consideran errores graves clasificar una cepa resistente como sensible (A) o una cepa sensible como resistente (B); mientras que se consideran errores menores la clasificacin de resistentes o sensibles como intermedias (C).

Descripcin de la prctica En esta prctica haremos una comparacin entre la tcnica de Kirby-Bauer (empleada mayoritariamente en los laboratorios de diagnstico veterinario) y la de microdilucin en placa (una de las tcnicas de referencia) utilizando una serie de cepas de E. coli aisladas de casos clnicos de porcino. En el antibiograma debereis hacer una seleccin de seis antibiticos a analizar (entre ellos obligatriamente la enrofloxacina) y en la prueba de microdilucin analizaremos la sensibilidad a la enrofloxacina.

1.- Fundamentos tericos de la prueba de difusin en disco de Kirby-Bauer La prueba de difusin en disco se basa en la capacidad de muchos agentes antimicrobianos de difundir en el agar creando un gradiente continuo de concentracin. Si el disco que contiene el antibitico se deposita sobre una placa recin inoculada, se producir la inhibicin del crecimiento del microorganismo analizado en un punto del gradiente y dar como resultado un rea concntrica al disco de inhibicin del crecimiento. Esta rea, al ser proporcional a la CMI permitir la distincin de cepas sensibles, resistentes o intermedias. Esta prueba est bien estandarizada y se acepta universalmente, si se realiza adecuadamente con los controles necesarios (Anexo 1)

Puntos crticos a) Concentracin del inculo. La concentracin ideal del inculo corresponde a una dilucin de turbidez 0,5 en la escala de McFarland. Concentraciones diferentes pueden dar lugar a interpretaciones errneas de los resultados. b) Medio. El medio adecuado para realizar la prueba es el Mueller-Hinton (MH). Para determinadas bacterias con requerimientos nutricionales especficos se pueden utilizar el MH-sangre o el MH-chocolate. c) Concentracin de los discos de antibitico. Para cada antimicrobiano hay fijadas unas concentraciones estndar. La variacin de estas concentraciones implica variar los criterios de interpretacin.

2.- Fundamentos tericos de la prueba de microdilucin en placa sta es probablemente la prueba de determinacin de CMI ms popular. Consiste en valorar el crecimiento del microorganismo a analizar en una serie de diluciones de caldo que contienen cantidades decrecientes del antimicrobiano elegido. Habitualmente el medio utilizado es el caldo de Mueller-Hinton o el Isosensitest. El inculo (cepa bacteriana) se debe dispensar en los pocillos de una microplaca conteniendo las diluciones de antibitico para tener una concentracin final de 5x105 UFC/ml en un volumen de entre 50 y 200 l. Despus de una incubacin de 20 h a 37C se determina la capacitat de crecimiento de la bacteria en presencia del antimicrobiano para valoracin de la turbidez del medio. La CMI se define como la mxima dilucin de antimicrobiano en la que no hay crecimiento bacteriano. Es necesario incluir un microorganismo de control (ver lista annexo 1), un control de creixement bacteriano y un control de pureza del inculo. Adems, se debe validar la densidad del inculo realizando siembras de diluciones seriadas.

Puntos crticos a) Cantidad de inculo: inculos excesivos tienden a incrementar la CMI mientras que inculos deficientes tienden a hacerla disminuir . b) Pureza del inculo: Un inculo contaminado con un microorganismo diferente al que se quiere analizar anula la prueba. c) Incubacin: Incubaciones menores de 16 h o ms de 24 h pueden dar lecturas errneas. El uso de CO2 puede alterar los resultados.

Tareas a realizar durante la prctica a) Seleccin de los antibiticos para el antibiograma b) Preparar el inculo de la cepa problema para la prueba de Kirby-Bauer c) Preparar el inculo de la cepa de control (E. coli ATCC 25922) d) Inocular la placa de Mueller-Hinton e) Dipositar los discos de los antimicrobianos seleccionados f) Preparar les dilucions dantibitic per a la prova de microdiluci g) Preparar el inculo de la prueba de microdilucin (cepa problema) h) Preparar el inculo de la prueba de microdilucin (E. coli ATCC 25922 ) i) Dispensar el antibitico en las microplacas j) Dispensar el control de medio k) Dispensar el control de crecimiento l) Dispensar la cepa problema m) Dispensar la cepa de control n) Incubar las placas o) Leer los resultados e interpretarlos METODOLOGA realizar durante la prctica ANTIBIOGRAMA MTODO Kirby-Bauer 1.- Seleccionar los antibiticos (mximo 6) a probar en el anlisis 2.- Rotular una placa de Mueller-Hinton con la referencia del microorganismo 3.- Preparar una suspensin del microorganismo problema (a partir de una colonia del TSA o agar-sangre) en solucin salina fisiolgica equivalente al 0,5 en la escala de McFarland (reservar la suspensin) 4.- Mojar un hisopo estril en la suspensin 5.- Escurrir el exceso de lquido contra las paredes del tubo de ensayo 6.- Tapar el tubo e inocular la placa completamente 7.- Inocular dos veces ms en ngulos de 60 8.- Con la ayuda de unas pinzas que se esterilizan en alcohol y flameando dispensar los antibiticos elegidos 9.- Dejar la placa en la estufa a 37C 10.- Pasadas 18-24 horas de incubacin, se pasa a medir el dimetro del halo de inhibicin y se interpreta segn las tablas de estndares, que normalmente proporciona cada casa comercial expendora de discos de antibiticos.

MICRODILUCIN EN PLACA 1.- Dispensa 100 l de mediO Isosensitest en todos los pocillos de las 2 primeras filas (A1B12). 2.- Dispensa 200 l de medio en los tres primeros pocillos de la tercera fila (C1, C2, C3) (control de esterilidad) 3.- Prepara una dilucin 32g/ml de enrofloxacina mezclando 0,5 ml de medio isosensitest y 0,5 ml de la dilucin 64g/ml de enrofloxacina (tubos rotulados como stock). 4.- Dispensa 100 l de la dilucin 32 g/ml en los pocillos de la primera columna en las dos primeres filas de la placa de microdilucin (A1, B1) 5.- Con una pipeta transfiere 100 l de la primera columna a la segunda. 6.- Mezcla y repite la operacin hasta llegar a la ltima columna (n12) (A1A2A3... y B1B2B3). Descarta los 100 l sobrantes. 7.- Aade 100 l de antibitico (64 g/ml) en los tres segundos pocillos de la tercera fila (C4, C5, C6). A continuacin aade 100 l de medio sin antibitico (control de antibitico) a esos mismos pocillos. Aade 100 l de medio en los pocillos 7, 8, 9, 10, 11, 12 (C7-C12) de la tercera fila. 8.- A partir de la dilucin 0,5 McFarland de la cepa problema (aprox. 108 UFC/ml) haz una dilucin 1:100 (10-2) por duplicado (transfiere 100 l de la suspensin a un tubo eppendorf con 900 l de medio, mezcla y repite la dilucin en dos tubos) 9.- Aade 100 l de la suspensin bacteriana 10-2 en todos los pocillos de la primera fila A1 A12) y en los pocillos 7,8 y 9 (C7, C8, C9) de la tercera fila (control de crecimiento) 10.- Repite el paso 8 utilizando la suspensin que has preparado con la cepa de control de E. coli (ATCC 25922) 11.- Aade 100 l de la cepa de control a todos los pocillos e la segunda fila (B1 B12) 12.- Dispensa 100 l de la cepa de control en C10-C12 13.- Deja la placa en la estufa.

Annexo I