AA 2009/2010

26/05/2010

Lezioni di Microscopia
IL MICROSCOPIO
Schema del microscopio standard
●Un'immagine (reale) dell'oggetto viene formata in un piano intermedio
tra obiettivo e oculare (l'oggetto non'è nel piano focale dell'obiettivo!!!)
●Un immagine virtuale dell'immagine reale viene prodotta dall'oculare e

visualizzata dall'occhio
L'ingrandimento complessivo è
il prodotto degli ingrandimenti
di obiettivo e oculare

M = Mob x Moc

Valori tipici:

●Oculare: 10x-20x
●Obiettivo: 4x-100x

Obiettivo ha focali molto corte!

 25cm L
P.I .  
fe fo
L’evoluzione della specie
ILLUMINAZIONE
Di cosa vogliamo parlare
•Illuminazione, condensatori di luce
•obiettivi, correzioni delle aberrazioni

•Oculari

•Problemi legati alla risoluzione

ILLUMINAZIONE
Microscopio diritto

Epi-
illumination
Source

Brightfield
Source
Microscopio invertito

Brightfield
Source

Epi-
illumination
Source
Illuminazione
Se io ho un'oggetto autoluminoso oppure un oggetto che, illuminato da
una lampada, diffonde molto la luce allora farne un immagine con una
lente non è difficile

Strato di
materiale
diffondente
Illuminazione
Tuttavia se l'oggetto è poco diffondente le cose non sono cosi' semplici

Perdita di luce, ma soprattutto di angoli!

 diaframma del condensatore
Condensatore

Illuminazione di Koehler
●ogni punto dell'oggetto è illuminato da tutti i punti della sorgente

●l'immagine del filamento si forma nel piano dove c'è la lente, nella

pratica dove c'è il diaframma del condensatore

In questo modo se apro e chiudo il diaframma non cambio la
omogeneità ma solo la luminosità
Applicazioni pratiche di condensatori:
Proiettore di diapositive

Lampada Condensatore Lente

concava con filtro anti convergente
termico
Lavagna luminosa
Il condensatore del microscopio
 Il livello di apertura del
diaframma deve essere
obiettivo commisurato
all’APERTURA
NUMERICA dell’obiettivo,
Campione in pratica deve mandare al
campione la quantità di luce
adatta affinchè l’obiettivo la
Condensatore raccolga tutta.
Anche la posizione verticale
del condensatore è molto
Diaframma importante!!!
GLI OBIETTIVI
Gli obiettivi aberrazione di curvatura
di campo
Obiettivo ha focali molto corte (mm) e
quindi ha curvature delle superfici ottiche
molto alte. Inoltre non è costituito da una
sola lente ma da moltissime lenti per
correggere le aberrazioni

aberrazione cromatica

aberrazione sferica
Le aberrazioni
Aberrazione cromatica

1 1 1 1
  (n  1)   
p q  R1 R2 
C’è un problema!!! L’indice di rifrazione, n, in realtà non è
costante, ma varia con la lunghezza d’onda… quindi varia anche la
focale della lente
Con sistemi di lenti più
complessi, alcuni obiettivi
possono correggere questa
aberrazione per 2 o 4 colori.
Aberrazione sferica
I vari punti di una lente sferica non mettono a
fuoco perfettamente nello stesso punto,
quindi un punto nello spazio reale diventa un
dischetto nell’immagine.

Un obiettivo a
fluorite corregge
questa aberrazione
Aberrazione di curvatura di campo

È un’aberrazione molto difficile da

correggere. È dovuta al fatto che un
oggetto che sta su un piano viene
mappato dalla lente su una
superficie curva.

obiettivo di tipo
“plan” corregge
questa aberrazione.
Tirando le somme
Gli obiettivi esistono in diverse tipologie. Esistono
vari tipi di obiettivi, tanto più complessi quante più
aberrazioni riescono a correggere. Tutto questo ha,
ovviamente, un costo (economico).

qualità/prezzo
Apertura numerica
N. A.  n sin 

Come si vede dalla tabella, NA e ingrandimento sono legati tra di loro in

modo monotono. Al crescere della NA, in generale cresce anche
l'ingrandimento dell'obiettivo!!! Vedremo in seguito che è necessario
introdurre una descrizione basata sull'ottica ondulatoria per trattare la
NA in modo corretto.

Ma si puo' aumentare l'apertura numerica?

Gli obiettivi ad immersione
n=1.5
n=1.5

n=1 n=1.5
n=1.5 n=1.5

Se non metto l'olio, passando dal vetro all'aria (da mezzo più
rifrangente a mezzo meno rifrangente) i raggi formano con la normale
all'interfaccia degli angoli maggiori di quelli nel vetro. Quindi vengono
“persi” dall'obiettivo. Se invece metto un olio con indice di rifrazione
simile a quello del vetro allora minimizzo questo fenomeno e
“aumento” l'apertura numerica dell'obiettivo. Si noti che esistono olii
con n=1.74. Cosa succede in questo caso? E se si fa in acqua?
“Leggere” un obiettivo

Plan 10x/0.25 ∞/- WD 10.5

Tipo di obiettivo N.A. vetrino Working
ingrandimento Lunghezza del tubo distance
La lunghezza del tubo
La lunghezza del tubo è standard (160 mm)
ed è quella della linea rossa in figura, cioè
dall'attaccatura degli obiettivi al punto dove
si appoggia il naso per guardare.

Il microscopio come lo abbiamo descritto noi

fino ad ora ha degli obiettivi che sono disegnati per questo tipo di
tubo e che lavorano al finito con un ingrandimento dato da
Mob=160mm/lung.foc.ob. (un obiettivo 10x ha una lunghezza
focale f data da 160mm/10=16 mm)

Negli obiettivi più vecchi è indicata la lunghezzza di riferimento del

tubo (es. 160). Ora si usa solitamente un altro tipo di obiettivo.
Obiettivi infinity-corrected
Fino ad ora l'oggetto non era nel piano focale anteriore dell'obiettivo e
l''immagine intermedia si formava a distanza finita dall'obiettivo.

Oggi si usano gli obiettivi infinity-corrected, disegnati per poter

mettere l'oggetto nel piano focale anteriore. In questo modo pero'
l'immagine si forma all'infinito e quindi occorre una lente dopo
l'obiettivo per riportare l'immagine al finito in quanto la lunghezza del
tubo è fissa (160 mm).

Il simbolino ∞ che si trova sugli obiettivi indica che sono infinity-

corrected.
In questo modo è possibile
inserire altri elementi ottici
lungo il tubo (beam splitter,
elementi per il phase
contrast…) senza
compromettere la qualità
dell’immagine.
Correzione per vetrini copri oggetto
Molti campioni, soprattutto biologici, devono essere coperti da un
vetrino durante l’osservazione. Anche il vetrino, essendo di vetro,
può distorcere l’immagine. Per questa ragione, alcuni obiettivi
hanno una correzione per compensare lo spessore del vetrino, che
è indicato sull’obiettivo stesso (tipicamente 0.17mm).
GLI OCULARI
Alcune caratteristiche
Gli oculari possono essere singoli oppure doppi

Possono essere anch’essi correttivi di alcune aberrazioni

Il loro potere di ingrandimento è legato alla distanza della visione

distinta dell’occhio umano, convenzionalmente posta a 25cm. In
pratica, sono lenti di ingrandimento.
0.25 , e tipicamente M=10-20.
Quindi M OC 
f OC
La pupilla di uscita

●La pupilla d'uscita (exit pupil) è

l'immagine del diaframma di
apertura

L'occhio o una camera vanno

●

messi dove c'è l'exit pupil

UN CLOSE-UP
Piani coniugati
Piani coniugati
IL PROBLEMA DELLA
RISOLUZIONE
Ingrandimento e risoluzione
Ammettiamo di volere vedere oggetti molto piccoli. Sappiamo quindi
che dobbiamo usare un obiettivo con ingrandimento alto e anche
apertura numerica grande. Bene, negli esempi sottostanti è stato fatto,
ma la differenza è evidente! Esiste quindi il problema della
risoluzione!

100x Risoluzione pessima 100x Risoluzione adeguata

L'occhio umano è in grado di separare due raggi che angolarmente sono
separati di non meno di 2 arcmin (580 mrad). Questo corrisponde al
poter vedere ad occhio nudo come distinte fino a 10 linee per
millimetro.

Cosa significa “risolvere” gli oggetti? Significa far arrivare i raggi di luce
che provengono da essi a fotorecettori diversi. Per questo, ad esempio,
in buone condizioni di illuminazione si ha una visione più nitida.
Pensiamo invece ad una macchina fotografica. Si dice che la
risoluzione è tanto migliore quanto maggiore è il numero dei
pixel della macchina.

È certamente vero, ma in realtà oggi il fattore limitante è dato

dalla componente ottica.

Ammettiamo infine di avere una macchina fotografica, o un

microscopio, con un’ottica molto ben collimata. Posso avere
allora una risoluzione infinita?
Abbiamo sempre parlato di raggi (ottica geometrica).
Ma riusciamo proprio a capire tutto così?

La risposta è no. Un microscopio che funziona

secondo l'ottica gemoetrica ha una risoluzione infinita
cioè manda un punto in un punto. In realtà bisogna
usare una descrizione ondulatoria, che tiene conto
dei fenomeni di diffrazione. Quello che si scopre è
che un punto finisce in una macchiolina descritta
dalla Point Spread Function (PSF) del microscopio
Qualcosa di già visto: la diffrazione
La luce che passa attraverso una piccola fenditura
fa emergere una figura di diffrazione in cui i
minimi di intensità luminosa si trovano ad angoli
ql/d. Se d è piccolo, allora lo spreading
angolare è molto grande.

Ma questo cosa ci interessa???

Gli oggetti che osserviamo fungono da reticolo di diffrazione! Questo

fenomeno però diventa importante solo quando voglio osservare
oggetti piccoli, di dimensioni paragonabili a l.
 PSF e pattern di Airy

E' chiaro che distinguo due punti solo se sono separati da una certa distanza.
Ecco spiegata la risoluzione del microscopio!!!
Criterio di Rayleigh

Due oggetti sono distinguibili se sono separati da una distanza D più

grande del raggio d/2 del loro spot di Airy. Risultato: ho una risoluzione
 L'intuizione di Abbe
Più è fitto il reticolo e più grande è l'angolo
formato dalle onde diffratte rispetto all'onda
incidente (dettagli fini --> grandi angoli)

Ecco spiegata la risoluzione!!!

Dettagli fini --> angoli>NA -> nessun contributo

Teoria di Abbe dell'imaging
Image from http://www.doitpoms.ac.uk/tlplib/diffraction/

●Un oggetto è l'insieme di tanti

reticoli con passi diversi

●Nel piano immagine ogni

reticolo compare con
magnificazione M=v/u

●Solo i reticoli con passo non

troppo fine riescono a
contribuire all'immagine finale
Nel piano focale gli angoli sono
punti. Per il microscopio è un
piano fondamentale.
Solo l'obiettivo determina la risoluzione?

NO: assenza di raggi SI: cono di illuminazione cono di illuminazione

obliqui, necessari alla ugual apertura del cono troppo acuto: riduzione NA
alta risoluzione di raccolta troppo aperto: basso contrasto

Anche il condensatore influenza la risoluzione e il contrasto!!!

Breve test (2)
1. Se in un microscopio l’obiettivo ha 3. In un microscopio diritto:
ingrandimento 40x e l’oculare ha un
ingrandimento 10x l’ingrandimento a. Il campione è illuminato dall’alto, e
totale è: l’obiettivo raccoglie la luce trasmessa
b. Il campione è illuminato dall’alto e
a. 400x l’obiettivo raccoglie la luce riflessa
b. 4x c. Il campione è illuminato dal basso e
c. 50x l’obiettivo raccoglie la luce trasmessa
d. 30x d. Il campione è illuminato dal basso e
l’obiettivo raccoglie la luce riflessa
2. In un microscopio, il condensatore serve a:
4. L’apertura numerica dell’obiettivo (2 risposte giuste):
a. Tenere il campione a temperatura
costante a. Cresce con l’aumentare dell’ingrandimento
b. Focalizzare l’immagine del campione sul b. Diminuisce con l’aumentare
diaframma di apertura dell’ingrandimento
c. Amplificare la potenza della lampada di c. Cresce con la distanza dell’obiettivo dal
illuminazione campione
d. Illuminare il campione in modo d. Diminuisce con la distanza dell’obiettivo dal
omogeneo campione
5. Una delle seguenti affermazioni riguardo agli 7. Una sola di queste affermazioni sulla risoluzione in
obiettivi è falsa. Quale? un microscopio è vera. La risoluzione:

a. Sugli obiettivi sono indicate eventuali a. Dipende solo dalla bontà del sistema ottico
correzioni alle aberrazioni e può idealmente essere infinita
b. Un obiettivo a immersione raccoglie più luce b. È comunque limitata dalla diffrazione
di un obiettivo tradizionale c. Non è influenzata dal condensatore, ma
c. L’obiettivo ha una lunghezza focale molto solo dall’obiettivo
corta, quindi le lenti che lo compongono d. Non è influenzata dall’obiettivo, ma solo dal
devono essere quasi piane condensatore.
d. La geometria delle lenti di un obiettivo tiene
conto della lunghezza del tubo di
osservazione del microscopio

6. L’occhio, durante l’osservazione del microscopio, va

posto idealmente:

a. In corrispondenza della lente dell’oculare

b. Nel punto in cui convergono i raggi
dell’oculare, a pochi centimetri dalla lente
c. A circa 25 cm dal campione, ovvero alla
distanza della visione distinta.
d. In corrispondenza del fuoco del
condensatore.